مقالة منهجية

إطار جينومي طبقي لتوقع نمط مصلل السالمونيلا : تقييم MLST وSeqSero وSeqSero2 وSeqSero2S وSISTR في جنوب غرب الصين

503 مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/69117

⸱

يناير 9, 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1West China School of Public Health and West China Fourth Hospital, Sichuan University, 2College of Pharmacy, Youjiang Medical University for Nationalities, 3Chengdu Center for Disease Control and Prevention (Chengdu Institute of Health Supervision), 4Sichuan Provincial Centre for Disease Control and Prevention, 5Department of Laboratory Medicine and Port Epidemic Disease Monitoring Key Laboratory of Sichuan Province, Sichuan International Travel and Healthcare Center (Chengdu Customs District Port Clinic), 6Health Promotion and Food Nutrition & Safety Key Laboratory of Sichuan Province, 7Innovation Center of Nursing Research and Nursing Key Laboratory of Sichuan Province, West China Hospital, Sichuan University

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

يؤسس هذا البروتوكول سير عمل جينومي طبقي للتنبؤ بنمط السالمونيلا ، مستخدما MLST أو SeqSero2S للمراقبة الروتينية، وSISTR مع الجينوم الأساسي MLST للكشف عن التفشي، وSeqSero2S للفحص السريع. تم التحقق من صحة البروتوكول من خلال تحليل متعدد المراكز لتعزيز المراقبة في الصين.

الملخص

يعد التصنيف المصلي الدقيق للسالمونيلا أمرا ضروريا للمراقبة الفعالة والتحقيق في التفشي، حيث يؤثر تنوع الأنماط المصلية بشكل مباشر على الممرضية وتقييم مخاطر الصحة العامة. ومع ذلك، فإن طرق الالتصاق التقليدية بالشريحة محدودة بسبب ضعف قابلية التكرار، وشدة العمل، والتكاليف العالية، مما يعيق تطبيقها في برامج المراقبة عالية الإنتاجية. لمعالجة هذه القيود، طورنا وتحقق من صحة سير عمل جينومي يدمج تصنيف تسلسل متعدد المواقع (MLST)، ومورد تصنيف السالمونيلا في السيليكو (SISTR)، وSeqSero، وSeqSero2، وSeqSero2S للتنبؤ بالأنماط المصلية باستخدام بيانات تسلسل الجينوم الكامل. تم تقييم هذا البروتوكول من خلال تحليل متعدد المراكز ل 315 عزلة سالمونيلا جمعت من الغذاء والمصادر البشرية في جنوب غرب الصين. أظهرت نتائج هذه الدراسة توافقا أعلى بشكل ملحوظ بين الأساليب الجينومية (حتى 100٪/99.1٪/90.1٪ في مجموعة التدريب و100٪/97.1٪/93.1٪ في مجموعة التحقق ل SISTR/MLST/SeqSero2S على التوالي) مقارنة بالتصنيف المصلي التقليدي. يتضمن سير العمل توصيات لاختيار طرق التنبؤ المناسبة بناء على سياق المراقبة، مع التركيز على MLST و SeqSero2S للمراقبة الروتينية، وSeqSero2S للفحص السريع، وSISTR مع الجينوم الأساسي MLST لتحقيقات التفشي. يسهل هذا النهج دمج التصنيف المصلي الجينومي في الممارسات الصحية العامة، مما يقلل الاعتماد على المصل التقليدي ويحسن قابلية التكرار والتوسع في برامج مراقبة السالمونيلا .

المقدمة

تعد السالمونيلا من أهم مسببات الأمراض المنقولة عن طريق الغذاء على مستوى العالم، حيث تسبب معدلات مراضة ووفيات كبيرة 1,2. في الصين، لا يزال السبب الرئيسي للأمراض المنقولة بالغذاء، مع عدد محدود من الأنماط المصلية التي تمثل غالبية الإصابات.3. التحديد الدقيق للنمط المصلي أمر بالغ الأهمية للمراقبة والتحقيقات في تفشي المرض (التفشي)، حيث يرتبط تنوع الأنماط المصلية ارتباطا وثيقا بالأمراض والمخاطر الصحية العامة. هذا معروف جيدا في الأنماط المصلية الشائعة مثل سالمونيلا أنتريتيديس وسالمونيلا تايفيموريوم، لكن بعض الأنماط المصلية الأقل دراسة، مثل سالمونيلا بنما، تعد أيضا سببا مهما للانتشار العالميوالأمراض الغازية، مما يبرز الحاجة العامة لقدرات تصنيف مصلية قوية. طرق التصنيف المصلي التقليدية، التي تعتبر منذ زمن طويل المعيار الذهبي، هي عملية تستغرق وقتا طويلا وعالية التكلفة وتتطلب أكثر من 150 مضاد مصل5. وتقيد بشكل أكبر ضعف قابلية التكرار6، وسير العمل المكثف7، والتباين الفطري الناتج عن التفسير الذاتي لتفاعلات الالتصاق8، مما يجعلها غير كافية لبرامج المراقبة عالية الإنتاجية9.

