مقالة منهجية

عزل البروتوبلاست عالي الجودة الخاص بالأنسجة لتحليلات الخلية المفردة في الأرابيدوبسيس

DOI:

10.3791/69330

⸱

فبراير 6, 2026

 ,  , 
1Max Planck Institute of Molecular Plant Physiology

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تقدم هذه الدراسة بروتوكول عزل البروتوبلاستيد المحزن لأنسجة الجذور والأوراق والساق والزهور في الأرابيدوبسيس ثاليانا. يستخدم خطوات تحسين هضم وتنقية الإنزيمات لتقليل تلف الخلايا والحطام، مما يزيد من الإنتاجية والحصول على بروتوبلايستات عالية الجودة لطرق الخلايا الواحدة، مثل تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أصبح تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية (scRNAseq) أداة أساسية في علم الأحياء النباتي للحصول على معلومات عالية الدقة حول تعبير الجينات الخاص بنوع الخلية، والديناميكيات التطورية، والاستجابات الخاصة بالأنسجة للعوامل البيئية. أحد التحديات التقنية الكبرى في تطبيق scRNAseq على النباتات هو العزل الفعال والقابل للتكرار للخلايا المفردة الحية بدون جدران خلية، مما يمثل تباين أنسجة النبات. عزل البروتوبلاستي، الذي يزيل جدار الخلية إنزيميا لإنتاج خلايا نباتية حية منفردة، هو نهج شائع الاستخدام لهذا الغرض. ومع ذلك، يتطلب العزل الناجح للبروتوبلاست تحسينا دقيقا للحفاظ على بقاء الخلايا والحفاظ على ملفات النسخ الخاصة بنوع الخلية. هنا، نقدم بروتوكولا قويا وقابلا للتكرار لعزل البروتوبلاست عالية الجودة من عدة أنسجة أرابيدوبسيس ثاليانا ، بما في ذلك الأنسجة فوق الأرض (الأوراق، السيقان، الأزهار) وأنسجة الجذور. يأخذ هذا البروتوكول في الاعتبار الخصائص الفسيولوجية الفريدة لأنواع الأنسجة، وتحسين ظروف الهضم الإنزيمية وخطوات التنقية لضمان إنتاجية عالية وتمثيل واسع لأنواع الخلايا المتنوعة. البروتوبلاستيدات الناتجة مناسبة لتطبيقات مثل scRNAseq، وقياس تدفق الخلايا (FACS)، وتحليل التعبير الجيني العابر. يسمح بتوليد تعليق خلية واحدة من أنواع أنسجة متعددة. تدعم الطريقة المقدمة استكشاف التغاير الخلوي وتعزز موثوقية الأساليب ذات الخلية الواحدة في أبحاث النبات.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لقد أحدث تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية (scRNAseq) ثورة في علم بيولوجيا النبات من خلال تمكين تحليل تعبير الجينات بدقة غير مسبوقة. يوفر scRNAseq معلومات النسخ حول التغاير الخلوي، ومسارات التطور، والاستجابة للمحفزات البيئية بدقة خاصة بنوع الخلية 1,2,3.

على عكس الأنظمة الحيوانية، فإن جدار خلية النبات الصلب والتعقيد الهيكلي لأنسجة النبات يشكلان حواجز كبيرة أمام العزل الفعال للخلايا المفردة لتحليل النسخ النصي. من بين الطرق المتاحة، ظهرت إزالة جدار الخلية بالإنزيم لإنتاج البروتوبلاستات كطريقة شائعة الاستخدام، تم تطويرها قبل أكثر من 60 عاما 4,5,6. على الرغم من استخدامه الواسع، يظل عزل البروتوبلاست إجراء تقنيا يتطلب تحسينا خاصا للأنسجة لتحقيق توازن بين إنتاج الخلية وقابلية الاستمرار واستقرار النسخ النصي. تتجنب الطرق البديلة، مثل تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي النواة (snRNA-seq)، الحاجة إلى هضم جدار الخلية عن طريق عزل النوى7. ومع ذلك، يأتي ذلك على حساب فقدان معلومات عن النسخ الناضجة الموجودة في السيتوبلازم. تتجنب طرق التفكك الفيزيائي الأخرى، مثل التشريح الميكانيكي والميكروبيكسي بمساعدة الليزر، هضم جدار الخلايا الإنزيمي، لكنها غالبا ما تكون عرضة للتلوث المتقاطع وقد تؤدي إلى انخفاض قدرة الخلايا على الحياة وتقليل إنتاجية 8,9,10.

