مقالة منهجية

نموذج عضوي الورم ثلاثي الأبعاد المستخرج من المريض لفحص مستقبلات المستضدات الكيميرية في المختبر

DOI:

10.3791/69113

⸱

ديسمبر 30, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Oncology, Shenzhen Qianhai Shekou Free Trade Zone Hospital, 2Department of Pharmacology, Joint Laboratory of Guangdong-Hong Kong Universities for Vascular Homeostasis and Diseases, School of Medicine, Southern University of Science and Technology, 3Department of Digestive Disease, Shenzhen Qianhai Shekou Free Trade Zone Hospital, 4Department of Human Cell Biology and Genetics, School of Medicine, Southern University of Science and Technology, 5Department of Surgical Endoscopy, Shenzhen People's Hospital (The First Affiliated Hospital, Southern University of Science and Technology; The Second Clinical Medical College, Jinan University), 6Department of Medicine and Therapeutics, Faculty of Medicine, The Chinese University of Hong Kong, 7Institute of Digestive Disease, State Key Laboratory of Digestive Disease, Faculty of Medicine, The Chinese University of Hong Kong

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يؤسس هذا البروتوكول نموذج زراعة مشتركة في المختبر باستخدام عضويات الأورام المشتقة من المريض وخلايا مستقبلات المستضدات الكيميرية T (CAR-T) لتقييم النشاط السام الخلوي المحدد لخلايا CAR-T ضد الخلايا الورمية الصلبة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

حقق علاج خلايا مستقبلات المستضد الكيميرية T (CAR-T) فعالية سريرية مثيرة في الأورام الدموية، لكن علاج خلايا CAR-T للأورام الصلبة لا يزال يتطلب تطويرا إضافيا. العضويات الورمية المشتقة من المرضى هي نماذج أمراض في المختبر تحتفظ بعدم تجانس المريض، وقد استخدمت لاختبار فعالية وسلامة العلاج الكيميائي والأدوية المستهدفة. تصف هذه الطريقة نموذج اختبار فعالية في المختبر لدمج عضويات الأورام مع خلايا CAR-T. يتم تصنيع عينات سرطان القولون والمستقيم من المرضى في عضويات ورمية ذات بنية ثلاثية الأبعاد (ثلاثية الأبعاد) في مصفوفة غشاء قاعدي. يمكن أن تنمو عضويات الورم بشكل مستقر وتمر باستمرار. يتم فصل عضويات الأورام الناضجة عن المصفوفة عن طريق الغسل والطرد المركزي، وتضاف خلايا CAR-T بنسب مختلفة من المؤثرات إلى الهدف (E:T) لتشكيل نظام زراعة مشتركة بين المناعة والعضويات. بعد 6-24 ساعة، تلاحظ الشكل والهياكل بين الخلايا للعضويات بواسطة تصوير المجال الساطع. تجري هذه التجربة أيضا تلوين الخلايا الميتة في نظام الزراعة المشتركة، مما يمكن أن يعكس جدوى العضوية ويقيم التأثير السام الخلوي لخلايا CAR-T على الأعضاء الورمية. يمكن لهذه التجربة مراقبة التفاعل بين خلايا CAR-T وعضويات الأورام ثلاثية الأبعاد بفعالية، ويمكن استخدام النتائج لتقييم النشاط المقتل للأورام في خلايا CAR-T.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أظهر علاج خلايا مستقبلات المستضدات الكيميرية T (CAR-T) نجاحا سريريا ملحوظا في علاج الأورام الخبيثة الدموية1. ومع ذلك، لا يزال تطبيقه في الأورام الصلبة محدودا بسبب عدة عقبات رئيسية، بما في ذلك تغاير الورم وفقدان المستضدات، والحواجز الفيزيائية والكيميائية داخل كتلة الورم، والبيئة الدقيقة للورم المثبط للمناعة2،3. تساهم هذه التحديات في محدودية فعالية علاج خلايا CAR-T في بيئات الأورام الصلبة.

يعد التقييم الصناعي لفعالية خلايا CAR-T خطوة حاسمة خلال التطور قبل السريري. النماذج الأكثر استخداما هي خطوط خلايا الورم، التي قد تعبر إما عن مستضدات مرتبطة بالورم أو مصممة لحمل جينات المراسلة مثل لوسيفيراز 4,5. وبالتالي، غالبا ما تفشل نتائج الفحوصات التقليدية القائمة على خطوط الخلايا في التنبؤ بالنتائج السريرية. تقدم نماذج الأورام المشتقة من المريض بديلا واعدا لتقييم وظيفة CAR-T بدقة أكبر في سياق الأورام الصلبة.