لقد غير ظهور تسلسل الجينوم الكامل (WGS) توصيف مسببات الأمراض من خلال تمكين التنبؤ السريع والدقة عالية بالنمطالمصلي 10,11,12. تم تطوير عدة أدوات في السيليكو، بما في ذلك تصنيف تسلسل متعدد المواقع (MLST)، SeqSero13، SeqSero214، SeqSero2S15، ومورد تصنيف السالمونيلا في السيليكو (SISTR)7,15. بينما يقدم MLST تتبع وبائي موحدوطويل الأمد 16، يسمح SeqSero2 و SeqSero2S بتحليل مباشر من القراءات الخام ويسهل الفحص عالي الإنتاجية للأنماط المصلية الشائعة14,15. وعلى العكس، يتطلب SISTR جينومات مجمعة لكنه يدمج اكتشاف جينات المستضد مع تصنيف تسلسل الجينوم الأساسي متعدد المواقع (cgMLST)، مما يوفر حلا شاملا لتحقيقات التفشي17. بينما يتم اعتماد توصيف السالمونيلا القائم على WGS بشكل متزايد كدليل أساسي في الأبحاث 16,18,19، لا يزال تطبيقه في المراقبة واسعة النطاق محدودا، وهو فجوة تعزى جزئيا إلى اعتبارات عملية غير معالجة تؤثر على ملاءمة الطريقة. كشف مسح عالمي أن 8٪ فقط من المختبرات المشاركة تستخدم WGS للمراقبة الروتينية، مع تعقيد التحليل كعائق رئيسي20. على سبيل المثال، يعتمد التنبؤ الموثوق بالنمط المصلي على عمق تسلسل كاف (عادة >75× من حيث الفعالية من حيث التكلفة، ويفضل ~200× للتحليل عالي الجودة) وتجميعات جينوم عالية الجودة (N50 من الكونتيغات > 30 كيلوبت كحد أدنى فعال من حيث التكلفة، ويفضل >100 كيلوبت لكل حركة)، خاصة للأدوات المعتمدة على التجميع مثل SISTR 21,22,23. بالإضافة إلى ذلك، يجب أن يتوافق اختيار الأدوات مع موارد وخبرات المختبر الحاسوبية: توفر الأدوات مفتوحة المصدر مثل SeqSero2S بدائل أسرع للفحص السريع من خلال تحليل القراءات الخام وتجاوز التجميع15 المكثف حسابيا، بينما قد تواجه المختبرات ذات القدرة المحدودة على المعلوماتية الحيوية صعوبات في تحليل البيانات وتخزينها. وبالتالي، لا توجد بيانات كافية لتحديد ما إذا كان يمكن تقليل الاختبارات المصلية في المراقبة واسعة النطاق20,24، مما يبرز الحاجة إلى أساليب تكيفية للموارد. ومن الجدير بالذكر أنه بعد جائحة كوفيد-19، هناك قدر كبير من أجهزة التسلسل الخاملة وqPCR عبر مستويات مختلفة من مؤسسات الرعاية الصحية، مما يشكل فرصة لإعادة توظيف هذه القدرة في المراقبة الجينومية.

لسد هذه الفجوة، أجرينا تقييما متعدد المراكز لأدوات التصنيف المصلي الجينومية المذكورة أعلاه باستخدام 315 عزلة سالمونيلا جمعت من الغذاء والمصادر البشرية في جنوب غرب الصين25,26. استنادا إلى هذه النتائج، طورنا سير عمل طبقي يأخذ في الاعتبار موارد مختبرية واحتياجات المراقبة المتغيرة، موفرا معايير واضحة لاختيار الأدوات في سياقات مختلفة. يعطي هذا الإطار الأولوية ل SeqSero2S للفحص السريع، وSISTR مع cgMLST في تحقيقات التفشي، مما يسهل تبني الأساليب الجينومية ويقلل الاعتماد على طرق التصنيف المصلي التقليدية. هنا، نصف كل خطوة من خطوات سير العمل بالتفصيل، بما في ذلك تحديد العزل، والتسلسل، وتحليل البيانات، ومعايير اختيار أدوات التنبؤ في سياقات مراقبة مختلفة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تم جمع ومعالجة عينات البراز البشرية بموافقة لجنة الأخلاقيات في مستشفى غرب الصين الرابع، جامعة سيتشوان (رقم البروتوكول: HXSY-EC-2022093)، وفقا لإعلان هلسنكي والممارسات السريرية الجيدة. تم التنازل عن الموافقة المستنيرة وفقا للوائح الصحة العامة الوطنية.

ملاحظة: يجب إجراء جميع الإجراءات المتعلقة بزراعة السالمونيلا الحية وعينات البراز البشري في مختبر للسلامة البيولوجية المستوى 2 (BSL-2) بواسطة أفراد مدربين على الممارسات الميكروبيولوجية القياسية وإجراءات السلامة البيولوجية. ارتد معدات الحماية الشخصية المناسبة (PPE) في جميع الأوقات، بما في ذلك معطف المختبر، والقفازات، ونظارات السلامة. قم بتعقيم وتغيير القفازات الملوثة بانتظام. قم بتطهير جميع أسطح العمل قبل وبعد التجارب باستخدام مطهر مناسب (مثل 70٪ إيثانول، 1٪ هيبوكلوريت الصوديوم). قم بتطهير جميع النفايات السائلة والصلبة التي تحتوي على مواد بيولوجية عن طريق التعقيم (مثلا عند 121 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 30 دقيقة) قبل التخلص منها. تجنب ظهور الهباء الجوي والرذاذ. قم بجميع الإجراءات التي قد تنتج هباء جذوي (مثل الطرد المركزي، الهزاز الشديد) داخل خزانة سلامة بيولوجية معتمدة.

