مقالة منهجية

تشريح ذبابة الفاكهة سوداء الجلد عضلات الطيران غير المباشرة لنهج الفحص المجهري

1.9K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/69185

⸱

نوفمبر 7, 2025

 ,  ,  , 
1Division of Biological and Biomedical Systems, School of Science and Engineering, University of Missouri Kansas City

في هذه المقالة

ملخص

ذبابة الفاكهة هو نموذج قوي لفهم الآليات الأساسية لتكوين العضلات. يتيح هذا البروتوكول الخاص بتشريح وتحضير المقاطع النصفية للصدر التحليل المجهري لعضلات الطيران غير المباشرة من مرحلتي العذراء والبالغين. يتيح هذا البروتوكول التصوير متحد البؤر للتشكل الخلوي ، وتوطين البروتين ، وبنية العضلات ، وجوانب أخرى متعددة من تكوين العضلات.

الملخص

عضلات الطيران غير المباشرة (IFMs) من ذبابة الفاكهة سوداء الصباغة هي نموذج جيني قوي لاستكشاف المبادئ الأساسية لتكوين العضلات. يتم الحفاظ على آلية الانقباض والعديد من مكونات الساركومير من الذباب إلى الفقاريات ، مما يتيح دراسة العمليات الخلوية من تنظيم النسخ ومعالجة الحمض النووي الريبي إلى التمثيل الغذائي وعلم الأحياء الميكانيكية الذي يوجه ويضبط نمو العضلات. يتم تغيير العديد من هذه المسارات الخلوية في الاعتلالات العضلية البشرية ، وتوفر دراسات IFM نظرة ثاقبة ذات صلة بالمسببات الجزيئية لأمراض العضلات. على وجه الخصوص ، الذباب مناسب تماما للفحص المجهري لتحليل الألياف العضلية ومورفولوجيا الأورام العضلية ووظيفتها عبر العملية الكاملة لتكوين العضلات IFM ، من مواصفات الأرومة العضلية إلى تكوين اللييفات العضلية ونضجها وصيانتها. هنا ، يتم تقديم بروتوكول لتشريح D. melanogaster IFMs في النقاط الزمنية للعذراء والبالغين لمناهج الفحص المجهري. يتم توفير بروتوكولات مصورة لتشريح نصفي الصدر للعذراء المتأخرة والبالغين IFMs ، بالإضافة إلى تشريح الكتاب المفتوح ل IFMs المبكرة للعذراء. يتم وصف إجراءات التثبيت والتلوين وتركيب العينات وقطع القطع الأثرية الشائعة ، مع بيانات تمثيلية توضح توافق تشريح IFM مع كواشف التثبيت المختلفة. يتم تطبيق هذه البروتوكولات لدراسة أليل SmnE33 hypomorphic للخلايا العصبية الحركية للبقاء على قيد الحياة للبروتين المرتبط بالحمض النووي الريبي (Smn) بعد 26 ساعة من تكوين الشرانق (APF) ، 72 ساعة APF ، وفي IFMs البالغين ، مما يوفر نظرة ثاقبة جديدة لنموذج ضمور محرك العمود الفقري (SMA) ويوضح المنفعة العامة لهذا البروتوكول. يسهل هذا البروتوكول التفصيلي الوصول إلى نظام نموذج IFM والحصول على بيانات الفحص المجهري عالية الجودة للتحقيق في مبادئ تكوين العضلات.

المقدمة

تمتلك مئات العضلات التي تتحكم في الحركات المختلفة ، من تمكين التنقل إلى تسهيل الكلام إلى الإمساك بالأداة. لدعم مثل هذه المجموعة الواسعة من الوظائف ، تختلف العضلات في الحجم ، والتعلق ، والقدرة على الانقباض ، والتمثيل الغذائي ، والتعبير الجيني1. ينصب التركيز الرئيسي في مجال بيولوجيا العضلات على فهم كيفية ظهور هذه الاختلافات الهيكلية والوظيفية أثناء التطور وتغيرها في أمراض العضلات2. يتم تشغيل تقلص العضلات بواسطة الأورام العضلية المبنية بخيوط رفيعة تحتوي على الأكتين مثبتة في القرص Z والتي تتداخل مع خيوط سميكة تحتوي على الميوسين ثنائي القطب والمثبتة في الخطM 3. يتم تنظيم الساركومير من طرف إلى طرف في اللييفات العضلية ، ويظهر هذا الترتيب المنتظم في العضلات المخططة على شكل أشرطة ضوئية وداكنة متناوبة تحت المجهر4 ، مما يوفر طريقة بصرية عملية لمراقبة التغيرات في تجميع العضلة العضلية وتنظيمها. بالاقتران مع علم الوراثة والأساليب الكيميائية الحيوية ، قدم الفحص المجهري رؤى مهمة في العمليات الخلوية مثل تنظيم النسخ ، ومعالجة الحمض النووي الريبي ، والتمثيل الغذائي ، والتحويل الميكانيكي5،6،7 التي توجه وتضبط نمو العضلات ووظيفتها. تتعطل العديد من هذه العمليات الخلوية في الاعتلال العضلي البشري والاضطرابات العصبية العضلية8،9 ، مما يؤكد أهمية فهم نمو العضلات لاكتساب نظرة ثاقبة لمسببات أمراض العضلات. يضمن التقدم في الهندسة الوراثية ، مما يتيح التلاعب بالخلايا الفردية ووضع العلامات الداخلية للبروتينات10،11 إلى جانب التقدم التكنولوجي في الحصول على الصور والدقة12،13 الأهمية المستمرة للفحص المجهري لأبحاث العضلات. وبالتالي ، فإن الأنظمة النموذجية ذات البروتوكولات الواضحة وسهلة التنفيذ لتشريح العضلات وإعداد العينة ذات قيمة في مجال العضلات.

عضلات الطيران غير المباشرة (IFMs) من D. melanogaster هي نموذج قوي وجيد الخصائص لدراسة المبادئ الأساسية لتكوين العضلات8. تتكون IFMs من ست عضلات ظهرية طولية (DLMs) لكل نصفي تتشكل على قوالب عضلات اليرقات وسبعة ألياف عضلية ظهرية بطنية (DVMs) تم بناؤها من جديد أثناء نمو العذراء14. نظرا لإمكانية الوصول إليها بالقرب من خط الوسط ، تركز العديد من دراسات IFM على DLMs ، وهي أكبر عضلة في الذباب البالغ تمتد على طول 1 مم بالكامل من الصدر15. في بداية التشرنق ، تهاجر الأرومات العضلية IFM من مكانها على مفصلي قرص الجناح إلى الصدر ، حيث تندمج لتشكيل أنابيب عضلية مخلوية16. بعد ربط الأوتار حوالي 24 ساعة APF عند 27 درجة مئوية ، تنظم الألياف العضلية IFM تدريجيا السيتوبلازم والهيكل الخلوي ، وتضغط ، وتبدأ تكوين الألياف العضلية من 30-32 ساعة APF17. تضاف الأورام العضلية الجديدة إلى اللييفات العضلية وتنمو الألياف العضلية لملء الصدر حتى حوالي 48 ساعة APF. ثم تخضع IFMs لعملية نضج متوافقة مع التغييرات في كل من النسخ والتضفير التي تعزز اكتساب خصائص التمثيل الغذائي والتقلص للبالغين وتنشيط التمدد18. الذباب البالغ يقترب من حالة العذراء بين 90 ساعة و 100 ساعة APF عند 27 درجة مئوية ، وفي حوالي 100 ساعة APF (الإناث في حوالي 98 ساعة APF والذكور عند حوالي 102 ساعة APF) عند 25 درجة مئوية19. IFMs هي نظام نموذجي متعدد الاستخدامات وملائم. يمكن مراقبتها في جميع مراحل تكوين العضلات ، وهي متميزة شكليا ووظيفيا عن أنواع الألياف العضلية الأخرى في الذبابة ، وتستفيد من مجموعة متنوعة من الأدوات الجينية التي يمكن الوصول إليها ونهج التلاعب8،20. يتم الحفاظ على آلية الانقباض ، ومورفولوجيا الساركومير الأساسية ، والعديد من المكونات الهيكلية من الذباب إلى الفقاريات5 ، مما يتيح ترجمة المبادئ العضلية من الذباب إلى البشر. في الواقع ، قدمت نماذج الذباب للأمراض العصبية العضلية مثل الحثل العضلي ، والضمور الحركي للعمود الفقري (SMA) ، والاعتلالات العضلية العضلية العضلية ، والاعتلالات الشعاعية رؤى مسببات وعلاجية21،22. والجدير بالذكر أن الذباب مناسب تماما للفحص المجهري لتحليل الألياف العضلية ومورفولوجيا الساركومير عبر تكوين العضلات ، من مواصفات الأرومة العضلية إلى تكوين الليفي العضلي إلى نضوج الساركومير وصيانته.

تم استخدام ذبابة الفاكهة IFMs لتطبيقات الفحص المجهري لأكثر من أربعة عقود ، مما ساهم بشكل كبير في فهم نمو العضلات وتطورها8. خلال هذا الوقت ، تم تكييف بروتوكولات تشريح IFM باستمرار مع تقدم التكنولوجيا ، مما أدى إلى مجموعة واسعة من البروتوكولات المقدمة بمستويات متغيرة من التفاصيل التي تعتبر مثالية للبعض ودون المستوى الأمثل لتقنيات التصوير الأخرى. على سبيل المثال ، تتضمن البروتوكولات التي تم تطويرها للفحص المجهري الإلكتروني ظروف تثبيت قوية ، وتقسيمات فائقة النحافة ، وتلوين التباين بالمعادن الثقيلة3،23،24،25 ، ولكنها ليست مثالية للفحص المجهري الضوئي. البروتوكولات التي تم تطويرها لتشريح IFMs بسرعة من الصدر لاستخدامها في المقايسات البيوكيميائية أو التحليلات الجزيئية26،27 تفقد سياق الأنسجة ويمكن أن تعطل بنية اللييفات العضلية ، وبالتالي فهي دون المستوى الأمثل لأساليب الفحص المجهري. تم تطوير مناهج التشريح لتحليل عضلة اليرقات أو عضلات البطن البالغة20،28 ، ولكنها ليست مثالية لعزل IFMs السليمة. تتطلب مناهج التصوير المباشر إما تشريحا طفيفا التوغل أو وسائط خاصة للحفاظ على أنسجة IFM على قيد الحياة أثناء عملية التصوير29،30 ، ولا تتضمن خطوات التثبيت اللازمة للحفاظ على العضلات للكيمياء المناعية. توجد بروتوكولات متعددة لتضمين البارافين أو التقسيم بالتبريد لأنسجة IFM وهي متوافقة مع الكيمياء النسيجية أو تلطيخ الأجسام المضادة27،31،32 ، ولكن هذه الأساليب تتضمن عادة التجميد وجفاف الأنسجة التي يمكن أن تغير البنية الفوقية للعضلات وتحد من التعرف على بعض المستضدات بواسطة الأجسام المضادة الأولية. تحافظ البروتوكولات التي تصلح بشكل مباشر على IFMs على مورفولوجيا العضلات وتحد من التغيرات في تشكل المستضد وهي مرغوبة للعديد من تجارب الكيمياء المناعية24. ومع ذلك ، تستهدف هذه البروتوكولات أيضا تطبيقات محددة ، على سبيل المثال ، البروتوكولات التي تفصل IFMs التي تتيح تحليل اللييفة العضلية المفردة عن طريق التألق أو cryoEM أو الفحص المجهري فائق الدقة20،33،34. تشمل الأمثلة الأخرى بروتوكولات لتشريح ألياف IFM السليمة من الصدر32،35 أو لتوليد مستحضرات كاملة أو نصفية20،32،36 تتيح تحليل كل من الألياف العضلية والعضلة العضلية في سياق سليم. قد يكون من الصعب على مستخدم جديد فرز العدد الكبير من البروتوكولات الحالية ، والتي يعتمد معظمها على النص. سيستفيد المتدربون والباحثون الجامعيون من بروتوكول تشريح IFM المفصل كما هو مطبق على تطبيقات الكيمياء المناعية القياسية.

