مقالة منهجية

إنتاج فعال لخلايا T لمستقبلات المستضدات الكيميرية (CAR) التي تتجاوز الجينات المحولة 10 كيلو بيت باستخدام ناقلات الفيروسات اللينتية

DOI:

10.3791/69121

⸱

يناير 23, 2026

 ,  ,  , 
1Center for Cellular Immunotherapies, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, 2Department of Pathology and Laboratory Medicine, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, 3Parker Institute for Cancer Immunotherapy, University of Pennsylvania

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا، نقدم سير عمل محسن لإنتاج خلايا تائية لمستقبلات المستضدات الكيميرية (CAR) ذات جينات محولة كبيرة تتجاوز 10 كيلوبايت باستخدام ناقلات فيروسات عدسية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

برز هندسة مستقبلات متعددة في خلايا تائية لمستقبلات المستضدات الكيميرية (CAR) كاستراتيجية قوية لمنع الانتكاس السلبي للمستضد وتقليل السمية الورمية المستهدفة أو غير المعتادة. ومع ذلك، لا يزال تصنيع خلايا CAR T متعددة المستقبلات تحديا، حيث أن زيادة حجم الجينات المعدلة للفيروسات يقلل بشكل كبير من معدلات العدوى الفيروسية ومعدلات نقل الخلايا التائية. تعتمد سير العمل الحالي في الإنتاج غالبا على فرز الخلايا لإثراء الخلايا التائية المحولة من الإنتاجات منخفضة الإنتاجية. ومع ذلك، فإن تقنيات فرز الخلايا لا تزيد من العدد المطلق لخلايا CAR T وتضيف مزيدا من التعقيد إلى عملية التصنيع المعقدة بالفعل. وبالتالي، تعيق هذه القيود الترجمة السريرية لخلايا CAR T متعددة المستقبلات وتقيد تطوير العلاجات المناعية من الجيل التالي.

هنا، نقدم سير عمل إنتاج مفصل خطوة بخطوة محسن لتوليد خلايا CAR T ذات جينات لينتيفيروسية كبيرة. باستخدام هذا السير العملي، نظهر زيادة تعتمد على الحجم في كفاءة النقل عبر مجموعة من أحجام الجينات المنقولة، مع ملاحظة أكبر تحسن يصل إلى 14.8 ضعف لناقل فيروسي عدسي بقوة 10.1 كيلوبايت. ومن المهم أن سير العمل يدعم توسع الخلايا التائية بشكل قوي ويلغي الحاجة إلى فرز الخلايا. من خلال تجاوز القيود الحالية في حجم الفيروس في نقل جينات الفيروس، يمكن هذا السير من توليد خلايا CAR T متعددة المستقبلات بكفاءة، مما يسهل تطوير علاجات مناعة متقدمة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لقد أحدثت خلايا T لمستقبلات المستضدات الكيميرية (CAR) ثورة في مجال العلاج المناعي. ومع ذلك، وعلى الرغم من نجاحهم الملحوظ، لا تزال هناك تحديات حرجة، بما في ذلك تثبيط المناعة التي تتوسط البيئة الدقيقة للورم (TME)، والانتكاسات السلبية للمستضدات، والسمية المباشرة أو غير المرتبطة بالورم 1,2. هندسة خلايا CAR T التي تحتوي على عدة مستقبلات صناعية، مثل CAR المزدوج، أو بنى CAR وTCR المدمجة، أو مستقبلات تبديل السيتوكين، لديها القدرة على تجاوز هذه العقبات 3,4. في سرطانات الدم، يسمح تزويد الخلايا التائية المؤثرة بمستضدين مزدوجين من CAR استهداف مستضدين مختلفين في نفس الوقت، مثل CD19 وCD205، مما يقلل من خطر هروب مستضدات الورم. في الأورام الصلبة، يمكن التخفيف من سمية الأورام المستهدفة أو غير المباشرة عن طريق دمج دوائر مستقبلات نوتش (synNotch) الصناعية التي تمكن التعبير المنطقي لاستهداف CAR وتعزز دقة الاستهداف 6,7,8,9,10,11,12,13 . ومع ذلك، لا يزال إنتاج خلايا CAR T التي تحمل عدة مستقبلات تحديا بسبب الزيادة الأساسية في حجم الجينات المحولة. ناقلات الفيروسات العدسية من الجيل الثالث التي تعطل نفسها من فيروس نقص المناعة البشرية (HIV) النوع 1 هي المعيار الذهبي الحالي لإنتاج خلايا CAR T على نطاق البحث والسرير14. لتوليد خلايا CAR التائية، يتم تصميم ناقلات الفيروسات العدسية باستخدام أشرطة تعبير مخصصة من CAR محاطة بتسلسلات التكرار النهائي الطويل (LTR)، والتي تتوسط الاندماج في جينوم الخلية التائية. أقصى قدرة فعالة على التعبئة (EPC) لناقلات الفيروسات الحالية هي حوالي 9.2 كيلوبازي (kb) من LTR إلى LTR، وهي تتوافق مع حجم الجينوم الأصلي ل HIV-1. مع انخفاض عدادات الفيروسات العدسية شبه لوغاريتميا مع زيادة طول الناقل15، فإن هندسة الجينات الكبيرة ذات المستقبلات المتعددة تقلل بشكل كبير من إنتاج الفيروسات العدسية وتعيق في النهاية تصنيع خلايا CAR T16. بينما يمكن استخدام تقنيات فرز الخلايا، مثل الفرز الخلوي المنشط مغناطيسيا أو بالفلورة (MACS أو FACS على التوالي)، لإثراء خلايا CAR T من إنتاجات منخفضة الإنتاجية، إلا أن هذه الطرق لا تزيد من العدد المطلق لخلايا CAR T وتضيف مزيدا من التعقيد إلى عملية تصنيع معقدة بالفعل. نتيجة لذلك، تظل تحديات تصنيع خلايا CAR T التي تحتوي على جينات لينتيفيروسية كبيرة تشكل عائقا رئيسيا أمام الأبحاث ما قبل السريرية والتطبيق السريري.

لقد أنشأنا مؤخرا سير عمل إنتاج خلايا T في CAR محسن لخلايا T الفعالة التي تحمل جينات لينتيفيروسية كبيرة، مثل نظام synNotch أحادي الناقل (svsNotch)17. هنا، نستعرض المنهجية في بروتوكول خطوة بخطوة لتسهيل اعتمادها الواسع. كدليل على المفهوم، نظهر تحسينات تعتمد على الحجم في كفاءة النقل عبر أحجام الجينات المنقولة للفيروسات العدسية تتراوح من 5.7 كيلوبيت إلى 9.2 كيلو بيت و10.1 كيلوبايت. بشكل عام، يعزز هذا العمل المحسن معدلات النقل بنسبة تصل إلى 14.8 ضعفا، مما يلغي الحاجة إلى فرز الخلايا ويتيح التوليد الفعال لخلايا T الفعالة ذات أحجام الجينات المنقولة 10 كيلوبايت.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم شراء الخلايا التائية البشرية من خلال مركز المناعة البشرية بجامعة بنسلفانيا، الذي يعمل وفقا لمبادئ الممارسات المختبرية الجيدة مع إجراءات تشغيل قياسية و/أو بروتوكولات محددة لاستلام العينات ومعالجتها وتجميدها وتحليلها، والتي تتوافق مع إرشادات أخلاقيات MIATA وجامعة بنسلفانيا.

