تم إجراء جميع الإجراءات التجريبية وفقا لمعايير المعاهد الوطنية للصحة لرعاية واستخدام المختبرية، وتمت الموافقة عليها من قبل لجنة أخلاقيات في جامعة بكين للطب الصيني (رقم الموافقة: BUCM-2024042505-2065).
1. تحضير
- اختيار ذكور بالغين من جرذان سبراج داولي (SD) بوزن 220.0 جرام ± 20.0 جرام للتجربة.
- تضم في مركز التجريبية بجامعة بكين للطب الصيني بدرجة حرارة مضبوطة (24 ± 2 درجة مئوية) وتحت دورة مظلمة/مضيئة لمدة 12 ساعة، مع مياه شرب معقمة ونظام غذائي قياسي للحبيبات متاحة حسب الرغبة.
- تعويد جميع على البيئة لمدة 7 أيام قبل بدء التجارب.
- قسم عشوائيا 24 فأر SD إلى ثلاث مجموعات (n = 8 لكل مجموعة): مجموعة العمليات الوهمية (Sham)، مجموعة نموذج SCI (النموذج)، ومجموعة الوخز بالإبر الكهربائية (EA). يوضح مخطط محور الزمن في التصميم التجريبي في الشكل 1.
2. تأسيس نموذج SCI
ملاحظة: تم حرمان الفئران من الماء والطعام لمدة 8 ساعات قبل العملية، وتم تعقيم الأدوات الجراحية باستخدام بخار عالي الحرارة. تم بناء نموذج SCI باستخدام تعديل لطريقة ألينرقم 24.
- ضع الجرذ في صندوق تحفيز التخدير وتحفزه بالأكسجين الذي يحتوي على 4٪ إيزوفلوران (1 لتر/دقيقة) حتى يتم تخديره بالكامل.
- أخرج الجرذ من صندوق الحث ووضع أنفه وفمه عند قناع التخدير. اضبط تركيز الإيزوفلوران إلى 1.5٪-2٪ للحفاظ على التخدير.
ملاحظة: أثناء عملية تخدير الفئران، من الضروري مراقبة حالة الجرذ عن كثب. إذا أظهر الفأر تنفسا ضحلا وسريعا أو انخفاضا في درجة حرارة الجسم، قلل تركيز الأيزوفلوران لتجنب الإفراط في التخدير.
- احلق شعر ظهر الفأر لكشف منطقة الجراحة بالكامل. قم بتعقيم منطقة العمليات باليودوفور والكحول.
- حدد الفقرة الصدرية العاشرة (T10). أنشئ شق طولي متوسط بقطر 2.5 سم مركزه على T10.
- استخدم شفرات جراحية لفصل عضلات الظهر، مما يكشف عن النتوء الشوكي والعضلات المجاورة للفقرات الصدرية. إزالة النتوء الشوكي واللامينا في T10 باستخدام ملقط دموي، مما يكشف عن جزء بحجم حوالي 10 مم من الحبل الشوكي.
- يصطدم بالدورا ماتر المكشوفة (200 كيلوداين) بدقة باستخدام جهاز ألين المعدل لتحفيز كدمة متوسطة.
ملاحظة: يتميز نجاح نموذج الحبل الشوكي بالاحتقان والوذمة في الجافة في موقع الإصابة وتأرجح تشنج الذيل. بالنسبة لمجموعة شام، خضعت الفئران لنفس الإجراء الجراحي، بما في ذلك إزالة الصفيحة الفقرية، لكن الحبل الشوكي لم يتضرر.
- غط الجاف بإسفنج جيلاتين وخيط الجرح طبقة طبقة.
- ضع الفأر على وسادة تسخين بدرجة حرارة ثابتة مضبوطة على 37 درجة مئوية وراقبه حتى يستعيد وعيه.
- حقن البنسلين الصوديوم في عضلة الجرذ مرة واحدة يوميا لمدة ثلاثة أيام بعد العملية لمنع العدوى. بالإضافة إلى ذلك، قم بتدليك المثانة للجرذ 2-3 مرات يوميا لتسهيل التبول.