تتضمن هذه المقالة سلسلة من البروتوكولات لتشريح وتحضير D. melanogaster IFMs في مراحل العذراء والبالغين لمناهج الفحص المجهري للكيمياء المناعية. تم استخدام هذا النهج في المنشورات الحديثة التي تتبع الوظائف التنموية للبروتينات المرتبطة بالحمض النووي الريبي Bruno137 و Rbfox138 في جميع أنحاء تكوين عضل IFM. يتضمن البروتوكول رسوما توضيحية مفصلة وصورا خطوة بخطوة لتوجيه المستخدمين المحتملين من خلال تشريح نصفي الصدر IFM للبالغين والعذراء المتأخرين (48 ساعة إلى 96 ساعة APF) IFMs ، حيث يتم تقسيم الصدر على طول خط الوسط ، مما يحافظ على بنية الألياف العضلية سليمة. بالإضافة إلى ذلك ، يغطي هذا البروتوكول تشريح الكتاب المفتوح لمراحل العذراء المبكرة (من 8 ساعات إلى 48 ساعة APF) ، حيث يتم شق الجزء البطني من الصدر ورفعه ، مثل فتح كتاب ، لفضح IFMs السليمة المرتبطة بالبشرة الظهرية. تشمل الخطوات الإضافية في البروتوكول التثبيت والتلوين وتركيب العينات ، وتظهر البيانات التمثيلية أن هذا النهج متوافق مع طرق التثبيت المتنوعة لإعداد الأنسجة للكيمياء المناعية والفحص المجهري الفلوري. يتم توفير أمثلة تمثيلية لمساعدة المستخدمين الجدد في تحديد القطع الأثرية الشائعة للتشريح. يتم تطبيق البروتوكول لتحليل النمط الظاهري التنموي IFM ل SmnE33 ، وهو أليل ناقص الشكل للخلايا العصبية الحركية للبقاء على قيد الحياة (Smn) يستخدم كنموذج ذبابة لضمور محرك العمود الفقري (SMA) 21،39 ، عند 26 ساعة APF ، 72 ساعة APF ، وفي IFMs للبالغين. توفر البيانات المعروضة هنا نظرة ثاقبة على الوظيفة الخاصة بالعضلات ل Smn وتسلط الضوء على قابلية تطبيق بروتوكول التشريح هذا لدراسة نمو العضلات ومسببات أمراض العضلات.

البروتوكول

البيان الأخلاقي:
تستخدم جميع التجارب في هذا البروتوكول ذبابة الفاكهة السوداء ، وهي حشرة هولوتابولوس. لا تخضع اللافقاريات للوائح الرفق بالحيوان في الولايات المتحدة الأمريكية ، ولا يتطلب استخدامها موافقة أخلاقية. تم إجراء جميع الأعمال وفقا لإرشادات السلامة البيولوجية المؤسسية القياسية وسلامة المختبرات ، وتمت الموافقة عليها من قبل لجنة السلامة البيولوجية المؤسسية بجامعة ميسوري كانساس سيتي بموجب البروتوكول رقم 21940 (22-11).

1. تشريح Hemithorax للبالغين IFM (الشكل 1)

  1. قم بتجميع المستلزمات اللازمة ، بما في ذلك ملقط Dumont # 5 مع أطراف علم الأحياء ، وملقط Dumont # 3 ، وزوج من مقص Vannas الربيع ، وماصة بلاستيكية ، وفرشاة طلاء ، ولوحة 24 بئرا ، ومناديل خالية من النسالة ، وشريحة مجهر ، وشفرات cryostat (انظر جدول المواد). قم بإعداد 1x PBS و 0.05٪ PBS-T ومحاليل التثبيت (انظر الملف التكميلي 1). تتوفر نظرة عامة على مخطط التدفق لتشريح نصفي الصدر للبالغين التالي (الشكل التكميلي 1).
  2. اجمع البالغين من النمط الجيني والعمر المطلوبين (على سبيل المثال ، مغلق حديثا ، أو بالغ في يوم واحد ، أو بالغ لمدة 5 أيام). تخدير ذباب عينة على ثاني أكسيد الكربون2 أو الجليد.
    ملاحظة: تمت زراعة الذباب المستخدم في هذا البروتوكول في دورة ليلية مدتها 12 ساعة في اليوم: 12 ساعة في حاضنة يتم التحكم في درجة الحرارة والرطوبة. تزرع ذبابة الفاكهة بشكل قياسي عند 25 درجة مئوية أو 27 درجة مئوية ، ويمكن زراعتها عند 18 درجة مئوية ، مما يمتد دورة النمو من 10 أيام إلى حوالي 20 يوما.
  3. استخدم ماصة بلاستيكية لنقل قطرة من 1x PBS40 إلى شريحة مجهر تحت مجهر تشريح ستيريو.
  4. انقل ذباب العينة إلى قطرة PBS في مجموعات صغيرة باستخدام فرشاة طلاء أو ملقط (الشكل 1 أ). قم بإزالة الرأس (الشكل 1 ب) والأجنحة (الشكل 1 ج - د) والبطن (الشكل 1 ه) باستخدام مقص زنبركي فاناس. اترك الساقين متصلتين (الشكل 1F).
  5. انقل الصدر برفق باستخدام فرشاة أو ملقط إلى محلول تثبيت 500 ميكرولتر في بئر واحد من صفيحة 24 بئرا. ثبت المدة الزمنية المطلوبة (عادة 15-60 دقيقة) على شاكر المغذيات / الهزاز.
    ملاحظة: هذا البروتوكول متوافق مع مخازن التثبيت المتعددة ، بما في ذلك بارافورمالديهايد ، والجلوتارالديهايد ، والميثانول ، ومحلول الغليوكسال ، وغيرها. راجع النتائج التمثيلية والملف التكميلي 1 للحصول على تفاصيل حول تحسين ظروف التثبيت. يجب التعامل مع المثبتات باستخدام القفازات ومعدات الحماية الشخصية المناسبة (PPE) وفقا لإرشادات المواد الكيميائية الخطرة لمؤسستك.
  6. قم بإزالة المثبت باستخدام ماصة 200 ميكرولتر واغسلها في 1 مل من PBS-T بنسبة 0.05٪ على جهاز تغذية / شاكر هزاز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: تخلص من المثبت باتباع إرشادات المؤسسة الكيميائية الخطرة. بالنسبة لمعظم المستضدات ، يمكن تخزين الصدر الثابت في 1 مل من 0.05٪ PBS-T لمدة تصل إلى أسبوعين عند 4 درجات مئوية قبل القطع والتلطيخ. يجب اختبار تركيزات أعلى من Triton X-100 قبل الاستخدام ، لأن الحضانات الطويلة في المنظفات يمكن أن تؤدي إلى تدهور بنية الساركومير.
  7. قم بإزالة المخزن المؤقت باستخدام ماصة 200 ميكرولتر وانقل الصدر باستخدام فرشاة أو ملقط إلى قطرة بنسبة 0.05٪ PBS-T على شريحة مجهر تحت مجهر تشريح ستيريو.
  8. قم بتوجيه الصدر مع توجيه الفرط لأعلى واستقراره بين زوج من ملقط Dumont # 3 (الشكل 1G-H).
  9. حرك شفرة cryostat عبر الصدر لإحراز السطح السترويجي (الشكل 1H ، J ، L) ، ثم قم بقصها بضربة واحدة سلسة لأسفل على طول خط الوسط (الشكل 1I ، J ، L - N) لتوليد المقطع النصفي للصدر الذي يعرض IFMs (الشكل 1 ك).
    ملاحظة: من المهم أن تكون البشرة "محززة" أو متشققة قبل قطع IFMs لتجنب تمدد القطع الأثرية التي تلحق الضرر ببنية الساركوم. لا "تشاهد" الشفرة ذهابا وإيابا ، لأن هذه الحركة تلحق الضرر ميكانيكيا ب IFMs ، مما يؤدي إلى تهترية اللييفات العضلية. يؤدي الكثير من المخزن المؤقت إلى زعزعة استقرار الصدر بين الملقط ويجعل القطع أكثر صعوبة. تشمل الأساليب البديلة تثبيت الصدر واحدا تلو الآخر على شريط مزدوج العصا لتسهيل الجروح ، وكذلك القطع من الجانب البطني للصدر.
  10. انقل نصفي الصدر إلى موضع على الشريحة حيث سيظلان مغطاة في المخزن المؤقت لتجنب الجفاف ، لكنهما ليسا في طريق الجروح المستقبلية. كرر الخطوات 1.8-1.10 حتى يتم قطع جميع الصدر.
  11. استخدم ملقطا لنقل نصف مقاطع الصدر من شريحة المجهر إلى 500 ميكرولتر من 0.05٪ PBS-T في بئر واحد من صفيحة مكونة من 24 بئرا واستمر في الحجب والتلوين المناعي (انظر القسم 4 أدناه).

2. تشريح الميثوراكس للعذراء المتأخرة IFM (~ 48 ساعة إلى 96 ساعة APF) (الشكل 2 ، الشكل 3)

  1. مرحلة الشرانق من النمط الجيني المطلوب والعمر إلى النقطة المحددة في نمو العذراء (الشكل 2). اجمع ذكور أو أنثى شرانق بيضاء مسبقة (الشكل 2 أ ، ب) باستخدام فرشاة رسم مبللة واحتضان على ورق ترشيح مبلل في طبق مزرعة خلايا مقاس 60 مم. تم وصف التدريج العذراء وإزالته من حالة العذراء سابقا20،26.
    ملاحظة: تخضع الشرانق لتغيرات مورفولوجية متعددة مع تقدمها في العمر ، مثل انعكاس الرأس وتصبغ حالة العذراء والعينين والشعيرات19،41 (الشكل 2 ج). يمكن استخدام هذه السمات المورفولوجية كدليل تقريبي لتحديد عمر الخادرة (الشكل 2D-E) ولتحديد الشرانق التي تفشل في النمو بشكل طبيعي (الشكل 2F). ومع ذلك ، لضمان جدول زمني دقيق للتدريج ، يوصى بجمع الشرانق البيضاء المسبقة في نوافذ زمنية ضيقة ، على سبيل المثال التدريج كل 30 دقيقة أو كل ساعتين. تعد النقاط الزمنية المرحلية بإحكام ضرورية للتمييز بين التغيرات الرئيسية في بنية الهيكل الخلوي وطول الألياف العضلية التي تحدث من 24 ساعة إلى 35 ساعة APF ، وكذلك لتمييز الاختلافات في بنية الساركومير في 35 ساعة و 48 ساعة و 60 ساعة و 72 ساعة و 80 ساعة و 90 ساعة APF18,42.
  2. قم بتجميع المستلزمات اللازمة ، بما في ذلك فرشاة الطلاء ، وملقط Dumont # 5 مع أطراف علم الأحياء ، وزوج من مقص Vannas الربيعي ، وشريط مزدوج العصا ، وشريحة مجهر ، وماصة بلاستيكية ، ولوحة 24 بئرا ، و Kimwipes ، وشفرات cryostat (انظر جدول المواد). قم بإعداد 1x PBS و 0.05٪ PBS-T ومحاليل التثبيت (انظر الملف التكميلي 1). تتوفر نظرة عامة على مخطط التدفق لتشريح نصفي العذراء التالي (الشكل التكميلي 2).
  3. في النقطة الزمنية المطلوبة ، استخدم فرشاة رسم لنقل الشرانق من ورق الترشيح إلى شريط من شريط مزدوج العصا ملتصق بشريحة مجهر تحت مجهر تشريح ستيريو بتكبير 10-20x (الشكل 3 أ ، ب). اصطف الشرانق على الشريط المواجه لنفس الاتجاه ، بحيث يكون الجانب البطني لأسفل.
  4. استخدم زوجا من الملقط # 5 لفتح الجزء الأمامي من حالة العذراء للخادرة الأولى ، وإزالة العمرة برفق (المنطقة فوق الرأس) (الشكل 3C ، D ، I).
  5. استخدم ملقطا # 5 بعناية للشق على طول علبة العذراء الظهرية إلى الجناح وقشر علبة العذراء بعيدا عن الخادرة بزيادات قدرها 1-2 مم. قم بلصق علبة العذراء على الشريط ذو العصا المزدوجة كما يعمل المرء من الأمام إلى الخلف (الشكل 3E - G ، I). تجنب وخز الخادرة نفسها ، بدلا من ذلك أدخل طرف الملقط بين علبة العذراء والغشاء القاعدي / كيس العذراء المحيط بالخادرة.
  6. بعد إزالة العلبة ، استخدم حركة الغرف مع الملقط لرفع أسفل (الشكل 3H ، I) وانقل الخادرة برفق من العلبة إلى قطرة 1x PBS على شريحة مجهر ثانية (الشكل 3J ، K) لتجنب الجفاف. كرر الخطوات 2.4-2.6 (الشكل 3I) حتى تتم إزالة جميع الشرانق من حالة العذراء.
  7. قم بإزالة البطن من الشرانق المشرحة باستخدام مقص زنبركي فاناس (الشكل 3 لتر).
    ملاحظة: تتم إزالة البطن لتمكين اختراق أفضل عن طريق التثبيت في الخطوة التالية. لتجنب إتلاف الصدر ، قم بقطع البطن مباشرة ، مع ترك ما يصل إلى 30٪ من البطن ملتصقا بالصدر.
  8. انقل رأس العذراء برفق مع الصدر (الشكل 3M) باستخدام فرشاة أو ملقط إلى 500 ميكرولتر من محلول التثبيت في بئر واحد من صفيحة 24 بئرا. قم بإصلاح المدة الزمنية المطلوبة (عادة 15-60 دقيقة) واغسلها في 1 مل من 0.05٪ PBS-T كما هو موضح في الخطوات 1.5-1.6.
  9. قم بإزالة المخزن المؤقت باستخدام ماصة 200 ميكرولتر وانقل الصدر باستخدام فرشاة أو ملقط إلى قطرة بنسبة 0.05٪ PBS-T على شريحة مجهر تحت مجهر تشريح ستيريو تحت تكبير 10x.
  10. افصل عينة واحدة عن الباقي وقم بتوجيهها مع الجانب البطني لأسفل واستقرارها بين زوج من ملقط Dumont # 3 (الشكل 3N).
  11. حرك شفرة cryostat عبر الصدر حتى يتم فتح الغشاء القاعدي والبشرة ، ثم قم بقصها بضربة واحدة سلسة لأسفل على طول خط الوسط (الشكل 3O) لتوليد المقاطع النصفية للصدر التي تعرض IFMs (الشكل 3 ص).
    ملاحظة: لا "تشاهد" الشفرة ذهابا وإيابا، لأن هذه الحركة تلحق الضرر ميكانيكيا ب IFMs مما يؤدي إلى تآكل اللييفات العضلية. يؤدي الكثير من المخزن المؤقت إلى زعزعة استقرار الصدر بين الملقط ويجعل القطع أكثر صعوبة. يمكن قطع الصدر العذراء مع توصيل الرأس وتوجيهه إما نحو اليسار أو اليمين.
  12. انقل نصفي الصدر إلى موضع على الشريحة حيث سيظلان مغطاة في المخزن المؤقت لتجنب الجفاف ، لكنهما ليسا في طريق الجروح المستقبلية. كرر الخطوات 2.10-2.12 حتى يتم قطع جميع الصدر.
  13. استخدم ملقطا لنقل نصف مقاطع الصدر من شريحة المجهر إلى 500 ميكرولتر من 0.05٪ PBS-T في بئر واحد من صفيحة مكونة من 24 بئرا واستمر في الحجب والتلوين المناعي (انظر الخطوة 4 أدناه).