تم تطوير العديد من أطالس خلايا النبات في السنوات الأخيرة، خاصة لعلاج الأرابيدوبسيس، مما يوفر رؤى مهمة حول المناظر الطبيعية الترانسكريبتومية للأنسجةالمختلفة 2,11,12,13,14,15,16,17,18 . ومع ذلك، فإن هذه الأطالس تعتمد بشكل أساسي على النباتات في مرحلة اليافعة أو الشتلات، مع التركيز بشكل رئيسي على أنسجة الجذور أو الأوراق. تتطلب البروتوكولات المستخدمة في هذه الدراسات عمليات تحسين لأنسجة الأرابيدوبسيس القديمة، مثل الأوراق الناضجة والزهور والسيقان. بالإضافة إلى ذلك، حتى استخدام دراسات التسلسل الخاصة بنوع الخلية مثل scRNAseq أو فرز الخلايا المنشط بالفلورة (FACS) مع تسلسل الحمض النووي الريبي، لم تكن التغيرات في النسخ النمطية التي تسبب بها عزل البروتوبلاست محسوبة بالكاملل 19.

تبني الطريقة المعروضة هنا على الجهود السابقة مع إدخال عدة تحسينات حاسمة: فهي تأخذ في الاعتبار التباين الفسيولوجي والتشريحي عبر أنسجة النبات من خلال تحسين تركيزات العزل لكل من الأنسجة الجذرية وفوق الأرض (الأوراق، السيقان، الأزهار) وتتضمن خطوات تنقية لطيفة لتقليل تلف الخلايا وتحسين نقاء البروتوبلاستيات. مقارنة بالأساليب القائمة على النوى، لدى هذه الطريقة القدرة على الاحتفاظ بنسخ الخلية الكاملة، مما يتيح معلومات بدقة أعلى لجزيئات mRNA الناضجة الموجودة في السيتوسول. والأهم من ذلك، أن الإجراء ينتج قدرة عالية على وجود بروتوبلاست، وتباين، وتركيزات قابلة للتكرار عبر الأنسجة، تتراوح من حوالي 9.8 × 103 خلايا/ملغ في الأزهار إلى 2.2 × 102 خلايا/ملغ في الأوراق.

الهدف العام من الطريقة المعروضة هو تقديم بروتوكول عزل بروتوبلاستيد قوي وقابل للتكرار مصمم لعدة أنسجة من الأرابيدوبسيس ثاليانا، لتلبية الحاجة الحرجة لمدخلات عالية الجودة تغطي أنواعا مختلفة من الخلايا لدراسات الخلايا الأحادية النباتية.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم إدراج الكواشف والمعدات المستخدمة في هذه الدراسة في جدول المواد.

1. تحضير المخزن

  1. تحضير مخزن عزل البروتوبلاست المناسب17,18 وفقا للجدول 1 في أنبوب طرد مركزي بسعة 15 مل؛ مخزن عزل البروتوبلاستيد الجذري لأنسجة الجذر أو عزل بروتوبلاست الأزهار/الساق/الأوراق للأنسجة فوق الأرض.
    ملاحظة: الكمية التقريبية من حاجز عزل البروتوبلاستيد المطلوبة لخمس نباتات مزهرة من الأرابيدوبسيس ثاليانا (المرحلة 11-12 مع براعم الأزهار المغلقة): الجذر (~ 375 ملغ): 7 مل، الأوراق (~930 ملغ): 5 مل، الساق (~215 ملغ): 3 مل، الزهرة (~10 ملغ): 2 مل.
  2. أضف 2٪ (مع الوزن) من سيلولاز RS و1٪ (بدون الوزن) ماسيروزايم R10 طازج قبل استخدام مخزن عزل بروتوبلاست الجذر/الأوراق. اخلط جيدا بوضع عازل البروتوبلاست على مدور حتى يذوب المسحوق تماما (حوالي 10 دقائق عند 25 درجة مئوية). تجنب تكوين فقاعات هواء وتأكد من عدم وجود كتل مسحوق داخل المخزن الكهربائي.

