يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة بحثية

يعدل حمض الليبويك مسار Nrf2/HO-1 لقمع الالتهاب في التهاب القرنية الفطري من خلال آليات الحماية الخلوية الموجهة من المضيف

403 مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/69362

⸱

ديسمبر 9, 2025

 , 
1Department of Ophthalmology, Jinan 2nd People's Hospital

في هذه المقالة

ملخص

ينشط حمض الدهون مسار الحماية للخلايا Nrf2/HO-1 في التهاب القرنية الفطري، مما يقلل من مستويات السيتوكينات الالتهابية وتلف القرنية. يظهر هذا العلاج الموجه من المضيف ملفات سلامة متفوقة مقارنة بمضادات الفطريات التقليدية، مع تقديم رؤى ميكانيكية لعلاج أمراض العين الناتجة عن الإجهاد التأكسدي من خلال تعزيز مسارات مضادات الأكسدة الداخلية.

الملخص

تم دراسة حمض الليبويك (LA)، وهو مضاد أكسدة ثنائي القطب ذو ملف سلامة عين نموذجي، لقدرته على تهدئة البيئة التأكسدية والالتهابية التي تدفع التهاب القرنية الفطري. تحملت خلايا الظهارة القرنية البشرية LA حتى 60 ميكرومولار دون فقدان البقاء، وعند تحدي داء أسبيرجيلوس التدخين ، تسبب LA في تصاعد الانتقال النووي للعامل النووي المرتبط بإريثرويد 2 (Nrf2) بثلاثة أضعاف، وزيادة خمسة أضعاف في تأثيره الأسفل هيم أوكسيناز-1 (HO-1). أدى الإسكات الدوائي ل Nrf2 مع ML385 أو الحجب التحفيزي ل HO-1 باستخدام بروتوبورفيرين القصدير IX إلى إلغاء هذه الأحداث الجزيئية وأعاد التعبير عن الإنترلوكين-1β وعامل نخر الورم α، مؤكدا الاعتماد الصارم على Nrf2/HO-1. أكدت التجارب المتوازية في نموذج التهاب القرنية الفأرية الملاحظات المختبرية : فقد قلل التحليل الموضعي من عتامة القرنية ودرجات الالتهاب بنسبة 47٪، مما أدى إلى تضخيم تعبير Nrf2 وHO-1 في القرنية مع تقليل نسخ السيتوكينات إلى النصف؛ أدى الإعطاء المشترك ل SnPPIX إلى إلغاء هذه الفوائد. تحدد البيانات مجتمعة تسلسلا ميكانيكيا متماسكا حيث يزيد LA، عند تركيزات سريرية يمكن تحقيقها، مستويات بروتين Nrf2 ويعزز النقل النووي، ويعزز نشاط HO-1، وبالتالي يهدئ الاضطراب السيتوكيني الناتج عن الممرض. تضع هذه النتائج لوس أنجلوس كمساعد سهل الترجمة وموجه من المضيف، قادر على تكمل العلاج الكيميائي المضاد للفطريات، وتشير إلى آفاق علاجية أوسع لتعديل التهاب القرنية المهدد للبصر بنظام Nrf2.

المقدمة

يعترف الآن بالتهاب القرنية الفطري (FK) كحالة طوارئ عينية شاملة، مسؤولة عن أكثر من مليون حالة أثبتت في الزراعة سنويا ونسبة غير متناسبة من عمى القرنية في المناطق الاستوائية وشبه الاستوائية 1,2. تشير تقديرات الإصابة التي تقترب من 6-8 لكل 100,000 في الولايات المتحدة، وحتى أعلى في الاقتصادات الزراعية، إلى تهديد عالمي متزايد يفضل أن يصيب السكان في سن العمل بعد إصابات نباتيةأو ارتداء العدسات اللاصقة. تهيمن الفطريات الخيطية، وأبرزها أنواع الفيزاريوم والأسبيرجيلوس، على المشهد المسبب، وتزدهر في المناخات الدافئة والرطبة وتستغل الإصابات الدقيقة في العين لبدء العدوى5.

على الرغم من نصف قرن من الاستخدام السريري، لا يزال ناتاميسين 5٪ هو العامل الموضعي الوحيد المعتمد خصيصا لعلاج FK؛ ومع ذلك، فإن كيمياء البوليين لديها تسبب ضعف اختراق القرنية، وتتطلب جرعات متكررة، وليست متوفرة عالميا 6,7. ومن المقلق أن دراسة مراقبة متعاقبة من جنوب آسيا كشفت عن زيادات تدريجية في التركيزات المثبطة الأدنى لكل من الناتامايسين والترييازول، حيث أظهرت عزلات الفيوزاريوم زيادة سنوية في مقاومة الناتامايسين ≥6٪ واتجاه مواز لفوريكونازول8. تتوافق هذه البيانات مع التقارير السريرية عن فشل العلاج وتعزز التوقعات بأن سوق علاجات FK سيتوسع من 0.9 مليار دولار أمريكي في عام 2023 إلى 1.48 مليار دولار بحلول عام 2033، مدفوعا بشكل كبير بعدم كفاية العلاج الدوائي الحالي. الإجراءات الجراحية المؤقتة، مثل شرائح الملتحمة أو القرنية المخترقة، تعيد التشريح في القرحات العنيدة، لكنها تستهلك الموارد وتحد من الرؤية9. بشكل مجتمع، تؤكد هذه النواقص الحاجة إلى استراتيجيات موجهة من قبل المضيف أو استراتيجيات متعددة الأهداف تتجاوز مجرد العمل الفطري.

