تمت الموافقة على جميع الإجراءات من قبل لجنة أخلاقيات التابعة لمعهد الوخز بالإبر والتكسي ، الأكاديمية الصينية للعلوم الطبية الصينية (رقم D2023-01-29-01). تم الحصول على ثمانية فئران ذكور من Sprague Dawley (SD) (عمر 8 أسابيع ، 200-220 جم) من شركة التكنولوجيا الحيوية المحدودة (رقم الترخيص. SCXK (جينغ) 2020-0001). تم إيواء في حاويات عزل معقمة في ظل ظروف خاضعة للرقابة: دورة الضوء والظلام لمدة 12 ساعة ، ودرجة حرارة 21 ±± 2 درجة مئوية ، مع إمكانية الوصول إلى كريات الطعام القياسية والماء. امتثلت جميع التجارب للمبادئ التوجيهية المؤسسية ودليل رعاية واستخدام المختبر.
ملاحظة: يظهر مخطط انسيابي يسلط الضوء على الإجراءات الرئيسية في الشكل 1.
1. تحضير والمتتبع: فلورسين الصوديوم (FS)
- لتحضير محلول تلطيخ الفلورسين الصوديوم (FS) بنسبة 1٪ ، قم بإذابة 0.1 جم من FS في 10 مل من محلول ملحي معقم (0.9٪ كلوريد الصوديوم). قم بتخزين المحلول في درجة حرارة الغرفة (RT) للاستخدام اللاحق.
- تخدير الفئران SD عن طريق تحريض الأيزوفلوران (الحث: 5٪ إيزوفلوران, صيانة: 2.5٪ إيزوفلوران). أزيلي الشعر من منطقة الجمجمة (باستثناء الرأس) باستخدام ماكينات قص كهربائية ، ثم ضعي كريم مزيل الشعر لمدة 5 دقائق. تخلص من بقايا الكريم والشعر عن طريق الشطف بالماء الدافئ.
ملاحظة: حافظ على شفرة المقص موازية لسطح الجلد أثناء التشغيل لمنع إصابة الجلد التي قد تضر بتحليل التصوير الكمي. يجب استخدام الماء الدافئ بشكل صارم للشطف لتجنب انخفاض حرارة الجسم في الذي يؤثر على النتائج التجريبية.
2. حقن FS
- تأمين الفئران.
- تخدير الفئران التي تمت إزالتها من الشعر عن طريق الحقن داخل الصفاق بنسبة 10٪ من اليوريثان (1 جم / 10 مل ، في محلول ملحي) بجرعة 1.0 جم / كغ.
- عند تحقيق التخدير الكامل ، قم بتأمين في وضع ضعيف على منصة التشغيل. ضع قرصة إصبع القدم اللطيفة على المخلب الخلفي باستخدام الملقط ولاحظ عدم وجود منعكس الانسحاب. تحقق من فقدان منعكس القرنية عن طريق لمس القرنية برفق بطرف قطني رطب.
- تأكد من عدم الاستجابة المستمرة ومعدل التنفس المستقر قبل متابعة الإجراء. أثناء التخدير ، حافظ على درجة حرارة جسم باستخدام وسادة تسخين 37 درجة مئوية.
ملاحظة: يجب تأكيد التخدير الكامل لمنع الحركات اللاإرادية التي من شأنها أن تضر بنقل نافذة التصوير.
- يتم إعطاء محلول FS 1٪ عن طريق الوريد عبر وريد الذيل بجرعة 0.1 مل لكل 100 جرام من وزن الجسم.
- قم بإجراء حقن وريد الذيل باستخدام حقنة سعة 1 مل مزودة بإبرة 27 جرام. امسح الذيل برفق بالماء الدافئ لتعزيز توسع الأوعية ، متبوعا بالتطهير بنسبة 70٪ من الإيثانول.
- أدخل الإبرة المخطوفة لأعلى بزاوية ضحلة (≤15 درجة) على طول المحور الطولي للوريد. حقن المحلول ببطء بمعدل 0.1-0.2 مل / دقيقة.