3. تشريح الكتاب المفتوح للعذراء المبكر IFM (~ 15 ساعة إلى 48 ساعة APF) (الشكل 4)

  1. مرحلة الشرانق من النمط الجيني المطلوب والعمر إلى النقطة المحددة في نمو العذراء (الشكل 2) كما هو موضح أعلاه (الخطوة 2.1).
    ملاحظة: بالنسبة لتشريح الكتاب المفتوح ، يجب تشريح الشرانق في مجموعات لا تزيد عن 8-10 ذباب.
  2. قم بتجميع المستلزمات اللازمة ، بما في ذلك فرشاة الطلاء ، وملقطين من Dumont # 5 مع أطراف علم الأحياء ، وزوج من مقص Vannas الزنبركي ، وشريط مزدوج العصا ، وشريحة مجهرية ، وماصة بلاستيكية ، وطبق تشريح من السيليكون الأسود ، وطبق تلطيخ زجاجي أسود ، ودبابيس حشرات ، ومناديل خالية من النسالة (انظر جدول المواد). قم بإعداد 1x PBS و 0.05٪ PBS-T ومحاليل التثبيت (انظر الملف التكميلي 1). تتوفر نظرة عامة على مخطط التدفق لتشريح الكتاب المفتوح للعذراء التالي (الشكل التكميلي 3).
  3. في النقطة الزمنية المطلوبة ، قم بإزالة الشرانق من حالة العذراء كما هو موضح في الخطوات 2.3-2.6. انقل الشرانق إلى طبق تشريح أسود من السيليكون مليء ب 1x PBS بعد إزالته من علبة العذراء (الشكل 4 أ).
  4. بعد تحرير جميع الشرانق من علبة العذراء ، استخدم ملقط Dumont # 5 للتغلب على التوتر السطحي ودفع الشرانق المشرحة برفق إلى سطح السيليكون. رتب الشرانق في خط بالقرب من وسط الطبق (الشكل 4 ب).
  5. أدخل إبرتين من الحشرات باستخدام ملقط Dumont # 5 عبر بطن كل خادرة لتثبيتها في مكانها (الشكل 4 ج ، د). تأكد من توجيه الشرانق مع الجانب البطني لأعلى.
  6. استخدم مقص زنبركي Vannas لقطع الغشاء القاعدي ومنطقة الرأس الأمامية لكل خادرة (الشكل 4E).
  7. أدخل المقص في الفتحة واقطع على طول الجانبين الأيمن والأيسر لكل خادرة (الشكل 4F ، G ، Q). ضع المقص واقطع أسفل الظهر النامي مباشرة إلى التقاطع بين الصدر والبطن لإزالة الساقين والأجنحة بالجزء البطني. تأكد من إدخال المقص أفقيا وعدم ملامسة الجزء الظهري من الصدر (الشكل 4Q).
  8. استخدم ملقط Dumont # 5 لإمساك الجزء البطني من الخادرة ورفعه وإزالته بمقص زنبركي Vannas (الشكل 4H ، I ، Q).
  9. قم بإزالة الدماغ والحبل العصبي البطني (VNC) والقصبة الهوائية والأمعاء باستخدام ملقط Dumont # 5 (الشكل 4J ، K ، Q). احرص على عدم إزعاج IFMs النامية ، والتي تقع مباشرة أسفل القصبة الهوائية و VNC المتصل بالبشرة في الجزء الظهري من الصدر.
  10. قم بقص طرف طرف الماصة سعة 200 ميكرولتر لإنشاء فتحة أوسع. استخدم ماصة سعة 200 ميكرولتر مع الطرف المقطوع لغسل المخزن المؤقت 1x PBS برفق فوق الصدر لإزالة معظم الأجسام الدهنية المتبقية لفضح IFMs (الشكل 4L ، M). كن لطيفا لتجنب تمزق ملحقات الأوتار التي تربط الألياف العضلية بالبشرة.
  11. استخدم مقص زنبركي Vannas لقطع خط الوسط للصدر الظهري ، وإنشاء "منشورتين" تحتويان على IFMs (الشكل 4N).
  12. قم بقص منشورات الصدر الظهري بعيدا عن البطن باستخدام مقص (الشكل 4O ، Q) ، وانقل الوريقات إلى 300 ميكرولتر من المحلول المثبت في طبق زجاجي أسود باستخدام ملقط Dumont # 5 (الشكل 4 ص). أمسك المنشورات الموجودة في علبة الرأس بالملقط لتجنب إتلاف الألياف العضلية أو الأوتار IFM.
  13. حدد المدة الزمنية المطلوبة (عادة 15 دقيقة). استخدم ماصة سعة 200 ميكرولتر لإزالة المثبت بعناية وغسلها في 500 ميكرولتر من PBS-T بنسبة 0.05٪. استمر في الحظر والتلمين المناعي (انظر الخطوة 4 أدناه).
    ملاحظة: لا تقم بتعطي العينات أو صخرتها في أطباق زجاجية سوداء. تكون مرفقات الأوتار العضلية في مراحل العذراء المبكرة هشة للغاية وستتمزق مع التحريض المستمر للعازلة ، مما يؤدي إلى فقدان IFMs. قم بسحب الماصة ببطء وحذر حول حواف المخزن المؤقت في الطبق لتجنب امتصاص العينات في طرف الماصة عند تغيير المحاليل.

4. التلوين المناعي والكيمياء النسيجية لعينات IFM الثابتة

  1. قم بتجميع المستلزمات الضرورية، بما في ذلك الماصة وأطراف الماصات والأجسام المضادة أو البقع المطلوبة. قم بإعداد 0.05٪ PBS-T ، ومحلول مانع ، ومخاليط الأجسام المضادة / البقع (انظر الملف التكميلي 1).
  2. قم بإزالة محلول الغسيل (0.05٪ PBS-T) من العينات وأضف محلول الحظر. احتضان العينات في محلول حجب لمدة 30 دقيقة على الأقل في درجة حرارة الغرفة (مع التأرجح للخطوات 1-2 ، دون التأرجح للخطوة 3).
    ملاحظة: يمكن بدلا من ذلك حجب العينات طوال الليل عند 4 درجات مئوية. في هذا البروتوكول ، تم حظر العينات في مصل الماعز الطبيعي بنسبة 5٪ (NGS) في 0.05٪ PBS-T. يتم توفير مزيد من المعلومات حول خيارات حل الحظر في الملف التكميلي 1.
  3. قم بإزالة محلول الانسداد من الصدر باستخدام ماصة. أضف خليط الأجسام المضادة الأولية واحتضان لمدة ساعتين على الأقل في درجة حرارة الغرفة أو طوال الليل عند 4 درجات مئوية (مع التأرجح للخطوات 1-2 ، دون التأرجح للخطوة 3).
    ملاحظة: هذا البروتوكول متوافق مع غالبية الأجسام المضادة الأولية. يجب تخفيف الأجسام المضادة في محلول الانسداد. تتراوح تخفيفات الأجسام المضادة الأولية التي تم اختبارها باستخدام هذا البروتوكول من 1:10 إلى 1:2000 ويتم تحديدها تجريبيا لكل جسم مضاد فردي. يتم توفير مزيد من التفاصيل حول تحسين تلطيخ الأجسام المضادة الأولية في الملف التكميلي 1.
  4. قم بإزالة خليط الأجسام المضادة الأولي باستخدام ماصة واغسل العينات 3 مرات لمدة 10 دقائق لكل منها ، في 0.05٪ PBS-T.
  5. أضف الجسم المضاد الثانوي أو خليط البقع إلى العينة. قم بتغطية العينة بقطعة من ورق الألمنيوم لتقليل التبييض. احتضن لمدة ساعتين على الأقل في درجة حرارة الغرفة أو طوال الليل عند 4 درجات مئوية (مع التأرجح للخطوة 1-2 ، دون التأرجح للخطوة 3).
    ملاحظة: يمكن استخدام معظم الأجسام المضادة الثانوية والبقع الخلوية الفلورية مع هذا البروتوكول. يتم استخدام العديد من الأجسام المضادة الثانوية عند تخفيف 1: 500. في البيانات التمثيلية أدناه (انظر النتائج التمثيلية) ، تم تصنيف النوى ب DAPI (مخزون 1 مجم / مل ، مخفف 1: 1000 في 0.05٪ PBS-T) و F-actin مع الرودامين فالويدين (مخزون 300 وحدة / مل ، مخفف 1: 500 في 0.05٪ PBS-T).
  6. قم بإزالة خليط البقع الثانوي باستخدام ماصة واغسل العينات 4 مرات لمدة 10 دقائق لكل منها ، في 0.05٪ PBS-T في درجة حرارة الغرفة. انتقل إلى التركيب (الخطوة 5) مباشرة بعد الغسيل.