ملاحظة: يظهر في الشكل 1 نظرة عامة تخطيطية على سير العمل المحسن لإنتاج لينتي فيروسات وخلايا CAR T في الشكل 1. يتم تلخيص مقارنة خطوات التحسين الرئيسية مع سير العمل القياسي الحالي في الجدول 1. تم الحفاظ على جميع الزراعة الخلوية عند 37 درجة مئوية في حاضنة رطبة تحتوي على 5٪CO2 باستخدام وسط الخلايا التائية (TCM) المكون من RPMI-1640 مع 10٪ مصل أبقار جنيني غير نشط بالحرارة (FBS)، 10 ملليمولار من محلول HEPES، 2 ملليمول L-ألانيل-إل-جلوتامين (انظر جدول المواد)، 100 U/mL بنسلين، و100 U/mL ستربتومايسين.

figure-protocol-1
الشكل 1: تحسين سير العمل لإنتاج اللينتيفيروس وخلايا CAR T باستخدام الجينات المحسنة الكبيرة. تمثيل تخطيطي لإنتاج فيروسات العدسة (الأعلى) وتوليد خلايا CAR T (الأسفل)، مع تسليط الضوء على الخطوات الرئيسية والتحسينات التي تعزز عدادات الفيروسات وكفاءة التحويل. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

سير العمل القياسيسير العمل المحسن
الفيروسالغلاف الفيروسيVSV-Gكوكال-جي
النقل المتبادلL2000L30001
حصاد LV24 ساعة2 + 48 ساعة230-36 ساعة3
خلية Tالسفينةقارورة T25صفيحة قاع مسطح ببئر 96
نسبة السطح إلى الحجمالمتغير5.12 سم2/مل4
مساعدلا شيءSF1085
13 ميكرولتر L3000 لكل 1 ميكروجرام DNA، دون تغيير في الوسائط
جهازينطرد مركزي عند 106,800 × جرام لمدة 2.5 ساعة، أنبوب دائري في الأسفل
3طرد مركزي بقوة 12,300 × جرام خلال الليل، أنبوب قاعي مخروطي
4مكملات وسائط إضافية بعد النقل
555 ميكروغرام/مل

الجدول 1: مقارنة بين سير العمل القياسي والمحسن. التحسينات الرئيسية لسير العمل المحسن مقارنة بسير العمل القياسي الحالي. تم تعديل هذا الجدول بإذن من رومل وآخرين. 17.