يفهم الآن أن الإجهاد التأكسدي والسلسلة الالتهابية الناتجة عنه هما من المحددين المحوريين لتكون المرض الفطري والندوب القرنية. عند الغزو الفطري، تبدأ خلايا الظهارة القرنية ومجموعات المناعة المقيمة، بما في ذلك خلايا البدينة الملتحمة، والخلايا التغصنية الليمبلية، والخلايا القرنية البديلة، استجابات مناعية فطرية من خلال مستقبلات التعرف على الأنماط، مثل Dectin-1 ومستقبلات شبيهة ب Toll10. تتراكم أنواع الأكسجين التفاعلي المستخرج من العدلات (ROS) في الجرومات المصابة كجزء من الانفجار التأكسدي المضاد للميكروبات، بينما تستمر الخلايا البلعمية والخلايا اللمفاوية التائية المتسللة في استمرار الالتهاب المزمن من خلال تضخيم السيتوكينات11. ومن المفارقات أن الفطريات الخيطية ترفع دوائرها المضادة للأكسدة (مثل ديسموتازات الأكسجين الفائق المنظمة بواسطة Yap1) لتتمكن من البقاء في هذا الجو العدائي. ينشط الفائض من ROS بدوره النسخ المعتمد على NF-κB لIL-1β وTNF-α ووسطاء التهابيين آخرين تدفع تدمير الأنسجة وعتامة القرنية12. في مركز الحماية الخلوية الداخلية يقع العامل النووي المرتبط بالإريثرويد 2 (Nrf2)، الذي ينسق نقله إلى النواة تعبير إنزيم الهيم أوكسيناز-1 (HO-1) ومجموعة من الإنزيمات المزيدة للسموم عبر أنواع خلايا قرنية متعددة، بما في ذلك الخلايا الظهارية، وخلايا القرنية، وخلايا البطانة13,14. تؤدي الشيخوخة، والسكري، والالتهاب المزمن إلى خفض هذا المحور، مما يجعل الأنسجة البصرية عرضة للإصابات المؤكسدة، بينما يعزز التعزيز الجيني أو الدوائي ل Nrf2 إغلاق الجروح الطهارية ويثبط ارتفاع السيتوكين في إصابات القرنية المتنوعة15.

بدأت دراسات إثبات المفهوم في استغلال هذا المسار في فرنديا كينغ. تحقق الجزيئات الصغيرة الطبيعية مثل بيريلالدهيد16، حمض الجاليك17، هيدروكسي تايروزول18، ومركب الأورغانوسيلينيوم إبسيلين19 تأثيرين مزدوجين مضاد للفطريات ومضاد للالتهابات من خلال تعزيز إشارات Nrf2-HO-1 مع إضعاف حيوية الفطريات بشكل مباشر. توضح منصات الطب النانوي التي تشارك في توصيل مضادات الفطريات ومضادات الأكسدة الوعد العلاجي لدمج إزالة مسببات الأمراض مع تعزيز الدفاع عن المضيف20,21. ومع ذلك، يواجه العديد من هؤلاء المرشحين عقبات انتقالية تتعلق بتعقيد التركيبة أو سلامة العين غير المثبتة.

حمض الدهون (LA) هو مضاد أكسدة ثنائي أيول منتشر في كل مكان، يتمتع بسجل أمان جهازي مثبت ومرونة استثنائية في الدواء الديناميكية. استنادا إلى دراسات في الأنسجة الكبدية والعصبية، يقترحأن يعدل 10,12 LA بقايا السيستين مباشرة (وخاصة Cys151 وCys273 وCys288) على بروتين ECH-1 المرتبط ب Keap1 المرتبط ب Kelch، مما يعطل تفاعله مع Nrf2 وبالتالي يمنع انتشار Nrf2 وتحلل البروتيازومات، مما يؤدي إلى زيادة مستويات بروتين Nrf2، وتحسين النقل النووي، وزيادة نسخ HO-1. ومع ذلك، فإن الإثبات المباشر لتفاعل Keap1-LA في خلايا ظهارة القرنية يستحق تحقيقا مستقبليا. أظهرت LA فوائد واقية للخلايا في نماذج الكبد والعصبية والعينية للإصابة التأكسدية13،15. طبيعته الأمفيباتية تسهل اختراق الأنسجة دون السمية الغشية التي لوحظت مع البوليينات، وتوجد بالفعل تركيبات سريرية للمؤشرات الموضعية والجهازية. ومع ذلك، لم يتم التدقيق بدقة في قدرة LA على تعديل البيئة الدقيقة الالتهابية للقرنية وبالتالي تحسين FK.