1. جمع عينات الطعام وتحديد السلالات

  1. اجمع عينات الطعام من أسواق التجزئة أو منشآت المعالجة. عزل السالمونيلا من عينات الغذاء وفقا للمعيار الوطني لسلامة الغذاء GB 4789.4 وبروتوكولات السرية لبرنامج مراقبة الأمراض المنقولة عن طريق الغذاء.
  2. الإثراء المسبق:
    1. زن بالضبط 25 جراما من كل عينة طعام. أضف 225 مل من ماء البيبتون المخزن (BPW) إلى العينة (نسبة تخفيف 1:10) والدوامة لمدة 30 ثانية لضمان التجانس الكامل والغمر.
    2. حضن العينة في BPW عند 36°C ± 1°C لمدة 8-18 ساعة في حاضنة اهتزازة مضبوطة على 150 دورة في الدقيقة.
      ملاحظة: التخصيب المسبق في المرق غير الانتقائي يزيد بشكل كبير من حمل الممرض. تعامل مع جميع المواد التالية (الحاويات، الماصات، إلخ) على أنها شديدة العدوى.
  3. الإثراء الانتقائي: بعد التخصيب المسبق، نقل 1 مل من العينة إلى مرق التتراثيونات (TTB). حضن جهاز TTB عند 42 درجة مئوية لمدة 18-24 ساعة دون هز.
  4. العزل: بعد الحضانة، قم بوضع الثقافة المخصبة على صفائح الأجار الانتقائية التالية: أجار الهكتون المعوي (HE)، أجار زيلوز ليسين ديوكسيكولات (XLD)، وسالمونيلا الكرومجار. حضن الصفائح على حرارة 36 درجة مئوية لمدة 18-24 ساعة.
    ملاحظة: عند وضع الألواح الخطوطية، كن حذرا لتجنب تكوين رذاذ أو تلوث متبادل. في الأجار عالي المستوى، تظهر مستعمرات السالمونيلا المفترضة عادة بلون أزرق مخضر إلى أزرق، مع أو بدون مراكز سوداء. قد يتخذ الأجار المحيط لونا أخضر مشابها. في أجار XLD، تكون مستعمرات السالمونيلا المفترضة عادة حمراء مع مراكز سوداء. في CHROMagar، تتميز مستعمرات السالمونيلا المفترضة بلونها من الأرجواني إلى البنفسجي، كما يحدده المصنع. على كل صفيحة انتقائية، توقع مستعمرات معزولة جيدا بعد 18-24 ساعة من الحضانة. قد تحتاج الصفائح المتضخمة (>300 مستعمرة) إلى تخفيف وإعادة تصفيف الخطوط.
  5. التعريف: افحص الألواح بحثا عن مستعمرات سالمونيلا مشتبه بها. تحديد السلالات المشتبه بها باستخدام نظام تعريف آلي باستخدام بطاقة تعريف سالبة الجرام (GN)، باتباع تعليمات الشركة المصنعة للتحليل.
    ملاحظة: تأكد من أن أرقام الدفعات في بطاقات GN صالحة وضمن تاريخ الانتهاء.
    1. تحضير تعليق بكتيري من مستعمرة نقية إلى العكارة المحددة (0.50-0.63 معيار ماكفارلاند) باستخدام محلول ملحي بنسبة 0.45٪.
    2. قم بتحميل نظام التعليق في بطاقة GN وقم بالاختبار. تأكد من أن النظام مضبوط على حضانة البطاقة تلقائيا عند 35.0 درجة مئوية ± 2.0 درجة مئوية ومراقبة التفاعلات الكيميائية الحيوية لمدة تصل إلى 8 ساعات.
    3. اقبل نتيجة سالمونيلا أنتريكا نوع إنتريكا باحتمال ≥ 95٪ وتقييم ثقة ممتاز .
  6. التصنيف المصلي: اختر مستعمرات فردية من صفيحة السرب بعد الحضانة الليلة عند 37 درجة مئوية. قم بإجراء اختبارات الالتصاق السلايد للكشف عن مستضدات O ومستضدات H. استخدم مجموعات مضادات مصل السالمونيلا المتوفرة تجاريا (انظر جدول المواد) للاختبار.

2. جمع العينات البشرية وتحديد السلالات

ملاحظة: لعزل السالمونيلا من عينات البراز البشري، اتبع بروتوكولات السرية الخاصة ببرنامج مراقبة الأمراض المنقولة عن طريق الغذاء.

  1. الجمع: جمع حوالي 2 جرام من عينات البراز البشري الطازجة. ضع عينات البراز في حاويات نظيفة وجافة وواسعة الفم. نقل عينات البراز إلى المختبر خلال ساعة واحدة باستخدام صناديق نقل معزولة للحفاظ على سلامة العينة.
    تحذير: قد تحتوي عينات البراز البشري على عدة مسببات أمراض تتجاوز السالمونيلا. تعامل مع جميع العينات باعتبارها معدية محتملة واتبع الاحتياطات القياسية للتعامل مع المواد البيولوجية الخطرة.
  2. التلقيح: تلقيح عينات البراز المجمعة مباشرة على صفائح الأجار الانتقائية التالية: سالمونيلا كروماغار، أجار السالمونيلا-XLD، وأجار شيجيلا (SS).
    ملاحظة: راجع الخطوة 1.4 للشكل المميز للمستعمرة على سالمونيلا CHROMagar وأجار XLD. في أجار SS، تظهر مستعمرات السالمونيلا المفترضة عادة كأنها عديمة اللون، معتمة، أو بلون بني مع مراكز سوداء. الأجار نفسه يبقى دون تغيير نسبي.
  3. التعريف: تحديد مستعمرات السالمونيلا المشتبه بها كما هو موضح في الخطوة 1.5.
  4. التصنيف المصلي: قم بإجراء التصنيف المصلي عن طريق التراكم المنزلق كما هو موضح في الخطوة 1.6.