3. علاج EA
- نفذ تدخل EA لمدة 24 ساعة بعد تأسيس نموذج الحبل الشوكي بنجاح.
- جهز إبر الوخز بالإبر المعقمة القابلة للتخلص منها (القطر: 0.30 مم؛ الطول: 25 مم).
- وفقا لنظرية الطب الصيني التقليدي والخبرة السريرية، اختر نقاط الوخز بايهوي (GV20)، دازوي (GV14)، ومينغمن (GV4) لعلاج EA.
- حضر جوارب حريرية سوداء. وجه الفأر ليحفر في الجوارب السوداء. اربط الفأر وثبت على لوح باستخدام رباط.
ملاحظة: يجب شد الحبل بشكل معتدل لمنع اختناق الجرذ من الارتباط بإحكام مفرط أو هروبه بسبب الربط الفضفاض المفرط.
- حدد نقطة الوخز GV20 في مركز العظم الجداري، عند تقاطع منتصف الجبهة ومنتصف الخط الذي يربط بين طرفي الأذنين. حدد موقع GV14 بين الفقرة العنقية السابعة (C7) والفقرة الصدرية الأولى (T1)، على الخط الأوسط من الظهر. حدد موقع GV4 في الانخفاض تحت النتوء الشوكي للفقرة القطنية الثانية (L2)، على الخط الأوسط للظهر (الشكل 2).
- قم بتعقيم نقاط الوخز باستخدام اليودوفور الطبي و75٪ كحول طبي.
- أدخل الإبر بشكل مائل للأسفل بزاوية 15° إلى عمق 2-3 مم عند GV20. أدخل الإبر في نقاط GV14 وGV4 بزاوية 45°، بعمق 5-7 مم (الشكل 3A).
- قم بتوصيل الإبر بجهاز العلاج الخارجي بتردد 2 هرتز وشدة 1 مللي أمبير. اختر شكل الموجة كموجة مستمرة (الشكل 3B، C).
ملاحظة: تم إجراء هذا التدخل التفاعلي المبكر يوميا لمدة 28 يوما، واستغرقت كل جلسة 20 دقيقة. لم تتلق الفئران في مجموعتي شام وموديل أي علاج، لكنها تم تجميدها لمدة 20 دقيقة يوميا بنفس الطريقة التي كانت في مجموعة EA.
4. تقييم الوظيفة الحركية (الشكل 4)
ملاحظة:في اليوم الأول والسابع والرابع عشر والحادي والعشرين والثامن والعشرين بعد العملية، تم تقييم الوظيفة الحركية للفئران في كل مجموعة بواسطة موسيقى باسو، بيتي، وبريسنهان (BBB).
- ضع الفأر في مكان مفتوح وهادئ للسماح بالحركة بحرية.
- راقب حركات الأطراف الخلفية للجرذ وقم بتقييمها وفقا للمقياسالمعتمد 25.
ملاحظة: قام باحثان، كانا غير مدركين لتجميع الفئران، بتوزيع الدرجات بشكل مستقل، وتم حساب الدرجة النهائية لكل فأر كمتوسط تقييماتهم.
5. إجراء تجربة متاهة Y (الشكل 5)
ملاحظة: في اليوم الأول بعد تدخل EA(اليوم التاسع والعشرون من التجربة)، تم إجراء تجربة متاهة Y، بما في ذلك اختبار التناوب التلقائي واختبار استكشاف الذراع الجديد. يتم عرض إجراء التجربة في متاهة Y في الشكل 5A.
- ضع أقفاص التجريبية في بيئة تجريبية قبل الاختبار واعتادها لمدة 30 دقيقة.
- نظف جهاز المتاهة Y بالكحول، واضبط عشوائيا الأذرع الثلاثة في متاهة Y كذراع بداية، وذراع جديدة، وذراع أخرى.