لذلك، بحثت الدراسة الحالية فيما إذا كان LA يمكن أن يخفف من اعتلال القرنية الناتج عن A. fumigatus عن طريق تنشيط محور Nrf2/HO-1 مع تثبيط السيتوكينات المؤيدة للالتهابات. باستخدام خلايا الظهارة القرنية البشرية ونموذج FK للفئران المعتمد، قمنا بتحديد خصائص الجرعة-الاستجابة، وحللنا الاعتماديات الميكانيكية باستخدام مثبطات انتقائية، وقياس النتائج العلاجية ضد مجموعات الضوابط غير المصابة والمجموعات التي عالجتها المركبات المصابة. حسب علمنا، يمثل هذا أول تحقيق منهجي يثبت فعالية حمض الليبويك العلاجي في التهاب القرنية الفطرية من خلال توصيف شامل للجرعة-الاستجابة، والتشريح الآلي باستخدام مثبطات دوائية انتقائية لكل من Nrf2 وHO-1، والتحقق في النماذج الخلوية والحيوانية. يدمج هذا العمل بشكل فريد القراءات الجزيئية والخلوية والترجمية ليقدم دليلا قاطعا على الاعتماد على مسار Nrf2/HO-1 الذي يكمن وراء تأثيرات LA المضادة للالتهابات. من خلال دمج قراءات جزيئية وخلاوية وداخل الجسم الحي ، سعينا لتقديم تقييم شامل ل LA كعلاج سهل الترجمة وموجه من قبل المضيف يعالج الضرورتين المزدوجين للقضاء على مسببات الأمراض وكبح الالتهاب في FK.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تمت الموافقة على جميع إجراءات من قبل لجنة رعاية واستخدام المؤسسية (رقم البروتوكول: IACUC-2024-FK-007) وأجريت وفقا لبيان جمعية أبحاث الرؤية وطب العيون لاستخدام في أبحاث العيون والرؤية. تم احتجاز ذكور فئران C57BL/6، التي تتراوح أعمارها بين 8-10 أسابيع ووزنها 20-25 جرام، في أقفاص مهواة بشكل فردي تحت ظروف بيئية محكمة تتراوح بين 22 ± 2 درجة مئوية ورطوبة نسبية بين 50٪-60٪ مع دورة من الإضاءة إلى الظلام 12:12 ساعة. تم الحصول على هذه الخالية من مسببات الأمراض من مختبرات تشارلز ريفر (انظر جدول المواد). خضعت جميع الفئران لفترة تأقلم مدتها أسبوع للتكيف مع البيئة الجديدة قبل الإجراءات التجريبية، مع وصول غير مقيد إلى طعام القوارض والماء القياسي.

تحذير: الرشاش الدهني هو كائن ممرض يتطلب احتواء من مستوى السلامة البيولوجية الثاني. يجب التعامل مع جميع المزارع الفطرية في خزانة سلامة بيولوجية معتمدة باستخدام معدات الحماية الشخصية المناسبة، بما في ذلك القفازات، والمعاطف المختبرية، وحماية العين. ثنائي ميثيل كبريتسيد (DMSO) قابل للاشتعال ويمكنه اختراق الجلد؛ التعامل معه في المناطق المهواة جيدا وتجنب الاتصال المباشر. الكيتامين والزيلازين هما من المواد الخاضعة للرقابة وتتطلب تخزينا آمنا وتوثيقا مناسبا وفقا للوائح المؤسسات.

التحضير التجريبي
تم تجهيز جميع المواد والكواشف والأدوية والمواد المطلوبة وفقا لسير العمل التجريبي (انظر جدول المواد والشكل التكميلي 1 للتخطيط). تم تحضير محاليل مخزون حمض الراسيمي (±)-α-ليبويك (LA) باستخدام حمض الراسيميك α-ليبويك (1,2-ديثيولان-3-بنتانويك) مذاب في DMSO بتركيز 60 ملليمول، وتم تخزينه في أليكوات أحادية الاستخدام عند -80 درجة مئوية لمنع التحلل التأكسدي. تم تحضير مثبط Nrf2 ML385 ومثبط HO-1 SnPPIX بنفس الطريقة وتم اختيارهما للاستخدام الواحد لتجنب دورات التجمد والذوبان. تم تجهيز جميع وسائط ومكملات زراعة الخلايا في ظروف معقمة وتم تدفئتها مسبقا إلى 37 درجة مئوية قبل الاستخدام.

جميع المواد الملوثة بزراعة الفطريات، بما في ذلك ألواح الأجار، وأنابيب الزراعة، والبلاستيك القابل للاستخدام مرة واحدة، تم تعقيم المواد عند حرارة 121 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة قبل التخلص منها في حاويات نفايات بيولوجية خطرة. تم جمع النفايات الكيميائية التي تحتوي على مذيبات عضوية بشكل منفصل والتخلص منها من خلال بروتوكولات الصحة والسلامة البيئية المؤسسية. تم حرق أنسجة وجثث من خلال خدمات النفايات الطبية الحيوية المعتمدة.

زراعة الفطريات وتحضير العدوى
تم تربية أسبيرجيلوس فوميغاتوس على أجار سابورو ديكستروز عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 5-7 أيام حتى لوحظ تكوين مخروطي ناضج. تم جمع الكونيديا عن طريق غمر المزارع الناضجة بمحلول ملحي معقم مخزز بالفوسفات (PBS) يحتوي على 0.05٪ Tween-80، وتم ترشيح المعلقات المخروطية عبر شاش معقم لإزالة شظايا الخيط. تم تحديد تركيز القرنية المخروفية باستخدام جهاز قياس الدم وتعديله على التركيزات المحددة بناء على نماذج التهاب القرنية الفطرية المنشورة. لتجارب المختبر، تم اختيار 1 × 106 كونيديا/مل (تعدد العدوى بنسبة 10:1) بناء على دراسات سابقة أظهرت أن هذا التركيز يحفز استجابات التهابية قوية في خلايا ظهارة القرنية مع الحفاظ على بقاء الخلايا الكافية للتحليلات اللاحقة16,17. في الدراسات الحية (invivo)، تم اختيار 1 × 107 كونيديا/ملتر لأن هذا اللقاح ينتج التهاب قرنية متوسط شدة متسق مع درجات مرضية قابلة للتكرار بحلول اليوم الخامس بعد العدوى، مما يوفر نطاقا ديناميكيا كافيا لتقييم فعالية العلاج دون زيادة في الوفيات16,19.

العلاج الحيواني وعدوى القرنية
تحت التخدير العام (الحقن داخل الصفاق للكيتامين 100 ملغ/كجم وزيلزين 10 ملغ/كغ)، تم تحفيز التهاب القرنية الفطري عن طريق خلق ثلاث خدوش خطية بعمق 1 مم على القرنية المركزية باستخدام إبرة معقمة 25 جرام، تلاها تطبيق موضعي لجرعة 5 ميكرولتر من التعليق المخروطي لألبوم فوميغاتوس . تم توزيع الفئران عشوائيا إلى مجموعات العلاج (n=8 لكل مجموعة): مجموعة التحكم (غير مصابة)، مجموعة تحكم مصابة، مصابة + علاج LA (60 ميكرومول/لتر موضعيا 4 مرات يوميا)، وعلاج المصاب + LA + SnPPIX (LA زائد 5 ملغ/كجم SnPPIX داخل الصفاق يوميا). تم إجراء التقييم السريري وجمع الأنسجة في اليوم الخامس بعد العدوى.

احتياطات التعامل مع: يجب إجراء جميع الإجراءات المتعلقة بالحيوانات المخدرة في ظروف معقمة. راقب باستمرار أثناء التخدير لعلاج تثبيط التنفس. التخلص من الفراش الملوث، والنفايات الجراحية، والأنسجة المصابة عن طريق التعقيم الطبي ثم الحرق وفقا لبروتوكولات إدارة النفايات البيولوجية المؤسسية.

زراعة الخلايا والعلاج
تم الحصول على خلايا الظهارة القرنية البشرية (HCECs) من ATCC وحفظها في وسط DMEM/F-12 مدعوم ب 10٪ مصل بقري جنيني، 1٪ بنسلين-ستريبتومايسين، و1٪ L-جلوتامين بتركيزات متساوية عند 37 درجة مئوية في غلاف جوي رطب يحتوي على 5٪ CO₂. كانت الخلايا تزرع كل 3-4 أيام عند الوصول إلى التقاء 80٪-90٪ وتستخدم بين المقاطع 3-8 لضمان الاتساق. في العلاجات التجريبية، تم زرع الخلايا بحجم 5 × 10⁳ من الخلايا لكل بئر في صفائح مناسبة وتركت تلتصق لمدة 24 ساعة قبل العلاج. في جميع التجارب الميكانيكية المختبرية ، تعرضت الخلايا أولا لداء الرشاش الدهني كونيديا عند تعدد العدوى (MOI) بنسبة 10:1 لمدة 4 ساعات لتثبيت العدوى، تلاها إضافة LA (60 ميكرومولار)، ML385 (5 ميكرومولار)، أو SnPPIX (1 ميكرومولار) بمفرده أو مجتمعة لمدة 24 ساعة إضافية قبل جمع العينات. يتيح هذا التصميم المتسلسل تقييم التأثيرات العلاجية لل أنجلوس على التحديات الفطرية المعتمدة بدلا من العلاج الوقائي.

تقييم بقاء الخلايا (تحليل CCK-8)
تم تقييم فعالية الخلايا باستخدام مجموعة عد الخلايا 8 (CCK-8). تم زرع الخلايا في صفائح بحجم 96 بئر بحجم 5 × 10 أو4 خلايا لكل بئر وحضنتها لمدة 24 ساعة قبل العلاج. بعد التعرض للدواء، أضيف 10 ميكرولتر من محلول CCK-8 إلى كل بئر، وتم حضن الصفائح لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية. تم قياس الامتصاص عند 450 نانومتر باستخدام قارئ ميكرولوح متعدد الأوضاع. تم إجراء كل حالة تجريبية بثماني تكرار، وتكررت التجارب ثلاث مرات بشكل مستقل. تم الحفاظ على تركيز التحكم في المركبات (DMSO) تحت 0.1٪ لتجنب التأثيرات السامة للخلايا.

استخراج الحمض النووي الريبي وPCR الكمي في الوقت الحقيقي
تم عزل إجمالي الحمض النووي الريبي من الخلايا والأنسجة القرنية المزروعة باستخدام مجموعة RNeasy Mini Kit وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. تم توحيد عينات الأنسجة في مخزن RLT باستخدام موحش الأنسجة لمدة دقيقتين عند 50 هرتز. تم تقييم جودة وتركيز الحمض النووي الريبي باستخدام مقياس طياف، مع استخدام العينات بنسبة 260/280 تتراوح بين 1.8-2.0 للتحليل في مرحلة ما بعد التيار. تم إجراء تخليق cDNA للسلسلة الأولى باستخدام مجموعة النسخ العكسي cDNA عالية السعة مع 1 ميكروغرام RNA إجمالي لكل تفاعل. تم إجراء PCR الكمي باستخدام مزيج رئيسي qPCR قائم على SYBR Green على نظام PCR في الوقت الحقيقي مع إزالة الطبيعة الأولية عند 95 درجة مئوية لمدة دقيقتين، تلتها 40 دورة من 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية و60 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة. تم إجراء تحليل منحنى الانصهار للتحقق من خصوصية الأمبليكون. تم التحقق من صحة جميع البادئات من حيث الكفاءة (90٪-110٪) والنوعية قبل الاستخدام. تم حساب التعبير النسبي لل mRNA باستخدام طريقة 2(-ΔΔCT) باستخدام GAPDH كجين مرجعي.

استخراج البروتين وتحليل البلوت الغربي
لاستخلاص البروتين الكلي، تم تحلل الخلايا والأنسجة في محلول RIPA مع مكمل كوكتيلات مثبطات للبروتياز والفوسفاتاز. تم تحضير كسور البروتين النووي والسيتوبلازمي باستخدام كواشف NE-PER النووية والاستخلاص السيتوبلازمي وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. تم تحديد تركيزات البروتين باستخدام اختبار برادفورد. تم فصل كميات متساوية من البروتين (30-50 ميكروغرام) بواسطة SDS-PAGE ونقلها إلى أغشية PVDF. بعد الحجب باستخدام حليب خالي من الدهون بنسبة 5٪ في محلول ملحي مخزن بتريس-يحتوي على 0.1٪ Tween-20 لمدة ساعة واحدة، تم حضان الأغشية بأجسام مضادة أولية طوال الليل عند درجة حرارة 4 درجات مئوية، تلاها الأجسام المضادة الثانوية المتقاربة ب HRP لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. تم تصور أشرطة البروتين باستخدام كاشف لمعان كيميائي معزز مع أوقات تعرض تتراوح بين 30-180 ثانية حسب شدة الإشارة. تم قياس الأشرطة باستخدام برنامج ImageJ، حيث كان β الأكتين يعمل كأداة تحكم في التحميل للبروتينات الكلية وطبقة B1 للبروتينات النووية.

التقييم السريري والتحليل النسيجي
تم تقييم شدة مرض القرنية باستخدام نظام تقييم سريري موحد استند إلى البروتوكولات المعتمدة لالتهاب القرنية الفطري في الفأر22. يقيم نظام التقييم ثلاثة معايير على مقياس 0-4: تعتيم القرنية (0 = صاف، 4 = معتمة تماما)، عدم انتظام السطح (0 = أملس، 4 = تقرحات شديدة مع ثقب)، والاستجابة الالتهابية (0 = عدم تسلل، 4 = تسرب كثيف مع الهيبوبيون)، مما يعطي مجموع درجات من 0 إلى 12. تم إجراء جميع التقييمات السريرية بواسطة مراقبين مستقلين اثنين كانا مقنعين في مجموعات العلاج، مع اتفاق بين المراقبين تجاوز 90٪. تم التقاط صور القرنية باستخدام مجهر حيوي ذو مصباح شق مزود بكاميرا رقمية. في التحليل الأنسيجي، تم استبعاد العينين، وتثبيتها في بارافورمالديهايد بنسبة 4٪، وغرس في البارافين، وقطعها بسماكة 5 ميكرومتر. تم صبغ المقاطع بالهيماتوكسيلين والإيوزين لتقييم الشكل العام.

اختبار التغذية المناعية المرتبطة بالإنزيمات (ELISA)
تم قياس مستويات IL-1β وTNF-α المفرزة في المواد الفائقة لزراعة الخلايا ومتجانسات أنسجة القرنية باستخدام مجموعات ELISA التجارية وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. تم جمع مواد الزراعة الخلوية بعد 24 ساعة من العلاج، بينما تم توحيد أنسجة القرنية في مثبطات البروتين الباروتيازي PBS. تم طرد العينات بحرارة 12,000 x g لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية، واستخدمت المواد الفائقة لتحليل ELISA. تم تحليل جميع العينات بشكل مكرر، وتم حساب تركيزات السيتوكينات من منحنيات قياسية.

التحليل الإحصائي
أجريت جميع التجارب باستخدام نسخ بيولوجية مناسبة (n ≥6 للدراسات المختبرية ، n = 8 للدراسات الحيوانية) وتكررت على الأقل 3 مرات بشكل مستقل. تعرض البيانات كمتوسط ± خطأ معياري للمتوسط (SEM). تم إجراء تحليل البيانات باستخدام GraphPad Prism الإصدار 9.0. على وجه التحديد، استخدمنا دالة اختبار الطبيعية (شابيرو-ويلك) لتقييم توزيع البيانات، وتحليل النوفاع الأحادي الاتجاه مع اختبار المقارنات المتعددة لتوكي للتجارب التي تضم أكثر من مجموعتين، واختبار t غير المزوج لطالب للمقارنات بين مجموعتين. تم إنشاء الرسوم البيانية كمخططات أشرطة مجمعة مع نقاط بيانات فردية تراكب كمخططات تشتت، مع أشرطة الخطأ التي تمثل الخطأ القياسي للمتوسط.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

أظهر سير العمل التجريبي أن علاج حمض الدهون يعدل بفعالية مسار إشارات Nrf2/HO-1 لكبح الالتهاب في نماذج التهاب القرنية الفطرية.

تقييم سمية الخلايا لحمض الليبويك والمثبطات الخاصة بالمسار
أجريت دراسات أولية للجرعة والاستجابة لتحديد التركيزات المثلى لكل مركب استخدم في هذا البحث. أظهر LA توافقا حيويا ممتازا مع HCECs، محافظا على بقاء الخلايا عند تركيزات تصل إلى 60 ميكرومولار بعد 24 ساعة تعرض، مما جعل هذا التركيز الأمثل لل LA للدراسات الميكانيكية اللاحقة (الشكل ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

تؤكد النتائج الحالية أن حمض الليبويك (LA) محفز قوي لمحور Nrf2/HO-1 يخفف من التهاب القرنية الفطرية (FK) عن طريق الحد من تعبير السيتوكين الالتهابي والحفاظ على بنية القرنية. تماشيا مع أبحاث حديثة أظهرت تنشيط قويا ل Nrf2 بواسطة مركبات الديثيولان في الاضطرابات التأكسدية15، أنتج LA زيادة خمسة أضعاف في نسخ HO-1 وخفض إفراز IL-1β/TNF-α إلى النصف، متفوقا على عدة منشطات كيميائية نباتية تم الإبلاغ عنها لالتهاب العين 2,23

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يصرح المؤلفون بعدم وجود تضارب مصالح مرتبط بهذا العمل. لم تؤثر أي علاقات تجارية أو تمويل خارجي على تصميم الدراسة أو تنفيذها أو تفسيرها.

شكر وتقدير

وقد تم دعم هذا البحث بتمويل داخلي من قسم طب العيون، مستشفى جينان الثاني للشعب. يشكر المؤلفون بكل امتنان المساعدة الفنية التي قدمها موظفو المختبر في صيانة زراعة الخلايا وإجراءات نماذج. شكر خاص للجنة رعاية واستخدام المؤسسية على مراجعة البروتوكول والموافقة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
ضد HO-1تكنولوجيا الإشارات الخلية، دانفرز، ماساتشوستس، الولايات المتحدة الأمريكية#8803
مضاد الأكتين وبيتاسيغما-ألدريتش، سانت لويس، ميزوري، الولايات المتحدة الأمريكيةA5441
مضاد اللامين B1أبكام، كامبريدج، ماساتشوستس، الولايات المتحدة الأمريكيةab16048
مضاد Nrf2أبكام، كامبريدج، ماساتشوستس، الولايات المتحدة الأمريكيةAB62352
Aspergillus fumigatus204305 ATCCلا يوجد
مجموعة اختبار برادفوردمختبرات بيو-راد5000006
فئران C57BL/6مختبرات تشارلز ريفرلا يوجد
مجموعة عد الخلايا-8 (CCK-8)مختبرات دوجيندو، كوماموتو، اليابان343-07623
DMEM/F-12 متوسطةجيبكو، ثيرمو فيشر ساينتيفك11320033
DMSOسيغما-ألدرتشD2650
كاشف ECLثيرمو فيشر العلمي32106
مصل الأبقار الجنينيجيبكو، ثيرمو فيشر ساينتيفك16000044
مقدمة GAPDH Forwardالتوليف المخصصالعرف
جلوتاماكسجيبكو، ثيرمو فيشر ساينتيفك35050061
مجموعة النسخ العكسي عالية السعة لنموذج cDNAأنظمة حيوية تطبيقية، ثيرمو فيشر ساينتفيك4368814
برايمر HO-1 فوروردالتوليف المخصصالعرف
برايمر عكسي HO-1التوليف المخصصالعرف
IgG مضاد للفأر مرتبط ب HRPأبكام، كامبريدج، ماساتشوستس، الولايات المتحدة الأمريكيةab205718
IgG مضاد للأرانب مرتبط ب HRPأبكام، كامبريدج، ماساتشوستس، الولايات المتحدة الأمريكيةab205719
خلايا الظهارة القرنية البشرية (HCECs)ATCC، ماناساس، فيرجينيا، الولايات المتحدة الأمريكيةCRL-11135
IL-1 & بيتا؛ مجموعة إليساR& دي سيستمز، مينيابوليس، مينيسوتا، الولايات المتحدة الأمريكيةDY201
حمض الليبويك (لوس أنجلوس)سيغما-ألدريتش، سانت لويس، ميزوري، الولايات المتحدة الأمريكيةT1395
ML385 (مثبط Nrf2)ميدكيم إكسبريس، مونماوث جنكشن، نيوجيرسي، الولايات المتحدة الأمريكيةHY-100523
مطياف نانوسدروب 2000ثيرمو فيشر العلميND-2000
كواشف الاستخلاص النووي والسيتوبلازم NE-PERثيرمو فيشر العلمي78833
مبراير Nrf2 Forwardالتوليف المخصصالعرف
مبرايمر العكسي Nrf2التوليف المخصصالعرف
PBS بنسبة 0.05٪ في Tween-80التحضير المخصصالعرف
البنسلين-ستربتوميسينجيبكو، ثيرمو فيشر ساينتيفك15140122
مزيج ماستر جرين من PowerUp SYBRأنظمة حيوية تطبيقية، ثيرمو فيشر ساينتفيكA25741
نظام كوانتستوديو 5 لمستقبل PCRثيرمو فيشر العلميA28140
مخزن RIPAالتحضير المخصصالعرف
مجموعة RNeasy الصغيرةتشياغن، هيلدن، ألمانيا74104
سابورو ديكستروز آجارالتحضير المخصصالعرف
المجهر الحيوي ذو المصباح المشقوقالمعدات المخصصةلا يوجد
SnPPIX (مثبط HO-1)فرونتير ساينتيفيك، لوغان، يوتا، الولايات المتحدة الأمريكيةF6140
قارئ الميكرولوح متعدد الأوضاع من Synergy HTXBioTek Instruments، وينوسكي، فيرمونت، الولايات المتحدة الأمريكيةSYNHXTTR
TBS-T (0.1٪ في سن المراهقة)التحضير المخصصالعرف
TissueLyser LTتشياغن69980
TNF-&; مجموعة إليساR& دي سيستمز، مينيابوليس، مينيسوتا، الولايات المتحدة الأمريكيةDY210