5. تركيب عينات ملطخة على شرائح لتحليل المجهر (الشكل 5)

  1. قم بتجميع المستلزمات اللازمة بما في ذلك فرشاة الطلاء ، والملقط ، وشرائح المجهر المصنفر ، والأغطية (سمك # 1) ، وطلاء الأظافر الشفاف ، ووسط التثبيت ، والمناديل المبللة الخالية من النسالة (انظر جدول المواد).
  2. قم بتسمية منطقة الكتابة المتجمدة لشريحة المجهر برقم العينة ذات الصلة أو معلومات التعريف المفضلة (التاريخ ، النمط الجيني ، الجسم المضاد ، رقم الشريحة ، إلخ).
  3. أضف فواصل الغطاء (# 1 أغطية زلة) ، مع ترك حوالي 1 سم بين الأغطية لوضع العينة (الشكل 5A-C). استخدم قطرة صغيرة من الجلسرين بنسبة 50٪ لتثبيت الفواصل في مكانها (الشكل 5 أ ، د).
    ملاحظة: تمنع الفواصل تشويه العينة عند تركيب عينات سميكة. تتطلب الصدر البالغة عادة فاصلا سميكا 2-غطاء ، و 48 ساعة APF thoraces فاصلا سميكا 1-غطاء ، ومنشورات كتاب مفتوحة بدون فاصل.
  4. أضف قطرة من وسيط التثبيت إلى البئر بين فواصل الغطاء ، أو إلى مركز شريحة المجهر في حالة تركيب عينات العذراء المبكرة (الشكل 5C-D). ضع الشريحة تحت مجهر تشريح ستيريو.
    ملاحظة: تتوفر أنواع متعددة من وسائط التركيب. إذا كنت تستخدم وسائط ذاتية التصلب ، ففكر في واحدة ذات وقت علاج لعدة ساعات لإتاحة الوقت الكافي لتوجيه العينات بشكل صحيح قبل أن تصلب الوسائط. ثبت أن وسائط التركيب تؤثر على أبعاد الساركومير43،44،45 ، لذلك يجب استخدام نفس الكاشف لجميع العينات في التجربة.
  5. استخدم ماصة لإزالة أكبر قدر ممكن من المخزن المؤقت للغسيل من العينات. انقل العينات على الفور باستخدام ملقط أو فرشاة رسم إلى قطرة وسيط التثبيت على الشريحة (الشكل 5E).
  6. باستخدام ملقط Dumont # 5 ، قم بتنظيم العينات في صفوف وأعمدة ، وتأكد من أن العينات غير متداخلة ، وقم بتوجيه الصدر مع توجيه IFMs لأعلى (الشكل 5F ، J ، Q ، S). قد يتطلب الاتجاه تقليب العينات بعناية حيث تكون الشعيرات / البشرة متجهة لأعلى (الشكل 5G ، H ، K ، L ، R). احرص على عدم لمس IFMs ، لأن التلامس سيؤدي إلى إتلاف بنية الساركومير (انظر النتائج التمثيلية).
  7. أضف بعناية غطاء # 1 (18 × 18 مم أو 22 × 22 مم) فوق عينات الصدر (الشكل 5 م). في حالة استخدام الفواصل ، اضغط برفق على الغطاء حتى يتلامس الفواصل على جانبي العينات (الشكل 5N).
  8. استخدم طرف ماصة أو قطارة لملء منطقة العينة مرة أخرى بوسط تركيب حتى يتم تغليف جميع الصدر (الشكل 5O). تجنب إنشاء فقاعات هواء من شأنها أن تعطل الحصول على الصور.
  9. استخدم طلاء الأظافر الشفاف لإغلاق الحامل الرطب. تذكر أن تغلق حول كل من غطاء العينة وكذلك أغطية الفاصل (الشكل 5P ، S).
    ملاحظة: تجنبي استخدام طلاء الأظافر العلوي أو طلاء الأظافر سريع الجفاف ، حيث يتم إغلاقهما بشكل سيئ وستتشكل فقاعات الهواء مع تبخر وسط التثبيت.
  10. جفف الشرائح لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. يحفظ في علبة منزلقة عند 4 درجات مئوية. يمكن تصوير الشرائح لعدة أيام أو أسابيع.
  11. عينات الصور على مجهر فلوري أو مجهر متحد البؤر أو أي نظام آخر وفقا للتصميم التجريبي. تتوفر بروتوكولات الاقتناء وتحليل الصور في أماكن أخرى14،30،46،47،48.

النتائج

يمكن استخدام بروتوكول التشريح المعروض أعلاه لتوليد عينات عالية الجودة لتحليل المجهري للألياف العضلية IFM ومورفولوجيا القبدة العضلية من وقت مبكر يصل إلى 8 ساعات بعد تكوين الشرانق (APF) باستخدام طريقة الكتاب المفتوح (الخطوة 3) خلال مراحل البالغين باستخدام نهج تشريح نصفي الصدر (الخطوتان 1 و 2). تم تطبيق هذه التشريح للتحقيق في تكوين العضلات والساركومير18،42،49 ، ووظيفة عامل النسخ50،51 ، وتنظيم الحمض النووي الريبي37،38 ، من بين أمور أخرى. توضح النتائج التمثيلية الواردة أدناه توافق هذا البروتوكول مع طرق التثبيت المختلفة ، وتفاصيل القطع الأثرية الشائعة للتشريح ، واستخدام النمط الظاهري المتحور SmnE33 لتوضيح فائدة هذا البروتوكول لمعالجة الأسئلة المورفولوجية والبيولوجية الخلوية في نموذج IFM.

تشريح IFM متوافق مع طرق تثبيت متعددة

أحد الجوانب المهمة لتحضير العينة للكيمياء النسيجية أو عينات التألق المناعي هو الحفظ الدقيق للهياكل الخلوية من خلال التثبيت. تحافظ المثبتات على بنية الأنسجة ومورفولوجيتها عن طريق منع التدهور وتثبيت هياكل البروتين والدهون من خلال التشابك52،53. فئات مختلفة من المثبتات ، على سبيل المثال ، المذيبات القائمة على الألدهيد مقابل المذيبات العضوية ، لها كفاءات اختراق وربط متقاطع مختلفة وتؤثر بشكل تفاضلي على التعرف على هدف الأجسام المضادة من خلال استهداف مجموعات وظيفية متميزة53،54. تتوافق تشريح IFM مع طرق التثبيت المتعددة ، بما في ذلك 4٪ بارافورمالديهايد (PFA) ، و 9٪ غليوكسال ، وتثبيت الميثانول (الشكل 6) ، مع التأكيد على الفائدة العامة لبروتوكول التشريح هذا.

لمقارنة حجم الساركومير والتشكل مع تطبيق طرق التثبيت المختلفة ، تم إجراء تشريح نصفي الصدر للبالغين في يوم واحد مع1118 ذبابة. تمت مقارنة تثبيت PFA بنسبة 4٪ في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) (الشكل 6 أ ، ه) أو محلول الاسترخاء (RS) (الشكل 6 ب ، و). يحتوي محلول الاسترخاء على ATP ويوصى باستخدامه عند تحديد أبعاد الساركومير للحفاظ على ساركومير في حالتها المريحة20،55 (انظر الملف التكميلي 1). يحافظ تثبيت PFA بنسبة 4٪ بشكل فعال على مورفولوجيا الساركومير ، ولكن لوحظ اختلاف كبير في عرض الساركومير بين 4٪ تثبيت PFA في PBS مقابل RS (الشكل 6I ، J). التثبيت في الميثانول الحفاظ على الألياف العضلية وهيكل الساركومير (الشكل 6C ، G) ، لكن الأورام القسيمة كانت أقصر وأرق بكثير من تثبيت PFA بنسبة 4٪ (الشكل 6I ، J). يمكن الحفاظ على IFMs بشكل فعال من خلال تثبيت غليوكسال بين عشية وضحاها بنسبة 9٪ (الشكل 6D ، H) (3٪ كان تثبيت الغليوكسال غير فعال) ، مما أدى أيضا إلى تغيير عرض الساركومير بشكل كبير مقارنة بتثبيت PFA بنسبة 4٪ (الشكل 6I ، J). في الختام ، يمكن الحفاظ على هيميثوراسات IFM بشكل فعال باستخدام مثبتات متعددة. ومع ذلك ، نظرا لأن كلا من التثبيت والمخزن المؤقت يمكن أن يؤثران على قياس أبعاد الساركومير ، يجب تصميم التجارب بضوابط مناسبة وبروتوكول تثبيت محدد جيدا ومتسق.

القطع الأثرية الشائعة للتشريح والتثبيت في IFMs

يتمثل أحد تحديات الفحص المجهري ، خاصة للمستخدمين والمتدربين الجدد ، في تمييز القطع الأثرية التقنية عن الأنماط الظاهرية ذات النية العظمية. للمساعدة في هذا التمييز في ذبابة الفاكهة IFMs ، يتم تقديم بيانات تمثيلية للقطع الأثرية الأكثر شيوعا وفشل التشريح (الشكل 6). تتطلب بروتوكولات التثبيت تحسين نوع التثبيت وتركيزه وطوله لتجنب التثبيت الناقص أو الزائد52،53،54. باستخدام مسار وقت التثبيت لw 1118 1 يوم تشريح نصفي الصدر للبالغين المحتضن في 4٪ PFA في محلول الاسترخاء ، لوحظ أنه في حين أن وقت التثبيت لمدة 15 أو 30 دقيقة يحافظ بدقة على مورفولوجيا الساركومير ، فإن التثبيت لمدة 7 دقائق ينتج عنه أشكال قاسية غير متسقة (الشكل 6K-M). بالإضافة إلى ذلك ، يكون النسيج أقل صلابة مع وقت تثبيت أقصر ، مما يجعل من الصعب قطع الصدر وتقسيمه دون الإضرار ب IFMs. يمكن أن تنشأ قطع أثرية إضافية أثناء كل من عملية القطع والتركيب. يمكن أن يبدو هيكل الألياف العضلية IFM غير منتظم إذا كانت الشفرة باهتة وتسببت في التمزق أو الاهتراء (الشكل 6N) أو إذا انزلقت الشفرة أو كان القطع مائلا (الشكل 6O). إذا لامس الملقط بشكل مباشر مع IFMs الثابتة أثناء المناولة أو التركيب ، فإنها تترك انطباعا يمكن أن يؤدي إلى انقسامات أو تمدد ويمكن أن تفصل عن الأورام العضلية (الشكل 6 ص). يؤدي تمدد الصدر أو تشوه الصدر ، سواء أثناء القطع أو المناولة أو التركيب ، إلى فصل العضلة القسارية ويؤدي إلى فقدان قرص Z محدد بوضوح (الشكل 6Q). أخيرا ، يؤدي "النشر" أو "فرك" IFMs بملقط أو شفرة إلى تآكل وتفكك اللييفات العضلية والاهتراء وعدم تنظيمها ، خاصة على سطح الألياف العضلية (الشكل 6R). يجب أن يصبح المستخدمون المحتملون على دراية بهذه القطع الأثرية الفنية واستبعادها من تحليل النمط الظاهري.

التقدم التنموي للنمط الظاهري Smn E33 في IFMs

يعد تشريح الكتاب المفتوح وتشريح الصدر الصفي مفيدا بشكل خاص لتتبع المسار التنموي للنمط الظاهري للعضلات ولتحديد وقت ظهور الجين ذي الاهتمام أو الأنماط الظاهرية لللييفات العضلية قيد التطور. يتم تقديم النمط الظاهري التنموي IFM ل SmnE33 ، وهو أليل ناقص الشكل للبروتين المرتبط بالحمض النووي الريبي للبقاء على قيد الحياة (Smn) 39 كبيانات تمثيلية توضح الفائدة الواسعة لتشريح الكتاب المفتوح وتشريح النصفي.

يتم تجميع البروتينات النووية الريبية النووية الصغيرة (snRNPs) التي تشكل الجسيم المتناسق ، المركب الجزيئي الذي يحفز تفاعل التضفير لتوليد mRNAs7 ، بواسطة مركب SMN. مركب SMN ، الذي يتكون من الخلايا العصبية الحركية للبقاء على قيد الحياة (Smn) وبروتينات Gemin ، مطلوب للبقاء في جميع الكائنات الحية56. يؤدي انخفاض مستويات SMN لدى البشر إلى الاضطراب العصبي العضلي الوراثي الشديد الضمور الحركي الشوكي (SMA)21. ذبابة الفاكهة تم استخدامه كنموذج لفهم مسببات ضمور العضلات الشوكي والوظيفة الخلوية ل Smn ، بما في ذلك تطوير الأليل ناقص الشكل SmnE33. ذباب SmnE33 قابل للحياة وخصب ، لكنه لا يستطيع الطيران أو القفز39. في حين أن ذباب SmnE33 يعاني من عيوب في تشجير الخلايا العصبية الحركية ، إلا أنه يعرض أيضا بنية IFM غير منظمة وفقدان تعبير Actin88F الخاص بعضلات الطيران39،57. يتم توطين SMN بشكل مشترك مع ألفا أكتينين في القرص Z في الذباب والفئران39 ، مما يشير إلى أن Smn قد يكون له وظيفة خاصة بالعضلات.