بينما بدأت عدة دراسات باستخدام PDTOs لتقييم خلايا CAR-T، لا تزال هناك تحديات في وضع بروتوكولات زراعة مشتركة موحدة وقوية وسهلة الوصول، توازن بفعالية بين الحفاظ على بنية الورم ثلاثية الأبعاد والتفاعل الفعال بين الخلايا المناعية والورمية. العضويات الورمية المشتقة من المريض (PDTOs) هي نماذج أمراض خارج الجسم ثلاثية الأبعاد (ثلاثية الأبعاد) تنتج من أنسجة أو خلايا الورم لدى المريض. تم تأسيس PDTO بنجاح لمجموعة واسعة من أنواع الأورام، بما في ذلك سرطانات القولون والمستقيم، وسرطان الثدي، والبنكرياس، والرئة. تحتفظ هذه الهياكل بالبنية النسيجة، والملفات الجزيئية، والتغاير الوظيفي للورمالأصلي 6. إلى جانب الخلايا الورمية الأولية والفضائيات المشتقة من المريض (PDX)، تمثل PDTOs منصة قيمة لنمذجة خصائص الأمراض الخاصة بالمريض7. مقارنة بخطوط الخلايا الورمية التقليدية أو الثقافات الأولية، تعيد PDTO بشكل أوثق بيئة الورم في الجسم الحي، حيث تظهر تركيبات خلوية معقدة وتنظيما هيكليا8. كما تحافظ على استقرار الجينوم وتحافظ على أنماط التعبير الجيني على مدى الممرات الممتدة، مما يسمح بتقييم أكثر دقة للاستجابات العلاجية 9,10. تم استخدام PDTO بنجاح في دراسات بيولوجيا الأورام، وفحص الأدوية، والطب الدقيق، وأصبحت معروفة بشكل متزايد لفائدتها في اختبارات العلاج المناعي، بما في ذلك تحديد أهداف CAR الجديدة، وتحسين تصميم CAR، وتقييم السمية الخلوية 6,11,12,13 . من القيود الشائعة لزراعة العضويات اعتمادها على مكونات المصفوفة خارج الخلية (ECM) مثل ماتريجيل (المعروفة لاحقا بمصفوفة الغشاء القاعدي [BMM]) للحفاظ على البنية ثلاثية الأبعاد، والتي يمكن أن تعيق تسرب الخلايا المناعية في اختبارات الزراعة المشتركة. لضمان الاتساق والتفاعل الأمثل بين الخلايا في الزراعة المشتركة، يتم عادة اختيار الأعضاء ضمن نطاق حجم محدد (مثل 100-200 ميكرومتر في القطر).

يصف هذا البروتوكول منصة زراعة مشتركة لتقييم سمية خلايا CAR-T باستخدام PDTOs المشتقة من سرطان القولون والمستقيم. يتم تفكيك عينات الأورام الإنزيمية وزراعتها في BMM لتوليد عضويات ثلاثية الأبعاد. بمجرد نضوجها وتوسعها، يتم عزل الأعضاء ذات الحجم الموحد ووضع علامات فلورية. يتم زراعتها في صفائح متعددة الآبار وتزرع معا مع خلايا CAR-T بنسب تأثير إلى هدف (E:T) متفاوتة. ميزة رئيسية لهذا النهج هي الإزالة المتعمدة لمواد PDTO من BMM قبل الزراعة المشتركة، مما يتيح الوصول المباشر وغير المعوق لخلايا CAR-T إلى عضويات الورم مع الحفاظ على سلامتها ثلاثية الأبعاد معلقة. بعد 24 ساعة، يكشف المجهر الساطع عن تفكك تدريجي لPDTO، يتميز بتعطيل في الشكل ثلاثي الأبعاد، وانكماش خلايا الورم، وفقدان القدرة على البقاء. يعرض تصوير الخلايا الحية والمجهر الفلوري بشكل أكبر التفاعلات بين خلايا CAR-T الموسومة بالفلورية وأهداف الأورام. تستخدم اختبارات موت الخلايا الكمية لتقييم السمية الخلوية. يوفر هذا الزراعة المناعية المعتمدة على الأعضاء منصة قوية ومحددة للمريض لتقييم فعالية خلايا CAR-T المضادة للأورام خارج الجسم الحي، مما يمكن من تحسين العلاج ودعم الترجمة السريرية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم استخدام عضويات مشتقة من مرضى سرطان القولون والمستقيم. تم الحصول على شظايا أنسجة الورم من مرضى غير مطلعين على العلاج يعانون من سرطان الغدة القولون والمستقيم الأولي المؤكد نسيجيا (CRC). تم الحصول على جميع الأنسجة من عينات خزعة بالمنظار تم جمعها خلال الإجراءات التشخيصية القياسية في مستشفى شنتشن تشيانهاي شيكو لمنطقة التجارة الحرة. تم تأكيد جميع أنسجة المتبرع ك CRC من خلال الفحص النسيجي المرضي من قبل أطباء الأمراض المؤسساتية. يتبع البروتوكول إرشادات مؤسسية. تم الحصول على موافقات مكتوبة مستنيرة من جميع المرضى. تمت الموافقة على الدراسة من قبل لجنة أخلاقيات مستشفى شنتشن تشيانهاي شيكو لمنطقة التجارة الحرة (2024KY-009-01K).