- خلال مرحلة اختبار التناوب التلقائي، غط الذراع الجديدة بحواجز.
- ضع الفأر برفق في نهاية ذراع البداية ودعه يستكشف بحرية في كلا الذراعين لمدة 10 دقائق. سجل أوقات ومسافة ووقت إقامة الفأر الذي دخل ذراع البداية والذراع الأخرى.
- قم بإزالة أي فضلات من الحجرة بعد إكمال كل فأر الاختبار. نظف داخل الحجرة بنسبة 75٪ كحول طبي وجففها بشاش نظيف لمنع التداخل الناتج عن الروائح التي تركها المشاركون السابقون. حافظ على بيئة داخلية هادئة طوال فترة التجربة.
- أزل الحاجز وأجر تجربة استكشاف الذراع الجديدة بعد 4 ساعات من تجربة التناوب التلقائي.
- ضع الفأر برفق في نهاية ذراع البداية ودعه يستكشف بحرية في الأذرع الثلاثة لمدة 5 دقائق.
- سجل تسلسل وعدد الإدخالات والمسافة ووقت إقامة الفأر الذي يدخل كل ذراع خلال 5 دقائق.
6. إجراء تجربة التعرف على الأجسام الجديدة (NOR) (الشكل 6)
ملاحظة: في اليوم الثاني بعد تدخل EA(اليوم الثلاثون من التجربة)، تم إجراء تجربة NOR. يتم عرض إجراء التجربة في NOR في الشكل 6A.
- جهز إعدادا تجريبيا يتكون من صندوق بقياس 70 سم × 60 سم × 30 سم، وأجسام مكعبة زرقاء، وأجسام أسطوانية حمراء.
- أدخل الفأر في صندوق التجارب ودعه يستكشف المحيط بحرية لمدة 10 دقائق.
- بعد الانتهاء من التجربة السابقة لمدة ساعة واحدة، ضع جسمين مكعبين متماثلين بشكل متماثل في زاويتين من صندوق التجربة، على بعد حوالي 10 سم من الجدران.
- أدخل الفأر في صندوق التجارب مع توجيه رأسه بعيدا عن كتلة الجسم. دع الفأر يستكشف محيطه بحرية لمدة 10 دقائق ليصبح معتادا على كتلة الأشياء.
- بعد الانتهاء من تجربة كل فأر، امسح صندوق التجربة جيدا بالكحول لتقليل تأثير الروائح المتبقية على سلوك الفئران اللاحقة. بمجرد أن يجف الصندوق، ضع الفأر التالي بداخله.
- بعد الانتهاء من التجربة أعلاه لمدة 4 ساعات، استبدل كتلة الجسم الأيمن بجسم أسطواني.
- أعد إدخال الفأر في صندوق التجارب ورأسه مواجها بعيدا عن جدار كتلة الجسم. دع الفأر يستكشف بحرية لمدة 5 دقائق داخل الصندوق.
- سجل الوقت الذي قضيته في استكشاف الأجسام الأسطوانية والمكعبة والمسافة والوقت الكلي. احسب مؤشر التفضيل باستخدام الصيغة: (وقت استكشاف الكائن الجديد - وقت استكشاف الكائن القديم)/(وقت استكشاف الكائن الجديد + وقت استكشاف الكائن القديم) × 100٪.
7. إجراء اختبار تفضيل السكروز
ملاحظة: يستخدم السكن في قفص واحد لمنع المنافسة الاجتماعية على المياه، والتي قد تعيق سلوك الشرب.
- حضر زجاجة بمحلول سكروز بنسبة 1٪ وزجاجة بماء الصنبور.
- ضع محلول السكر وزجاجات ماء الصنبور داخل القفص، مع التأكد من تبديل مواقعهما كل 12 ساعة.
- دع الجرذ يتكيف مع ماء السكر وماء الصنبور لمدة 48 ساعة. بعد ذلك، حرم الفأر من شرب الماء لمدة 24 ساعة دون صيام.