لاكتساب فهم أفضل لوقت فقدان بنية اللييفات العضلية ووظيفة Smn مطلوبة في تطوير العضلات ، تم إجراء تحليل المسار الزمني التنموي للنمط الظاهري SmnE33 في IFMs في 26 ساعة APF و 72 ساعة APF و 1 إلى 5 أيام بالغة. في حين أن التحكم مع1118 IFMs في كل من 72 ساعة APF وفي البالغين لديه إشارة F-actin ملطخة بالقضيب القوي (الشكل 7E ، E '، I ، I') وهيكل الساركومير العادي (الشكل 7G ، G '، K ، K ') ، يتم تقليل إشارة الفالويدين بشكل كبير (الشكل 7F ، F '، J ، J') وهياكل ساركومير غائبة (الشكل 7H ، H '، L ، L ') في SmnE33 IFMs. بدلا من ذلك ، لوحظ F-actin في الهياكل الشبيهة بالشبكة حول النوى أو في الحزم غير المنتظمة أو هياكل "الانفجار النجمي" في السيتوبلازم (الشكل 7H ، H '، L ، L') ، بما يتفق مع فقدان تعبير Act88F18 ، 39 وعدم القدرة على تجميع الخيوط الرقيقة. تم إجراء تشريح الكتاب المفتوح لفحص النمط الظاهري SmnE33 في 26 ساعة APF وكشفت أن تطوير IFM المبكر يستمر بشكل طبيعي في SmnE33. مقارنة ب w 1118 التحكم IFMs (الشكل 7A ، A '، C ، C ') ، يحتوي ذباب SmnE33 على 6 ألياف IFM طولية ظهرية لكل نصفي ، ويشكل كبلات F-actin منظمة في محيط الألياف العضلية قبل تكوين الألياف العضلية (الشكل 7 ب ، ب) ، ويعرض شبكة F-actin تشبه الشبكة في جميع أنحاء الألياف العضلية (الشكل 7D ، D '). تشير هذه النتائج إلى أن المراحل الأولية من تمايز IFM تسير بشكل طبيعي ، في حين أن Smn ضروري في المراحل اللاحقة من تطوير IFM للحفاظ على تعبير Act88F وبناء ساركومير. الأهم من ذلك ، أن هذه النتائج التمثيلية توضح تفاصيل النمط الظاهري والدقة التي يمكن تحقيقها عن طريق تشريح الكتاب المفتوح وتشريح الصدر.

figure-results-1
الشكل 1: تشريح المقطع النصفي للبالغين IFMs. (أ) ضع ذبابة بالغة في 1x PBS على شريحة مجهرية. (ب) باستخدام ملقط (سماوي ، نقطة) لتثبيت الذبابة ، قم بإزالة الرأس بمقص (برتقالي). (ج-ه) قم بإزالة الجناحين الأيسر (C) والأيمن (D) والبطن (E). (و) تخلص من الرأس والبطن والأجنحة وانقل الصدر إلى مثبت. (G ، H) قم بتوجيه صدر ثابت على شريحة قطرة 1x PBS-T مع الخلف (P) ويشير السطح النصي لأعلى (G) ، باستخدام ملقط لتثبيت الاتجاه (H). (I-K) استخدم شفرة التبريد لقطع الصدر إلى نصفين (I-J) ، لتوليد قسمين نصفي للصدر (K). (L) رسم تخطيطي لشفرة التبريد والصدر ، يوضح موضع القطع السهمي لإنتاج مقطع نصفي. تنزلق الشفرة إلى اليمين لإحراز الصدر ، ثم تتحرك لأسفل بحركة سلسة (أسهم صفراء) لقطع الصدر (خط أحمر منقط). (م ، ن) رسم تخطيطي للعرض الإكليلي (M) والعرضي (N) للصدر ، يوضح موضع مجموعات العضلات الرئيسية وموضع القطع (بين المثلثات الصفراء). يشار إلى اتجاه الصدر (L ، على اليسار ؛ R ، على اليمين. خامس, بطني; د ، ظهري. أ, الأمامي; ف ، خلفي). أشرطة المقياس = 1 مم. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-2
الشكل 2: التدريج العذراء وخصائص نمو العذراء. (أ) يمكن تمييز الشرانق الذكور و (ب) الإناث على أنها شرانق بيضاء عند 0-2 ساعة APF. الشرانق الذكور لها هياكل مزدوجة ومستديرة وشفافة (الخصية النامية) باتجاه الخلف (الأسهم). (ج) جدول السمات التي تستخدم كسمات مميزة لنمو العذراء. تشمل الميزات نضوج حالة العذراء ، وانعكاس الرأس ، وانفصال الخادرة عن حالة العذراء ، وتطور تصبغ العين ، وتصبغ الشعيرات ، والأجنحة ، والساقين ، والبطانة ، والبشرة ، ورؤية البقعة البكر (العقي). لون العين والتصبغ يغمق تدريجيا. تم تحديد توقيت ومراحل تطور العذراء المسماة في الجزء العلوي من كل عمود في الجدول (النقاط الزمنية المشار إليها بنص أسود ، والمرحلة المقابلة في تطور العذراء أدناه بنص أزرق) مسبقا بواسطة Bainbridge and Bownes19،41. (D-E) المسار الزمني لتطور العذراء في 0-2 ساعة و 24 ساعة و 48 ساعة و 72 ساعة و 96 ساعة APF في خادرة سليمة بعيون حمراء (D ؛ Mef2-Gal4 ، fln-GFP) وفي خادرة ذات عيون برتقالية تم تشريحها من حالة العذراء (E; فلن غال 4). لاحظ السغمة التدريجية للعينين والشعيرات من 48 ساعة إلى 96 ساعة APF. (و) أمثلة على فتك العذراء في النقاط الزمنية المبكرة والمتوسطة والمتأخرة للتطور. يتم تشكيل الذباب القاتل Pharate بالكامل ، لكنه يفشل في الإغلاق تماما من حالة العذراء. أشرطة المقياس = 1 مم. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-3
الشكل 3: تشريح المقطع النصفي للعذارى IFMs (>48 ساعة APF). (أ-ح) إزالة خادرة من حالة العذراء. قم بلصق الشرانق على شريط من الشريط اللاصق المزدوج (أ ، ب). افتح عند التلال الأمامية (C) وقم بإزالة الملف (D) باستخدام زوج من ملقط Dumont # 5 (أزرق ، سهم يشير إلى اتجاه الحركة ، والنقطة ثابتة). استخدم الملقط لقطع (E) وتقشير (F) علبة العذراء في شرائح (G). يتم لصق شرائط من علبة العذراء على شريط العصا المزدوجة. بعد تعريض البطن ، ارفع الخادرة من العلبة (H). (ط) رسم تخطيطي يوضح عملية تشريح خادرة من حالة العذراء. يتم تسمية لوحات الشكل المقابلة لكل خطوة في التخطيطي (أسفل). يشير الخط الأحمر المنقط إلى المكان الذي يمكن فيه إدخال الملقط دون الإضرار بخادرة لقطع علبة العذراء. (جي إل) بعد إزالة الخادرة من العلبة (J) ونقلها إلى شريحة مجهرية في قطرة 1x PBS (K) ، استخدم مقصا لإزالة البطن (L). (م) تخلص من البطن وانقل الصدر إلى مثبت. (ن) بعد التثبيت ، انقل صدر العذراء إلى شريحة قطرة 1x PBS-T. قم بتوجيه الجانب الظهري للخادرة لأعلى واستقر باستخدام ملقط. (O-P) استخدم شفرة التبريد (O) لقطع نصف القسم من العذراء (P). موضع القطع هو نفسه الشكل 1 M-N. أشرطة المقياس = 1 مم. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-4
الشكل 4: تشريح الكتاب المفتوح ل IFMs العذراء (<48 ساعة APF). (أ) بعد إزالة الخادرة من حالة العذراء كما هو موضح في الشكل 3 A-I ، انقل الخادرة إلى 1x PBS في طبق تشريح السيليكون الأسود. (ب د) ادفع الخادرة برفق إلى سطح طبق السيليكون باستخدام ملقط (B) ، ودبوس الجانب البطني لأعلى باستخدام دبابيس حشرة (C ، D). (ه) افتح الغشاء القاعدي (bm) وبشرة الرأس باستخدام مقص (برتقالي). (F ، G) قطع على طول الجانب الأيمن (F) والأيسر (G). موضع القطع مخطط في (Q). (ح ، أنا) ارفع الجزء البطني بملقط (H) ثم قم بإزالته بمقص (I). (J ، K) استخدم ملقطا لإزالة الدماغ (J) والقصبة الهوائية الجذعية الجانبية والأمعاء (K). (L-M) استخدم تيارا لطيفا من المخزن المؤقت من الماصة لإزالة الأجسام الدهنية وفضح IFMs. (ن) قطع الصدر إلى منشورين. (س ، ع) اقطع المنشورات وانقلها إلى مثبت. (س) تلخيص تخطيطي للخطوات في تشريح كتاب مفتوح. يتم تسمية لوحات الشكل المقابلة لكل خطوة (أسفل). يتم توفير المشاهدات العلوية والجانبية لتوضيح وضع الجروح (الخط الأحمر المنقط) على الجانب الأيسر والأيمن من الخادرة. تستخدم الأجنحة والساقين وخرطوم (المسمى) لتمييز الجانبين الظهري والبطني للخادرة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-5
الشكل 5: تركيب العينة على شرائح المجهر. (A-D) تستخدم فواصل الغطاء لتركيب عينات نصف القسم الصدري السميكة. يستخدم الجلسرين (A) لتثبيت الفواصل (# 1 أغطية) على شريحة مصنفة (B) ، ويتم تثبيت العينات في وسط تركيب في الفراغ بين الفواصل (C). تتطلب الشرانق المتأخرة والصدر البالغ اثنين من فواصل الغطاء # 1 (D). تتطلب النقاط الزمنية في منتصف العذراء فاصلا واحدا # 1 ، ويمكن تركيب تشريح العذراء المبكر بدون فاصل. (إي إه) يتم نقل عينات نصفي الصدر البالغة إلى وسط تركيب باستخدام ملقط أو فرشاة رسم (E). يتم توجيه الصدر في البداية بشكل عشوائي (F) ، وقد تحتاج إلى قلبها باستخدام ملقط (G) بحيث يتم توجيه IFMs نحو الغطاء (H). (I-L) يتم نقل المنشورات من تشريح الكتب المفتوحة في وقت مبكر من العذراء للتركيب باستخدام ملقط (I). يتم توجيه المنشورات بشكل عشوائي (J) ويمكن قلبها باستخدام ملقط (K) بحيث تكون IFMs متجهة لأعلى نحو الغطاء (L). (م-ب) بعد توجيه العينات بشكل صحيح، ضع غطاء فوق العينات (M) واضغط عليه حتى على الفواصل (N). املأ حول العينات بوسط تركيب (O) ، مع الحرص على تجنب تكوين الفقاعات. أغلق جميع الحواف المفتوحة للغطاء والفواصل بطلاء الأظافر (P) لتجنب تبخر وسط التثبيت. (الرم) صور لعينات الصدر البالغة المثبتة بشكل صحيح (Q ، تكبير 10x) موجهة مع توجيه IFMs لأعلى نحو الغطاء (R ، تكبير 20x). (S) مخطط للشريحة المكتملة ، مع عينات موجهة IFM-up بين الفواصل وطلاء الأظافر التي تغلق جميع الحواف المفتوحة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-6
الشكل 6: تشريح IFM متوافق مع المثبتات المختلفة. (A-H) إسقاط z متحد البؤر لهيكل الألياف العضلية (A-D) أو صور أحادية المستوى لهيكل الليفات العضلية والساركومير (E-H) للتحكم مع1118 IFM للبالغين. تشريح الهيميثوراكس متوافق مع طرق تثبيت متعددة ، بما في ذلك 4٪ بارافورمالديهايد (PFA) في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) (A ، E) أو محلول الاسترخاء (RS) (B ، F) أو الميثانول (C ، G) ، أو محلول غليوكسال 9٪ (D ، H). DAPI (1: 1000) ، أزرق ؛ فالويدين (1: 500) ملطخ F-actin ، رمادي. (أنا ، ي) القياس الكمي لطول الساركومير (I) والعرض (J) من E-H. يمكن أن تؤثر طريقة التثبيت والمخزن المؤقت بشكل كبير على قياس طول وعرض الساركومير. كان طول الساركومير العضلي البالغ 3.040 ± 0.2935 ميكرومتر مع تثبيت الميثانول أقصر بكثير من الأطوال المقاسة البالغة 3.271 ± 0.2736 ميكرومتر و 3.190 ± 0.2586 ميكرومتر و 3.217 ± 0.2023 ميكرومتر مع PFA (PBS) و PFA (RS) و 9٪ تثبيت غليوكسال ، على التوالي (ص < 0.001). كان عرض الساركومير مختلفا بشكل كبير بين جميع طرق التثبيت التي تم اختبارها (PFA (PBS) ، 1.410 ± 0.1331 ميكرومتر ؛ PFA (RS) ، 1.284 ± 0.2514 ميكرومتر ؛ الميثانول ، 1.280 ± 0.1538 ميكرومتر ؛ و 9٪ تثبيت غليوكسال ، 1.137 ± 0.2032 ميكرومتر). يتم عرض المخططات الصندوقية بشعيرات Tukey مع نقاط بيانات متطرفة مميزة كنقاط سوداء. تم تحديد الأهمية بواسطة ANOVA من خلال اختبار Tukey اللاحق (** ، ص < 0.01 ؛ *** ، ص < 0.001). (ك-م) الصور متحد البؤر أحادية المستوى لمسار وقت التثبيت للبالغين ث 1118 في 4٪ PFA في تثبيت RS ، مما يدل على أن أوقات التثبيت 15 (لتر) أو 30 (م) دقيقة ، مقارنة ب 7 دقائق (كلفن) ، تؤدي إلى بنية ساركومير محفوظة جيدا ومتسقة. (N ، O) إسقاطات Z-stack للبالغين Act88F-Gal4 IFMs المثبتة في 4٪ PFA مما يدل على القطع الأثرية في الألياف العضلية. تشمل القطع الأثرية الشائعة ألياف عضلية مقطوعة أو مهترئة أو جزئية من شفرة باهتة (N) أو قطع بزاوية (O). (ص - ر) صور أحادية المستوية أحادية البؤر للبالغين مع1118 عينة مثبتة في 4٪ PFA في PBS توضح القطع الأثرية الشائعة للتشريح في الأورام العضلية واللييفات العضلية. تشمل القطع الأثرية التقنية الشائعة التمدد غير المنتظم للعضلة العضلية بسبب ملامسة الملقط أثناء التركيب (P) ، وسحب الأقراص Z من السجل عن طريق شد الألياف العضلية أثناء القطع الطولية (Q) ، واللييفات العضلية البالية أو غير المنظمة أو الملتفة بسبب التآكل أو الشفرة الباهتة (R). DAPI (1: 1000) ، أزرق ؛ فالويدين (1: 500) ملطخ F-actin ، رمادي. شريط المقياس = 100 ميكرومتر (AD ، N-O) ، 5 ميكرومتر (E-H ، KM ، PR). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-7
الشكل 7: تطبيق التشريح للتحقيق في النمط الظاهري التنموي IFM ل SmnE33. (م-د) بنية العضلات في الشرانق المبكرة في 26 ساعة APF. صورة أحادية المستوية متحد البؤر لهيكل الألياف العضلية (أ ، أ ، ب ، ب) وهيكل اللييفة العضلية والعضلة العضلية (C ، C '، D ، D') في التحكم (A ، A '، C ، C') و SmnE33 (B ، B '، D ، D'). يحتوي كل من التحكم و SmnE33 على ستة ألياف عضلية IFM لكل نصفي ويشكلان كابلات F-actin. (إي إه) هيكل العضلات في الشرانق المتأخرة في 72 ساعة APF. صورة إسقاط Z لهيكل الألياف العضلية في التحكم (E ، E ') و SmnE33 (F ، F '). توجد IFMs في SmnE33 بناء على تلطيخ DAPI ولكنها تفتقر إلى إشارة F-actin قوية. تكشف الصور متحدة البؤر أحادية المستوى أن التحكم في IFMs لها بنية ساركومير منظمة للغاية (G ، G'). على النقيض من ذلك ، فإن SmnE33 IFMs (H ، H ') لها هياكل F-actin غير طبيعية تشبه النجوم (أسهم صفراء) وتفتقر إلى بنية القرب العضلي المنظمة التي لوحظت في IFMs التحكم. (I-L) بنية العضلات البالغة في السيطرة (أنا ، أنا '، ك ، ك ') و SmnE33 (J '، L ، L '). يكشف الإسقاط Z (I ، J) والصور متحد البؤر أحادية المستوى (K ، L) عن انخفاض كبير في محتوى F-actin وهياكل أكتين غير طبيعية (الأسهم الصفراء) في SmnE33IFMs. DAPI (1: 1000) ، أزرق ؛ فالويدين (1: 500) ملطخ F-actin أو أرجواني أو رمادي. شريط المقياس = 50 ميكرومتر (أ ، ب) ، 10 ميكرومتر (ج ، د ، ز ، ح ، ك ، ل) ، 100 ميكرومتر (E ، F ، I ، J). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الملف التكميلي 1: وصف مفصل لطرق التثبيت والتلوين المستخدمة في النص وخاصة لتوليد البيانات الموضحة في الشكل 6 والشكل 7. يتم تضمين معلومات إضافية حول تحديد تخفيفات الأجسام المضادة الأولية. يتم أيضا توفير قائمة بمكونات المخزن المؤقت والوصفات المستخدمة في هذا البروتوكول. تحفز هذه البيانات بروتوكول التشريح وتثبت فائدته في الفحص المجهري متحد البؤر وتحليل الأنماط الظاهرية ل IFM التنموي. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 1: مخطط تدفق الخطوات في تشريح نصفي الصدر ل IFMs للبالغين. ملخص نصي للخطوات الواردة في الشكل 1 لإعداد أقسام hemithorax IFM. بعد التشريح والتثبيت وتشريح الصدر ، يتم تلطيخ الأقسام لتحليل الفحص المجهري. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الرقم.