1. ثقافة PDTO

  1. تحضير الأنسجة
    1. ضع شظايا أنسجة الورم التي تم الحصول عليها عبر خزعة تنظير القولون من مرضى يعانون من سرطان الغدة القولون والمستقيم الأولي المؤكد نسيجيا في أنبوب معقم بحجم 50 مل.
    2. أضف 30 مل من محلول غسل الأنسجة الباردة المكون من محلول هانكس المتوازن للملح (HBSS)، ألبومين مصل البقر 1٪ (BSA)، 100 وحدة U/mL بنسلين، 0.1 ملغ/مل ستريبتومايسين، 50 ميكروغرام/مل جنتاميسين، 5 ميكروغرام/مل أمفوتريسين B، و10 ميكرومولار مثبط كيناز مرتبط بالرو (Y-27632).
    3. ضع الأنبوب على الثلج وحركه بلطف لمدة 5 دقائق لغسل الأنسجة.
    4. كرر الخطوة 1.1.3. مرتين إضافيتين مع محلول غسيل مناديل جديد.
  2. هضم الأنسجة
    1. قم بتقليم الأنسجة النخرية أو الدهنية وقطع الورم إلى شظايا نسيجية.
    2. 8 مل دافئ من وسط الهضم (وسط DMEM، 500 U/mL كولاجناز IV، 1.5 ملغ/مل كولاجناز II، 20 ميكروغرام/ملليتر هيالورونيداز، 0.1 ملغ/ملتر ديسبايس النوع الثاني، 10 ميكرومولار Y-27632، و1٪ سيروم البقري الجنيني) إلى 37 درجة مئوية.
    3. انقل الشظايا إلى حاجز الهضم وحضانه عند 37 درجة مئوية في حمام ماء. لف الأنبوب بلطف باليد لمدة ~10 ثوان كل 5 دقائق لتسهيل اختراق الإنزيم.
      ملاحظة: ضبط حجم مخزن الهضم حسب حجم كتلة الأنسجة. بشكل عام، 8-10 مل كافية لأحجام الخزعة بالمنظار.
    4. راقب تحت المجهر بعد 15 دقيقة للتحقق من حالة الانفصال. إذا بقيت شظايا الأنسجة، استمر في الهضم حتى حد أقصى 30 دقيقة.
    5. عندما تكون العناقيد مرئية، قم بعمل الماصة بلطف (5-10 مرات) باستخدام ماصة بحجم 10 مل للتفكك الميكانيكي. الطرد المركزي عند 350 × جرام لمدة 5 دقائق.
    6. التخلص من السوبرناتانت؛ أعد تعليق الحبيبات في محلول غسيل بسعة 10 مل وجهاز طرد مركزي عند 350 × جرام لمدة 5 دقائق. كرر الغسل مرتين.
      ملاحظة: عادة ما تبدأ PDTO بتكوين هياكل كروية مدمجة خلال 3-5 أيام من الزراعة. أظهرت العضويات تكاثرا قويا ووصلت إلى حجم مناسب للتجارب (حوالي 100-200 ميكرومتر قطرا) بحلول اليوم 10-14. تم إجراء عملية المرور كل 7-10 أيام للحفاظ على نمو صحي ومنع التقاء مفرط أو نخر مركزي. بشكل عام، يستخدم محلول هضم بسعة 8-10 مل لكل خزعة (شظايا بحجم 2 مم³)، مما يضمن تركيز عمل نهائي ل TrypLE Express بنسبة 1× نهائي.

2. بناء PDTO

  1. تضمين المصفوفة
    1. ضع 200 ميكرولتر من BMM (مبرد مسبقا عند 4 درجات مئوية) في أنبوب نظيف وقم بعمل ماصة على الحبيبات للخلية للأعلى والأسفل على الأقل 10-15 مرة باستخدام رأس ماصة مبرد مسبقا حتى يبدو التعليق متجانسا دون وجود كتل ظاهرة.
    2. قم بتوزيع قطرات بسعة حوالي 30 ميكرولتر في كل بئر من صفيحة ذات 24 بئرا. حضن عند حرارة 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق حتى يتصلب.
    3. أضف 500 ميكرولتر من وسط الزراعة العضوية (وسط DMEM/F12 متقدم، يحتوي على 50 ميكروغرام/ملليتر R-spondin 1، 10 ميكروغرام/ملتر نوجين، 500 ميكروغرام/مل EGF، 100x HEPES، 100x جلوتامكس، 500x نورموسين، 500x جنتامسين/أمفوتيرسين B، 50x N2، 100x B27، 500 ملليمولار n-أستيل سيستيين، 1 ميلار نياسيناميد، 5 ملليمولار Alk 4/5/7 مثبط، 30 مولار مثبط p38، 100 ميكرومولار جاسترين، و100 ميكرومولار بروستاجلاندين E2) لكل بئر.
      ملاحظة: استخدم حوالي 30 ميكرولتر من BMM لكل قطرة؛ عدل بناء على كثافة الخلايا.
  2. صيانة الثقافة
    1. زراعة الأعضاء عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون; غير المتوسط كل 3 أيام.
    2. راقب تكوين العضويات يوميا. توقع وجود كروي صغير بحلول اليوم الثالث.
    3. قيم نجاح التكوين العضوي خلال الأيام 6-10. مدة التكوين (تتراوح بين 3 إلى 14 يوما) تعتمد على صلاحية الأنسجة وساقها.