2. هضم الأنسجة

  1. قم بتصفية مخزن عزل البروتوبلاست المناسب عبر مرشح بحجم 0.2 ميكرومتر قبل الاستخدام. استخدم طبق بترى بحجم قياسي (100 مم × 15 مم) للأوراق والجذور، وطبق بتري صغير الحجم (30 مم × 15 مم) لكميات صغيرة من الأنسجة مثل الزهور. أضف بضع قطرات من عزل البروتوبلاست إلى طبق البتري قبل نقل الأنسجة.
  2. انقل الأنسجة المعنية إلى طبق البتري وقطعها إلى قطع أصغر بضربات رأسية باستخدام شفرة حلاقة بأدق وسرعة ممكنة (الشكل 1A).
    ملاحظة: استخدم دائما شفرات وملاقط مختلفة لكل عينة لتجنب التلوث المتبادل. ارتد قفازات واقية أثناء التعامل مع شفرة الحلاقة.
  3. أضف ما تبقى من محلول عزل البروتوبلاست إلى طبق بتري المناسب لغمر النسيج المقطع وحضنه على حرارة 25 درجة مئوية لمدة ساعة. حافظ على الأنسجة فوق الأرض على الطاولة (بدون اهتزاز) وانقل أنسجة الجذور إلى منصة هزاز الحجاجية (60 دورة في الدقيقة).

3. الترشيح

  1. عينة الجذر بعد الحضانة:
    1. باستخدام ماصة باستور، انقل البروتوبلاستات من طبق البتري إلى مصفاة خلية بسعة 40 ميكرومتر موضوعة فوق أنبوب طرد مركزي مفتوح مبرد مسبقا بسعة 50 مل.
    2. لجمع البروتوبلاستات المتبقية، أضف نفس حجم محلول W5 بالضبط (2 ملليمولار MES pH 5.7، 154 ملليمولار NaCl، 125 ملليمولار CaCl2، 5 ملليمولار KCl) في نفس طبق بتري لجمع البروتوبلاستات الملتصقة بقاعدة طبق بيتري. نقل البروتوبلاستيدات المعلقة في محلول W5 إلى نفس مصفاة الخلية بسعة 40 ميكرومتر الموضوعة فوق أنبوب طرد مركزي مفتوح مسبقا بسعة 50 مل.
    3. مررها مرة ثانية عبر مصفاة خلايا جديدة بسعة 40 ميكرومتر إلى أنبوب طرد مركزي مبرد مسبقا بسعة 50 مل. من الآن فصاعدا، حافظ على العينات على التجميد وكن لطيفا جدا عند التعامل مع البروتوبلاست.
  2. عينات فوق الأرض بعد الحضانة:
    1. باستخدام ماصة باستور، يتم نقل البروتوبلاستات من طبق بتري إلى مصفاة خلية بسعة 70 ميكرومتر موضوعة فوق أنبوب طرد مركزي مفتوح ومبرد مسبقا بسعة 50 مل.
    2. لجمع البروتوبلاستات المتبقية، أضف نفس حجم محلول W5 (2 ملليموتر MES pH 5.7، 154 ملليمولار NaCl، 125 ملليمولار CaCl2، 5 ملليمولار KCl) في نفس طبق بتري لجمع البروتوبلاستات الملتصقة بقاعدة طبق البتري. نقل البروتوبلاستات المعلقة في محلول W5 إلى نفس مصفاة الخلية بسعة 70 ميكرومتر الموضوعة فوق أنبوب طرد مركزي مفتوح مبرد مسبقا بسعة 50 مل. من الآن فصاعدا، احتفظ بالعينات على التجميد وكن لطيفا جدا مع البروتوبلاست.