الشكل التكميلي 2: مخطط التدفق لخطوات تشريح نصفي الصدر ل IFMs العذراء. ملخص نصي للخطوات الواردة في الشكل 3 لإعداد أقسام نصفي الصدر من IFMs العذراء. بعد إزالتها من حالة العذراء ، يتم تثبيت الخادرة وتقسيمها إلى قسمين وتلطيخها للفحص المجهري. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الرقم.

الشكل التكميلي 3: مخطط تدفق الخطوات في تشريح الكتاب المفتوح ل IFMs المبكرة للعذراء. ملخص نصي للخطوات الموضحة في الشكل 4 لإجراء تشريح كتاب مفتوح ل IFMs العذراء قبل 48 ساعة APF. بعد التشريح والتثبيت ، يتم تلطيخ الوريقات الظهارية مع IFMs المرفقة للفحص المجهري. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الرقم.

المناقشة

يقدم هذا البروتوكول إجراء لتشريح نصفي الصدر ل D. melanogaster البالغ (الشكل 1) والعذراء المتأخر (48 ساعة - 96 ساعة APF) (الشكل 3) IFMs بالإضافة إلى تشريح الكتاب المفتوح ل IFMs في وقت مبكر من العذراء (8 ساعات - 48 ساعة APF) (الشكل 4). هذا البروتوكول هو الأمثل لتطبيقات الكيمياء المناعية والفحص المجهري الفلوري. يتم توضيح البروتوكول بمخططات تخطيطية وصور تدريجية لإجراء التشريح. تجعل مخططات النظرة العامة البروتوكول في متناول العلماء الجدد في مجال ذبابة الفاكهة وكذلك الباحثين الجامعيين والمتدربين في المراحل المبكرة. يتم تضمين أمثلة تمثيلية لسوء التثبيت وإعداد العينات لتمكين مستخدمي البروتوكول من تمييز القطع الأثرية عن الأنماط الظاهرية للعضلة العضلية الحقيقية النية.

أصعب خطوة في تشريح نصفي الصدر IFM هي تقسيم الصدر (الشكل 1I و J و L والشكل 3O). تتطلب هذه الخطوة وقتا وممارسة لإتقانها. لمزيد من الثبات أثناء القطع ، يمكن وضع الصدر الفردي على شريط مزدوج العصا وقطع36 ، ولكن يجب توخي الحذر لتجنب جفاف IFMs. من الممكن أيضا القطع من الجانب البطني للصدر ، مع توجيه الجانب الظهري لأسفل ، بحيث يمكن للمستخدمين الجدد اختبار النهج الأكثر فاعلية في إعدادهم. يجب إجراء التخفيضات بشفرات جديدة وحادة لتجنب إتلاف IFMs ، ويجب استبدال الشفرة عندما تصبح باهتة. تستخدم شفرات Microtome (Cryostat) لقطع الصدر بشكل نظيف في هذا البروتوكول ، مقارنة بالبروتوكولات الأخرى التي تستخدم إبرة أو ملقط أو شفرة مشرط24 ، 32 ، 36. شفرات الحلاقة هي بديل آخر لتقسيم الصدر إلى نصفين نظيف. التثبيت مهم أيضا قبل التقسيم ، حيث أن الأنسجة الثابتة قليلا ، على الرغم من الحفاظ عليها بثبات ، قد تكون "إسفنجية" ويصعب قطعها. توازن أوقات التثبيت من 30 إلى 60 دقيقة بين توافر المستضد وتصلب الأنسجة مما يسهل التخفيضات ، ويمكن تقصيرها إلى 15 دقيقة مع الخبرة.

أحد قيود مستحضرات هيميثوراكس هو تغلغل الأجسام المضادة. الهيميثورات عبارة عن عينات سميكة32 ، ويتم الحصول على أفضل صور مجهرية متحد البؤر من أعلى 10-20 ميكرومتر من IFMs42 ، 58. يمكن أن يؤدي تركيز المنظفات المنخفض جدا أو وقت النفاذية القصير جدا إلى تلطيخ ضعيف وغير متسق. يمكن أيضا تحسين تغلغل الأجسام المضادة عن طريق حضانة أطول (2-3 د) في الجسم المضاد الأولي. يمكن لنظام ثنائي الفوتون أو هدف بمسافة عمل أكبر أن يزيد أيضا من عمق التصوير59. إذا احتاج المجرب إلى تصوير القطر الكامل للألياف العضلية IFM ، فيجب النظر في نهج بديل مثل microtome24 أو 58 أو التقسيمبالتبريد 27 في المستوى السهمي.

أحد الجوانب المهمة التي لم يتم تناولها في البروتوكول الرئيسي هو تحليل بيانات الصور. لتحليل الألياف العضلية IFM في صور 10x أو 20x (الشكل 6A-D ، الشكل 7A ، B ، E ، F ، I ، J) ، ، يتضمن التحليل القياسي تحديد ما إذا كانت الألياف العضلية متصلة وما إذا كان التشكل الإجمالي للألياف العضلية سليما37 ، 38. تتضمن أمثلة المعلمات التي يمكن قياسها كميا ، اعتمادا على التجربة ، الطول أو العرض أو الرقم أو العدد المرفق أو عدد الألياف العضلية الممزقة37 ، 60. تتمثل إحدى المزايا الرئيسية لهذا البروتوكول في التوافق مع الفحص المجهري الفلوري والقدرة على تحليل مورفولوجيا العضلة واللييفة العضلية عند تكبير أعلى يبلغ 60x أو 100x (الشكل 6E-H ، الشكل 7C ، D ، G ، H ، K ، L). يجب تحليل مورفولوجيا ساركومير في عينات خالية من القطع الأثرية التقنية (الشكل 6K-P). تم تحديد عدد من فئات الأنماط الظاهرية المحتملة لللييفة العضلية والساركوميرمسبقا 60. الأكثر شيوعا ، يتم قياس طول وعرض الساركومير إما عن طريق رسم وقياس خط من Z-disc إلى Z-disc في برنامج معالجة الصور ، أو بالتناوب باستخدام إحدى الأدوات الآلية العديدة المتوفرة مجانا18 ، 45 ، 61. يمكن تحسين تقييم مورفولوجيا الساركومير من خلال تضمين العلامات التي تصنف القرص Z أو الخط M ، أو الخيوط السميكة أو الرقيقة30 ، 34،58. يمكن استخدام هذه البيانات لوصف الأنماط الظاهرية للألياف العضلية واللييفة العضلية والعضلية العضلية والساركومير كميا بين عينة التحكم والاختبار المعدة باستخدام بروتوكول التشريح هذا.