3. مركبات PDTO التمرير

  1. التفكيك
    1. قم بتبريد الطرد المركزي إلى 4°C. أزل الوسط وأضف 1 مل من HBSS البارد جدا والماصة بلطف 3-5 مرات لتعطيل BMM.
      ملاحظة: يمكن ملاحظة العضويات الناتجة جيدا كنقاط بيضاء صغيرة بالعين المجردة.
    2. انقل نظام التعليق إلى أنبوب معقم بسعة 15 مل وجهاز طرد مركزي عند 350 × جرام لمدة 5 دقائق.
  2. تفكك الإنزيمات
    1. تخلص من السوبرناتانت وأضف 1 مل من تريبل. ضعها في حمام ماء بدرجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة دقيقتين.
    2. أضف 2 مل من HBSS لتحييد TrypLE؛ الطرد المركزي عند 350 × جرام لمدة 5 دقائق.
    3. أزل المادة الفائقة وأعد تعليقها ب 2 مل من HBSS. الطرد المركزي مرة أخرى عند 350 × جرام لمدة 5 دقائق.
  3. إعادة التضمين
    1. أضف BMM طازج إلى الحبيبة بنسبة 1:3-1:6 (الحبيبة العضوية: BMM، v/v); أعد تعليقها برفق. تحتوي كل قطرة على حوالي 30 ميكرولتر حجم نهائي. وضع القطرات في صفيحة جديدة مكونة من 24 بئرا؛ حضانة عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
    2. أضف 500 ميكرولتر من وسط الزراعة لكل بئر وحضن عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
    3. فحص الآبار يوميا؛ راقب إعادة التجميع ثلاثية الأبعاد خلال حوالي 48 ساعة.
    4. بعد 3-5 مرات، اختر عضويات صحية للاختبارات اللاحقة أو الحفظ بالتجميد.