4. الغسل وتنقية الفيكول

  1. قم بتبريد الطرد المركزي إلى 4 درجات مئوية وجمع (حبيبات) البروتوبلاستيدات لمدة 5 دقائق عند 500 × جرام مع عدم وجود أي فرامل في جهاز الطرد المركزي.
  2. عينة الجذر بعد الطرد المركزي:
    1. تخلص من السوبرناتانت دون إزعاج حبيبات البروتوبلاست.
    2. أعد تعليق البروتوبلاست بلطف شديد في مخزن إعادة تعليق الجذور المبرد مسبقا (4 درجات مئوية) بسعة 600-700 ميكرولتر (بأجزاء متساوية من عازل عزل البروتوبلاست الجذري (بدون إنزيمات) ومحلول W5) باستخدام ماصة باستور أو ماصة جيلسون بسعة 1 مل مع طرف مقطوع لتجنب القص.
    3. انقل نظام التعليق إلى أنابيب مبردة مسبقا بسعة 1.5 مل (4 درجات مئوية).
  3. عينات فوق الأرض بعد الطرد المركزي:
    1. تخلص من الفائق دون إزعاج الحبيبة.
    2. أعد تعليق الحبيبة بلطف شديد في محلول إعادة تعليق للزهور/ساق/ورقة مبرد مسبقا (4 درجات مئوية) بسعة 600-700 ميكرولتر (مزيج متساو من محلول عزل البروتوبلاست للزهور/الساق/الأوراق (بدون إنزيمات) ومحلول W5) باستخدام ماصة باستور أو ماصة جيلسون بسعة 1 مل مع طرف مقطوع لتجنب القص.
    3. انقل نظام التعليق إلى أنابيب مبردة مسبقا بسعة 1.5 مل (4 درجات مئوية).
    4. جهز 300 ميكرولتر من محلول Ficoll PM 400 بنسبة 13.3٪ (بدون جهد) في أنبوب بحجم 1.5 مل. اخلط وأبق على الثلج.
    5. أضف عينة البروتوبلاست المعلقة (600-700 ميكرولتر) ببطء فوق محلول فيكول المعد دون لمس أو خلط طبقة فيكول.
    6. الطرد المركزي عند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق عند 700 × جرام مع ضبط صفر انقطاع في جهاز الطرد المركزي.
    7. اجمع البروتوبلاستيدات الموجودة في الطبقة الوسطى (الواجهة) مع الطور العلوي (الطبقة الأولى) (الشكل 1B). كن حذرا من جمع الطبقة الثالثة السفلية، التي تحتوي على فيكول والحطام المنفصل. تخزين الحرارة عند 4 درجات مئوية حتى الاستخدام الإضافي.

5. العد وفحص الجودة

  1. استخدم 10 ميكرولتر من محلول البروتوبلاست لعد عدد البروتوبلاستيدات المعزولة باستخدام مقياس خلية نيوباور.
    اختياري: يمكن إضافة صبغة إيفانز بلو 1٪ (مع الزجاج) لتقييم مدى صلاحية البروتوبلاستات (الشكل 1C).
  2. تخفيف محلول البروتوبلاست إلى التركيز المطلوب من البروتوبلاستات/مل باستخدام محلول إعادة تعليق مبرد مسبقا (4 درجات مئوية) (موضح في الخطوة 4.2.2 للجذر والخطوة 4.3.2 للأنسجة فوق الأرض) للنسيج المعني.
  3. تابع التجربة المقصودة بأسرع وقت ممكن، مثل تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية و/أو FACS15,19.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمكن بروتوكولات عزل البروتوبلاست المطبقة للأنسجة فوق الأرض والأنسجة الجذرية بنجاح من هضم جدار الخلية بكفاءة وإطلاق خلايا منفردة سليمة من جميع أنسجة الأرابيدوبسيس ثاليانا. عبر أنواع الأنسجة المختبرة، والتي شملت الزهور والسيقان والأوراق والجذور، أنتجت عملية الهضم الإنزيمي بروتوبلاستات منفصلة جيدا مع عدد قليل جدا من مجموعات الخلايا غير المهضومة (الشكل 2A-D). أكدت اختبارات الصبغة الزرقاء من إيفانز أن البروتوبلاستات التي أظهرت شكلا كرويا مع حدود غشاء بلازما ملساء هي خلايا قابلة للحياة (الشكل 1C). لكل نوع من الأنسجة، تم عد البروتوبلاستيدات الكروية. احتوت الأزهار بمتوسط 97,875 ± 7,531 (9,788 خلية/ملغ، n = 3)، وجذع 119,025 ± 22,508 (550 خلية/ملغ، n = 4)، أوراق 210,483 ± 15,572 (225 خلية/ملغ، n = 3)، وجذور 225,363 ± 52,561 (599 خلية/ملغ، n = 4).