1. إنتاج اللينتيفيروس

  1. صيانة الخلايا HEK293T
    1. تأكد من توزيع الخلايا HEK293T بشكل متساو، وخالية من الكتل، وعند 50-70٪ من التقاء (العائد النموذجي: 1.0-1.5 ×10 7 خلايا لكل قارورة T150).
    2. استنشق السوبرناتان، أضف 20 مل من PBS بدرجة حرارة الغرفة (RT) إلى الجانب العلوي من القارورة لتجنب إزاحة الخلايا، وقم بتدوير PBS بلطف فوق الخلايا، ثم استنشق الغسيل.
    3. أضف 3 مل من 0.05٪ تريبسين-إيدتا وحضن لمدة 15-30 ثانية عند الأشعة مع إمالة القارورة يمينا ويسارا. راقب انفصال الخلية.
    4. أضف 7 مل من الطب الصيني الصيني البارد، وأعد تعليق الخلايا على قاع القارورة لتوليد تعليق خلية واحدة، ثم انقله إلى أنبوب بسعة 50 مل. اغسل القارورة ب 10-20 مل من الطب الصيني الصيني البارد وأضف الغسيل إلى نفس الأنبوب.
    5. قم بالطرد المركزي للخلايا (300 × جرام، 5 دقائق، 4 درجات مئوية)، استنشاق الفائق الطبيعي، إعادة تعليق 10 مل من الطب الصيني الصيني، وعد الخلايا.
    6. ضع خلايا HEK293T في قوارير T150 عند 3 × 10أو 6 خلايا لكل قارورة للمرور كل يومين (مثل الاثنين والأربعاء) أو عند 1 × 10 أو6 خلايا لكل قارورة للمرور كل 3 أيام (مثلا، الطلاء يوم الجمعة للمرور خلال عطلة نهاية الأسبوع) باستخدام 30 مل من الطب الصيني الصيني المسبق المسخن إلى 37 درجة مئوية.
  2. تحويل خلايا HEK293T لإنتاج فيروس العدس
    ملاحظة: قم بإجراء تجربة تجريبية صغيرة لتحديد كثافة البذور التي تنتج باستمرار 70-80٪ من التقاء الأشجار بعد يومين. تأكد من أن HEK293T التقاء الخلية لا يتجاوز 80٪ عند التحويل (انظر النقاش). تم تحسين النقل باستخدام الوسط الأساسي الأدنى في المصل المنخفض ومواد الليبوفكشن التجارية (L3000 و P3000، انظر جدول المواد).
    1. احصد HEK293T الخلايا عن طريق التريبسينية كما هو موضح أعلاه وطبق 4 ×10 6 خلايا لكل قارورة T150 مع 30 مل من الطب الصيني التقليدي مسخن مسبقا إلى 37 درجة مئوية.
    2. بعد يومين، تأكد من توزيع الثقافات بشكل متساو وتتقاطع بنسبة 70-80٪.
    3. سخن 50 مل من الوسط الأساسي الأقل بمصل إلى RT. قم بإذابة البلازميدات العدسية الفيروسية، وامزج بلطف، وقم بتدوير سريع. كواشف الشفط الدوامة النبضية، الدوران السريع، واتركها عند RT.
    4. حضر خلطات الحمض النووي الرئيسية. لكل قارورة، اجمع بهذا الترتيب: 2 مل من الوسط الأساسي المنخفض المصل، 39 ميكروغرام من بلازميدات تعبئة الفيروسات العدسية (18 ميكروغرام من pTRP Gag-Pol، 18 ميكروغرام من pTRP RSV-Rev، 3 ميكروغرام من pTRP Cocal-G)، 15 ميكروغرام من البلازميد النقلي، و108 ميكرولتر من كاشف P3000 (2 ميكرولتر من P3000/ميكروغرام DNA). قم بتوسيع الكميات حسب الحاجة وزد الكميات النهائية بنسبة لا تقل عن 10٪ لتعويض فقدان التوصيل بالماصة. دوامة نبضية، دوران سريع، وتخزين في RT.
    5. جهز خلطات L3000 ماستر. لكل قارورة، اجمع بهذا الترتيب: 1.84 مل من الوسط الأساسي المصلي المنخفض و162 ميكرولتر من L3000 (3 ميكرولتر من L3000/μg DNA). قم بتوسيع الكميات حسب الحاجة وزد الكميات النهائية بنسبة لا تقل عن 10٪ لتعويض فقدان التوصيل بالماصة. دوامة النبض، دوران سريع، وحضانة في RT لمدة 5 دقائق.
    6. بعد 5 دقائق، أضف 2 مل من خليط L3000 الرئيسي لكل قارورة إلى خليط الحمض النووي الرئيسي المقابل لتحقيق تخفيف بنسبة تقريبية بنسبة 1:2. أضف خليط L3000 ببطء بدءا من أسفل الأنبوب دون لمس جوانبه. اخلط جيدا عن طريق التوصيل بالماصات واحتضن 15 دقيقة عند RT.
    7. في هذه الأثناء، قم بإزالة 6 مل من المادة الفائقة بعناية من كل مزرعة HEK293T ووضع علامة على كل قارورة.
    8. بعد 15 دقيقة، قم بنقل كل مزرعة عن طريق إمالة القارورة نحو الأعلى وإطلاق 4 مل من خليط النقل ببطء في المادة الفائقة على الجانب العلوي من القارورة لتجنب إزاحة الخلايا. قم بعمل الماصة ببطء للأعلى/الأسفل مرتين، ثم أعد القارورة إلى وضعها الأصلي، ثم لف برفق، ثم أعدها إلى الحاضنة، وسجل الوقت.
      ملاحظة: اترك الزراعة دون إزعاج حتى حصاد فيروس العدس. على عكس توصية الشركة المصنعة باستبدال المادة الفائقة HEK293T التي تحتوي على خليط النقل L3000 بوسط زراعة طازج بعد النقل18، فإن حذف هذه الخطوة يحافظ على عدادات الفيروسات العدسيةالأعلى 17.
  3. حصاد وتركيز وتجميد الفائقات العدسية الفيروسية
    ملاحظة: احتفظ بالمواد الفائقة الفيروسية العدسية على التجميد أو عند 4 درجات مئوية أثناء جميع خطوات المعالجة لمنع التحلل.
    تحذير: تصنف ناقلات الفيروسات اللينتيفيرالية كمواد معدية. اتبع الاحتياطات المناسبة للسلامة الحيوية، بما في ذلك استخدام معدات الحماية الشخصية (مثل القفازات المزدوجة، معاطف المختبر ذات الاستخدام الواحد). قم بتطهير جميع أسطح العمل بنسبة 10٪ من المبيض ثم 70٪ إيثانول. تعقيم المواد الاستهلاكية الملوثة والنفايات السائلة بنسبة 10٪ قبل التخلص منها كنفايات بيولوجية خطرة وفقا لإرشادات السلامة البيولوجية المؤسسية.
    1. نظف معدات الطرد المركزي الفائق (الدلاء، الأنابيب المخروطية، والمحولات المخروطية) بمادة 10٪ مبيض، ثم اشطفها بالماء. تجفيف الهواء لفترة وجيزة، ثم رش ب 70٪ إيثانول وتجفيفه بالهواء تحت غطاء زراعة المناديل.
    2. قم بتبريد الطرد المركزي فوق الفائق باستخدام الدوار المدخل إلى 4 درجات مئوية.
    3. احصد السوبرناتيكات اللينتيفيروسية بعد 30-36 ساعة من النقل عن طريق نقلها إلى أنابيب بحجم 50 مل. قم بتنقية المواد الفائقة عن طريق الطرد المركزي (500 × جم، 5 دقائق، 4 درجات مئوية)، وترشيح عبر فلتر مسام بحجم 0.45 ميكرومتر، وخزنها على الثلج.
    4. أدخل محولات مخروطية في الدلاء، وانقل الفائقات المفلترة إلى أنابيب الطرد المركزي المخروطي، وتحميلها في الدلاء. وازن الدلاء المتقابلة مع TCM البارد، مع التأكد من أن فروق الوزن أقل من 0.1 جم.
    5. تركيز المواد الفائقة عن طريق الطرد المركزي فوق الطرد المركزي عند 12,300 × جرام خلال الليل عند 4 درجات مئوية.
    6. في صباح اليوم التالي، أزل الدلاء بعناية وخزنها على الثلج.
    7. حضر علبة بها ثلج جاف للتجميد وكروفيالات مميزة للتجميد.
    8. تحت غطاء زراعة الأنسجة، افتح كل دلو وأزل أنبوب الطرد المركزي الخارق بداخله باستخدام الملقط. لكل أنبوب، تابع كما يلي:
    9. استنشق السائل الفائق بحذر حتى يصل إلى 0.5 بوصة من قاع الأنبوب ثم قم بتفريغ السائل المتبقي في صفيحة ذات 6 آبار. اضغط بلطف على الأنبوب لإزالة بعض السائل المتبقي.
    10. أضف 300 ميكرولتر من التيار الصيني الصيني البارد، ثم أعد تعليقه بلطف لمدة 30 ثانية، ثم انقل التعليق إلى التعليق المبرد.
    11. اغسل الأنبوب ب 200 ميكرولتر من الطب الصيني التقليدي البارد وأضف الغسيل إلى نفس جهاز التبريد.
    12. اخلط بلطف وجمع 60 ميكرولتر لقياس عدسات الفيروسات (انظر الخطوة 1.4)، وعدة أليكوات بسعة 100 ميكرولتر لإنتاج خلايا CAR T العليا، وأنبوب إضافي مع الحجم المتبقي كمتبق. قم بتجميد الأليكوات فورا على الثلج الجاف. انقل النقاط إلى -80 درجة مئوية للتخزين طويل الأمد.
  4. قياس عداد فيروس العدس المركز باستخدام الخلايا التائية الأولية
    ملاحظة: تقريبا 1 × 105 الخلايا التائية مطلوبة لكل تخفيف لكل فيروس عدس. على سبيل المثال، ستة فيروسات لينتي مع ثمانية تخفيفات لكل منها تتطلب: 6 × 8 × 1 × 105 = 4.8 × 106 خلايا T. يجب أن تكون هناك خلايا إضافية مستعدة لأخذ التعويض عن فقدان الماصات. يتم تحفيز الخلايا التائية باستخدام حبيبات تنشيط مغناطيسية مغطاة بأجسام مضادة مضادة ل-CD3 ومضاد CD28 (انظر جدول المواد).
    1. تنشيط الخلايا التائية (اليوم 0)
      1. المتطلب الأساسي: الحفاظ على خلايا T البشرية المنقاء CD4+ وCD8+ في الطب الصيني التقليدي جاهزة.
      2. عد خلايا T CD4+ وCD8+ وادمجها بنسبة 1:1.
      3. اغسل خرزات التنشيط كما يلي: أضف 1 مل من الطب الصيني التقليدي إلى الأنبوب، وأعد تعليق الخرزات عن طريق الدوامة، وانقل الكمية المطلوبة لتحقيق نسبة 3 إلى 1 من الخلايا من الخرزات إلى الخلايا الت. ضع الأنبوب في قاعدة مغناطيسية ودع الخرزات تتكون على طول جدار الأنبوب. بعد 30 ثانية، استنشق السوبرناتانت بحذر، وأخرج الأنبوب من الحامل المغناطيسي، وأعد تعليق الخرزات في 1 مل من TCM. كرر الغسيل مرتين إضافيتين.
      4. أضف حبيبات التنشيط إلى الخلايا التائية واضبط التركيز النهائي إلى 1 ×10 6 خلايا/مل مع تسخين الطب الصيني الصيني إلى 37 درجة مئوية.
      5. اخلط جيدا وانقل التعليق إلى خزان كاشف. خلايا الصفائح في ألواح ذات 96 بئرا مسطحة القاع مع 100 ميكرولتر من الطب الصيني التقليدي لكل بئر باستخدام ماصة متعددة القنوات. اخلط جيدا كل دقيقة إلى دقيقتين لمنع ترسيب الخرز.
    2. تحويل الخلايا التائية (اليوم الأول)
      ملاحظة: بالنسبة لفيروسات لينتيفيروسات ذات جينات منقولة كبيرة (مثل 9 كيلوبايت من LTR إلى LTR)، جهز 6 حالات باستخدام تخفيف تسلسلي بنسبة 1:2 (غير مخفف، 1:2، 1:4، 1:8، 1:16، 1:32). بالنسبة لفيروسات لينتي التي تحتوي على جينات مترجمة أصغر (مثل 7 كيلو بايت من LTR إلى LTR)، هناك حاجة إلى 8 حالات مع تخفيف تسلسلي بنسبة 1:4. استخدم الآبار المتبقية كعناصر تحكم غير محولة (UTD).
      1. قم بإذابة 60 ميكرولتر من كل فيروس لينتي مركز في RT وتخزينها على الثلج.
      2. جهز سلسلة تخفيف في صفيحة قاعية دائرية بسعة 96 بئئر: أضف 60 ميكرولتر من لينتي فيروسات إلى الصف العلوي، أضف 30 ميكرولتر من الرطوبة الصبغية الباردة إلى كل صف أسفل، انقل 30 ميكرولتر من الأعلى إلى الصف الثاني وامزج (تخفيف بنسبة 1:2)، نقل 30 ميكرولتر من الصف الثاني إلى الثالث وامزج (تخفيف بنسبة 1:4). استمر حتى يتم إعداد ستة شروط إجمالا (غير مخفف، 1:2، 1:4، 1:8، 1:16، 1:32). استخدمه فورا للتحويل.
      3. بين 23-26 ساعة بعد تحفيز الخرز، يتم تحويل خلايا T تحتوي على 25 ميكرولتر لكل بئر من اللينتيفيروس من صفيحة التخفيف باستخدام ماصة متعددة القنوات. أضف 25 ميكرولتر من التيار الصيني الصيني إلى آبار التحكم في UTD.
    3. تغذية الخلايا التائية (اليوم الثالث)
      1. أضف بلطف 125 ميكرولتر من الطب الصيني الصيني المسخن مسبقا إلى 37 درجة مئوية إلى كل بئر باستخدام ماصة متعددة القنوات.
    4. إزالة القطرات من الخلايا التائية وتحليل تدفق الخلايا الخلوية (اليوم الخامس)
      1. جهز ثلاث مجموعات من أنابيب غطاء اللولب بحجم 1.5 مل لكل حالة وإزالة الأغطية. ضع مجموعتين من الثلاث في حامل مغناطيسي.
      2. أعد تعليق كل بئر وانقل الخلايا إلى المجموعة الأولى من الأنابيب للسماح للخرزات بتكوين حبيبة على طول جدار الأنبوب. بعد 30 ثانية، انقل السوبرناتينات بعناية إلى المجموعة الثانية من الأنابيب. انتظر 30 ثانية (يجب ألا تكون الخرزات مرئية بعد الآن)، ثم انقل المواد الفائقة إلى المجموعة الثالثة من الأنابيب وخزنها على الثلج.
      3. قم بعمل خلايا T مصبوغة لعلامة التحويل المناسبة (مثل CAR المضادة ل CD19 أو synNotch المضادة HER2) مع الأجسام المضادة (انظر جدول المواد) وتحليل تعبير العلامة بواسطة قياس تدفق السيارة.
      4. حدد الحالات التي تكون معدلات التحويل فيها أقل من 30٪، بما يتوافق تقريبا مع النطاق الخطي بين حجم الفيروس ومعدل التحويل.
      5. احسب عدادات الفيروسات العدسية باستخدام الصيغة التالية:
        العيار (TU/mL) = (العدد الأولي لخلايا T × نسبة الخلايا المحولة × عامل التخفيف)/حجم الفيروس (mL)
        على سبيل المثال، تعبير CAR بنسبة 20٪ مع تخفيف بنسبة 1:32 من مخزون الفيروسات العدسية:
        (100,000 خلية × 0.2 × 32) / (0.025 مل) = 2.56 ×10 7 وحدة حركية/مل

2. إنتاج خلايا CAR T

ملاحظة: الكميات النموذجية لبدء إنتاج خلايا CAR T هي من 1 إلى 5 × 10إلى 6 خلايا T لكل مجموعة. زيادة عدد الخلايا في مجموعة التحكم في UTD بنسبة 50٪، حيث ستستخدم هذه المجموعة أيضا لتطبيع مستويات النقل في التجارب اللاحقة. توقع تضاعف عدد السكان من 5 إلى 6 خلال التوسع. تم تحسين نقل الخلايا التائية باستخدام بوليمر كوبليمر ككتلة كمحسن (انظر جدول المواد) ومع نسب زراعة سطح إلى حجم محددة في صفائح ذات قاع مسطح بسعة 96 بئئرا17.

  1. تحضير محلول معزز بسعة 100 ملغ/مل
    1. أضف 5 جرام من معزز البوليمر المساعد إلى زجاجة بلاستيكية، ثم أضف 45 مل من الماء فائق النقي. حركه طوال الليل في RT.
    2. انقل المحلول إلى أسطوانة متدرجة واضبط الحجم إلى 50 مل باستخدام ماء فائق النقي.
    3. قم بترشيح المحلول عبر مرشح مسام بحجم 0.22 ميكرومتر وخزنها عند 4 درجات مئوية.
  2. تنشيط الخلايا التائية (اليوم 0)
    1. المتطلب الأساسي: الحفاظ على خلايا T البشرية المنقاء CD4+ وCD8+ في الطب الصيني التقليدي جاهزة.
    2. عد خلايا T CD4+ وCD8+ وادمجها بنسبة 1:1.
    3. خرز التفعيل الغسيل كما يلي.
      1. أضف 1 مل من التيار الاستهلاكي الحركي إلى الأنبوب، وأعد تعليق الخرزات عن طريق الدوامة، وانقل الكمية اللازمة لتحقيق نسبة 3 إلى 1 من الخلايا من الخرزات إلى التي. ضع الأنبوب في قاعدة مغناطيسية ودع الخرزات تتكون على طول جدار الأنبوب.
      2. بعد 30 ثانية، استنشق السوبرناتانت بحذر، وأخرج الأنبوب من الحامل المغناطيسي، وأعد تعليق الخرزات في 1 مل من TCM. كرر الغسيل مرتين إضافيتين.
    4. أضف حبيبات التنشيط إلى الخلايا التائية واضبط التركيز النهائي إلى 1 ×10 6 خلايا/مل مع تسخين الطب الصيني التقليدي إلى 37 درجة مئوية.
    5. اخلط جيدا وانقل التعليق إلى خزان كاشف. خلايا الصفائح في ألواح ذات 96 بئر مسطحة القاع مع 50 ميكرولتر من الطب الصيني التقليدي لكل بئر باستخدام ماصة متعددة القنوات. اخلط جيدا كل دقيقة إلى دقيقتين لمنع ترسيب الخرز.
  3. تحويل الخلايا التائية (اليوم الأول)
    ملاحظة: اختر كميات فيروس العدسة بناء على نتائج المعايرة السابقة، لضمان أن مستويات النقل النهائية قابلة للمقارنة بين المجموعات (عادة بين 20٪ إلى 30٪). لتجنب تكاملات الفيروسات العدسية المتعددة، حافظ على أقصى مستويات نقل ≤ 30٪. الفيروسات اللينتي ذات الجينات المعدلة الكبيرة عادة ما تحتاج إما إلى فيروس غير مخفف أو تخفيف بنسبة 1:4-1:8. قم بتعديل أحجام المجموعات لتجنب بقايا فيروس العدس، حيث تقلل كل دورة تجمد ذوبان من مستويات الفيروس. استخدم خلطات الماستر العينية اللينتيفيرالية مباشرة بعد التحضير.
    1. قم بإذابة الكميات المطلوبة من فيروس العدسة المركز في RT وخزنها على الثلج.
    2. تحضير مخزون عمل معزز بسعة 2 ملغ/مل في الطب الصيني التقليدي البارد عن طريق خلط، مثلا، 100 ميكرولتر من المحسن (مخزون 100 ملغ/مل) مع 4.9 مل من الطب الصيني الصيني.
    3. تحضير خلطات رئيسية لفيروس لينتي بناء على نتائج المعايرة وإضافة المحسن إلى تركيز نهائي يبلغ 275 ميكروغرام/مل. زد الحجم النهائي بنسبة لا تقل عن 10٪ لتعويض فقدان التوصيل بالماصة. على سبيل المثال، لتحقيق تخفيف بنسبة 1:16 مع 100 بئر:
      الحجم الكلي: 100 بئر × 12.5 ميكرولتر من لينتيفيروس × 110٪ = 1,375 ميكرولتر
      تخفيف 1:16: 1,375 ميكرولتر/16 = 85.9 ميكرولتر من لينتيفيروس
      المعزز: 189 ميكرولتر (275 ميكروغرام/مل نهائي)
      الخليط النهائي الرئيسي: 1,100 ميكرولتر من TCM + 85.9 ميكرولتر من لينتي فيروس + 189 ميكرولتر من المحسن = 1,375 ميكرولتر
    4. بين 23-26 ساعة بعد تحفيز الخرز، يتم تحويل خلايا T بسعة 12.5 ميكرولتر لكل بئر من خليط رئيسي لفيروس لينتيفيروس باستخدام ماصة متعددة القنوات، مما ينتج تركيز محسن نهائي يبلغ 55 ميكروغرام/مل. أضف 12.5 ميكرولتر من التيار التقني الصيني إلى آبار التحكم في UTD.
  4. تغذية الخلايا التائية (اليوم الثالث)
    1. أضف بلطف 125 ميكرولتر من الطب الصيني الصيني المسخن مسبقا إلى 37 درجة مئوية إلى كل بئر باستخدام ماصة متعددة القنوات.
  5. إزالة خرزات الخلايا التائية (اليوم الخامس)
    ملاحظة: جهز خزانا معقما وثلاث مجموعات من أنابيب 50 مل لكل مزرعة. حدد حجم الغسيل الكلي إلى ≤ 20٪ من حجم زراعة الخلايا التائية لتجنب تخفيف الخلايا التي تقل عن 8 ×10 5 خلايا/مل.
    1. قم بتجميع كل مزرعة في خزان معقم باستخدام ماصة متعددة القنوات، وغسل الألواح الأصلية بتقنية TCM، وإضافة الغسيل إلى الخزان. انقل كل تعليق خلية إلى المجموعة الأولى من أنابيب 50 مل.
    2. ضع الأنابيب في حامل مغناطيسي للسماح للخرزات بتكوين حبيبة على طول جدار الأنبوب. بعد 30 ثانية، انقل السوبرناتينات بعناية إلى المجموعة الثانية من الأنابيب وضعها في الحامل المغناطيسي. انتظر 30 ثانية (يجب ألا تكون الخرزات مرئية بعد الآن)، ثم انقل الفائقات إلى المجموعة الثالثة من الأنابيب وخزنها في الحاضنة.
    3. عد كل مزرعة وقم بتطبيع النسبة إلى 8 ×10 إلى 5 خلايا/مل مع تسخين الطب الصيني الصيني إلى 37 درجة مئوية. الطبق في وعاء الزراعة المناسب حسب الحجم النهائي (الجدول 2).
    4. دع الخلايا التائية ترتاح ليوم واحد، ثم ابدأ التغذية اليومية بدءا من اليوم السابع (انظر الخطوة التالية).
  6. تغذية الخلايا التائية (اليوم السابع واليوم اليومي بعده)
    ملاحظة: تتضاعف خلايا T تقريبا كل 24-36 ساعة وتخضع لعدد من 5 إلى 7 تعدد قبل الراحة. مراقبة أحجام الخلايا التائية باستخدام عداد خلايا قائم على المقاومة الكهربائية (انظر جدول المواد) لتحديد النقطة الزمنية المثلى للحفظ بالتجميد.
    1. اجمع كل مزرعة، اخلط جيدا، وعد الخلايا.
    2. قم بتطبيع كل مزرعة إلى 8 ×10 5 خلايا/مل مع تسخين الطب الصيني الصيني إلى 37 درجة مئوية وإعادة الطلاء في وعاء الزراعة المناسب (الجدول 2).
    3. استمر في التوسع حتى ينخفض متوسط حجم الخلية إلى أقل من 320 ميكرومتر3، ثم انتقل إلى خطوة الحفظ بالتبريد.
  7. التحقق من صحة نقل الخلايا التائية باستخدام قياس تدفق الخلايا
    ملاحظة: يمكن تقييم نقل الخلايا التائية في أي وقت بين اليوم الخامس ويوم الحفظ بالتجميد. ستنخفض مستويات التعبير خلال فترة التمدد بحيث يضمن القياس المبكر الفصل الواضح للكسور السالبة والموجبة أثناء تحليل قياس تدفق السيارة.
    1. احصد 2 × 10خلايا T من كل مزرعة.
    2. قم بصبغ خلايا T لعلامة النقل المناسبة (مثل CAR المضادة CD19 أو synNotch المضادة HER2) مع الأجسام المضادة (انظر جدول المواد) وتحليل تعبير العلامة بواسطة قياس تدفق الخلايا
  8. حفظ الخلايا التائية بالتجميد (عادة بين الأيام 10-12)
    ملاحظة: تقوم Cryopreserve بتوسيع الخلايا التائية قبل أو بعد فترة الراحة لتحسين قابليتها للبقاء أثناء الذوبان. يمكن أن يكون متوسط حجم 320 ميكرومتر3 نقطة فاصلة للحفظ بالتجميد. بمجرد أن ينخفض حجم الخلية إلى أقل من 300 ميكرومترمكعب، تتوقف الخلايا التائية عن الانقسام، وتبدأ أعدادها الإجمالية في الانخفاض. تأكد من أن جميع المجموعات لديها أحجام مماثلة في وقت الحفظ بالتبريد، مما قد يتطلب يوما إضافيا من الزراعة لبعض المجموعات. تجميد الخلايا بمعدل ثابت -1 درجة مئوية في الدقيقة باستخدام حاويات تجميد مناسبة (مثل حاويات تجميد الخلايا الخالية من الكحول، انظر جدول المواد).
    1. قم بتجميع كل مزرعة في أنبوب مناسب (مثلا 500 مل)، وعدد الخلايا، وتخزينها في الحاضنة.
    2. احسب العدد الكلي للخلايا ومبالغ الأليكوت المطلوبة.
    3. تستنشق خلايا الطرد المركزي (300 × جم، 10 دقائق، 4 درجات مئوية) المواد الفائقة، وتعيد تعليق كل مزرعة في وسط تجميد يحتوي على 50٪ وسط خال من المصل، و40٪ FBS غير منشط بالحرارة، و10٪ ثنائي ميثيل كبريتسيد (DMSO) عند 2 × 107 خلايا/مل (انظر جدول المواد).
    4. تتحول Aliquot إلى خلايا كريويال (250 ميكرولتر إلى 1 مل، أي 5-20 × 106 خلايا لكل قارورة). ضع الكروفيالات في حاوية تجميد الخلايا وخزنها عند -80 درجة مئوية طوال الليل.
    5. انقل المكبرات المبردة إلى النيتروجين السائل للتخزين طويل الأمد.
  9. ذوبان الخلايا التائية
    ملاحظة: لكل مجموعة من خلايا T، جهز أنبوبا واحدا يحتوي على 50 مل من الطب الصيني الصيني المسال مسخنا مسبقا إلى 37 درجة مئوية لتخفيف DMSO في وسط التجمد بعد الإذابة. قم بتسخين الطب الصيني الصيني الإضافي للطبق.
    1. قم بإذابة البرودة بسرعة عند 37 درجة مئوية في حمام مائي أو تحت ماء دافئ جاري.
    2. بمجرد رؤية السائل، توجه إلى غطاء زراعة الأنسجة، أضف 500 ميكرولتر من TM الطبي الصيني المسخن مسبقا، اخلط الخلايا بلطف، وانقل الخلايا إلى الأنابيب المحضرة التي تحتوي على 50 مل TM.
    3. اغسل الميكروفون ب 500 ميكرولتر من النسيج الصيني الصيني وأضف الغسيل إلى نفس الأنبوب.
    4. حضن الخلايا لمدة 10 دقائق عند RT.
    5. تستنشق خلايا الطرد المركزي (300 × جم، 10 دقائق، درجة حرارة الغرفة) المواد الفائقة، وتعيد تعليق الخلايا عند 4 × 106 خلايا/مل.
    6. قم بتغليف الخلايا في وعاء الزراعة المناسب (الجدول 2).
    7. أرياح الخلايا طوال الليل في الحاضنة قبل المضي قدما في التجارب التالية.
السفينةحجم أدنىالحجم الأقصى
96-بئر0.1 مل/بئر*0.25 مل/بئر
48-بئر0.2 مل/بئر1 مل/بئر
24-بئر0.5 مل/بئر2 مل/بئر
12-بئر1 مل/بئر4 مل/بئر
6-آبار2 مل/بئر6 مل/بئر
T25 (أفقي)3 مل8 مل
T75 (أفقي)8 مل20 مل
T150 (أفقي)20 مل60 مل
* يتم تقليل حجم الزراعة مؤقتا إلى 50 ميكرولتر/بئر لتعزيز نقل الخلايا التائية

الجدول 2: أحجام وسائط الزراعة الموصى بها لتوسعات خلايا CAR T المختلفة. حجم وسائط الزراعة الأدنى والأقصى عبر صوت الأوعية المستخدمة عادة خلال توسع الخلايا التائية.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لإظهار التحسينات التي تم تحقيقها من خلال سير العمل المحسن (الشكل 1) عبر مجموعة واسعة من أحجام الجينات الناقلة، اخترنا ثلاثة أحجام ناقلات للفيروسات العدسية: 5.7 كيلوبايت (CD19 CAR)، 9.2 كيلوبايت (HER2-MSLN svsNotch)، و10.1 كيلوبايت (HER2-MSLN-CBG svsNotch) (الشكل 2A). تم إنتاج الفيروسات اللينتي إما تحت ظروف قياسية أو محسنة (الشكل 2B: الفصول القديمة مقابل الاختيار والجدول 1).

بالنسبة لأصغر ناقل بقوة 5.7 كيلوبايت، لوحظ تحسن متوسط فقط في نقل الخلايا التائية في دفعة إنتاج واحدة (الشكل 2B: الأعلى، 73٪ مقابل 88٪ باستخدام الفيروس غير المخفف). بشكل مستمر، ارتفعت معدلات الفيروسات العدسية بشكل طفيف فقط بحوالي 1.5 مرة (الشكل 2C: الأعلى، 2.86 × 10⁸ TU/mL مقابل 4.35 × 10⁸ TU/mL). على النقيض من ذلك، أظهر متجه 9.2 كيلو بايت تحسنا كبيرا في الأداء، حيث زادت معدلات نقل الخلايا التائية القصوى بحوالي 5.4 أو 3.8 أضعاف حسب الدفعة (الشكل 2B: الوسط، 8.3٪/16.6٪ مقابل 45.1٪/63.1٪ باستخدام الفيروس غير المخفف) وتحسن العدادات الوظيفية بحوالي 3.3 أضعاف (الشكل 2C: الوسط؛ 3.1 × 10⁶ TU/mL مقابل 10.1 × 10⁶ TU/mL). كان أقوى تأثير مع متجه 10.1 كيلوبايت، حيث زادت معدلات النقل بحوالي 12.4 أو 9.8 ضعف (الشكل 2B: القاع، 1.4٪/1.5٪ مقابل 17.3٪/14.7٪ باستخدام الفيروس غير المخفف) وتحسن العدادات الوظيفية بحوالي 10 أضعاف (الشكل 2C: الأسفل، 0.24 × 10⁶ TU/ml مقابل 2.41 × 10⁶ TU/mL).

بعد ذلك، تم نقل خلايا T من متبرعين أصحاء مع ناقلات فيروسات عدسية تم إنتاجها في ظروف قياسية أو محسنة، باستخدام سير العمل المقابل (الشكل 3 والجدول 1). لمقارنة كفاءة التحويل، تم استخدام كميات متساوية من فيروس لينتي في كل سير عمل، وتم تعديل جرعة الفيروس للحفاظ على معدلات النقل عند أو أقل من 30٪ لمنع حدوث عدة أحداث تكامل. مقارنة بالخلايا التائية المحولة باستخدام الظروف القياسية وإنتاج الفيروسات اللينتيفيروس القياسي، زاد النقل في المتوسط 5.1 ضعف للمتجه 5.7 كيلوبايت، و13.3 ضعف للمتجه 9.2 كيلوبايت، و14.8 ضعف للمتجه 10.1 كيلوبايت (الشكل 3A والجدول التكميلي 1). تم توسيع زراعات الخلايا التائية المختارة التي تم توليدها مع سير العمل المحسن حتى وصلت إلى حالة راحة (الشكل 3B,C). تراوحت تضاعفات السكان بين 5.3 و6.7، حسب متبرع الخلايا التائية (الشكل 3B). أظهرت قياسات حجم الخلايا التائية اليومية وجود حطام خلوي طفيف جدا، مما أشار إلى عدم وجود علامات سمية خلال التوسعات. قبل الحفظ بالتبريد، تم تقييم معدلات التحويل من خلال التلوين لتعبير مستقبلات CAR/synNotch أو بقياس تألق mTag-BFP219 (الشكل 3C والشكل التكميلي 1). كانت معدلات النقل 31.2٪ للناقل 5.7 كيلو بايت (أسود؛ تخفيف 1:512 لنتيجو الفيروس)، 29.8٪ للناقل 9.2 كيلوبايت (الأحمر؛ تخفيف 1:16 لينتيفيراس)، و20.2٪ للناقل 10.1 كيلو بايت (الأزرق؛ تخفيف 1:4 للعدس). تم تقديم بيانات وظيفية إضافية تؤكد أداء خلايا SvsNotch T المولدة وخلايا CAR T في دراستناالمصاحبة 17. ومن المهم أن الخلايا التائية المؤثرة المنتجة بالبروتوكول المحسن لم تظهر أي اختلافات في تضاعف السكان أو النمط الظاهري للخلايا التائية مقارنة بتلك التي تم توليدها مع سير العملالقياسي 17.

figure-results-1
الشكل 2: إنتاج لينتي فيروسات وفقا لسير العمل القياسي والمحسن. (أ) نظرة مخططة على ناقلات الفيروسات العدسية ذات أحجام الجينات المترجمة المقابلة17. الأعلى: يتم التعبير عن CAR مقابل CD19 (CD19 CAR) بواسطة محفز عامل الإطالة البشري-1 ألفا (EF1α)، بحجم إجمالي للجينات المنتقلة حوالي 5.7 كيلوبايت. الأوسط والأسفل: يتم التعبير عن مستقبل سيننوتش HER2 إما مع بروتين مراسل أزرق فلوري (BFP2) (وسط) أو لوسيفيراز أخضر لخنفساء النقر (CBG) (الأسفل) عبر ببتيد 2A ذاتي الشق (P2A) بواسطة محفز EF1α. يتم التحكم في تعبير CAR المستهدف للميزوثيلين (MSLN) بواسطة محفز فيروس مضخم خلوي (CMV) خاص ب GAL4 (GAL4-CMV). إجمالي أحجام الجينات المعدلة حوالي 9.2 كيلوبايت لجهاز HER2-MSLN svsNotch (الأوسط) و10.1 كيلوبايت لجهاز HER2-MSLN-CBG svsNotch (الأسفل). SIN = متجه يعطل ذاتيا؛ LTR = تسلسل تكرار الطرف الطويل. (ب) تحويل الخلايا التائية مع تخفيفات متسلسلة من لينتيفيروس المولدة تحت ظروف قياسية (std) ومحسنة (opt) باستخدام الناقلات الموصوفة في (A). إنتاجان مستقلان (دائرتان ومثلثات) لكل متجه مع دفعتين لكل دفعة، واثنين من المعطحين المميزين لخلايا T في كل دفعة. تم قياس معدلات النقل عبر المتبرعين بالخلايا التائية. (ج) العدادات الوظيفية لإنتاجات الفيروسات القياسية (STD، الدوائر المفتوحة) والمحسنة (الدوائر المغلقة) المعروضة في (B). تم توليد البيانات من إنتاجين مستقلين لفيروس لينتيفيرو، كل منهما بدفعتين، وباستخدام متبرعين مختلفين لخلايا T في كل دفعة. تشير جميع أشرطة الخطأ إلى متوسط ± SD. تم حساب الدلالة الإحصائية باستخدام اختبار t ثنائي الطرفين. *P < 0.03، **p < 0.01، ***p < 0.001، ****p < 0.0001. تم تعديل هذا الشكل بإذن من رومل وآخرين. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-2
الشكل 3: إنتاج خلايا CAR T مع سير عمل قياسي ومحسن. (أ) زيادة الطي في معدلات تحويل الخلايا التائية مع سير العمل الأمثل (opt) مقارنة بسير العمل القياسي (std) (انظر أيضا الجدول S1). تم الحصول على البيانات من توسعات مستقلة لخلايا T باستخدام متبرعين مميزين وإنتاجين مستقلين لفيروس العدس. (ب) مضاعفات عدد السكان لتوسعات الخلايا التائية التي يتم توليدها باستخدام سير العمل المحسن. لكل ناقل، يتم عرض توسعين مستقلين لخلايا T من متبرعين طبيعيين مختلفين (ND)، كل منهما يستخدم إنتاج منفصل لفيروس العدس. (ج) مخططات قياس تدفق الخلايا تظهر تعبير مستقبلات CAR وBFP2 وSynNotch في خلايا T الفعالة الموسعة في اليوم السابع (10.1 كيلو بايت) أو اليوم العاشر (5.7 كيلو بايت) و9.2 كيلوبايت (انظر أيضا الشكل التكميلي 1). تشير جميع أشرطة الخطأ إلى متوسط ± SD. تم حساب الدلالة الإحصائية باستخدام اختبار t ثنائي الطرفين. *P < 0.03، **p < 0.01، ***p < 0.001، ****p < 0.0001. تم تعديل هذا الشكل بإذن من رومل وآخرين. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل الإضافي 1: استراتيجية البوابة لتقييم تعبير CAR، ومستقبل synNotch، وBFP2، المتعلقة بالشكل 3C. مخططات قياس تدفق الخلايا التمثيلية تظهر استراتيجية البوابات المستخدمة لتحديد تعبير CAR، وsynNotch، وBFP2 في مزارع الخلايا التائية الموسعة. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الجدول التكميلي 1: معدلات التحويل عبر توسعات الخلايا التائية الفردية، مرتبطة بالشكل 3A. معدلات التحويل لتوسعات الخلايا التائية التي تولد مع سير العمل القياسي والمحسن. تم تعديل هذا الجدول بإذن من رومل وآخرين. 17. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا، نقدم بروتوكولا خطوة بخطوة يوضح سير عمل إنتاج محسن لخلايا CAR T ذات الجينات اللينتيفيروسية الكبيرة، مثل خلايا SvsNotch T. هذا السير يلغي الحاجة إلى فرز الخلايا ويتيح التوليد الفعال لخلايا T الفعالة التي تحمل جينات لينتيفيرالية كبيرة. باستخدام هذا السير العملي، ننتج بشكل روتيني خلايا T فعالة تحتوي على جينات معدلة من فيروسات لينتيفيروس بحجم 9-10 كيلو بايت ومعدلات نقل قصوى بين 60-70٪ (9 كيلوبايت) أو 15-20٪ (10 كيلوبايت).

عند حل مشاكل انخفاض معدلات الانتقال الفيروسي أو معدلات التحويل، يجب أخذ عدة عوامل رئيسية في الاعتبار. أولا، جودة الخلايا HEK293T. من المهم أن تمر HEK293T الخلايا بجدول ثابت وألا يسمح لها بالنمو إلى ما يزيد عن 50-70٪ من التقاطع. من خلال تجربتنا، تظهر ناقلات الفيروسات العدسية الناتجة عن خلايا HEK293T التي كانت متضخمة سابقا معدلات معدودة، حتى عندما تبدو الخلايا متعافية شكليا. نقوم بانتظام بتوليد ناقلات فيروسية عالية العيار باستخدام HEK293T الخلايا بعد المرحلة 30، مما يشير إلى أن أعداد المرور الأعلى يمكن تحملها إذا تم الحفاظ على الخلايا بشكل صحيح. بالإضافة إلى جودة الخلية، فإن التقاء HEK293T الخلايا وقت النقل عامل حاسم. لقد لاحظنا انخفاضا في عرارات الفيروسات العدسية عند نقل خلايا HEK293T عند التقاء عالي (90-100٪).

ثانيا، الالتزام الصارم بالتوقيتات والتركيزات والأحجام المحددة في هذا البروتوكول أمر أساسي، حيث تم تحسين العديد من الخطوات بشكل كامل في دراسة سابقة17. على سبيل المثال، تم تعديل معزز البوليمرات المشتركة (انظر جدول المواد) لتعظيم معدلات التحويل دون سمية قابلة للكشف. بينما يمكن أن تزيد التركيزات الأعلى من التحويل، إلا أنها تسبب أيضا سمية وتقلل من تمدد الخلايا التائية. وبالمثل، أدى جمع الفائقات العدسية خارج نافذة 30-36 ساعة الموصى بها (مثلا عند 24 ساعة أو 48 ساعة) إلى نتائج عيارات أقل في تجربة زمنيةمقابلة 17. في المقابل، لا حاجة للالتزام الصارم بنسبة 1:1 من CD4 إلى CD8 للخلايا التائية، حيث لم نلاحظ فروقا كبيرة في كفاءة النقل عند استخدام خلايا T الضخمة ذات توزيعات متغيرة بين CD4/CD8. ومع ذلك، قد تؤثر الانحرافات عن هذه النسبة على مدة التوسع وعدد تضاعفات السكان. لذلك، نحافظ عادة على نسبة 1:1 من CD4 إلى CD8 لتحقيق الاتساق عبر التجارب.

قد تركز جهود التحسين المستقبلية على استراتيجيات إضافية لتحسين نقل الخلايا التائية باستخدام جينات انتقالية لفيروسات عدسية أكبر، مثل تركيبات وسائط متخصصة أو أنظمة سيتوكين مخصصة. توسيع هذا السير ليشمل أنواع الخلايا المناعية الأخرى، بما في ذلك الخلايا القاتلة الطبيعية والبلاعميات، قد يوسع تطبيقاته العلاجية. ومن المهم أن الترجمة السريرية لهذا سير العمل قد تساعد أيضا في تقليل تكاليف تصنيع منتجات علاج الخلايا المعدلة بفيروس العدس.

يوفر البروتوكول الشامل خطوة بخطوة المعروض هنا مرجعا عمليا لإنتاج خلايا CAR T ذات الجينات المحولة الفيروسية الكبيرة ويضع الأساس لتطوير خلايا CAR T الجديدة ضد سرطانات الصلبة والدم.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

شركة P.C.R. مخترعة في مجال براءات الاختراع وطلبات البراءات المرخصة لشركة كايت فارما وتتلقى إيرادات من هذه التراخيص. B.L.L. مخترع في براءات الاختراع و/أو طلبات البراءات المرخصة لمعاهد نوفارتيس للأبحاث الطبية الحيوية وشركة كايت فارما، ويتلقى عائدات من هذه التراخيص. B.L.L. هو مؤسس علمي لشركة Tmunity Therapeutics وCapstan Therapeutics. بي.إل.إل. عضو في المجالس الاستشارية العلمية لشركات مثل أفكتاس، كابستان ثيرابيوتكس، سيلولا ثيرابيوتيكس، إيمونيل ثيرابيوتيكس، إيميسوفت، إن8بيو، أوري بيوتيك، أكسفورد بيوميديكا، كويل ثيرابوتيكس، ثيرموفيشر فارما سيرفيسز، ويو تي سي ثيرابيوتيكس. يعمل B.L.L. كمستشار خلال الاثني عشر شهرا الماضية لشركات أسترازينيكا، وBioMereux، وKite Gilead، ومعهد لودفيغ لأبحاث السرطان. سي.إتش.جي. مخترع في براءات الاختراع و/أو طلبات براءات الاختراع مرخصة لمعاهد نوفارتس للأبحاث الطبية الحيوية، كايت فارما، كابستان ثيرابيوتكس، ديسباتش بيوثيرابيوتكس، وبلو ويل بيو. سي. إتش. جي. عضو في المجالس الاستشارية العلمية ل AC Immune، BluesphereBio، BlueWhale Bio، Cabaletta، Cartography، Cellares، Celldex، Decheng، Qihan Biotech، Shinobi Therapeutics، Verismo، ViTToria Bio، وWIRB-Copernicus.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نود أن نشكر جميع أعضاء مختبر يونيو، وكذلك يوهانس سي. إم. فان دير لو، ديفانشو شوكلا، وجيمس إل. رايلي، على مناقشاتهم. بالإضافة إلى ذلك، نود أن نشكر ماكس إلداباس، إميلي مادوكس، تانيشك سينها، وجايي شو من مركز المناعة البشرية في كلية بيرلمان للطب بجامعة بنسلفانيا لتوفيرهم خلايا T البشرية المنقية. وأخيرا، نود أن نشكر مختبر الموارد المشتركة لعلم الخلايا وفرز الخلايا في بنسلفانيا على صيانة أجهزة قياس تدفق الخلايا لدينا. حظي P.C.R. بدعم من المعهد الوطني للسرطان (رقم المنحة 5T32CA009140).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
الأجسام المضادة - مضاد CD19 CARسايتوارت200101مضاد CD19 CAR (النمط الخاص)، مرافق AF647، 1:100
الأجسام المضادة - سيناتش مضاد HER2R& دي سيستمزFAB95471Gمضاد تراستوزوماب (النمط الخاص)، AF488-مترافق، 1:80
المبيضكلوروكسمبيض مبيث للجرثومات
حاوية تجميد الخلاياالوحدة الحيويةFTS30خال من الكحول
الطرد المركزي (كبير)ثيرمو ساينتفيكليجند إكس تي آر
الطرد المركزي (مصغر)فيشر ساينتيفكسبراوت بلس
جهاز الطرد المركزي (صغير)إبندورف5425
عداد كولتربيكمان كولترمتقارب الأحجام 4عداد خلايا قائم على المقاومة الكهربائية يحدد أعداد الخلايا وأحجام الخلايا
أنابيب التبريدثيرمو ساينتفيك375418
كبريتات ثنائي ميثيل (DMSO)تقنية الإشارة الخلوية12611P
DPBS (بدون كالسيوم، بدون مغنيسيوم)جيبكو14190-136
داينابيدز (CD3/CD28)جيبكو40203Dخرزات التنشيط المستخدمة لتحفيز الخلايا التائية
الإيثانولمختبرات ديكوندليل 200
FBS (معطل الحرارة)أفانتور (VWR)97068-091
مقياس التدفق الخلويBDLSRFortessa (647177)
الفريزر (-80 & درجة؛ C)باناسونيكMDFU76VA-PA
الفريزر (النيتروجين السائل)MVE HEco1500-190
الثلاجة (4 ودرجة؛ C)فيشر ساينتيفكإيزوتمب
قفازات (نيتريل)هاليارد55082
مكمل جلوتاماكسجيبكو35050-061إل-ألانيل-إل-جلوتامين  
هيبيس (1 ذكر)جيبكو15630-080
الثلج (الجاف)ن.أ.ن.أ.
الجليد (الرطب)ن.أ.ن.أ.
دلو الثلجفيشر ساينتيفك07-210-108
معطف المختبر (قابل للتخلص منه)كابلرPVS112WH-MD
بلازميدات تغليف لينتيفيرالالملكيةن.أ.pTRP Gag-Pol، pTRP RSV-Rev، pTRP Cocal-G
البلازميدات اللينتيفيرالية المنتقلةالملكيةن.أ.مثلا: pTRPE svsNotch
كاشف النقل ليبوفكتامين 3000إنفيتروجينL3000015مادة الليفوفكشن التجارية؛ يحتوي على ليبوفكتامين 3000 (L3000) وكاشفه المعزز (P3000)
حامل مغناطيسي (كبير)الخلايا الجذعيةإيزي سبتمبر 18103لسعة 5 مل/15 مل
حامل مغناطيسي (صغير)إنفيتروجيندايناماج-2 12321Dلأنابيب 1.5 مل
قضيب التحريك المغناطيسيفيشر ساينتيفك14-513-82مجموعة بار التحريك
منصة التحريك المغناطيسيثيرمو ساينتفيكS88857100
أسطوانة القياس (100 ملمتر)VWR76019-316 
مياه MQميركQ-PODماء ألترابوي؛ يستخدم مرشح نهائي ميليباك 40 إكسبريس، 0.22 ميكرون (MPGP04001)
الماصة متعددة القنواتفيشر ساينتيفكانظر التعليقات30-300 وميكرو؛ L:  FBE1200300؛ 5-50 وميكرو؛ L:  FBE1200050
أوبتي-ميم (مع إل-جلوتامين، فينول ريد)جيبكو31985-070الوسط الأساسي البسيط المصلي المحدود يستخدم لنقل الحمض النووي
البنسلين-ستربتوميسين (10,000 U/mL، 10,000 وميكرو؛ g/mL)جيبكو15140-122
الأنابيبفيشربراندانظر التعليقات50 مل: 13-678-11 فهرنهايت؛ 25 ملم: 13-678-11; 10 مل: 13-678-11E; 5 مل: 13-678-11D
البيبيتس (الشفط)فالكون3575582 مل
بيبيتيجيلسونPIPETMAN P10/P20/P200/P1000
وحدة تحكم البيبيتهيرشمانبيبيتوس Z314951
أطراف البيبيتتوماس ساينتفيكانظر التعليقات1000 وميكرو؛ الطول: 1159M42; 200 وميكرو؛ الطول: 1159M40; 20 وميكرو؛ L: 1159M43; 10 وميكرو؛ الطول: 1159M41
زجاجة تخزين بلاستيكية (500 مل)كورنينغ430282
خزان الكواشفسيلتريت3054-2007
RPMI-1640 (مع إل-جلوتامين، فينول ريد)جيبكو11875-085
الحجمأوهاوسرائددقة دنيا مطلوبة تبلغ 0.1 جرام
فلتر ستيريفليب (0.45 وميكرو؛ m)ميليبورSE1M003M00
سينبيرونيك F 108 (SF108)سيغما-ألدرتش07579-250G-Fالبوليمر المشترك الكتلي المستخدم لتعزيز نقل الخلايا التائية
قارورة زراعة الأنسجة - T150كورنينغ430825
قارورة زراعة الأنسجة - T25كورنينغ430639
قارورة زراعة الأنسجة - T75كورنينغ430641U
غطاء زراعة الأنسجةثيرمو ساينتفيكسلسلة 1300 A2
حاضنة زراعة الأنسجةثيرمو ساينتفيكهيراسيل 150i
صفيحة زراعة الأنسجة - 6-بئركورنينغ3516
لوحة زراعة الأنسجة - 96 بئر مسطحة القاعفالكون353072
لوحة زراعة الأنسجة - 96 بئر دائري قاع  فالكون353077
تريبسين-إيدتا (0.05٪)جيبكو25300-054
الأنابيب - أغطية برغبة بحجم 1.5 ملسارستيدت72692005
الأنابيب - 15 ملفالكون352099
الأنابيب - 5 ملMSP62-1028-2
الأنابيب - 500 ملكورنينغ431123
أنابيب - 50 ملفالكون352098
الطرد المركزي فوق الفائقبيكمان كولترأوبتيما XPN-100
دوار الطرد المركزي الفائق مع دلاءبيكمان كولترSW 32 Ti
محولات أنابيب الطرد المركزي فوق الفائق (للأنابيب المخروطية)سيتون ساينتفيك4230
أنابيب الطرد المركزي فوق الفائق (مخروطية)سيتون ساينتفيك5067
الدوامةفيشر ساينتيفك02215414
حمام مائي (37 ودرجة مئوية؛ C)فيشر ساينتيفكإيزوتمب 210تستخدم مع خرز لابرادور أمور (Gibco) بدلا من الماء
X-VIVO-15لونزا04-418Qوسائط خالية من المصل المستخدمة لتجميد الخلايا التائية

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sterner, R. C., Sterner, R. M. CAR-T cell therapy: current limitations and potential strategies. Blood Cancer J. 11 (4), 69(2021).
  2. Wagner, J., Wickman, E., Derenzo, C., Gottschalk, S. CAR T cell therapy for solid tumors: Bright future or dark reality. Mol Ther. 28 (11), 2320-2339 (2020).
  3. Hong, M., Clubb, J. D., Chen, Y. Y. Engineering CAR-T cells for next-generation cancer therapy. Cancer Cell. 38 (4), 473-488 (2020).
  4. Teppert, K., et al. Joining forces for cancer treatment: From "TCR versus CAR" to "TCR and CAR". Int J Mol Sci. 23 (23), 14563(2022).
  5. Aparicio-Perez, C., Carmona, M., Benabdellah, K., Herrera, C. Failure of ALL recognition by CAR T cells: a review of CD 19-negative relapses after anti-CD 19 CAR-T treatment in B-ALL. Front Immunol. 14, 1165870(2023).
  6. Roybal, K. T., et al. Precision tumor recognition by T cells with combinatorial antigen-sensing circuits. Cell. 164 (4), 770-779 (2016).
  7. Moghimi, B., et al. Preclinical assessment of the efficacy and specificity of GD2-B7H3 SynNotch CAR-T in metastatic neuroblastoma. Nat Commun. 12 (1), 511(2021).
  8. Roybal, K. T., et al. Engineering T cells with customized therapeutic response programs using synthetic notch receptors. Cell. 167 (2), 419-432.e16 (2016).
  9. Srivastava, S., et al. Logic-gated ROR1 chimeric antigen receptor expression rescues T cell-mediated toxicity to normal tissues and enables selective tumor targeting. Cancer Cell. 35 (3), 489-503.e8 (2019).
  10. Williams, J. Z., et al. Precise T cell recognition programs designed by transcriptionally linking multiple receptors. Science. 370 (6520), 1099-1104 (2020).
  11. Hyrenius-Wittsten, A., et al. SynNotch CAR circuits enhance solid tumor recognition and promote persistent antitumor activity in mouse models. Sci Transl Med. 13 (591), eabd8836(2021).
  12. Hernandez-Lopez, R. A., et al. T cell circuits that sense antigen density with an ultrasensitive threshold. Science. 371 (6534), 1166-1171 (2021).
  13. Choe, J. H., et al. SynNotch-CAR T cells overcome challenges of specificity, heterogeneity, and persistence in treating glioblastoma. Sci Transl Med. 13 (591), eabe7378(2021).
  14. Dull, T., et al. A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system. J Virol. 72 (11), 8463-8471 (1998).
  15. Kumar, M., Keller, B., Makalou, N., Sutton, R. E. Systematic determination of the packaging limit of lentiviral vectors. Hum Gene Ther. 12 (15), 1893-1905 (2001).
  16. Sweeney, N. P., Vink, C. A. The impact of lentiviral vector genome size and producer cell genomic to gag-pol mRNA ratios on packaging efficiency and titre. Mol Ther Methods Clin Dev. 21, 574-584 (2021).
  17. Rommel, P. C., et al. Engineering single-vector logic-gated CAR T cells with transgene sizes beyond current limitations. J Immunother Cancer. 14, e012318(2026).
  18. Improve Lentiviral Production Using Lipofectamine 3000 Reagent. , Thermo Fisher Scientific Inc. At https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cell-culture/cell-culture-learning-center/cell-culture-resource-library/cell-culture-transfection-application-notes/improve-lentiviral-production-using-lipofectamine-3000-reagent.html (2025).
  19. Subach, O. M., Cranfill, P. J., Davidson, M. W., Verkhusha, V. V. An enhanced monomeric blue fluorescent protein with the high chemical stability of the chromophore. PLoS One. 6 (12), e28674(2011).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

CAR
الفيديو قريباً

مقالات ذات صلة