3. تحضير المكتبة وتسلسل الجينوم الكامل

  1. الزراعة البكتيرية: سالمونيلا متسلسلة على أجار LB، حضانة عند 37 درجة مئوية لمدة 12 ساعة. اختر مستعمرة معينة، وقم بتلقيح في مرق 200 مل رطل، ورزه بسرعة 150 دورة في الدقيقة (37 درجة مئوية، 12 ساعة). الطرد المركزي بقوة 12,000 × جرام لمدة 10 دقائق لجمع الخلايا.
    ملاحظة: قم بجميع خطوات الطرد المركزي باستخدام أقراص محكمة الإغلاق أو أكواب أمان لمنع تكوين الهباء الجوي.
  2. استخراج الحمض النووي: استخلاص الحمض النووي الجينومي باستخدام مجموعة استخراج تجارية (انظر جدول المواد)، وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
    تحذير: المواد المستخدمة في مجموعات استخراج الحمض النووي التجارية (مثل مخازل التحلل، البروتيناز K) قد تكون ضارة إذا تم استنشاقها أو عند ملامستها للجلد والعينين. قم بالاستخراج باستخدام غطاء بخار أو خزانة أمان بيولوجية إذا تم استخدام كواشف متطايرة، وارتد معدات الحماية الشخصية المناسبة.
  3. تقييم جودة الحمض النووي: نقية الحمض النووي الجيني وقياسه باستخدام جهاز قياس الفلورومتر باستخدام مجموعة اختبار عالية الحساسية dsDNA. تحقق من سلامة الحمض النووي عن طريق الرحلان الكهربائي على جل أغاروز بنسبة 1٪ عند 100 فولت لمدة 45 دقيقة؛ يظهر الحمض النووي عالي الجودة كشريط واحد مضغوط >20 كيلو بيت مع حد أدنى من التلطيخ27.
    ملاحظة: (خطوة حرجة) يعد الحمض النووي الجينومي عالي الجودة وعالي الوزن الجزيئي (بنسبة A260/A280 ~1.8-2.0) ضروريا لنجاح إعداد المكتبة والتسلسل الجيني.
    تحذير: أصباغ تلوين الأحماض النووية المستخدمة في الرحلان الكهربائي بجل الأجاروز (مثل GelRed، Ethidium Bromide) هي صبغات طفرة. ارتد دائما قفازات عند التعامل مع الجل ومحاليل التلوين، وتخلص منها وفقا للوائح النفايات الخطرة المؤسسية.
  4. تجزئة الحمض النووي: تجزئة حوالي 150 نانوغرام من الحمض النووي الجينومي المؤهل إلى متوسط حجم ~350 بيسون باستخدام نظام موجات فوق صوتية مركزة وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
  5. قم ببناء مكتبة التسلسل من شظايا الحمض النووي المقطوعة باستخدام مجموعة تحضير مكتبة تجارية (انظر جدول المواد). قم بإصلاح الطرف وفسفرة 5 أقدام لقطع الحمض النووي المقطوعة. ثم أضف قاعدة واحدة من حرف 'A' إلى الأطراف الثلاثة، وربطها محولات التسلسل المفهرسة.
  6. قم بتضخيم وإثراء شظايا الحمض النووي المرتبطة بالمحول عبر برنامج PCR محدود الدورة كما هو محدد في المجموعة.
  7. تأهيل وقياس المكتبة النهائية باستخدام طرق مثل الفلورومترية والتحليل الكهربائي الشعري.
  8. إجراء تسلسل مزدوج الأطراف (2 × 150 bp) على منصة تسلسل وفقا لإجراءات التشغيل القياسية.