أظهرت معلقات البروتوبلاست توزيعا واسعا لأحجام الخلايا ووجود بلاستيدات خضراء أو فاتحة، مما يعكس التركيب الخلوي غير المتجانس لكل نسيج تم جمعه (الشكل 3A-D). لتأكيد ذلك، تم إجراء عزل للبروتوبلاست باستخدام خط مراسل YFP خاص بالخلايا المصاحبة المعدلة وراثيا، واحتوى التعليق على بروتوبلاستات صغيرة صالحة مع إشارة YFP تمثل الخلايا المرافقة (الشكل 3E). وهذا يؤكد أن بروتوكول عزل البروتوبلاست المستخدم مناسب للخلايا الوعائية التي يصعب عزلها ذات جدران الخلايا الصلبة.

مع الطريقة المحسنة المقدمة، يمكن عزل عدد كبير من البروتوبلاست القابلة للحياة مع كمية قليلة من الحطام من أنسجة النباتات البالغة المختلفة. لتحسين تنقية العينات فوق الأرض، أدرجنا خطوة تنظيف وسادة Ficoll لإزالة العضيات المنبعثة وغيرها من الحطام الخلوي من العينات المهضمة مع الحفاظ على جودة النسخ (الشكل 4).

في مكتبات scRNAseq cDNA المولدة من البروتوبلاستيات، تم الكشف عن نسخ منزلية عالية التعبير مثل ACTIN2 ونصوص نادرة/منخفضة التعبير مثل عامل النسخ الهوميدومين KNAT1، وهو علامة خاصة بالخلايا المحيطية والميريستيمية، بالإضافة إلى العلامات الخلوية المرافقة SUC2 وPARCL1، بواسطة اختبارات cDNA PCRمحددة 15 (الشكل 5). يشير هذا إلى تمثيل واسع لأنواع الخلايا وتباين مجموعة البروتوبلاست الحاصلة عليها، وقد تم تأكيد ذلك بشكل أكبر من خلال تحليل بيانات scRNAseq المنتجة بهذه الطريقة15.

figure-results-1
الشكل 1: سير عمل خطوات عزل البروتوبلاست. تم عرض ست خطوات رئيسية: (1) تحضير المخزن المؤقت (2) هضم الأنسجة، (3) الترشيح، (4) تنقية الغسل وتقنية فيكول، (5) العد ومراقبة الجودة، و(6) الاستمرار في التجارب اللاحقة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-2
الشكل 2: صور خطوات تحضير البروتوبلاستيك. (أ) صورة تمثيلية لمرحلة تقطيع عينة الورقة (الخطوة 2.1). تظهر الصورة العلوية الأنسجة المحصودة مع بضع قطرات من العزل في طبق بتري بحجم قياسي وشفرة حلاقة للتقطيع. الصورة أدناه، على اليسار، تمثل النسيج بعد عدة ضربات عمودية بشفرة الحلاقة (انظر السهم). الصورة أدناه، على اليمين، تمثل العينة المقطعة، جاهزة للخطوة التالية. (ب) صورة لوسادة فيكول بعد الطرد المركزي في أنبوب بسعة 1.5 مل (الخطوة 4.3.7). يشير السهم الأبيض إلى الطبقة الوسطى التي تحتوي على البروتوبلاستيات. (ج) صورة المجهر التمثيلية لبروتوبلايستات الأوراق الحضانة في صبغة إيفانز بلو. شريط المقياس: 250 ميكرومتر. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-3
الشكل 3: صور مجهرية للبروتوبلاستيدات المولدة. تعرض صور البروتوبلاست من كل نوع من الأنسجة. (أ) زهرة، (ب) ساق، (ج) ورقة، (د) جذر. شريط القياس: 250 ميكرومتر. (E) صور المجهر الكونفوكال لخط مراسل YFP الخاص بالخلايا المرافقة. الصورة الأولى (على اليسار) تمثل تعبير مراسل خلية YFP المرافقة في الأوعية الدموية للورقة (اللون الأخضر). الصورة الثانية (على اليمين) تمثل بروتوبلاستيدات من خلايا تعبر عن مراسل YFP (إشارة خضراء). اللون البنفسجي/الأزرق يمثل التألق الذاتي للبلاستيدات الخضراء. شريط المقياس 10 ميكرومتر. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-4
الشكل 4: صور المجهر لبروتوبلاستيدات الأوراق قبل (أ) وبعد (ب) تنظيف وسادة فيكول. أشرطة المقياس: 250 ميكرومتر. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-5
الشكل 5: أجهزة تحكم الجودة في مكتبات scRNAseq. صور هلامية تمثيلية لأجهزة التحكم في جودة PCR لمكتبات RNAseq أحادية الخلية في الأنسجة الجذرية وفوق الأرض. تم اختبار الجيناتSUC2، PARCL، KNAT1، ACT2 (من A إلى D على التوالي)، ولكل نسيج: زهرة، ساق، ورقة، جذر من اليسار إلى اليمين على التوالي. يستخدم cDNA (+) كتحكم إيجابي، ويستخدم الماء كمادة تحكم سلبية. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