4. الزراعة المشتركة لخلايا CAR-T وPDTOs

  1. تحضير وسيط الزراعة المشتركة
    1. مكمل وسط زراعة العضوية الأساسي ب 10 نانوغرام/لتر IL-2 و0.05 مللي مولار β-ميركابتوإيثانول لدعم فعالية CAR-T.
      ملاحظة: الوسط الأساسي يدعم البنية ثلاثية الأبعاد وقابلية PDTOs.
  2. تحضير PDTO
    1. قم بإزالة قطرات BMM التي تحتوي على PDTO ناضجة (مثل اليوم 4-6) من لوحة الزراعة باستخدام مكشطة خلايا معقمة أو طرف ماصة.
    2. انقل خليط BMM/PDTO إلى أنبوب مخروطي بحجم 15 مل.
    3. أضف 5-10 مل من محلول HBBS البارد جدا أو محلول غسيل الأنسجة (كما هو موضح في الخطوة 1.1.2) إلى الأنبوب. اقلب بلطف 5-10 مرات لإزالة الأعضاء من BMM.
    4. اترك الخليط ليبقى على الثلج لمدة 5 دقائق. سيتحول BMM إلى سائل، بينما تبقى PDTOs المفككة معلقة.
    5. استنشق الفائق الذي يحتوي على BMM بعناية، مع ترك حبيبات PDTO خلفك. تجنب إزعاج الحبيبة.
    6. كرر الخطوات من 4.2.3 إلى 4.2.5 مرتين إضافيتين لضمان إزالة BMM بالكامل.
    7. بعد الغسل النهائي، اجمع المادة الفائقة والطرد المركزي الذي يحتوي على PDTO عند حرارة 300 × جرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    8. استنشق المادة الفوقية وأعد تعليق حبيبات PDTO في 1-2 مل من وسط زراعة العضوية أو وسط الزراعة المشتركة.
    9. (اختياري للعد) جهز نظام تعليق أحادي الخلية.
      1. إذا كان هناك حاجة للعد الدقيق، انقل الأعضاء المعلقة إلى أنبوب جديد وحضن باستخدام جهاز TrypLE Express المسخن مسبقا عند 37 درجة مئوية لمدة 3-5 دقائق، يليه بعمل عمل بلطف لتحقيق تعليق خلية واحدة. تابع عد الخلايا (مثل استخدام مقياس الدم أو عداد الخلايا الآلي).
        ملاحظة: هذه الخطوة تفكك الأعضاء العضوية وتكون فقط لأغراض العد قبل إعادة الطبق.
    10. اختيار الحجم والتوحيد القياسي: لضمان حجم متسق للعضويات للزراعة المشتركة، مرر PDTO المعلقة (من الخطوة 4.2.8) عبر مصفاة خلية بمقاس 70 ميكرومتر موضوعة فوق أنبوب مخروطي بحجم 50 مل. تزيل هذه الخطوة التجمعات العضوية الكبيرة والحطام، مما يمثل نسبة حجم موحد مناسبة للزراعة المشتركة الموحدة.
    11. قم بالطرد المركزي بنظام التعليق العضوي المعياري عند 300 × جرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    12. استنشق المادة الفائقة وأعد تعليق PDTOs الموحدة في حجم مناسب من وسط الزراعة المشتركة المسخن مسبقا.
    13. عد PDTOs الموحدة (مثلا، باستخدام مقياس الدم تحت المجهر، عد عدد الأعضاء العضوية في كل حقل).
      ملاحظة: العد يعتمد على عدد العضويات، وليس على رقم الخلية.
    14. زرع PDTO الموحدة في لوحة متعددة الآبار المطلوبة (مثل لوحة U-bottom ذات 96 بئر) عند العدد المستهدف لكل بئر.
    15. أضف خلايا CAR-T إلى الآبار عند نسب المؤثر إلى الهدف (E:T) المطلوبة.
  3. تصنيف PDTOs
    1. قم بتبريد الطرد المركزي إلى 4 درجات مئوية. استنشق الوسيط؛ أضف 1 مل من HBSS لإزاحة القطرات.
    2. انقله إلى أنبوب طرد مركزي بسعة 15 مل، أضف 4 مل من HBSS، ثم استخدم الماصة بلطف. الطرد المركزي عند 350 × جرام لمدة 5 دقائق.
    3. تخلص من السوبرناتانت، أضف 5 مل من HBSS، واضع الماصة برفق. الطرد المركزي مرة أخرى عند 350 × جرام لمدة 5 دقائق.
    4. جهز حل هوشت 33342 التشغيلي.
    5. إعادة تعليق الحبيبات في محلول Hoechst 33342 بسعة 1 مل (تركيز نهائي 5 ميكروغرام/مل). اخلط بلطف عن طريق الانقلاب 3-5 مرات لضمان انتشار الصبغة بشكل متساو. احم من الضوء عن طريق لف الأنبوب بورق الألمنيوم. احتضن عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. بعد التلوين، اغسله مرتين باستخدام HBSS لإزالة الصبغة الزائدة.
  4. PDTO الطلاء
    1. تقدير كثافة العضويات بنسبة قطرات هلام إلى بئر 1:5؛ يعيد تعليق الزراعة في وسط الزراعة المشتركة عند حوالي 1 ×10 3 عضوات/مل.
    2. أضف 100 ميكرولتر لكل بئر إلى صفيحة ذات 96 بئر؛ تتضمن على الأقل ثلاث نسخ لكل شرط.
      ملاحظة: لا تقوم بعد الخلايا في هذه المرحلة؛ تظل العضوية سليمة.
  5. الثقافة المشتركة بين CAR-T
    ملاحظة: يركز هذا البروتوكول على الزراعة المشتركة وتقييم فعالية خلايا CAR-T مع PDTOs. تم وصف توليد وتوصيف خلايا CAR-T المستخدمة في هذه الدراسة في القسم 8.
    1. حصاد خلايا CAR-T في طور لوغاريتم. صبغ ب Trypan Blue لتأكيد صلاحيته >95٪.
    2. خلايا الطرد المركزي عند 350 × جرام لمدة 5 دقائق؛ إعادة التعليق في وسيط الثقافة المشتركة.
    3. اضبط التركيزات إلى 4 × 106/مل، 2 × 106/مل، و1 × 106/مل.
    4. أضف 100 ميكرولتر من نظام تعليق CAR-T لكل بئر وفقا للتصميم التجريبي. أضف 100 ميكرولتر من وسط الزراعة المشتركة للتحكم في الآبار.
    5. حضانة الصفيحة عند 37 درجة مئوية، 5٪ ثاني أكسيد الكربونلمدة 6-24 ساعة.

5. تلوين الخلايا الميتة

  1. صبغة SYTOX الخضراء
    1. لكل 1 × 10إلى 5 خلايا، حضر 100 ميكرولتر من محلول التلوين النووي الأخضر عن طريق تخفيف 1 ميكرولتر من SYTOX Green (1000x) إلى 1 مل من مخزن الاختبار.
    2. عند نقاط الزراعة المشتركة التي تستغرق 6 و24 ساعة، أضف 100 ميكرولتر من محلول التلوين الأخضر SYTOX لكل بئر. حضن عند حرارة 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة في الظلام.