المراجع

  1. Kam, K. W., Rao, S. K., Young, A. L. The diagnostic dilemma of fungal keratitis. Eye. 37 (3), 386-387 (2023).
  2. Shaikh, N. R., Choudhary, K. G. Fungal keratitis- an update on the global threat. Int J Adv Res. 11 (03), 51-55 (2023).
  3. Lambert, L. H., Finger, G. E., Tompkins, B. L. Case Report: Vision-Threatening Fungal Keratitis in a Service Member Stationed at Guantanamo Bay. Military Med. 189 (1-2), 379-383 (2023).
  4. Arboleda, A., Ta, C. N. Overview of Mycotic Keratitis. Cornea. 43 (9), 1065-1071 (2024).
  5. Gautam, M., et al. An Emerging Global Threat of Mycotic Keratitis Caused by Uncommon Fungal Species: A Systematic Review and Meta-Analysis. Transl Vis Sci Technol. 14 (4), 4(2025).
  6. Qiu, S., et al. Natamycin in the treatment of fungal keratitis: a systematic review and Meta-analysis. Int J Ophthalmol. 8 (3), 597-602 (2015).
  7. Hoffman, J. J., et al. Topical Chlorhexidine 0.2% versus Topical Natamycin 5% for the Treatment of Fungal Keratitis in Nepal: A Randomized Controlled Noninferiority Trial. Ophthalmology. 129 (5), 530-541 (2022).
  8. Prajna, N. V., et al. Patterns of Antifungal Resistance in Adult Patients With Fungal Keratitis in South India: A Post Hoc Analysis of 3 Randomized Clinical Trials. JAMA Ophthalmol. 140 (2), 179-184 (2022).
  9. Khalil, A. S., Baioumy, S. A., Hegab, M. A., Khairy, M. A., Ali, A. G. Temporary Conjunctival Flap Plus Medical Treatment Versus Medical Treatment Only for High-Risk Fungal Keratitis: A Randomized Controlled Trial. Cornea. 44 (7), 866-873 (2025).
  10. Wang, B., et al. Oxidative Stress Initiates Receptor-Interacting Protein Kinase-3/Mixed Lineage Kinase Domain-Like-Mediated Corneal Epithelial Necroptosis and Nucleotide-Binding Oligomerization Domain-Like Receptor Protein 3 Inflammasome Signaling during Fungal Keratitis. Am J Pathol. 193 (7), 883-898 (2023).
  11. Barnes, T. C., Anderson, M. E., Edwards, S. W., Moots, R. J. Neutrophil-derived reactive oxygen species in SSc. Rheumatology (Oxford). 51 (7), 1166-1169 (2012).
  12. Mendoza-Martínez, A. E., Cano-Domínguez, N., Aguirre, J. Yap1 homologs mediate more than the redox regulation of the antioxidant response in filamentous fungi. Fungal Biol. 124 (5), 253-262 (2020).
  13. Zhang, Y. N., Ouyang, W. J., Hu, J. Y., Liu, Z. G. Targeting Nrf2 signaling in dry eye. Int J Ophthalmol. 17 (10), 1911-1920 (2024).
  14. Wang, M. X., et al. Potential Protective and Therapeutic Roles of the Nrf2 Pathway in Ocular Diseases: An Update. Oxid Med Cell Longev. 2020, 9410952(2020).
  15. O'Rourke, S. A., Shanley, L. C., Dunne, A. The Nrf2-HO-1 system and inflammaging. Front Immunol. 15, 1457010(2024).
  16. Fan, Y., et al. Perillaldehyde Ameliorates Aspergillus fumigatus Keratitis by Activating the Nrf2/HO-1 Signaling Pathway and Inhibiting Dectin-1-Mediated Inflammation. Invest Ophthalmol Vis Sci. 61 (6), 51(2020).
  17. Luan, S., et al. Gallic Acid Ameliorates Aspergillus fumigatus Keratitis Through Reducing Fungal Load and Suppressing the Inflammatory Response. Invest Ophthalmol Vis Sci. 63 (12), 12(2022).
  18. Gu, L., et al. Hydroxytyrosol downregulates inflammatory responses via Nrf2/HO-1 axis during fungal keratitis and exerts antifungal effects. Int Immunopharmacol. 149, 114202(2025).
  19. Yu, B., et al. Ebselen improves fungal keratitis through exerting anti-inflammation, anti-oxidative stress, and antifungal effects. Redox Biol. 73, 103206(2024).
  20. Liu, X., et al. Macrophage Membrane-Coated Nanoparticles for the Delivery of Natamycin Exhibit Increased Antifungal and Anti-Inflammatory Activities in Fungal Keratitis. ACS Appl Mater Interf. 16 (44), 59777-59788 (2024).
  21. Liu, F., et al. Synergistic wall digestion and cuproptosis against fungal infections using lywallzyme-induced self-assembly of metal-phenolic nanoflowers. Nat Comm. 15 (1), 9004(2024).
  22. Leal, S. M., et al. Distinct Roles for Dectin-1 and TLR4 in the Pathogenesis of Aspergillus fumigatus Keratitis. PLoS Pathogens. 6 (7), e1000976(2010).
  23. Awad, R., Ghaith, A. A., Awad, K., Mamdouh Saad, M., Elmassry, A. A. Fungal Keratitis: Diagnosis, Management, and Recent Advances. Clin Ophthalmol. 18, 85-106 (2024).
  24. Qu, S., Zheng, S., Muhammad, S., Huang, L., Guo, B. An exploration of the ocular mysteries linking nanoparticles to the patho-therapeutic effects against keratitis. J Nanobiotechnol. 23 (1), 184(2025).
  25. Kim, L. N., Karthik, H., Proudmore, K. E., Kidd, S. E., Baird, R. W. Fungal Keratitis, Epidemiology and Outcomes in a Tropical Australian Setting. Trop Med Infect Dis. 9 (6), (2024).
  26. Puumala, E., Fallah, S., Robbins, N., Cowen, L. E. Advancements and challenges in antifungal therapeutic development. Clin Microbiol Rev. 37 (1), e0014223(2024).
  27. Yagishita, Y., Gatbonton-Schwager, T. N., McCallum, M. L., Kensler, T. W. Current Landscape of NRF2 Biomarkers in Clinical Trials. Antioxidants (Basel). 9 (8), (2020).
  28. Li, X., et al. Developing the biomarker panels and drugs by proteomic analysis for autoimmune uveitis and posterior scleritis. iScience. 27 (12), 111389(2024).
  29. Jin, K., Zhang, C. Personalized Medicine in Ophthalmic Diseases: Challenges and Opportunities. J Pers Med. 13 (6), (2023).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

مسار Nrf2تعبير HO-1الإجهاد التأكسديالتهاب القرنيةالعلاج الموجه للمضيفالاستجابة لمضادات الأكسدةتثبيط السيتوكينات
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.