يجب أن يدرك مستخدمو البروتوكول أنه في حين أن التثبيت يحافظ على الألياف العضلية ومورفولوجيا القارب العضلي ، فإن التثبيت وكذلك المخازن المؤقتة والوسيط المتصاعد قد يتسبب في انكماش الأنسجة أو تورمها ويمكن أن يؤثر على قياس المعلمات المورفولوجية45. من المعروف أن تثبيت الجلوتارالديهايد والجفاف اللازمين للفحص المجهري الإلكتروني يقلص قطر الساركومير43 ، بينما ثبت أن سلخ الألياف والجلسرة يزيدان من قطر الساركومير 44,45. قد تكمن هذه الظاهرة في الاختلافات في معلمات الساركومير في الأدبيات وتؤكد على أهمية تضمين عينات التحكم والاختبار في كل تجربة. يجب معالجة IFMs للتحكم والاختبار في وقت واحد في نفس المخازن المؤقتة من أجل مقارنة دقيقة للمعلمات الكمية الساركومير.

يهدف هذا البروتوكول التفصيلي إلى جعل تشريح IFM للبالغين وعذراء الكيمياء المناعية والفحص المجهري الفلوري أكثر سهولة لأخصائيي ذبابة الفاكهة المبتدئين والمتقدمين. يمكن تكييف هذا البروتوكول للاستخدام مع الحشرات الأخرى وكذلك لتقنيات التصوير الأخرى مثل الفحص المجهري الإلكتروني بالتبريد (cryo-EM) ، أو التألق أحادي الجزيء في الموقع (smFISH) ، أو النسخ المكاني. يوفر الجمع بين أدوات علم الوراثة القوية ذبابة الفاكهة والفحص المجهري الفلوري فرصا فريدة للتحقيق في المبادئ المحفوظة لتكوين العضلات ووظيفة العضلات. نظرا لأن IFMs قابلة أيضا للنهج الجزيئية والكيميائية الحيوية26 ، 27 ، فإن الدراسات المستقبلية التي تربط الأنماط الظاهرية الجزيئية بمورفولوجيا العضلات وبيولوجيا الخلية ووظيفتها ستوفر فهما أعمق لتكوين العضلات ومسببات اضطرابات العضلات.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

يشكر المؤلفون جريجوري ماتيرا على توفير أليل SmnE33 وعلى المناقشات المفيدة حول Smn. يشكر المؤلفون فرانك شنورر وكورنيليا شوينباور ومانويلا ويتكونات وأينور كايا كوبور على المناقشات والدعم المفيدين. يقر المؤلفون بمركز بلومنجتون لتزويده بالذباب. تم دعم هذا العمل من خلال تمويل بدء التشغيل من كلية العلوم والهندسة بجامعة ميسوري كانساس سيتي (UMKC) ، وقسم الأنظمة البيولوجية والطبية الحيوية (MLS) ، وبرنامج تمويل UMKC للتميز (MLS) ، ومكتب UMKC للبحوث الجامعية والمنح الدراسية الإبداعية (SF ، MLS).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
أطباق زراعة الأنسجة بقطر 60 ممفيشر ساينتيفكFB01292160 مم، بوليسترين
حمض الخليك، جليدي (معتمد من ACS)فيشر ساينتيفكA38S-212
أدينوزين ثلاثي الفوسفات (ATP)ميليبور سيغماA1852
رقائق الألمنيوم، متحمل التكلفةأمازون12 بوصة. × 1000 قدم.
أطباق تشريح السيليكون الأسود: مسحوق الفحم النشطميليبور سيغماC9157متوفر أيضا من معظم الصيدليات
أطباق السيليكون الأسود: سيلغارد 184ميليبور سيغما761036لصنع أطباق تجزئة السيليكون، ادمج مكونات سيلجارد في كيس زيبلوك وامزج جيدا. أضف مسحوق الفحم النشط (~200 ملغ) إلى سيلجارد (~50 جرام)، اخلط جيدا، اقطع زاوية الكيس، املأ أطباق الزراعة بسمك 60 مم، أزل الفقاعات برأس ماصة، وتجبر طوال الليل.
صينية شرائح كرتونية، شركة ريسيرش برودكتس إنترناشونال كوربفيشر ساينتيفك50-136-7558
المجهر الكونفوكلي، نيكون AXR الكونفوكال المقلوبنيكونwww.microscope.healthcare.nikon.com/
المجهر الكونفوكلي، Zeiss LSM 780 الكونفوكال المقلوبزايسwww.zeiss.com
غرفة تربية الحشرات داروين (الحاضنة)فيشر ساينتفيك/داروين تشامبرزIN034حاضنة تتحكم بها الضوء ودرجة الحرارة والرطوبة
طبق تشريح (زجاج أسود)ميكروسكوب تكنيك ديتيلم398011ليمفبيكن (أوعية الصباغة/خزانات اللمف)، زجاج أسود، 4x4 سم، مع غطاء زجاجي شفاف
دومونت #3 ملقطأدوات العلوم الدقيقة11231-30طرف دوموكسل المستقيم بملقط بطول 12 سم مع طرف 0.17 × 0.1 مم  
دومونت #5 ملقطأدوات العلوم الدقيقة11252-20ملقط Inox مستقيم بطول 11 سم، درجة بيولوجية بطرف 0.05 × 0.02 مم  
EGTA (حمض الإيغتازيك)ميليبور سيغما324626
الإيثانول، مطلق (200 بروف)فيشر ساينتيفكBP28184درجة علم الأحياء الجزيئي
زجاج غطاء فيشربراند بريميوم (18 × 18 مم)، أغطيةفيشر ساينتيفك12548Aزجاج، مربع، #1 سمك (0.13 - 0.16 مم)
زجاج غطاء فيشربراند بريميوم (22 × 22 مم)، أغطيةفيشر ساينتيفك12548Bزجاج، مربع، #1 سمك (0.13 - 0.16 مم)
ألواح زراعة الخلايا ذات القاع المسطح (24-بئر)فيشر ساينتيفك7200740
كاميرا مجهر التشريح الفلوري، كاميرا Infinity8تيليداين (فيجوال دايناميكس)6 ميجابكسل، إضاءة منخفضة، أحادي اللون
ذبابة: Smn[E33]الطيران الصناعي؛ هدية غريغوري ماتيرا
الطيران: w[1118]مركز بلومينغتون للأسهمRRID:BDSC_3605الطيران
الجلسرولفيشر ساينتيفكBP229-1درجة علم الأحياء الجزيئي
محلول غليوكسال (40٪ وزن في H2O)ميليبور سيغما128465  هذا محلول 40٪ في الأصل
برنامج معالجة الصور، Affinity Designer 2الألفةhttps://affinity.serif.com/en-us/
برنامج معالجة الصور، Image J (فيجي)ImageJ2https://imagej.net/software/fiji/
دبابيس الحشراتأدوات العلوم الدقيقة26002-10الفولاذ المقاوم للصدأ، قطر 0.1 مم (دبابيس دقيقة)
كلوريد المغنيسيوم (MgCl2)فيشر ساينتيفكAA12315A1
الميثانول (HPLC)فيشر كيميكال (فيشر ساينتفيك)A452-4هل تسترخي عند -20؟ قبل الاستخدام
شرائح المجهر، مغطاة بالتجميمفيشر ساينتيفك12-550-400مساحة الكتابة، غير مشحونة، 75 مم × 25 مم × 1 مم
شرائح المجهر، زجاج عاديفيشر ساينتيفك12-544-4تم تنظيفه مسبقا، 75 مم × 25 مم
شفرات MX35 ألترا ميكروتومإبريديا (فيشر ساينتفيك)3053835منخفض الارتفاع، 34&00; زاوية القطع؛ شفرات ريشة C35 بقياس 80 مم تعمل بشكل جيد
طلاء الأظافر، شفاف (طلاء الأظافر Sally Hansen Xtreme Wear)أمازون0.4 أونصة سائلة.
مصل الماعز العاديميليبور سيغماS26 لتر
نوتاتور (روكر صغير ذو نوتاتين، معيار القياس)الغرب الأوسط العلميH3D102024 دورة في الدقيقة، ثابتة؛ 8 × 6 إنش. منصة مع حصيرة مغفرة
فرشاة الرسم (الجولة رقم 0)أمازونالطلقة رقم 0 أو فرشاة مشابهة من أي قطعة فنية
بارافورمالديهايد (PFA)ميليبور سيغما158127-500G
محلول ملحي مخزن الفوسفات (PBS): KClميليبور سيغما529552-250GMتحضير PBS وفقا لبروتوك كولد سبرينغ هارب؛ 2006; doi:10.1101/pdb.rec8247
محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS): KH2PO4ميليبور سيغماP0662-500Gتحضير PBS وفقا لبروتوك كولد سبرينغ هارب؛ 2006; doi:10.1101/pdb.rec8247
محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS): Na2HPO4ميليبور سيغماS9763-500Gتحضير PBS وفقا لبروتوك كولد سبرينغ هارب؛ 2006; doi:10.1101/pdb.rec8247
محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS): NaClفيشر كيميكال (فيشر ساينتفيك)S271-1تحضير PBS وفقا لبروتوك كولد سبرينغ هارب؛ 2006; doi:10.1101/pdb.rec8247
نصائح بيبيت PR1MA (10 وميكرو؛ L)الغرب الأوسط العلميPR10XLRK-NSيونيفرسال 10 وميكرو؛ أطراف ماصة L
أطراف PIPETTE من PR1MA (1000 وميكرو؛ L)الغرب الأوسط العلميPR-1000RK-FLيونيفرسال 1000 وميكرو؛ أطراف ماصة L
نصائح بيبيت PR1MA (200 وميكرو؛ L)الغرب الأوسط العلميPR-200RK-NSيونيفرسال 200 وميكرو؛ أطراف ماصة L
رودامين-فالويدينإنفيتروجين، المجسات الجزيئيةR415
شريط اسكتلندي مزدوج الوجهسكوتش/3M (ستيبلز)649280كلا الجانبين مطليان بمادة لاصقة، بحجم 0.5" × 7 ياردات، متوفر في معظم متاجر مستلزمات المكاتب
ثنائي هيدروجين فوسفات الصوديوم (NaH2PO4)فيشر ساينتيفكAAA1131636
البرمجيات: GraphPad Prismمنشور جراف بادwww.graphpad.com
البرمجيات: إنفينيتي أناليزي 7تيليداين (فيجوال دايناميكس)https://www.teledynevisionsolutions.com/products/infinity-analyze/
البرمجيات: Microscoft Excelمايكروسوفتhttps://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel
مناديل/ كيمتيك ساينس كيموائيب المدللة الحساسة، 1 طبقةفيشر ساينتيفك06-666مناديل المناديل القياسية
ماصة النقلفيشر ساينتيفك13-711-9AMMDالماصة البلاستيكية
تريشن X-100ميليبور سيغماT9284-100ML
مقص فاناس الربيعأدوات العلوم الدقيقة15000-00حافة قطع 3 مم، قطر الرأس 0.05 مم، الطول 8 سم
فيكتاشيلد مع DAPIمختبرات فيكتورH-2000
Vectashield بدون DAPIمختبرات فيكتورH-1900
ورق واتمانميليبور سيغماWHA1004070دوائر ورق الفلتر، الدرجة 4، 70 مم
مجهر الفلورسنت الفلوري z10 التحليليفيجوال دايناميكس (ميدويست ساينتيفيك)http://www.visualdynamix.net/
مجهر التحليل التكبير الستيريو المريح Z850فيجوال دايناميكس (ميدويست ساينتيفيك)http://www.visualdynamix.net/