العزل الجذري للبروتوبلاستينغحاجز بروتوبلاستينغ للزهرة/الساق/الأوراق
مانيتول 600 مللي مولارمانيتول 400 مللي
2 مللي مولار MgCl2-
0.1٪ BSA0.1٪ BSA
2 مللي مولار CaCl210 مللي مولار CaCl2
2 مللي مولار MES pH 5.720 مللي مولار MES pH 5.7
10 مللي مولار KCl20 مللي مولار KCl
اضبط الرقم الهيدروجيني إلى 5.5 باستخدام 1M Tris Base إذا لزم الأمراضبط الرقم الهيدروجيني إلى 5.5 باستخدام 1M Tris Base إذا لزم الأمر

الجدول 1: تركيبات عزل البروتوبلاست. توفر وصفات عزل البروتوبلاست للأنسجة الجذرية والأنسجة فوق الأرض (الزهور، الساق، الأوراق).

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تخصيص هذا البروتوكول المحسن لعزل البروتوبلاستا من أنسجة الأرابيدوبسيس المختلفة لتطبيقات scRNAseq، حيث يحلل كامل الترانسكريبتوم الموجود في السيتوبلازم والنوى. أدى تحسين الأنسجة الخاصة بالمخازل وخطوات إضافية للهضم والتنقية إلى إنتاجية قوية وقابلة للتكرار عبر أنسجة مختلفة. تحديدا، بلغ متوسط ~98,000 خلية لكل عينة (~9,788 خلية لكل ملغ من النسيج)، وبروتوبلاستيدات الجذع ~119,000 خلية (~550 خلية لكل ملغ)، وبروتوبلاستيدات الأوراق ~210,500 خلية (~225 خلية لكل ملغ)، وبروتوبلاستات الجذور ~225,000 خلية (~599 خلية لكل ملغ)، مما يعكس التنوع البنيوي والفسيولوجي لهذه الأنسجة.

كان من التعديلات الرئيسية في هذا البروتوكول استخدام وسادة قائمة على فيكول بدلا من التدرجات والوسائد المعتمدة على السكروز الأكثر شيوعا للتنقية. على عكس السكروز، الذي يمتصه الخلايا وله تأثير كبير على النسخ 13,20,21، فإن فيكول خامد أسموزيا وغير نفاذ للغشاء، مما يحافظ على سلامة الحمض النووي الريبي أثناء العزل22. كما قللت هذه الخطوة من عدد العضيات الحرة، مثل البلاستيدات الخضراء، الناتجة عن الخلايا المكسورة والحطام الخلوي في المعلق. وجود مثل هذه الحطام يمكن أن يتداخل مع تكون القطرات عن طريق انسداد قنوات الأجهزة الميكروفلويدية أو التسبب في وجود أكثر من خلية واحدة في القطرات المتشكلة، مما يساهم في تلوث الحمض النووي الريبي المحيط. كل هذه العوامل يمكن أن تؤدي إلى استنتاجات خاطئة أو تحيزات في تحليل بيانات scRNA-seq.