4. تحليل البيانات

  1. التحكم في جودة بيانات التسلسل الخام: قم بإجراء مراقبة جودة أولية على ملفات FASTQ الخام باستخدام fastp (الإصدار 0.23.0) مع المعلمات الافتراضية. الهدف هو إزالة تسلسلات المحولات والقراءات منخفضة الجودة، وبالتالي توليد بيانات FASTQ نظيفة للتحليل اللاحق.
  2. قم بتجميع القراءات عالية الجودة والمفلترة في مسودات جينومية باستخدام SPAdes (الإصدار 3.15.0) مع خيار دقيق لتقليل عدم التطابق وتقليل ال indels26.
  3. استخدم تسلسلات الجينوم (ملفات FASTQ / FASTA) كمدخل لتوقع النمط المصلي المختلف.
    1. بالنسبة ل MLST، يستورد ملف FASTQ إلى برنامج BioNumerics (الإصدار 7.6).
      1. في نافذة استيراد القالب، انقر على تعديل التحليل تحت الخيارات المتقدمة. قم بتعيين سلسلة تحليل البيانات وزخرفة البيانات على [DATA]. تطبيق التعبيرات المنتظمة DATA]_* و [DATA] لتحليل أسماء الملفات. احفظ القالب، اختره، ثم اضغط التالي ثم إنهاء. أكد التقديم في نافذة مهمة الإرسال لرفع البيانات. ستفتح أداة CEStoreUploader تلقائيا لنقل بيانات WGS الخام إلى محرك الحساب.
      2. اختر إدخال الجينوم بعد الرفع. انتقل إلى أدوات WGS واختر "TraNetGenotype" للتنبؤ التلقائي ب ST. في مربع حوار TraNetGenotype ، اختر سالمونيلا كنوع السلالة، واختر تحليل النمط المصلي، وتحليل الضراوة، وتحليل الحساسية المضادة للميكروبات، واضغط على نعم.
    2. ل SISTR (الإصدار 1.1.3؛ https://github.com/phac-nml/sistr_cmd؛ المعلمات: جميع المعاملات هي الافتراضية)، افتح طرفية وانتقل إلى الدليل الذي يحتوي على ملف الجينوم المجمع assembly.fasta.
      1. شغل الأمر التالي لتنفيذ التنبؤ بالسيروفار وتوليد تقرير شامل بصيغة CSV: sistr --qc --alleles-output allele-results.json --cgmlst-profiles cgmlst-profiles.csv -f tab -o sistr-output.tab -i assembly.fasta. هذا الأمر يولد تقريرا يحتوي على السيروفار المتوقع.
        ملاحظة: -qc: يجري فحوصات مراقبة الجودة على التجميع. -i assembly.fasta: يحدد ملف FASTA المدخل. -f csv: يعرف صيغة الإخراج على أنها CSV. -o sistr_results: يحدد الاسم الأساسي لملف الإخراج (مثل sistr_results.csv). -p 4: يستخدم 4 خيوط معالج للتحليل لتسريع الحساب. --alleles-output: يحفظ تسلسلات الأليل والمعلومات في ملف JSON. --cgmlst-profiles: يصدر ملفات تعريف الأليلات cgMLST إلى ملف CSV.
    3. ل SeqSero (الإصدار 1.0؛ https://github.com/denglab/SeqSero؛ المعلمات: جميع المعلمات افتراضية)، انتقل إلى الدليل الذي يحتوي على ملف بيانات الإدخال. شغل الأمر التالي مع المعلمات الافتراضية للتحليل: بايثون SeqSero.py -m 4 -i assembly.fasta. تنشئ الأداة مجلد إخراج يحتوي على Seqsero_result.txt الملف مع النمط المصلي المتوقع.
      ملاحظة: -m 4 يحدد نوع الإدخال كتجميع جينوم. -i يحدد ملف FASTA المدخل.
    4. بالنسبة ل SeqSero2 (الإصدار 1.3.1؛ https://github.com/denglab/SeqSero2؛ المعاملات: جميع المعاملات هي الوضع الافتراضي). شغل الأمر التالي: python3 SeqSero2_package.py -m k -t 4 -i assembly.fasta. تقوم الأداة بإخراج النمط المصلي المتوقع مباشرة إلى شاشة الطرفية عند الانتهاء. يوفر الناتج النمط المصلي المتوقع.
      ملاحظة: -m k: يحدد سير العمل القائم على k-mer للتنبؤ السريع بالنمط المصلي باستخدام k-mers فريدة من محددات النمط المصلي. -t 4: يشير إلى نوع الإدخال كتسلسلات مجمعة.
    5. بالنسبة ل SeqSero2S (الإصدار 1.1.1؛ https://github.com/denglab/SeqSero2S؛ المعلمات: جميع المعلمات افتراضية): شغلها باستخدام السكربت المقدم: python SeqSero2S.py -m k -t 4 -i assembly.fasta. يوفر الناتج النمط المصلي المتوقع.
      ملاحظة: -m k يتيح التحليل القائم على k-mer للقراءات الخام أو تجمعات الجينوم. -t 4 يحدد إدخال التسلسل المجمع.

5. المعايير الحرجة والاعتبارات العملية

ملاحظة: الاعتبارات التالية ضرورية لنجاح تنفيذ هذا السير الجيني، خاصة في البيئات ذات الموارد المحدودة.

  1. تحقق من أن بيانات التسلسل الخام تحقق عمق كاف من التغطية. عمق تسلسل يقارب 100x عادة ما يكون كافيا للتحليل عالي الجودة.
    ملاحظة: بالنسبة للمختبرات التي تعطي الأولوية للفعالية من حيث التكلفة، يوصى بوجود عمق تسلسل أدنى يبلغ 75 ضعف كعتبة عملية أقل للتنبؤ الموثوق بنمط المصل باستخدام MLST أو SeqSero221.
  2. تأكد من أن جودة القراءات الخام عالية، مع درجة Q30 (دقة الاستدعاء الأساسية 99.9٪) عادة فوق 90٪.
  3. قيم جودة تجميع الجينوم الجديد قبل المضي قدما في أدوات التنبؤ بالنمط المصلي التي تتطلب تجميعات مجمعة. استخدم إحصائية N50 كمقياس رئيسي.
    ملاحظة: يوصى ب N50 بقوة لا تقل عن 100 كيلوبت22، بينما يجب اعتبار N50 أكبر من 30 كيلوبت هو الحد الأدنى للتحليلالموثوق 23.
  4. تحقق من اكتمال التجميع بضمان معدل رسم خرائط قراءة لا يقل عن ≥98٪ عند إعادة تعيين القراءات المصفاة إلى الجينوم المجمع.

6. بروتوكول التنبؤ بنمط المصل الموصى به لمراقبة السالمونيلا عالية الإنتاجية

ملاحظة: اختر طرق التنبؤ بنمط المصل بناء على سياق المراقبة، والدقة المطلوبة، والموارد المخبرية المتاحة. لمراقبة السالمونيلا عالية الإنتاجية، اتبع البروتوكول أدناه:

  1. التعريف الأولي: إجراء فحص أولي وفقا لمعيار GB 4789.4 لتأكيد أن العزلات هي أنواع السالمونيلا .
    ملاحظة: في هذه المرحلة، لا حاجة لتحديد النمط المصلي المحدد للمعزولات.
  2. المراقبة الروتينية (وضع المعالجة العالية): للمراقبة الروتينية، وبما أن BioNumerics لم يعد محدثا، استخدم MLST28 أو SeqSero2S أو منصات تحليل جينوم موثوقة وسهلة الاستخدام أخرى تتلقى دعما فنيا وتحديثات مستمرة.
    ملاحظة: بالنسبة ل MLST: يقدم نظام الجينات السبعة موحدا ومحمولا ومفيدا من الناحية التطورية (نوع التسلسل، ST) وهو مثالي لعلم الأوبئة طويل الأمد ومقارنة السلالات العالمية. بساطته تضمن تحليلا سريعا وعبء حسابي بسيط للغاية. بالنسبة ل SeqSero2S: يوفر ميزة مزدوجة تتمثل في التنبؤ السريع بالنمط المصلي ونتائج MLST المتكاملة في جولة واحدة. يمكنه تحليل قراءات التسلسل الخام مباشرة، متجاوزا تجميع الجينوم لتوفير الوقت والموارد. حتى مع بيانات FASTA المجمعة، فهي أسرع من أدوات مثل SISTR، حيث تقوم بتنبؤ النمط المصلي بشكل مستقل دون الاعتماد على التحليل الحاسوبي.
  3. الفحص السريع (الإعدادات الحساسة للوقت): للحصول على نتائج سريعة أو في مختبرات ذات قدرة حسابية محدودة، استخدم SeqSero2S للتنبؤ الأولي بالنمط المصلي.
    ملاحظة: عند تنفيذ توقعات SeqSero2S، ينصح أساسا بتفسير "I_4,[5],12:i:-" على أنها سالمونيلا تيفيموريوم.
  4. التحقيق في التفشي (وضع الدقة العالية): لتتبع التفشي الذي يتطلب دقة عالية، استخدم SISTR، الذي يستخدم cgMLST لدعم التنبؤ بالمصل وتوفير تحليل عنقودي عالي الدقة لتتبع المصادر.
  5. تأكيد مراقبة الجودة والنتائج غير المتسقة:
    1. بالنسبة لأنواع التسلسل الشائعة، قم بإجراء تحقق عشوائي. بالنسبة للأنواع غير الشائعة، استخدم نسبة تحقق تبلغ 20٪. في حالات نتائج التصنيف المصلي غير المتسقة، يمكن إحالة العزلات إلى مختبر أعلى أو مختبر مرجعي للحصول على نتيجة نهائية.
    2. للتحليل التأكيدي، استخدم عدة طرق مثبتة منها: التحليل الجينومي المتكرر باستخدام أداتين مختلفتين على الأقل للتنبؤ بالسيلكو ؛ يتكرر في التنبؤ بالسيلكو باستخدام أداتين مختلفتين على الأقل؛ التوثيق الوراثي باستخدام طرق عالية الدقة قائمة على WGS (مثل cgMLST أو تحليل SNP بالجينوم الكامل)29.
    3. قم بتعيين النمط المصلي النهائي بناء على الإجماع من هذا الدليل الشامل.
      ملاحظة: نسبة التحقق الموصى بها 20٪ للأنماط المصلية غير الشائعة تعتمد على ملاحظة أن أدوات الجينوم تحافظ على توافق عالي (93.3٪ ل SISTR مقابل MLST، 95.0٪ ل SISTR مقابل SeqSero2S) حتى بين الأنماط المصلية غير الشائعة (الجدول 1). هذا العتبة فعالة من حيث التكلفة وتوفر هامش أمان كاف لاكتشاف انخفاض تكرار الفروقات بين أدوات الجينوم في المراقبة الروتينية.

7. التحليل الإحصائي

  1. قم بتحليل البيانات باستخدام برنامج R (الإصدار 4.1.2).
  2. قدم المتغيرات التصنيفية كترددات مع نسب مئوية.
  3. قارن المجموعات باستخدام اختبارات χ2 للبيانات التصنيفية30، واعتبر قيمة P <0.05 ذات دلالة إحصائية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

تم التحقق من صحة البروتوكول باستخدام 315 عزلة سالمونيلا من جنوب غرب الصين، حيث خدمت 213 عزلة (2/3) كمجموعة تدريب لمقارنة خمس طرق تنبؤ بنمط مصل تعتمد على WGS (MLST، SISTR، SeqSero، SeqSero2، وSeqSero2S) مع نتائج التصنيف المصلي التقليدية، بينما تم استخدام 102 عزلة (ثلث) المتبقية كمجموعة تحقق لتقييم أداء MLST وSISTR وSeqSero2S.

تحليل مجموعة التدريب (n = 213)
تقييم قابلية التكرار: أظهر التصنيف المصلي التقليدي توافقا م...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يظهر هذا التقييم واسع النطاق، الذي يشمل 315 عزلة سالمونيلا من جنوب غرب الصين، قابلية تكرار متفوقة لطرق التصنيف المصلي المعتمدة على WGS مقارنة بالطرق التقليدية (84.1٪ مقابل 62.9٪ تغطية، P<0.001). تؤكد نتائجنا وجود سير عمل جينومي شامل حيث تؤثر الخطوات الأولية الحرجة لتحضير العينات ومراقبة جودة الحمض النووي (الأقسام 1-3) بشكل مباشر على موثوقية المراحل التالية. يركز البروتوكول على تجميعات جينوم عالية الجودة (ويفضل >100 كيلوبت في البوت) للأدوات المعتمدة على التجميع (الأقسام 4-5). تسم...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

المؤلفون لا يفرضون أي تضارب مصالح.