6. الحصول على الصور

  1. استنشق المادة الفائقة وأضف 100 ميكرولتر من DMEM/F12.
  2. التقاط صور المجال الساطع والفلورة باستخدام المجهر (مثل الكونفوكل):
    Hoechst 33342 (PDTOs): الإثارة (Ex)/الانبعاث (Em) = 350 نانومتر/461 نانومتر
    mCherry (CAR-T): Ex/Em = 587 نانومتر/610 نانومتر
    SYTOX Green (الخلايا الميتة): Ex/Em = 504 نانومتر/528 نانومتر
  3. التقط على الأقل ثلاث صور في كل بئر، مع التركيز على الحقل المركزي.

7. تحليل البيانات

  1. إطلاق ImageJ (الإصدار 1.54، NIH، https://imagej.nih.gov/ij/)؛ استيراد صور قناة SYTOX الخضراء. اضبط العتبة يدويا لتمييز إشارات الفلورة عن الخلفية (الصورة > تعديل > العتبة).
  2. استخدم دالة التحليل > القياس لحساب الكثافة المتكاملة. تصدير البيانات .csv للتحليل الإحصائي اللاحق في برنامج تحليل إحصائي مناسب (مثل GraphPad Prism).
  3. اضبط العتبة لفصل إشارات الفلورة عن الخلفية.
  4. اختر المجال بالكامل؛ تشغيل تحليل > قياس لحساب شدة إشارة الفلورة المجمعة.
  5. تصدير البيانات وإجراء التحليل الإحصائي لمقارنة المعالج مقابل الضابط بعد 24 ساعة.

8. توليد وتوصيف خلايا CAR-T

  1. تصميم بناء CAR
    ملاحظة: الخلايا المستخدمة في هذه الدراسة تستهدف B7-H3 (المشفر بواسطة جين CD276)، وهو مستضد يعبر عنه بشكل مفرط في سرطان القولون والمستقيم14. يتكون بناء CAR من:
    المجال خارج الخلية: جزء متغير أحادي السلسلة (scFv) مشتق من جسم مضاد وحيد النسيلة ضد نسخة B7-H3 376.96.
    المفصل والمجال العابر للغشاء: مفصل CD8α ومجال الغاشية العابرة.
    المجال التحفيزي المشترك: الإنسان CD28.
    مجال الإشارة: CD3ζ البشري.
  2. توليد خلايا CAR-T
    1. العزل: عزل خلايا الدم أحادية النواة المحيطية (PBMCs) من طبقات المتبرع السليمة باستخدام الطرد المركزي بتدرج كثافة Ficoll-Paque14.
    2. التفعيل: تنشيط الخلايا السرطانية الخلفية البشرية بأجسام مضادة مضادة لروابط الصفائح CD3/CD28 لمدة 48 ساعة في وسط الخلايا التائية مع تغذية 10 نانوغرام/مل IL-7 و5 نانوغرام/مل IL-15. جهز وسط الخلايا التائية بخلط كميات متساوية (250 مل لكل منهما) من RPMI 1640 وClick's Media، مع مكمل ب 10٪ مصل بقري جنيني (FBS)، و1x جلوتا ماكس، و1٪ بنسلين-ستريبتومايسين (Pen/Strep).
    3. التحويل: نقل الخلايا التائية المنشطة باستخدام فائض الفيروس الرجعي باستخدام صفيحة مغطاة بالريترونكتين كما هو موضحسابقا 15.
    4. التوسع: حصاد وزراعة خلايا T بعد 3 أيام من النقل في وسط خلايا T البشرية الكاملة يحتوي على IL-7 و IL-15 لمدة 7-9 أيام إضافية قبل التوصيف والاختبارات الوظيفية.
  3. توصيف خلايا CAR-T
    1. تعبير CAR: تقييم تعبير CAR بعد 5-7 أيام من النقل بواسطة قياس تدفق الخلايا باستخدام بروتين B7-H3-Fc المؤتلف، يليه جسم مضاد ثانوي موسوم فلورية ضد Fc14 البشري. تتراوح كفاءة النقل النموذجي (خلايا CAR+) بين 80٪ إلى 90٪.
    2. النمط الظاهري: توصيف المجموعات الفرعية لخلايا T (مثل CD4+، CD8+، إلخ) باستخدام قياس تدفق الخلايا باستخدام الأجسام المضادة ضد CD3، CD4، CD8، CD45RA، CCR7، وغيرها14.
    3. التحقق الوظيفي (اختياري قبل الزراعة المشتركة): قبل تجارب الزراعة المشتركة، تحقق من صحة خلايا CAR-T وظيفيا من خلال الزراعة المشتركة مع خطوط الخلايا المستهدفة الموجبة B7-H3 وB7-H3 السلبية وقياس إطلاق السيتوكينات (مثل IFN-γ بواسطة ELISA) أو السمية الخلوية (مثلا باستخدام قياس تدفقالخلايا 15).
  4. التحضير للزراعة المشتركة (اختبار PDTO)
    1. استخدم خلايا CAR-T للزراعة المشتركة أثناء توسع الطور اللوغاريتمي (عادة بين اليوم 10-14 بعد التفعيل). قبل الاستخدام، اغسل الخلايا مرتين باستخدام HBSS لإزالة IL-7/IL-15 وأعد تعليقها في وسط الزراعة المشتركة الموضح في الخطوة 4.1.
    2. أكد أن صلاحية الصلاحية >95٪ باستخدام صبغة Trypan Blue.
    3. نقاط الفحص البصرية: تحقق من وجود تجمعات كروية صغيرة (50-100 ميكرومتر) في الأيام 3-5 والكروي الناضجة (100-200 ميكرومتر) في الأيام 10-14.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم استخراج عضويات سرطان القولون والمستقيم بنجاح من عينات الخزعة بالمنظار (الشكل 1)، مع تأكيد هوية الورم بالتشخيص المرضي (الشكل 2). بدأت شظايا الأورام التي تم زراعتها في BMM بتكوين هياكل ثلاثية الأبعاد خلال 24 ساعة. تم تمرير العضويات من الجيل الأول (P0) بين الأيام 7-14. أظهرت العضويات أشكال متنوعة، بما في ذلك هياكل كروية وكيسية ودائرية (الشكل 2A).