وقد أظهر أن عزل البروتوبلاست يمكن أن يغير النسخ النصي لخلايا النبات 2,15,16,19. استراتيجية رئيسية في هذا البروتوكول لتقليل هذه القطعة هي الحفاظ على البروتوبلاستات عند 4 درجات مئوية (على الجليد) بعد الهضم الإنزيمي، مما يبطئ نشاط الأيض والنشاط النسخي، وبالتالي يقلل من التغيرات النسخية المعروفة المرتبطة بعزل البروتوبلاستي. بالإضافة إلى ذلك، من الضروري الحفاظ على اتساق وقت حصاد الأنسجة عبر النسخ المكررة ومواءمته مع هدف الدراسة، حيث ثبت أن التغيرات في التوقيت تؤثر على كل من الجينات الناتجة عن البروتوبلاست والنسخ التي تنظمها الساعة البيولوجية التي تم اكتشافها في مجموعات بيانات scRNA-seq15.

في هذه الطريقة، بالإضافة إلى إنتاج خلايا مفردة مع حطام قليل، كان هناك نقطة مهمة أخرى للحفاظ على تباين الأنسجة لتمثيل جميع أنواع الخلايا. تم تأكيد التنوع في معلقات البروتوبلاست من خلال اكتشاف أشكال مختلفة للبروتوبلاست، بما في ذلك الأحجام المتنوعة ووجود إشارات من خطوط مراسلة خاصة بنوع الخلية ضمن السكان الحاصلين عليها (الشكل 2). بالإضافة إلى ذلك، تم تقييم مجموعة البروتوبلاست من خلال اكتشاف نسخ نادرة وخاصة بنوع الخلية وكذلك نصوص التنظيف في مكتبات cDNA scRNA-seq باستخدام PCR (الشكل 4). شملت هذه الجينات النادرة للعلامات في قمة الفروع، وعلامات الخلايا المرافقة15. يؤكد التقاط هذه النسخ بنجاح أن الطريقة المعروضة تسمح بعزل أنواع خلايا متنوعة بنزاهة عالية، مما يجعلها أداة قيمة لتعزيز أبحاث الخلايا المفردة في النباتات. بالإضافة إلى scRNAseq، يمكن استخدام هذه الطريقة أيضا في قياس تدفق الجينات، وتحليل تعبير الجينات العابر، واختبارات تجديد النباتات.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أعلن المؤلفون عدم وجود تضارب مصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هذه المقالة جزء من مشروع حصل على تمويل من المجلس الأوروبي للأبحاث (ERC) ضمن برنامج الاتحاد الأوروبي Horizon 2020 للبحث والابتكار (اتفاقية المنحة رقم 810131).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
سيلولاز RS دوشيفا بيوكيمياC8003
طراز الطرد المركزي 5810Rإبندورف5810000010
Ficoll PM 400 سيغما-ألدرتش26873-85-8
ماسيروزايم R10دوشيفا بيوكيمياM8002
نموذج الطرد المركزي الدقيق 5417Rإبندورفتم إيقافه
فلتر حقن معقم Puradisc 30، 0.2 وميكرو؛ mسيتيفا10462200يشار إليه باسم 0.2 وميكرو؛ مرشح m في البروتوكول
مصفاة الخلايا المعقمة 40 وميكرو؛ m نايلون ميش  فيشربراند22363547
مصفاة الخلايا المعقمة 70 وميكرو؛ m نايلون ميش  فيشربراند22363548