شكر وتقدير

وقد تم دعم هذا العمل بمنح من تمويل مكتب العلوم والتكنولوجيا التبت وسيتشوان (XZ202301ZY0049G، 2024NSFSC0563 إلى H.Z. و2024NSFSC0033 إلى X.P.)، وبرنامج العلوم والتكنولوجيا في سيتشوان (2024JDRC0032 إلى Y.X.)، ومشروع معهد الصحة الجديدة للإنتاجية (HN240302C إلى H.Z.)، ومشروع تنشيط تخصصات علوم مختبرات الصحة العامة (2023SY-04 إلى H.Z.)، مدرسة غرب الصين للصحة العامة/مستشفى غرب الصين الرابع، جامعة سيتشوان.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
BioNumerics (الإصدار 7.6)الرياضيات التطبيقيةhttps://bionumerics.software.informer.com/7.6/التنبؤ ب MLST/النمط المصلي/التحليل التطوري
سالمونيلا كروماجاربيكتون، ديكنسون وشركاه214983وسط كروموجيني للسالمونيلا الانتقائي
فاستب (الإصدار 0.23.0)مفتوح المصدرhttps://github.com/OpenGene/fastpاقرأ مراقبة الجودة
نظام التسلسل Illumina NovaSeq 6000إلومينا20012850منصة تسلسل الجينوم الكامل
M220 الموكب فوق الصوتيات المركزكوفاريس500295قص الحمض النووي
مجموعة الحمض النووي السريع من Magbeads للتربةMP BiomedicalsMP116560200مجموعة استخراج الحمض النووي الجيني
مايكروسوفت إكسل 2016مايكروسوفتKB5002794إدارة البيانات
مجموعة NEXTFLEX لتسلسل الحمض النووي السريعالتجديد50-255-1124تحضير مكتبة التسلسل
فلورومتر الكيوبت 2.0ثيرمو فيشر العلميس32866قياس الحمض النووي
مجموعة اختبار عالية الحساسية لديناموعة dsDNA الكيوبيةثيرمو فيشر العلميس32851قياس الحمض النووي
R (الإصدار 4.1.2)مؤسسة Rhttps://www.r-project.org/الحوسبة الإحصائية
مجموعة مضاد مصل السالمونيلامعهد ستاتنز للسيروم60898كشف مستضدات O/H
سيكسيرومفتوح المصدرhttps://github.com/denglab/SeqSeroالتنبؤ بنمط المصل
سيكسيرو2مفتوح المصدرhttps://github.com/denglab/SeqSero2التنبؤ بنمط المصل
SeqSero2Sمفتوح المصدرhttps://github.com/denglab/SeqSero2sالتنبؤ بنمط المصل
SISTRمفتوح المصدرhttps://github.com/phac-nml/sistr_cmdالتنبؤ بنمط المصل
SPAdes (الإصدار 3.15.0)مفتوح المصدرhttps://github.com/ablab/spadesتجميع الجينوم
سوارم آجاربكالوريوس العلوم الحيوية211519يستخدم في الحضانة المصلية
جهاز الفلورومتر TBS-380تيرنر بيوسيستمزرقم التعريف 3800-003قياس الحمض النووي
نظام VITEK 2 المدمجBioMé ريو95061-768نظام التعرف الآلي على الميكروبات