تم استخدام نظام تصوير فلو...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تقدم هذه المقالة طريقة لتقييم التأثير الخلوي السام لخلايا CAR-T على PDTOs، تجمع بين التصوير الساطع والتلوين الفلوري لتقييم صلاحية العضويات. يتيح هذا النهج المزدوج النمط من التصور القوي لموت خلايا الورم في نظام نموذج ثلاثي الأبعاد ويوفر تقييما شبه كمي لسمية الخلايا في CAR-T.

مكون أساسي في هذا البروتوكول هو وسيط الزرعة. نظرا لأن خلايا CAR-T وعضويات الأورام لها متطلبات غذائية مميزة، فقد تم تقييم توافق خلايا CAR-T مع وسط الزراعة العضوية أولا. حافظت خلايا CAR-T على...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون عدم وجود تضارب مصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد دعم هذا العمل البرنامج الوطني الرئيسي للبحث والتطوير في الصين (2022YFC2304400، 2022YFC2304401)، ومشروع العلوم والتكنولوجيا في نظام الطب والصحة في نانشان (NSZD2024046، NS2024105)، وصندوق شنزن للأبحاث الطبية (D2401023).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
أنبوب 15 ملسينينغ3030100
صفيحة ذات 24 بئركورنينغ3524
أنبوب 50 ملسينينغ3030000
صفيحة ذات 96 بئركورنينغ3599
DMEM/F12 المتقدمجيبكوC11330500BT
مثبط Alk 4/5/7MCEHY-10432 
B27جيبكو17504044
خزانة السلامة الحيوية (الفئة الثانية)ثيرمو فيشرلا يوجد
مصل البقر ألبومينسيغما ألدريتشA9056
طبق زراعة الخلايابيوفيلTCD010060
الطرد المركزيإبندورف5810R
وسيط كليكفيلم فوجي9195
حاضنة ثاني أكسيد الكربونياماتاIP610
كولاجناز IIسولاربيولوجياC8150
الكولاجيناز IVسيغما ألدريتشC9407
مجهر الليزر الكونفوكالزايسLSM900
وسط حافظ للتجميدزينواكCELLBANKERTM2
مخزن الهضمالمواد المحضرة داخليالا يوجدالمؤلف المقدم في المخطوطة
الهزاز الرقميميولابHS-25
ديسباس النوع الثانيسيغما-ألدرشD4693
DMEMجيبكوC11995500BT
منشط Dynabeads البشري CD3/CD28ثيرمو فيشر11131D
EGFبيبروتكAF-100-15-500UG
مصل الأبقار الجنينيجيبكو1631389
غاسترينGlpBioGA20228
جنتاميسين/أمفوتيريتين BجيبكوR0151
غلوتامكسجيبكو35050061
محلول هانكس المتوازن للملحجيبكوC14175500BT
هيبسجيبكو15630080
هوشست 33342 بيوتايمC1027
هيالورونيدازسولاربيولوجياh8030
IL-15بيبروتيك200-15-10UG
IL-2نوفوبروتينCK24-10
IL-7بيبروتيك200-07-10UG
ImageJNIH (المصدر المفتوح)https://imagej.nih.gov/ij/
مقلوب  المجهر الفلوريإم شوتMF52-N
ماتريجيلكورنينغ356231
N2جيبكو17502048
n-أستيل سيستينسيغما ألدريتشA7250-5G
نياسيناميدسيغما ألدريتشN0636-100G
نوجينبيبروتك120-10C-20
نورموسينإنفيفوجينant-nr-1
وسط زراعة الأورجينويدالمواد المحضرة داخليالا يوجدالمؤلف المقدم في المخطوطة
مثبط p38MCEHY-10295 
استئصال البنسلين-العقديجيبكو15140122
بروستاجلاندين E2MCEHY-101952 
مثبط كيناز المرتبط بالرو الخلايا الجذعية72304
RPMI 1640هايكلونSH30809.01B
R-سبوندين 1بيبروتك120-38-20UG
حشوات البايبت S1ثيرمو ساينتفيك9501
الماصبة المصليةبيوفيلGSP-010-050
الماصة أحادية القناةإبندورف3123000063
الماصة أحادية القناةإبندورف3123000055
الماصة أحادية القناةإبندورف3123000098
الماصة أحادية القناةإبندورف3123000022
المشرطات المعقمة القابلة للتخلص منهاتيك-إسSSD10
سايتوكس جرينبيوتايمC1181S
تيكس ماكس ميديومميلتيني بيوتيك130-097-196
خزان مياه منظم الحرارةبلوباردBWS-10
تريبان بلوفيجينPH0519
TrypLE Expressجيبكو12605028
β-ميركابتوإيثانولجيبكو21985023