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Macosko, E. Z., et al. Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
  2. Denyer, T., et al. Spatiotemporal developmental trajectories in the Arabidopsis root revealed using high-throughput single-cell RNA sequencing. Dev Cell. 48 (6), 840-852.e5 (2019).
  3. Tenorio Berrío, R., et al. Dual and spatially resolved drought responses in the Arabidopsis leaf mesophyll revealed by single-cell transcriptomics. New Phytol. 246 (3), 840-858 (2025).
  4. Cocking, E. C. A Method for the Isolation of Plant Protoplasts and Vacuoles. Nature. 187 (4741), 962-963 (1960).
  5. Zhai, Z., Jung, H., Vatamaniuk, O. K. Isolation of protoplasts from tissues of 14-day-old seedlings of Arabidopsis thaliana. J Vis Exp. (30), e1149(2009).
  6. Adedeji, O. S., Naing, A. H., Kim, C. K. Protoplast isolation and shoot regeneration from protoplast-derived calli of Chrysanthemum cv. White ND. Plant Cell Tissue Organ Cult. 141 (3), 571-581 (2020).
  7. Wang, K., et al. An optimized FACS-free single-nucleus RNA sequencing (snRNA-seq) method for plant science research. Plant Sci. 326, 111535(2023).
  8. Kerk, N. M., Ceserani, T., Tausta, S. L., Sussex, I. M., Nelson, T. M. Laser capture microdissection of cells from plant tissues. Plant Physiol. 132 (1), 27-35 (2003).
  9. Brandt, S., Walz, C., Schad, M., Pavlovic, N., Kehr, J. A simple, chisel-assisted mechanical microdissection system for harvesting homogenous plant tissue suitable for the analysis of nucleic acids and proteins. Plant Mol Biol Report. 21 (4), 417-427 (2003).
  10. Berkowitz, O., et al. RNA-seq analysis of laser microdissected Arabidopsis thaliana leaf epidermis, mesophyll and vasculature defines tissue-specific transcriptional responses to multiple stress treatments. Plant J. 107 (3), 938-955 (2021).
  11. Jean-Baptiste, K., et al. Dynamics of gene expression in single root cells of Arabidopsis thaliana. Plant Cell. 31 (5), 993-1011 (2019).
  12. Ryu, K. H., Huang, L., Kang, H. M., Schiefelbein, J. Single-cell RNA sequencing resolves molecular relationships among individual plant cells. Plant Physiol. 179 (4), 1444-1456 (2019).
  13. Shulse, C. N., et al. High-throughput single-cell transcriptome profiling of plant cell types. Cell Rep. 27 (7), 2241-2247.e4 (2019).
  14. Wendrich, J. R., et al. Vascular transcription factors guide plant epidermal responses to limiting phosphate conditions. Science. 370 (6518), eaay4970(2020).
  15. Apelt, F., et al. Shoot and root single-cell sequencing reveals tissue- and daytime-specific transcriptome profiles. Plant Physiol. kiab537. , (2021).
  16. Kim, J. -Y., et al. Distinct identities of leaf phloem cells revealed by single-cell transcriptomics. Plant Cell. 33 (3), 511-530 (2021).
  17. Zhang, T. -Q., Chen, Y., Wang, J. -W. A single-cell analysis of the Arabidopsis vegetative shoot apex. Developmental Cell. 56 (7), 1056-1074.e8 (2021).
  18. Shahan, R., et al. A single-cell Arabidopsis root atlas reveals developmental trajectories in wild-type and cell identity mutants. Dev Cell. 57 (4), 543-560.e9 (2022).
  19. Birnbaum, K., et al. A gene expression map of the Arabidopsis root. Science. 302 (5652), 1956-1960 (2003).
  20. Aghdasi, M., Smeekens, S., Schluepman, H. Microarray analysis of gene expression patterns in Arabidopsis seedlings under trehalose, sucrose and sorbitol treatment. Int J Plant Prod. 2 (4), 309-320 (2008).
  21. Nakayama, Y., Kusano, M., Kobayashi, M., Manabe, R., Watanabe, M. Catabolic reprogramming of Brassica rapa leaf mesophyll protoplasts during the isolation procedure. Plant Growth Regul. 99 (2), 337-357 (2023).
  22. Grgac, R., Rozsypal, J., Des Marteaux, L., Štětina, T., Koštál, V. Stabilization of insect cell membranes and soluble enzymes by accumulated cryoprotectants during freezing stress. Proc Natl Acad Sci USA. 119 (41), e2211744119(2022).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Single Cell AnalysisArabidopsis ThalianaSingle Cell RNAseqTissue Specific IsolationEnzymatic DigestionCell ViabilityFlow CytometryGene Expression AnalysisPlant Cell Suspension

مقالات ذات صلة