المراجع

  1. GBD 2017 Non-Typhoidal Salmonella Invasive Disease Collaborators. The global burden of non-typhoidal Salmonella invasive disease: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2017. Lancet Infect Dis. 19 (12), 1312-1324 (2019).
  2. Selim, S. A. A comprehensive review of antibiotic susceptibility patterns in strains isolated from food. J Pure Appl Microbio. 19 (2), 818-833 (2025).
  3. Shen, Y., et al. Genomic investigation of Salmonella enterica serovar Welikade from a pediatric diarrhea case first time in Shanghai, China. BMC Genomics. 25 (1), 604(2024).
  4. Pulford, C. V., et al. Global diversity and evolution of Salmonella enterica serovar Panama: a genomic epidemiology study. Lancet Microbe. 6 (9), 101150(2025).
  5. Hong, H., et al. Genetic characterization and in silico serotyping of 62 Salmonella enterica isolated from Korean poultry operations. BMC Genomics. 26 (1), 166(2025).
  6. Kitchens, S. R., Wang, C., Price, S. B. Bridging classical methodologies in Salmonella investigation with modern technologies: a comprehensive review. Microorganisms. 12 (11), 2249(2024).
  7. Uelze, L., et al. Performance and accuracy of four open-source tools for in silico serotyping of Salmonella spp. based on whole-genome short-read sequencing data. Appl Environ Microbiol. 86 (5), e02265-e02319 (2020).
  8. Wang, B. X., et al. High-throughput fitness experiments reveal specific vulnerabilities of human-adapted Salmonella during stress and infection. Nat Genet. 56 (6), 1288-1299 (2024).
  9. Kumar, S., Kumar, Y., Kumar, G., Kumar, G., Kasana, D. A highly drug-resistant Salmonella enterica serovar Weltevreden of human origin from India and detection of its virulence factors. Indian J Microbiol. 65 (3), 1384-1394 (2025).
  10. Lu, Y., et al. Advances in whole genome sequencing: methods, tools, and applications in population genomics. Int J Mol Sci. 26 (1), 372(2025).
  11. Mukherjee, S., et al. Increasing frequencies of antibiotic resistant non-typhoidal Salmonella infections in Michigan and risk factors for disease. Front Med (Lausanne). 6, 250(2019).
  12. Yachison, C. A., et al. The validation and implications of using whole genome sequencing as a replacement for traditional serotyping for a national Salmonella reference laboratory. Front Microbiol. 8, 1044(2017).
  13. Zhang, S., et al. Salmonella serotype determination utilizing high-throughput genome sequencing data. J Clin Microbiol. 53 (5), 1685-1692 (2015).
  14. Zhang, S., et al. SeqSero2: rapid and improved Salmonella serotype determination using whole-genome sequencing data. Appl Environ Microbiol. 85 (23), e01746-e01819 (2019).
  15. Deng, X., et al. Salmonella serotypes in the genomic era: simplified Salmonella serotype interpretation from DNA sequence data. Appl Environ Microbiol. 91 (3), e0260024(2025).
  16. Cui, Q., et al. Characterization and implications of the regionally prevalent ST8333 strains of Salmonella enterica serotype 4,[5],12:i: - China, 2017-2023. China CDC Wkly. 6 (47), 1232-1235 (2024).
  17. Yoshida, C. E., et al. The Salmonella In Silico Typing Resource (SISTR): an open web-accessible tool for rapidly typing and subtyping draft Salmonella genome assemblies. PLoS One. 11 (1), e0147101(2016).
  18. Ikeuchi, S., et al. Molecular epidemiological analysis of Salmonella Schwarzengrund isolated in Japan by newly developed multi-locus variable-number tandem repeat analysis method. Lwt. 207, 116593(2024).
  19. Kong, X., et al. Emergence of extensively drug-resistant Salmonella Kentucky ST198 in Southwest China. J Glob Antimicrob Resist. 43, 264-270 (2025).
  20. Davedow, T., et al. PulseNet international survey on the implementation of whole genome sequencing in low and middle-income countries for foodborne disease surveillance. Foodborne Pathog Dis. 19 (5), 332-340 (2022).
  21. Xian, Z., et al. Subtyping evaluation of Salmonella Enteritidis using single nucleotide polymorphism and core genome multilocus sequence typing with nanopore reads. Appl Environ Microbiol. 88 (15), e0078522(2022).
  22. Liu, C. C., Hsiao, W. W. L. Machine learning reveals the dynamic importance of accessory sequences for Salmonella outbreak clustering. mBio. 16 (3), e0265024(2025).
  23. Fourteenth external quality assessment for Salmonella typing. , European Centre for Disease Prevention and Control. ECDC, Stockholm. (2025).
  24. Gomes, E., et al. Advances in whole genome sequencing for foodborne pathogens: implications for clinical infectious disease surveillance and public health. Front Cell Infect Microbiol. 15, 1593219(2025).
  25. Zhou, L., et al. Antimicrobial resistance and genomic investigation of Salmonella isolated from retail foods in Guizhou, China. Front Microbiol. 15, 1345045(2024).
  26. Zuo, H., et al. Comparative genomic and antimicrobial resistance profiles of Salmonella strains isolated from pork and human sources in Sichuan, China. Front Microbiol. 16, 1515576(2025).
  27. Feehan, J. M., et al. Purification of high molecular weight genomic DNA from powdery mildew for long-read sequencing. J Vis Exp. (121), e55463(2017).
  28. Jolley, K. A., Bray, J. E., Maiden, M. C. J. Open-access bacterial population genomics: BIGSdb software, the PubMLST.org website and their applications. Wellcome Open Res. 3, 124(2018).
  29. Yang, L., et al. Phylogeny and divergence of the 100 most common Salmonella serovars available in the NCBI Pathogen Detection database. Front Microbiol. 16, 1547190(2025).
  30. Zuo, H., et al. High-altitude exposure decreases bone mineral density and its relationship with gut microbiota: results from the China multi-ethnic cohort (CMEC) study. Environ Res. 215 (Pt 2), 114206(2022).
  31. Arrieta-Gisasola, A., et al. Genotyping study of Salmonella 4,[5],12:i:- monophasic variant of serovar Typhimurium and characterization of the second-phase flagellar deletion by whole genome sequencing. Microorganisms. 8 (12), 2049(2020).
  32. De Sousa Violante, M., et al. Genomic diversity of Salmonella Typhimurium and its monophasic variant in pig and pork production in France. Microbiol Spectr. 12 (12), e0052624(2024).
  33. Kong, X., et al. Phenotypic and genotypic characterization of Salmonella Enteritidis isolated from two consecutive food-poisoning outbreaks in Sichuan, China. J Food Safety. 43 (1), e13015(2022).
  34. Hong, W., et al. Integrating serotyping, MLST, and phenotypic data: decoding the evolutionary drivers of Salmonella pathogenicity and drug resistance. Appl Environ Microbiol. 91 (10), e0151125(2025).
  35. Lin, A., et al. Targeted next-generation sequencing assay for direct detection and serotyping of Salmonella from enrichment. J Food Prot. 87 (4), 100256(2024).
  36. van den Berg, O. E., et al. Ongoing increase in autochthonous Salmonella Enteritidis infections, the Netherlands, June 2023 to June 2025. Euro Surveill. 30 (30), 2500536(2025).
  37. Li, X., Oladeinde, A., Rothrock, M. Jr, Chung, T. J., Ghazi Al Hakeem, W. Using core genome and machine learning for serovar prediction in Salmonella enterica subspecies I strains. FEMS Microbiol Lett. 372, fnaf040(2025).
  38. Krüger, G. I., et al. Adaptive signatures of emerging Salmonella serotypes in response to stressful conditions in the poultry industry. Lwt. 215, 117188(2025).
  39. Gou, J., et al. Microbial biomarkers and sex-associated gut microbiota characteristics of thyroid cancer. BMC Cancer. 25, 1688(2025).
  40. Meng, J., et al. Medical laboratory data-based models: opportunities, obstacles, and solutions. J Transl Med. 23 (1), 823(2025).
  41. Wu, X., et al. Evaluation of multiplex nanopore sequencing for Salmonella serotype prediction and antimicrobial resistance gene and virulence gene detection. Front Microbiol. 13, 1073057(2022).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة