مقالة منهجية

توليد عضويات الحويصلات ثلاثية الأبعاد المدمجة في الكولاجين A549/MRC-5 باستخدام مفاعل حيوي ميكانيكي يمدد الخلايا

DOI:

10.3791/69447

⸱

مارس 27, 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, University of British Columbia - Okanagan, 2Centre for Heart Lung Innovation, St. Paul's Hospital, University of British Columbia

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

إشعار تصحيح

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يحدد هذا البروتوكول توليد الأعضاء من خلايا الظهارة السنخية A549 والأرومات الليفية الرئوية MRC-5 على سقالة هيدروجيل مصفوفة خارج الخلية، تليها دمج في هلام الكولاجين ثلاثي الأبعاد والتعرض للإجهاد الميكانيكي باستخدام مفاعل حيوي يمدد الخلايا لدراسة علم ميكانيكية الحويصل.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

على الرغم من أن ديناميكيات التنفس والإجهاد الميكانيكي تلعبان أدوارا حاسمة في بيولوجيا الحويصلات، إلا أن مساهماتهم في نشوء أمراض الجهاز التنفسي غالبا ما يتم تجاهلها. ولمعالجة هذه الفجوة، طورنا نموذجا عضويا حيث تتعرض عضويات الخلايا الليفية الظهارية لإجهاد ميكانيكي مسيطر عليه باستخدام مفاعل حيوي يمدد الخلايا بشكل محكم. تكرر هذه المنصة التنظيم المكاني والتعقيد متعدد الخلايا للأنسجة السنخية وتمكن من دراسة كيفية تأثير التواصل الخلوي والخلايا والنقل الآلي على بنية ووظيفة الأنسجة في الصحة والمرض. في هذا البروتوكول، نسصف طرق توليد وزراعة عضويات الأرومات الليفية الظهارية باستخدام خطوط الخلايا الليفية الرئوية A549 الظهارية السنخية وMRC-5 في الهيدروجيل المصفوفة خارج الخلية في الغشاء القاعدي. ثم تعزل العضويات غير إنزيميا وتدمج في هلام الكولاجين ثلاثي الأبعاد في صفائح متخصصة في المفاعل الحيوي. نحدد إجراءات تطبيق الإجهاد المتساوي لمحاكاة أنماط التنفس المرضية التي ترى في تفاقم التنفس. وأخيرا، نقدم سير عمل توصيف قياسي، بما في ذلك التلوين المناعي لعلامات الخلايا المحددة والاختبارات المناعية لملف تعريف إطلاق وسيط المناعة. معا، تدعم هذه التحليلات تقييم بنية ووظيفة العضويات. يوفر هذا البروتوكول منصة سهلة الاستخدام وقابلة للتكرار وقابلة للتكيف لدراسة علم الأحياء السنخية تحت الضغط الميكانيكي، مع معايير سهلة التعديل لتحقيق أهداف تجريبية متنوعة وتعزيز البحث في آليات أمراض الرئة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الحويصلات هي الأكياس النهائية للجهاز التنفسي وتعمل كموقع رئيسي لتبادل الغازات. تتكون بشكل رئيسي من خلايا ظهارية من النوع الأول والثاني السنيخية، مسؤولة عن تبادل الغازات، وظائف المناعة، والحفاظ على سلامة البنيو، والأرومات الليفية داخل الجدران التي تحافظ على توازن المصفوفة خارج الخلية1. هذه الخلايا المقيمة وغيرها تتعرض باستمرار للتمدد الدوري وإجهاد القص أثناء التنفس2. تتحول هذه الإشارات الميكانيكية إلى إشارات كيميائية حيوية تؤثر على بنية الخلية والتمايز والتواصل3.

يلاحظ الإجهاد الميكانيكي المرضي في أمراض الرئة مثل مرض الانسداد الرئوي المزمن (COPD). مرض الانسداد الرئوي المزمن هو حالة تقدمية تتميز بتدمير النسيج العميق، والالتهاب المزمن، وتضيق المجاري الهوائية الصغيرة4. في هذا المرض، فإن تدمير الجدران السنخية، وفقدان الإيلاستين، وإعادة تشكيل المصفوفة خارج الخلية (ECM) الذي يؤدي إلى التليف، والالتهاب المزمن كلها تؤثر على قدرة الرئة علىتحمل الضرر الهيكلي. ينتج عن ذلك تشوه سنخيلي غير طبيعي وغير طبيعي أثناء التنفس، والذي يزداد سوءا أثناء نوبات المرض7،8.

بينما تم استخدام عدة طرق في المختبر لدراسة علم الأحياء السنخية، إلا أن لكل منها حدود ملحوظة. تسهل أنظمة الزراعة المشتركة ثنائية الأبعاد دراسة تفاعلات الخلية والخلية لكنها تفشل في التقاط بنية الأنسجة أو ديناميكيات المصفوفة خارج الخلية، مما يقلل من الأهمية الفسيولوجية. تحافظ الثقافات ثلاثية الأبعاد الثابتة بشكل أفضل على التنظيم الهيكلي وتفاعلات المصفوفة، لكنها لا تدمج الإشارات الميكانيكية الديناميكية الموجودة في الحي. يمكن لمنصات الميكروفلويديك ونظام الأعضاء على الشريحة تقليد تدفق السوائل والإجهاد الميكانيكي، مما يوفر دقة فسيولوجية عالية، لكنها غالبا ما تكون معقدة تقنيا، منخفضة الإنتاجية،ومكلفة. في المقابل، يجمع النموذج العضوي ثلاثي الأبعاد المتجهد ميكانيكيا المعروض هنا بين التعقيد البنيوي، والتغاير الخلوي، والتحفيز الميكانيكي المسيطر عليه، وهو جانب غالبا ما يغفل في النماذج الحالية، ضمن منصة قابلة للتكرار وقابلة للتوسع توفر توازنا بين الأهمية الفسيولوجية وسهولة الوصول التجريبي10,11.

لفهم الآليات المعقدة التي تسهم في أمراض مثل الانسداد الرئوي المزمن واكتشاف أهداف علاجية، تم إنشاء نماذج مرضية. على الرغم من أهميتها، غالبا ما يتم تجاهل الإجهاد الميكانيكي في النماذج الحويصلية المختبرية المستخدمة لدراسة آليات وأمراض الرئة مثل مرض الانسداد الرئوي المزمن (COPD). لسد هذه الفجوة، نقدم طريقة لزراعة عضويات الخلايا الليفية الظهارية الحويخية في مصفوفة قاعدية، واسترجاعها وتضمينها في جل الكولاجين ثلاثي الأبعاد، وتطبيق إجهاد ميكانيكي دوري باستخدام مفاعل حيوي يمدد الخلايا، وتقييم النتائج الهيكلية والوظيفية الرئيسية. تلتقط هذه النماذج العضوية الميكانيكية ثلاثية الأبعاد بشكل أفضل التفاعلات الخلوية والبيئة الدقيقة في مجوبة السنخة الهوائية البشرية، مما يمكن دراسة التداخل بين الظهارة والميزنكيمية12.

يطبق المفاعل الحيوي إجهادا متساويا المحاور مع معايير قابلة للتكوين، مما يسمح باستطالة تصل إلى 30٪ وترددات تصل إلى 5 هرتز لنمذجة الظروف الفسيولوجية والمرضية. في هذه الدراسة، أنشأنا نماذج عضوية مدمجة في هيدروجيلاتين الكولاجين-I التي تعرضت لإجهاد 18٪ عند 0.4 هرتز لمدة 24 ساعة لمحاكاة التنفس المرضي. أنشأنا سير عمل موحد لتوصيف التوصيف يشمل التلوين المناعي لمؤشرات الخلايا الخاصة وفحوصات مناعية لقياس إطلاق وسيط المناعة بعد الإجهاد الميكانيكي. هدف هذه الدراسة هو توفير منصة ذات صلة فسيولوجية، سهلة الاستخدام، وقابلة للتكيف للتحقيق في بيولوجيا الحويصلات تحت الضغط الميكانيكي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تتطلب جميع الخطوات تقنية معهرة، ومواد معقمة، وكواشف، وتنفذ في خزانة سلامة حيوية لتقليل تعرض الموظفين للمواد الخطرة البيولوجية وتلوث المزارع. المواد المستخدمة والمواد المستخدمة مدرجة في جدول المواد.

1. زراعة الخلايا وإنشاء مخزونات الخلايا

  1. قبل تكوين الخلايا العضوية، كانت تزرع خلايا A549 وMRC-5 على قوارير بلاستيكية معالجة بزراعة الأنسجة القياسية (T75سم 2) حتى تصل إلى حوالي 70٪-80٪ باستخدام وسط النسر المعدل من دولبيكو (DMEM) مع 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) و1٪ بنسلين-ستريبتوميسين، ويشار إليه هنا باسم "DMEM الكامل".
  2. لكل من A549 و MRC-5، قم بالبذور بمقدار 2 × 104 خلايا/سم2، بحجم إجمالي 10 مل DMEM كامل. زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربونفي بيئة رطبة حتى يصل إلى حوالي 70٪-80٪ من التقاء البعض.
  3. استبدل وسط الزراعة كل 48 ساعة لضمان أفضل ظروف نمو.
  4. الزراعة الفرعية عن طريق استنشاق جميع الوسائط من القارورة بمجرد أن تصل إلى 70٪-80٪، ثم تغسل مرة واحدة بمحلول ملحي دافئ مخزن بالفوسفات (PBS)، ثم أضف 4 مل من تريبسين-إيدتا.
  5. حضن على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق وتصور القوارير باستخدام مجهر سbrightfield لضمان الانفصال التام. قم بالتحييد بإضافة 4 مل من DMEM كامل.
  6. عد الخلايا باستخدام التقنية المختارة، مثل عد الاستبعاد الأزرق التريباني.
  7. قم بعمل نظام الطرد المركزي في تعليق الخلية عند 200 × g لمدة 5 دقائق.
  8. استنشق الفائق لترك حبيبة خلية في أسفل الأنبوب المخروطي. أعد تعليق حبيبة الخلية في حجم مناسب من DMEM الكامل عن طريق التفجير بلطف.
  9. للتجميد، أعد تعليقها في وسط كامل يحتوي على 10٪ DMSO لإنتاج 1 ×10 6 خلايا/مل. لتكوين العضوات، أعد تعليقها للحصول على 1 ×10 6 خلايا/مل.

2. تأسيس وتوصيف نضج نموذج عضوي ثلاثي الأبعاد للأحمر الظهاري-الأرومي الليفي

ملاحظة: يجب إذابة مصفوفة القبو على الثلج طوال الليل وحفظها على الثلج خلال هذه الخطوات. درجات الحرارة الأعلى يمكن أن تسبب تصلب المصفوفة.

  1. حضر مزيجا بنسبة 2:3 من مصفوفة القبو وDMEM المتقدم. أضف 300 ميكرولتر من هذا المحلول إلى كل بئر من صفيحة مكونة من 24 بئرا، لضمان تغطية قاع كل بئر بشكل متساو. حضن الصفيحة عند حرارة 37 درجة مئوية في حاضنة رطبة لمدة ساعة واحدة للسماح للمصفوفة بالتصلب.
  2. جهز محلول مصفوفة قاعدة بنسبة 5٪ في DMEM كامل، والذي سيكون وسط الزراعة للعضويات. لكل بئر، اصنع 1.2 مل من هذا المحلول عن طريق تخفيف 60 ميكرولتر من مصفوفة القاعدة في 1,140 ميكرولتر من DMEM الكامل.
  3. خلال الفترة التي يتصلب فيها خليط مصفوفة القاعدة، اخلط 300,000 خلية A549 مع 30,000 خلية MRC-5 في 200 ميكرولتر من محلول مصفوفة القاعدة بنسبة 5٪ المصنوع ب DMEM كامل كما هو موصوف في الخطوة 2.2.
  4. بمجرد أن يتصلب خليط القاعدة بنسبة 2:3، يتم استخدام الماصة 200 ميكرولتر من خليط A549/MRC-5 على المصفوفة المجهلة، ثم تعيد صفيحة 24 بئر إلى الحضانة عند حرارة 37 درجة مئوية، مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 21 يوما للسماح بالنمو والتمايز بين الأعضاء السنيخية.
  5. تخيل الثقافات تحت المجهر الضوئي لمدة 48 ساعة القادمة. يجب أن تتجمع الخلايا خلال هذه الفترة الزمنية.
  6. استبدل محلول مصفوفة القبو/DMEM بنسبة 5٪ كل 48 ساعة ب 200 ميكرولتر من الوسط الطازج بنسبة 5٪. لتجنب إزعاج الأعضاء المدمجة في الهيدروجيل، قم بإمالة الصفيحة بلطف حتى يتجمع المحلول القديم على طول جدار البئر قبل الشفط.
  7. في الأيام 3 و9 و21 من النضج، قم بتصوير الأعضاء بزاوية تكبير موضوعي 10 أضعاف والتقاط أربع صور أو مجالات رؤية تمثيلية لكل بئر. تظهر صور تمثيلية لشكل العضويات المبكر في الأيام 3 و9 و21 في الشكل 1.
  8. لكل مجال رؤية، عد جميع الأعضاء التي يزيد قطرها عن 50 ميكرومتر. باستخدام المساحة المعروفة من مجال الرؤية، استنتج متوسط العدد الكلي للعضويات العضوية في البئر من متوسط العد لكل حقل، بافتراض أن مساحة سطح صفيحة تضم 24 بئرا تبلغ 1.9 سم².
    ملاحظة: يمكن إجراء هذه التحليلات باستخدام برامج تحليل الصور مثل Fiji13.
  9. يمكن أيضا قياس متوسط قطر ومساحة العضوية للحصول على معلومات كمية حول خصائص نمو العضويات في الزراعة.

3. جمع الأعضاء ثلاثية الأبعاد في الخلايا الليفية الظهارية ثلاثية الأبعاد

ملاحظة: يجب تنفيذ جميع خطوات جمع الأورجينويدات على الجليد.

  1. بعد 21 يوما من النضج، استنشق المادة الفائقة واغسل بلطف بحوالي 1-2 مل من PBS البارد جدا.
  2. أضف 1-2 مل من محلول الحصاد العضوي البارد وحضن اللوح عند 2-8 درجة مئوية لمدة 30-90 دقيقة مع هز معتدل.
    ملاحظة: أوقف الحضانة عندما ترى العضويات تطفو في قاع البئر.
  3. راقب الانفصال باستخدام مجهر الحقل المضيء. يعتبر التفكك مكتملا بمجرد أن تختفي مصفوفة القاع في قاع البئر وتصبح الأعضاء معلقة. يمكن استخدام مكشطة الخلايا لتحريك الهيدروجيل المصفوفة العضوية القاعدية بلطف لتسريع العملية.
  4. اجمع محتويات جميع الآبار في أنبوب مخروطي بسعة 50 مل على الجليد.
  5. الطرد المركزي عند 500 × جرام لمدة 5 دقائق عند 2-8 درجات مئوية. استنشق السوبرناتانت، وغسل الحبيبة العضوية ب 1-2 مل من PBS البارد جدا، ثم استخدم الطرد المركزي مرة أخرى للحصول على حبيبة. استنشق PBS.

4. تأسيس عضويات الأرومات الليفية المدمجة في الكولاجين ثلاثي الأبعاد وتطبيق الإجهاد الميكانيكي

ملاحظة: استخدم ألواح زراعة رغوة دائرية مع مراسي رغوية متوافقة مع مفاعل حيوي يمدد الخلايا. لوحة الزراعة المستخدمة في هذا البروتوكول لها مساحة نمو ~6.6 سم2.

  1. حضر محلول يعمل من جل الكولاجين I بسعة 2 ملغ/مل. يجب أن يحتوي المحلول على 1× PBS، 11.4 ملليمولار NaOH، و2 ملغ/لتر كولاجين I، مع تعديل الحجم النهائي باستخدام ماء معقم. حضر 2 مل من محلول الكولاجين I هذا لكل بئر من صفيحة الفوم الدائرية ذات 6 آبار.
  2. أضف 1 مل من محلول الكولاجين I بسعة 2 ملغ/مل إلى مثبتات الرغوة على أطراف اللوحة، لضمان التشبع الكامل.
    ملاحظة: يجب أن تكون مثبتات الرغوة مشبعة تماما بمحلول الكولاجين I لضمان الالتصاق الصحيح. يمكن أن يؤدي التشبع غير الكامل إلى انفصال هلام الكولاجين أثناء تطبيق الإجهاد الميكانيكي، مما يؤدي إلى تقليل الانفعال مقارنة بالهدف المقصود.
  3. أعد تعليق الحبيبة العضوية في 6 مل من 2 ملغ/مل من كولاجين ذيل الجرذ والماصة 1 مل من التعليق في وسط صفيحة رغوة دائرية ذات 6 آبار، لضمان اختلاط خليط الكولاجين العضوي مع الكولاجين الخالي من العضوية المضاف إلى مراسي الرغوة الدائرية.
    ملاحظة: تجنب توليد فقاعات عند إضافة التعليق العضوي إلى كل بئر.
  4. قم بلمرة الكولاجين-I لمدة ساعة واحدة بترك الصفائح في الحاضنة (37 درجة مئوية، 5٪ ثاني أكسيد الكربون2). بعد البلمرة، يجب أن يبدو الجل عكرا.
  5. أضف 2 مل من DMEM الكامل فوق عضويات A549/MRC5 المدمجة ثلاثية الأبعاد في الكولاجين وأعد الصفيحة إلى الحاضنة لمدة 24 ساعة.
  6. استبدل وسط الزراعة ب DMEM + 1٪ FBS وحضنه طوال الليل قبل التعرض للإجهاد الميكانيكي.

5. إعداد المفاعل الحيوي لتمديد الخلايا والتعرض للإجهاد الميكانيكي

  1. أدخل محطات تحميل في كل بئر من قاعدة القاعدة. تحتوي هذه على ستة أعمدة تحميل قطرها 25 مم، تسمح للغشاء المرن لألواح قطار الأنسجة بالتشوه حولها وتعريض الثقافة ثلاثية الأبعاد لإجهاد متساوي المحور.
  2. ضع طبقة رقيقة من شحم السيليكون على أعلى أعمدة التحميل.
  3. ضع حشوات حمراء في أسفل كل صفيحة ذات 6 آبار.
  4. أدخل الألواح المحضرة في لوحة القاعدة فوق أعمدة التحميل.
  5. انقل هذا الجهاز إلى حاضنة رطبة بدرجة حرارة 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربونوتوصيل وصلات الفصل السريع إلى لوحة الأساس. كرر الخطوات من 5.1 إلى 5.6، مع حذف الوصلات لإنشاء تحكم غير مجهد.
    ملاحظة: اختياريا، يمكن تطبيق سدادة ختم الأنبوب، التي تمنع تطبيق الضغط الفراغي في قاع بئر BioFlex واحد، مما يسمح بتوليد ثقافة تحكم غير متجهدة على نفس اللوحة.
  6. غطها بورقة بليكسي غلاس وأضف ~5-10 أرطال من الوزن لضمان إحكام الإغلاق الكامل.
  7. شغل ضاغط الهواء وافتح صمام الخروج من ضاغط الهواء.
  8. شغل مضخة الضغط الفراغية وافتح صمام خزان الضغط المتصل بتدفق خزان التفريغ. تأكد من أن ضغط الفراغ حوالي 90 كيلو باسكال.
  9. افتح صمام التدفق من ضاغط الهواء الموجود بالقرب من وحدة تحكم المفاعل الحيوي. اضبط الضغط بحيث لا يتجاوز 15 PSI عند منفذ التهوية.
  10. شغل البرنامج المدمج وضبط معايير الإجهاد الميكانيكي الدوري المطلوب. في هذه الدراسة، تم استخدام نظام بسعة إجهاد 18٪ عند 0.4 هرتز لمدة 24 ساعة. لتكوين ذلك، أنشئ نظاما جديدا، واضبط الحد الأدنى للإطالة إلى 0٪، وأقصى استطالة إلى 18٪، وابدأ البروتوكول.
  11. راقب الصفيحة والغشاء لضمان أن الحركة مرئية طوال جلسة الإجهاد. يجب أن يكون الغشاء يتشوه حول أعمدة التحميل.
  12. افحص مصيدة الماء بحثا عن رطوبة بشكل دوري، وراقب شاشة الكمبيوتر لمعرفة مدة التشغيل، والتقدم، والشكل المناسب لنظام الإجهاد.
  13. افصل تجميع الصفائح الأساسية عند اكتمال نظام الإجهاد، وأعد المزارع المجهدة إلى الحضانة لمدة 24 ساعة قبل تحليلات التوصيف في مرحلة لاحقة.
  14. قم بإيقاف تشغيل النظام وتفكيكه بترتيب عكسي عند بدء التشغيل: أغلق أو أغلق صمام تدفق ضاغط الهواء، ثم صمام خزان الضغط، مضخة الضغط الفراغي، صمام خروج ضاغط الهواء، وأخيرا ضاغط الهواء بهذا الترتيب.
  15. اجمع المادة الفائقة بعد 24 ساعة من الحضانة بعد التعرض للإجهاد الميكانيكي. خزن عند -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.

6. التوصيف الموركولوجي للعضويات عبر التألق المناعي

  1. اغسل نموذج جل الكولاجين العضوي ثلاث مرات باستخدام PBS بإضافة 1 مل PBS برفق، مع حضانه لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  2. استنشق PBS بعناية وكرر عملية الغسل ثلاث مرات إجمالا.
  3. تثبيت النموذج عن طريق حضانة 2 مل من بارافورمالديهايد 4٪ لمدة ساعة واحدة عند 4 درجات مئوية.
  4. اغسل النماذج ثلاث مرات باستخدام PBS كما هو موضح أعلاه.
  5. استخدم مشرطا لقطع مراسي الرغوة الدائرية في الآبار المرنة مع الجل المرفق بلطف وضعه في طبق بتري.
  6. قم بنفاح الأعضاء عن طريق حضانها ب 2 مل من ترايتون X-100 بنسبة 0.1٪ في PBS لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  7. اغسل النماذج ثلاث مرات باستخدام PBS.
  8. حجب الارتباط غير النوعي عن طريق حضنة النماذج ب 3 مل من ألبومين مصل البقري 5٪ (BSA) في PBS لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. أزل محلول الانسداد وانتقل إلى الخطوة التالية.
  9. حضن النماذج طوال الليل عند 4 درجات مئوية مع مزيج تلوين يحتوي على زونولا أوكلودينز-1 (ZO-1) مضاد للإنسان (ZO-1) مرافق مع أليكسا فلور 594 عند تخفيف 1:100، والفالويدين المصاحب مع أليكسا فلور 488 عند تخفيف 1:1000 لتقييم F-actin، والصبغة النووية، DAPI عند تخفيف 1:4000. التخفيف هو 1 مل من 1٪ BSA في PBS. قم بلصق حواف الصفيحة قبل الحضانة عند 4 درجات مئوية.
  10. استنشق محلول الكوكتيل الملون في اليوم التالي واغسل النماذج ثلاث مرات باستخدام PBS.
  11. صور باستخدام مجهر كونفوكال وخذ مكدسات Z عند شرائح 5 ميكرومتر من الأعضاء الممثلة بتكبير موضوعي 40x.
  12. تحليل شدة الفلورة باستخدام برنامج تحليل الصور في فيجي. تطبيع متوسط شدة الفلورة مع مساحة العضوي لضمان المقارنة الدقيقة عبر ظروف بيئية مختلفة.

7. التوصيف الوظيفي للعضويات من خلال اختبار السمية الخلوية ELISA وLDH لديهيدروجيناز اللاكتات

  1. قم بإذابة المواد الفائقة على الجليد وتقييم إفراز الإنترلوكين-6 (IL-6) والإنترلوكين-8 (IL-8) باستخدام مجموعات ELISA المتوفرة تجاريا وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
  2. تقييم إفراز LDH، وهو مؤشر على السمية الخلوية، باستخدام اختبار امتصاص LDH متوفر تجاريا.
  3. توليد منحنى قياسي باستخدام بروتين LDH المؤتلف بتركيزات نصف لوغاريتمية من 0.5 ميكروغرام إلى 0.5 نانوغرام. استيفاء تركيزات LDH من كل عينة باستخدام المنحنى القياسي.

8. اختياري: عزل العينات لتحليل الحمض النووي الريبي أو البروتين

  1. بدلا من إضافة 4٪ بارافورمالديهيد لصبغ التلوين المناعي، أضف محلول RLT محضر يحتوي على β-ميركابتوإيثانول بمعدل 10 ميكرولتر لكل 1 مل من RLT.
  2. استخدم 300 ميكرولتر لكل نموذج واستخدم الماصة للأعلى والأسفل لفصل الخلايا وتحليلها بالكامل.
  3. انقل الليزات إلى أنبوب طرد مركزي دقيق خال من RNase وضع الأنابيب على الثلج الجاف لتتجمد بسرعة. الانتقال إلى -80 درجة مئوية للتخزين طويل الأمد.
    ملاحظة: بدلا من ذلك، يمكن استخدام مخزن RIPA لاستخراج البروتين عن طريق تحضير: 50 ملي مولار Tris-HCl، درجة الحموضة 7.4-7.5؛ 150 مللي مولار NaCl; 1٪ NP-40 أو Triton X-100؛ 0.5٪ ديكوسيكولات الصوديوم؛ 0.1٪ SDS في المياه منزوعة الأيون. مخزن RIPA الجاهز متوفر أيضا تجاريا.
  4. أضف 200 ميكرولتر لكل نموذج، ثم اضع الحجر على الجليد لمدة 5 دقائق، ثم اجمع الليزات.
  5. قم بتدوير بحرارة 15,000 × g لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية لتكوين حطام خلايا الحبيبات ثم انقله إلى -80 درجة مئوية للتخزين طويل الأمد.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تأسيس وزراعة عضويات الخلايا الظهارية الليفية المشتقة من خط الخلية لأكثر من 21 يوما. لوحظت تغيرات شكلية خلال هذه الفترة، حيث تم تقييم عدد الأعضاء ومساحتها وقطرها في الأيام 3 و9 و21 لمراقبة النمو والتطور. انخفض متوسط عدد الأعضاء العضوية في كل بئر بشكل ملحوظ خلال اليومين 9 و21 مقارنة باليوم الثالث (الشكل 2A). على النقيض من ذلك، زاد متوسط مساحة وقطر العضوية بشكل ملحوظ في اليومين 9 و21، مما يشير إلى استمرار النمو والتوسع (الشكل 2B,C

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمثل الأعضاء ثلاثية الأبعاد (ثلاثية الأبعاد) للاستنساخات الظهارية الليفية منصة ذات صلة فسيولوجية كبيرة لنمذجة بنية الرئة ووظائفها تحت الضغط الميكانيكي. على عكس أنظمة الزراعة المشتركة ثنائية الأبعاد أو حتى ثلاثية الأبعاد، تحافظ العضويات على السمات الحيوية لبيئة الرئة الدقيقة في الجسم الحي، بما في ذلك التنظيم المكاني، والتداخل بين الظهارة والميزنكيمية، وتفاعلات المصفوفة خارج الخلايا (ECM)14. يلعب الإجهاد الميكانيكي دورا مركزيا في إعادة تشكيل مجرى الهواء في ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون أن البحث أجري في غياب أي علاقات تجارية أو مالية يمكن اعتبارها تضارب محتمل في المصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يقر المؤلفون بدعم مركز بروفيدنس للطيران في بروفيدنس للرعاية الصحية، الذي ساهمت مساهماته في إكمال هذه المخطوطة. تم تمويل هذا العمل من قبل MITACS (ID IT27789)، بالتعاون مع مركز بروفيدنس للطيران (PAC) في بروفيدنس للرعاية الصحية (PHC)، ومجلس أبحاث العلوم الطبيعية والهندسة الكندي (NSERC) (المعرفات AWD-024378 وAWD-0244440).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
أنبوب طرد مركزي دقيق بسعة 1.5 ملإبندورف0030 125.215
أنبوب مخروطي بحجم 15 ملفيشر ساينتيفك14-959-53A
16٪ بارافورمالديهايدثيرمو فيشر العلمي28908
2-ميركابتوإيثانولميليبور سيغماM3148
أنبوب مخروطي بحجم 50 ملفيشر ساينتيفك14-432-22
صفيحة الفوم الدائرية ذات الغرشة السادسة (الغشاء المرن) من أنسجة قطارفليكسسيل إنترناشونالTTCF-5001
خلايا A549مجموعة ثقافة الأنواع الأمريكية (ATCC)CCL-171
ضاغط الهواءأدوات الهواء في كاليفورنيا10020DSPCAD
مصل البقر الألبومينميليبور سيغماA9418
مخزن RLTتشياغن79216
حاضنة CO2PHCBIMCO-170AICUVL-PA
محلول جمع الأورجينويدات كولتريكسبيو-تكني3700-100-01
مجموعة اختبار السمية الخلوية CyQUANT LDHثيرمو فيشر العلميC20300
DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole)ثيرمو فيشر العلميD1306
ثنائي ميثيل كبريتاتسيغما ألدريتشD2650-100ML
دولبيكو' النسر المعدل' s medium (DMEM)ثيرمو فيشر العلمي11965092
مجهر إيفوس XL كورثيرمو فيشر العلميAMEX1200
مصل البقر الجنيني (FBS)ثيرمو فيشر العلميA5209501
برنامج تحليل الصور في فيجيالمعاهد الوطنية للصحة
نظام التوتر والأنسجة Flexcell FX-6000 (يشمل وحدة تحكم التوتر Flexlink FX-6000، خزان الضغط، لوحة الأساس، نافذة أكريليك، محطات تحميل أسطوانية بقطر 25 مم، مصيدة ماء، برنامج FlexSoft FX-6000 V1.0، وأنابيب متنوعة)فليكسسيل إنترناشونالFX6000T
إنترلوكين-6 ديوسيت ELISAبيو-تكنيDY206
إنترلوكين-8 ديوسيت الإنسان ELISAبيو-تكنيDY208
مجهر لايكا DMi8 الكونفوكاللايكا مايكروسيستمز11889122
مصفوفة غشاء القبو في ماتريجيلكورنينغ356237
خلايا MRC-5ATCCCCL-185
بارافيلمميليبور سيغماP7793
البنسلين/الستربتوميسين (القلم / العقدية)ثيرمو فيشر العلمي15140122
مجسات وسم الفالويدين، أليكسا فلور 488ثيرمو فيشر العلميA12379
محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)ثيرمو فيشر العلمي14190-144
كولاجين ذيل الجرذ Iسيغما-ألدرتشC3867
بروتين إنزيم اللاكتات المعاد تركيبه (نشط)أبكامAb93699
مخزن تحليل RIPAثيرمو فيشر العلمي89901
أنابيب ميكروفوج خالية من RNaseثيرمو فيشر العلميAM12400
قارورة T75 سم2غرينر658175
ترايتون X-100سيغما-ألدرتشX100-5ML
الجسم المضاد وحيد النسيلة ZO-1 (ZO1-1A12)، أليكسا فلور 594ثيرمو فيشر العلمي339194