- ضمان التدفق التقني الخالي من المقاومة ، وعدم وجود وذمة حول الأوعية الدموية ، وتأكيد الحقن الناجح عن طريق تغير لون التلاميذ والصيوان والكفوف.
ملاحظة: يجب تجنب الحقن العرضي داخل الشرايين بدقة.
3. إعداد الفحص المجهري بالليزر متحد البؤر (pCLE) في الجسم الحي
- قم بتنشيط نظام pCLE وتحقق من نظافة كل من موصل مسبار المسح الضوئي والطرف البعيد.
- نظف الطرف البعيد للمسبار (يسمى أيضا طرف المسح) باستخدام قطعة قطن مبللة بالمحلول الملحي الفسيولوجي ، ثم جففها برفق باستخدام أنسجة العدسة.
- ضع مسبار الليزر في موقع المراقبة المستهدف (على سبيل المثال ، منطقة الفخذ الإنسي). قم بتأمين مسبار التصوير متحد البؤر باستخدام مشبك قابل للتعديل ، مما يضمن ملامسة ثابتة لسطح الأنسجة بدون قطع أثرية مضغوطة ، وقم بإصلاحه عن طريق إحكام ربط مقبض الضبط.
- قم بتوصيل المسبار بنظام pCLE وقم بتكوين معلمات الاستحواذ (على سبيل المثال ، مجال الرؤية [FOV] ، دليل التخزين). المعلمات المحددة المستخدمة في هذه التجربة هي كما يلي: العمق: 18 ميكرومتر ؛ الليزر: 219 ميغاواط ؛ السطوع: 76٪ ؛ السرعة: 1920 × 540 ؛ الكسب: 2400 ؛ التكبير: 1× (464 ميكرومتر) ؛ الفلتر: LP 515 ؛ جدول البحث: مسح ضوئي رمادي.
ملاحظة: تم تحسين معلمات التصوير (عمق المسح / طاقة الليزر) بشكل متكرر حتى يتم تحقيق تصور مميز لبنية الأنسجة. الكثافة المتسقة أمر بالغ الأهمية لقابلية مقارنة الصورة الطولية. أدت إضافة قطرات محلول ملحي 37 درجة مئوية في واجهة أنسجة المسبار إلى القضاء على فقدان الإشارة الذي لوحظ في التكرارات الأولية. قوة الليزر المستخدمة في هذه الدراسة أقل من العتبة المقبولة عموما للسمية الضوئية في التصوير متحد البؤر في الجسم الحي .
4. تصوير الهيكل التنظيمي باستخدام pCLE والاستحواذ
- ضع المسبار على سطح الجلد وابدأ الحصول على البيانات لتصور بنية الأنسجة.
- امسك المسبار بطريقة قبضة قلم رصاص ؛ قم بالمناورة للمناطق المستهدفة (على سبيل المثال ، المناطق ذات الأوعية الدموية أو النسيج الضام الليفي داخل مجال الرؤية) ، ضع الطرف البعيد مباشرة على منطقة التصوير ، ثم استقر عبر ذراع المسبار.
- أولا ، اكتساب بنية الأنسجة الأساسية لمدة 1 دقيقة في ظل الظروف الفسيولوجية ، متبوعا بتسجيل 5 دقائق أثناء التدخل في الوخز بالإبر. إنهاء الاستحواذ بعد التدخل. يتم حفظ ملفات البيانات تلقائيا في الدليل المحدد في الخطوة 3.3-3.4.
ملاحظة: يتم حفظ الملفات كمكدسات طبقات (.tiff) وإطارات فردية (.tiff).
5. التدخل في الوخز بالإبر
ملاحظة: يتم إجراء الاستحواذ في خطوة التصوير أثناء التدخل.
- أدخل إبرة من الفولاذ المقاوم للصدأ 1-cun (الوحدة الصينية لقياس الطول حوالي 13 مم) يمكن التخلص منها في نقطة الوخز المجاورة للأنسجة التي تمت ملاحظتها من قبل المسبار. قم بتوصيل سلك واحد بإبرة الفولاذ المقاوم للصدأ ، وقم بتأمين القطب المرجعي الآخر على ذيل الفئران.
- تطبيق التحفيز بالوخز بالإبر الكهربائية (EA) باستخدام المعلمات التالية: شدة 1 مللي أمبير، موجة كثيفة مشتتة (2/15 هرتز)، لمدة 5 دقائق.
ملاحظة: حافظ على مسافة كافية (>3 مم) بين موقع إدخال الإبرة والمسبار لمنع الهزات الجلدية الناجمة عن EA والتي تعرض ثبات الصورة للخطر.
6. تحليل الصور
- افتح مكدسات الصور المكتسبة في ImageJ. قم بتحويل المعايرة المكانية إلى ميكرومتر وتحويل تنسيق الصورة إلى 8 بت لتوافق المكون الإضافي (الصورة > النوع > 8 بت).
ملاحظة: أبعاد الصورة الافتراضية بالبوصة (إعداد خاص بالنظام).
- تحديد منطقة الاهتمام (ROIs) من أجل: دوران الأوعية الدقيقة: جزء شعري واحد ، هيكل المصفوفة: منطقة ألياف الكولاجين. حافظ على عائد استثمار متطابق عبر الصور المتسلسلة لتحقيق الاتساق الطولي.
- تحليل دوران الأوعية الدقيقة
- حدد المنطقة التي تحتوي على خلايا الدم الحمراء التي يجب ملاحظتها، واقتصاص الصورة لإزالة المناطق الأخرى المتداخلة (مستطيل > صورة > اقتصاص). استخدم أداة العتبة لتقسيم خلايا الدم الحمراء (RBC) حصريا (الصورة > أداة ضبط العتبة >).
- قم بتحميل المكون الإضافي MTrack2 . قم بتعيين معلمات التتبع المناسبة بناء على حجم كرات الدم الحمراء (في هذه التجربة ، 10-42 بكسل) لاستبعاد التداخل وضمان تتبع RBC بدقة (تتبع > المكون الإضافي > MTrack2).
- التحليل الهيكلي للمصفوفة
- قم بتحميل المكون الإضافي Directionality ، وحدد وضع مكونات فورييه ، وقم بإجراء تحليل إحصائي على نسبة توزيع ألياف الكولاجين عبر اتجاهات 0 درجة إلى 180 درجة (تحليل > الاتجاه).
7. وضع اللمسات الأخيرة على البيانات
- قم بتصدير البيانات التي تم تحليلها بتنسيقات TIFF / XSL باستخدام اصطلاح التسمية: [Group]_[Date].extension. قم بعمل نسخة احتياطية من جميع الملفات الأولية والمعالجة إلى خادم آمن معين. سجل المخرجات الكمية في جدول بيانات موجز للتحليل الإحصائي.
8. السلامة وإدارة النفايات
- معدات الحماية الشخصية (PPE): ارتد قفازات النتريل ومعطف المختبر ونظارات واقية عند التعامل مع اليوريثان أو الأيزوفلوران أو الفلورسين الصوديوم.
- التعامل مع التخدير: قم بإجراء الإجراءات التي تتضمن اليوريثان أو الأيزوفلوران داخل غطاء الدخان لتقليل التعرض للاستنشاق.
- احتياطات الأدوات الحادة: تخلص من جميع الإبر والأشياء الحادة على الفور في حاويات الأدوات الحادة المقاومة للثقب.
- سلامة الوخز بالإبر الكهربائية (EA): تحقق من العزل الكهربائي لمعدات EA وتأمين توصيلات الرصاص لمنع تيارات التسرب أو الدوائر القصيرة.
- التخلص من النفايات: تخلص من زجاجات الأيزوفلوران كنفايات طبية وفقا للإرشادات المؤسسية. تخلص من نفايات المواد الملوثة بالصبغة (مثل المسحات والأنسجة) في حاويات نفايات خطرة محكمة الغلق. اجمع الأدوات الحادة في صناديق التخلص من الأدوات الحادة المعتمدة.
ملاحظة: يجب أن تتوافق جميع الإجراءات مع لوائح السلامة المؤسسية والصحة البيئية.