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lu, J., Jiang, G. The journey of CAR-T therapy in hematological malignancies. Mol Cancer. 21 (1), 194(2022).
  2. Maalej, K. M., et al. CAR-cell therapy in the era of solid tumor treatment: Current challenges and emerging therapeutic advances. Mol Cancer. 22 (1), 20(2023).
  3. Albelda, S. M. CAR T cell therapy for patients with solid tumours: Key lessons to learn and unlearn. Nat Rev Clin Oncol. 21 (1), 47-66 (2024).
  4. Shi, H., et al. IL-15 armoring enhances the antitumor efficacy of claudin 18.2-targeting CAR-T cells in syngeneic mouse tumor models. Front Immunol. 14, 1165404(2023).
  5. Zhang, D. K. Y., et al. Enhancing CAR-T cell functionality in a patient-specific manner. Nat Commun. 14 (1), 506(2023).
  6. Qu, S., et al. Patient-derived organoids in human cancer: A platform for fundamental research and precision medicine. Mol Biomed. 5 (1), 6(2024).
  7. Yoshida, G. J. Applications of patient-derived tumor xenograft models and tumor organoids. J Hematol Oncol. 13 (1), 4(2020).
  8. Qu, J., Kalyani, F. S., Liu, L., Cheng, T., Chen, L. Tumor organoids: Synergistic applications, current challenges, and future prospects in cancer therapy. Cancer Commun. 41 (12), 1331-1353 (2021).
  9. Mo, S., et al. Patient-derived organoids from colorectal cancer with paired liver metastasis reveal tumor heterogeneity and predict response to chemotherapy. Adv Sci. 9 (31), 2204097(2022).
  10. Nam, C., Ziman, B., Sheth, M., Zhao, H., Lin, D. -C. Genomic and epigenomic characterization of tumor organoid models. Cancers. 14 (17), 4090(2022).
  11. Taurin, S., et al. Patient-derived tumor organoids: A preclinical platform for personalized cancer therapy. Transl Oncol. 51, 102226(2025).
  12. Tao, B., et al. Organoid-guided precision medicine: From bench to bedside. MedComm. 6 (5), e70195(2025).
  13. Ning, R. -X., et al. Application status and optimization suggestions of tumor organoids and CAR-T cell co-culture models. Cancer Cell Int. 24 (1), 98(2024).
  14. Du, H., et al. Antitumor responses in the absence of toxicity in solid tumors by targeting B7-H3 via chimeric antigen receptor T cells. Cancer Cell. 35 (2), 221-237.e8 (2019).
  15. Sun, S., et al. Preclinical evaluation of antitumor activity and toxicity of TROP2-specific CAR-T cells for treatment of triple-negative breast cancer. J Immunother Cancer. 13 (9), e012442(2025).
  16. Schnalzger, T. E., et al. 3D model for CAR-mediated cytotoxicity using patient-derived colorectal cancer organoids. EMBO J. 38 (12), e100928(2019).
  17. Zou, F., et al. The CD39+ HBV surface protein-targeted CAR-T and personalized tumor-reactive CD8+ T cells exhibit potent anti-HCC activity. Mol Ther. 29 (5), 1794-1807 (2021).
  18. Yu, L., et al. Patient-derived organoids of bladder cancer recapitulate antigen expression profiles and serve as a personal evaluation model for CAR-T cells in vitro. Clin Transl Immunol. 10 (2), e1248(2021).
  19. Wang, X., et al. Dynamic profiling of antitumor activity of CAR T cells using micropatterned tumor arrays. Adv Sci. 6 (23), 1901829(2019).
  20. Dekkers, J. F., et al. Uncovering the mode of action of engineered T cells in patient cancer organoids. Nat Biotechnol. 41 (1), 60-69 (2023).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

CAR T

مقالات ذات صلة