- أعد إلى القفص زجاجة ماء سكر وزجاجة ماء صنبور. غير مواقع الزجاجات بعد ساعتين، وسجل استهلاك كل سائل خلال فترة 4 ساعات. احسب نسبة تفضيل السكروز باستخدام الصيغة: (تناول محلول السكروز/(مدخل محلول السكروز + مدخل الماء) × 100٪.
8. تلوين HE على الحصين
- بعد الاختبار السلوكي، قم بتخدير الفأر بكمية 3٪ من الفينوباربيتال الصوديوم (2.0 مل/كجم). قم بإجراء تروية القلب باستخدام بارافورمالديهايد. خذ نسيج الدماغ وادمجها في البارافين. حضر شرائح بسماكة 5 ميكرومتر.
تحذير: البارافورمالديهايد مهيج ويجب التعامل معه في بيئة جيدة التهوية.
- قم بإزالة البارافين من الشرائح باستخدام الزيلين (I) والزيلين (II) لمدة 10 دقائق متتالية. انقع الشرائح في كحول تدرج لتجفيفها، بحيث يستمر كل تدرج لمدة 3 دقائق. وأخيرا، اغمر الشرائح في ماء مقطر لمدة دقيقتين.
- صبغ الشرائح بمحلول الهيماتوكسيلين لمدة 10 دقائق. اشطف المحلول الزائد بالماء لمدة 1-3 دقائق. اغمر الشرائح بسرعة في حمض المورياتيك الإيثانول لمدة 5-10 ثوان. اشطف الزحليقة بالماء مرة أخرى.
- انقل الشرائح إلى محلول قلوي ضعيف للعودة الزرقاء. اشطف الشرائح بالماء لمدة 1-3 دقائق. اغمر الشرائح في 85٪ إيثانول لمدة 3-5 دقائق.
- صبغ الشرائح بمحلول الإيوزين لمدة 3-5 دقائق، ثم جفف بالكحول المتدرج بعد الغسيل. ضع الشرائح في الزيلين لمدة 5-10 دقائق. وأخيرا، استخدم راتنج محايد لإغلاق الشرائح.
- افحص الشرائح الملونة تحت المجهر الضوئي بتكبير 400×.
9. تحليل ELISA
- بعد الاختبار السلوكي، قم بقتل الجرذ بحقن الصوديوم بنتوباربيتال داخل الصفاق (200 ملغ/كغ). احصد أنسجة الحصين.
- وزن نسيج الحصين وانقله إلى أنبوب تجانس مبرد مسبقا.
- قم بتجانس الأنسجة على الجليد باستخدام أداة تجانس الأنسجة.
- قم بالطرد المركزي بالتجانس عند 5000 × جرام لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. اجمع المادة الفائقة وحدد تركيز البروتين الكلي.
- حدد تركيز IL-1β وIL-6 في الحصين باستخدام مجموعات ELISA.
10. التحليل الإحصائي
- استخدم برنامج تحليل إحصائي مناسب للتحليل الإحصائي. عبر عن البيانات كمتوسط ± انحراف معياري.
- إجراء تحليل ثنائي الاتجاه للتباين (ANOVA) باستخدام مقاييس متكررة واختبار الفرق الأقل دلالة (LSD) لتحليل الفروقات بين المجموعات في بيانات درجات BBB.
- إجراء تحليل أنوفاي أحادي الاتجاه باستخدام طريقة LSD لمقارنة التباين بين المجموعات في تجارب أخرى عندما كانت البيانات موزعة بشكل طبيعي أو تحتوي على تباين متجانس. وإلا، قم بإجراء الاختبار غير المعلمي.
- إذا كانت البيانات تتوافق مع توزيع طبيعي، قم بإجراء تحليل بيرسون للارتباط. وإلا، قم بإجراء تحليل الارتباط بتقنية سبيرمان.
- ضع في اعتبارك الفروق ذات دلالة إحصائية عندما < P 0.05.