المراجع

  1. Schiaffino, S., Reggiani, C., Murgia, M. Fiber type diversity in skeletal muscle explored by mass spectrometry-based single fiber proteomics. Histol Histopathol. 35 (3), 239-246 (2020).
  2. Plantié, E., Migocka-Patrzałek, M., Daczewska, M., Jagla, K. Model organisms in the fight against muscular dystrophy: lessons from Drosophila and zebrafish. Molecules. 20 (4), 6237-6253 (2015).
  3. Reedy, M. C., Beall, C. Ultrastructure of developing flight muscle in Drosophila. I: assembly of myofibrils. Dev Biol. 160 (2), 443-465 (1993).
  4. Henderson, C. A., Gomez, C. G., Novak, S. M., Mi-Mi, L., Gregorio, C. C. Overview of the muscle cytoskeleton. Compr Physiol. 7 (3), 891-944 (2017).
  5. Luis, N. M., Schnorrer, F. Mechanobiology of muscle and myofibril morphogenesis. Cells Dev. 168, 203760(2021).
  6. Romani, P., Valcarcel-Jimenez, L., Frezza, C., Dupont, S. Crosstalk between mechanotransduction and metabolism. Nat Rev Mol Cell Biol. 22 (1), 22-38 (2021).
  7. Nikonova, E., Kao, S. -Y., Spletter, M. L. Contributions of alternative splicing to muscle type development and function. Semin Cell Dev Biol. , (2020).
  8. Jawkar, S., Nongthomba, U. Indirect flight muscles in Drosophila melanogaster as a tractable model to study muscle development and disease. Int J Dev Biol. 64 (1-3), 167-173 (2020).
  9. Sparrow, J., Hughes, S. M., Segalat, L. Other model organisms for sarcomeric muscle diseases. Adv Exp Med Biol. 642, 192-206 (2008).
  10. Khan, A. O., Simms, V. A., Pike, J. A., Thomas, S. G., Morgan, N. V. CRISPR-Cas9 mediated labelling allows for single molecule imaging and resolution. Sci Rep. 7 (1), 8450(2017).
  11. Atoki, A. V., et al. Exploring the versatility of Drosophila melanogaster as a model organism in biomedical research: a comprehensive review. Fly (Austin). 19 (1), 2420453(2025).
  12. Ling, Y. -P., Li, J. -J., Liu, J. -W., Zeng, B., Chen, G. -L., Wang, N. Technical innovations of signal amplification in fluorescence in situ hybridization. Gene. 964, 149647(2025).
  13. Ishikawa-Ankerhold, H. C., Ankerhold, R., Drummen, G. P. C. Advanced fluorescence microscopy techniques-FRAP, FLIP, FLAP, FRET and FLIM. Molecules. 17 (4), 4047-4132 (2012).
  14. Fernandes, J., Bate, M., VijayRaghavan, K. Development of the indirect flight muscles of Drosophila. Development. 113 (1), 67-77 (1991).
  15. Swank, D. M. Mechanical analysis of Drosophila indirect flight and jump muscles. Methods. 56 (1), 69-77 (2012).
  16. Dobi, K. C., Schulman, V. K., Baylies, M. K. Specification of the somatic musculature in Drosophila. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 4 (4), 357-375 (2015).
  17. Gunage, R. D., Dhanyasi, N., Reichert, H., VijayRaghavan, K. Drosophila adult muscle development and regeneration. Semin Cell Dev Biol. 72, 56-66 (2017).
  18. Spletter, M. L., et al. A transcriptomics resource reveals a transcriptional transition during ordered sarcomere morphogenesis in flight muscle. eLife. 7, e34058(2018).
  19. Bainbridge, S. P., Bownes, M. Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster. J Embryol Exp Morphol. 66, 57-80 (1981).
  20. Weitkunat, M., Schnorrer, F. A guide to study Drosophila muscle biology. Methods. 68 (1), 2-14 (2014).
  21. Matera, A. G. Chaperone dysfunction in motor neuron disease: new insights from studies of the SMN complex. Genetics. 229 (3), iyae223(2025).
  22. Jagla, K., Kalman, B., Boudou, T., Hénon, S., Batonnet-Pichon, S. Beyond mice: emerging and transdisciplinary models for the study of early-onset myopathies. Semin Cell Dev Biol. 64, 171-180 (2017).
  23. Reedy, M. K., Reedy, M. C. Rigor crossbridge structure in tilted single filament layers and flared-X formations from insect flight muscle. J Mol Biol. 185 (1), 145-176 (1985).
  24. Fyrberg, E. A., Bernstein, S. I., VijayRaghavan, K. Chapter 14: basic methods for Drosophila muscle biology. Methods Cell Biol. 44, 237-258 (1994).
  25. Volk, T., Fessler, L. I., Fessler, J. H. A role for integrin in the formation of sarcomeric cytoarchitecture. Cell. 63 (3), 525-536 (1990).
  26. Kao, S. -Y., Nikonova, E., Ravichandran, K., Spletter, M. L. Dissection of Drosophila melanogaster flight muscles for omics approaches. J Vis Exp. (152), e60309(2019).
  27. Bryantsev, A. L., Castillo, L., Oas, S. T., Chechenova, M. B., Dohn, T. E., Lovato, T. L. Myogenesis in Drosophila melanogaster: dissection of distinct muscle types for molecular analysis. Methods Mol Biol. 1889, 267-281 (2019).
  28. Wang, W., Yoder, J. H. Drosophila pupal abdomen immunohistochemistry. J Vis Exp. (56), e3139(2011).
  29. Segal, D. Live imaging of myogenesis in indirect flight muscles in Drosophila. Bio Protoc. 7 (13), e2377(2017).
  30. Lemke, S. B., Schnorrer, F. In vivo imaging of muscle-tendon morphogenesis in Drosophila pupae. J Vis Exp. 132, e57312(2018).
  31. Kucherenko, M. M., Marrone, A. K., Rishko, V. M., Yatsenko, A. S., Klepzig, A., Shcherbata, H. R. Paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila adult muscles. J Vis Exp. (46), e2438(2010).
  32. Hunt, L. C., Demontis, F. Whole-mount immunostaining of Drosophila skeletal muscle. Nat Protoc. 8 (12), 2496-2501 (2013).
  33. Szikora, S., Novák, T., Gajdos, T., Erdélyi, M., Mihály, J. Superresolution microscopy of Drosophila indirect flight muscle sarcomeres. Bio Protoc. 10 (12), e3654(2020).
  34. Szikora, S., et al. Nanoscopy reveals the layered organization of the sarcomeric H-zone and I-band complexes. J Cell Biol. 219 (1), e201907026(2020).
  35. Xiao, Y. S., Schöck, F., González-Morales, N. Rapid IFM dissection for visualizing fluorescently tagged sarcomeric proteins. Bio Protoc. 7 (22), e2606(2017).
  36. Chakraborty, K., VijayRaghavan, K., Gunage, R. A method to injure, dissect and image indirect flight muscle of Drosophila. Bio Protoc. 8 (10), e2860(2018).
  37. Nikonova, E., et al. Bruno 1/CELF regulates splicing and cytoskeleton dynamics to ensure correct sarcomere assembly in Drosophila flight muscles. PLoS Biol. 22 (4), e3002575(2024).
  38. Nikonova, E., Mukherjee, A., Kamble, K., Barz, C., Nongthomba, U., Spletter, M. L. Rbfox1 is required for myofibril development and maintaining fiber type-specific isoform expression in Drosophila muscles. Life Sci Alliance. 5 (4), e202101342(2022).
  39. Rajendra, T. K., Gonsalvez, G. B., Walker, M. P., Shpargel, K. B., Salz, H. K., Matera, A. G. A Drosophila melanogaster model of spinal muscular atrophy reveals a function for SMN in striated muscle. J Cell Biol. 176 (6), 831-841 (2007).
  40. Phosphate-buffered saline (PBS). Cold Spring Harb Protoc. 2006 (1), (2006).
  41. Chyb, S., Gompel, N. Atlas of Drosophila morphology. , Academic Press. San Diego. (2013).
  42. Weitkunat, M., Kaya-Çopur, A., Grill, S. W., Schnorrer, F. Tension and force-resistant attachment are essential for myofibrillogenesis in Drosophila flight muscle. Curr Biol. 24 (7), 705-716 (2014).
  43. Chakravorty, S., et al. Flightin maintains myofilament lattice organization required for optimal flight power and courtship song quality in Drosophila. Proc Biol Sci. 284 (1854), 20170431(2017).
  44. Tanner, B. C. W., Farman, G. P., Irving, T. C., Maughan, D. W., Palmer, B. M., Miller, M. S. Thick-to-thin filament surface distance modulates cross-bridge kinetics in Drosophila flight muscle. Biophys J. 103 (6), 1275-1284 (2012).
  45. Görög, P., et al. A myofilament lattice model of Drosophila flight muscle sarcomeres based on multiscale morphometric analysis during development. bioRxiv. , (2025).
  46. Jonkman, J., Brown, C. M., Wright, G. D., Anderson, K. I., North, A. J. Tutorial: guidance for quantitative confocal microscopy. Nat Protoc. 15 (5), 1585-1611 (2020).
  47. Brown, J. R., Phongthachit, C., Sulkowski, M. J. Immunofluorescence and image analysis pipeline for Drosophila motor neurons. Biol Methods Protoc. 4 (1), bpz010(2019).
  48. Elliott, A. D. Confocal microscopy: principles and modern practices. Curr Protoc Cytom. 92 (1), e68(2020).
  49. Kaya-Çopur, A., et al. The Hippo pathway controls myofibril assembly and muscle fiber growth by regulating sarcomeric gene expression. eLife. 10, e63726(2021).
  50. Schönbauer, C., et al. Spalt mediates an evolutionarily conserved switch to fibrillar muscle fate in insects. Nature. 479 (7373), 406-409 (2011).
  51. Zhang, X., et al. Mechanoresponsive regulation of myogenesis by the force-sensing transcriptional regulator Tono. Curr Biol. 34 (18), 4143-4159.e6 (2024).
  52. Kouchmeshky, A., McCaffery, P. Chapter six: use of fixatives for immunohistochemistry and their application for detection of retinoic acid synthesizing enzymes in the central nervous system. Methods Enzymol. 637, 119-150 (2020).
  53. Konno, K., Yamasaki, M., Miyazaki, T., Watanabe, M. Glyoxal fixation: an approach to solve immunohistochemical problem in neuroscience research. Sci Adv. 9 (28), eadf7084(2023).
  54. Thavarajah, R., Mudimbaimannar, V. K., Elizabeth, J., Rao, U. K., Ranganathan, K. Chemical and physical basics of routine formaldehyde fixation. J Oral Maxillofac Pathol. 16 (3), 400-405 (2012).
  55. Schönbauer, C., et al. Spalt mediates an evolutionarily conserved switch to fibrillar muscle fate in insects. Nature. 479 (7373), 406-409 (2011).
  56. Monani, U. R. Spinal muscular atrophy: a deficiency in a ubiquitous protein; a motor neuron-specific disease. Neuron. 48 (6), 885-896 (2005).
  57. Imlach, W. L., Beck, E. S., Choi, B. J., Lotti, F., Pellizzoni, L., McCabe, B. D. SMN is required for sensory-motor circuit function in Drosophila. Cell. 151 (2), 427-439 (2012).
  58. Weitkunat, M., Schnorrer, F. A guide to study Drosophila muscle biology. Methods. 68 (1), 2-14 (2014).
  59. Toomre, D., Bewersdorf, J. A new wave of cellular imaging. Annu Rev Cell Dev Biol. 26, 285-314 (2010).
  60. Schnorrer, F., et al. Systematic genetic analysis of muscle morphogenesis and function in Drosophila. Nature. 464 (7286), 287-291 (2010).
  61. Baheux Blin, M., Loreau, V., Schnorrer, F., Mangeol, P. PatternJ: an ImageJ toolset for the automated and quantitative analysis of regular spatial patterns found in sarcomeres, axons, somites, and more. Biol Open. 13 (6), bio060548(2024).

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

تشريح ذبابة الفاكهة سوداء الجلد عضلات الطيران غير المباشرة لنهج الفحص المجهري
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.