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Knudsen, L., Ochs, M. The micromechanics of lung alveoli: structure and function of surfactant and tissue components. Histochem Cell Biol. 150 (6), 661-676 (2018).
  2. Novak, C., Ballinger, M. N., Ghadiali, S. Mechanobiology of pulmonary diseases: a review of engineering tools to understand lung mechanotransduction. J Biomech Eng. 143 (11), 110801(2021).
  3. Shiraishi, K., et al. Biophysical forces mediated by respiration maintain lung alveolar epithelial cell fate. Cell. 186 (7), 1478-1492.e15 (2023).
  4. Hogg, J. C., et al. The nature of small-airway obstruction in chronic obstructive pulmonary disease. N Engl J Med. 350 (26), 2645-2653 (2004).
  5. Bidan, C. M., Veldsink, A. C., Meurs, H., Gosens, R. Airway and extracellular matrix mechanics in COPD. Front Physiol. 6, 346(2015).
  6. Burgess, J. K., Gosens, R. Mechanotransduction and the extracellular matrix: key drivers of lung pathologies and drug responsiveness. Biochem Pharmacol. 228, 116255(2024).
  7. Harris, C., et al. An in vitro investigation of the inflammatory response to the strain amplitudes which occur during high frequency oscillation ventilation and conventional mechanical ventilation. J Biomech. 88, 186-189 (2019).
  8. Xu, Y., et al. Strain analysis in patients at high risk for COPD using four-dimensional dynamic-ventilation CT. Int J Chron Obstruct Pulmon Dis. 17, 1121-1130 (2022).
  9. Huh, D., Hamilton, G. A., Ingber, D. E. From 3D cell culture to organs-on-chips. Trends Cell Biol. 21 (12), 745-754 (2011).
  10. Al Yazeedi, S., Guo, T. J. F., Sohd, J., Abokor, F. A., Osei, E. T. Dynamic mechanical stimulation of alveolar epithelial-fibroblast models using the Flexcell tension system to study lung disease mechanisms. Front Med. 12, 1552803(2025).
  11. Guo, T. J. F., Faiz, A., Osei, E. T., Pouwels, S. D. Editorial: Next generation in vitro models to study chronic pulmonary diseases, volume II. Front Med. 12, 1683514(2025).
  12. Lim, M. J., Kim, S. J., Jo, A., Kim, S. W. Enhanced application potential of alveolar organoids through epithelial and niche cell interactions. Sci Rep. 15 (1), 17538(2025).
  13. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  14. Purev, E., Bahmed, K., Kosmider, B. Alveolar organoids in lung disease modeling. Biomolecules. 14 (1), 115(2024).
  15. Manuyakorn, W., et al. Mechanical strain causes adaptive change in bronchial fibroblasts enhancing profibrotic and inflammatory responses. PLoS One. 11 (4), e0153926(2016).
  16. Kılıç, A., et al. Mechanical forces induce an asthma gene signature in healthy airway epithelial cells. Sci Rep. 10 (1), 966(2020).
  17. Tam, A., et al. Hedgehog signaling as a therapeutic target for airway remodeling and inflammation in allergic asthma. Cells. 11 (19), 3016(2022).
  18. Georas, S. N., Rezaee, F. Epithelial barrier function: at the front line of asthma immunology and allergic airway inflammation. J Allergy Clin Immunol. 134 (3), 509-520 (2014).
  19. Ivanov, A. I., Parkos, C. A., Nusrat, A. Cytoskeletal regulation of epithelial barrier function during inflammation. Am J Pathol. 177 (2), 512-524 (2010).
  20. Barnett, K. C., et al. An epithelial-immune circuit amplifies inflammasome and IL-6 responses to SARS-CoV-2. Cell Host Microbe. 31 (2), 243-259.e6 (2023).
  21. Li, Y., et al. HB-EGF-induced IL-8 secretion from airway epithelium leads to lung fibroblast proliferation and migration. BMC Pulm Med. 21 (1), 347(2021).
  22. Guo, T. J. F., Singhera, G. K., Leung, J. M., Dorscheid, D. R. Airway epithelial-derived immune mediators in COVID-19. Viruses. 15 (8), 1655(2023).
  23. Thomas, D., Choi, S., Alamana, C., Parker, K. K., Wu, J. C. Cellular and engineered organoids for cardiovascular models. Circ Res. 130 (12), 1780-1802 (2022).
  24. Li, K., He, Y., Jin, X., Jin, K., Qian, J. Reproducible extracellular matrices for tumor organoid culture: challenges and opportunities. J Transl Med. 23 (1), 497(2025).
  25. Vande Geest, J. P., Di Martino, E. S., Vorp, D. A. An analysis of the complete strain field within Flexercell membranes. J Biomech. 37 (12), 1923-1928 (2004).
  26. Mondoñedo, J. R., et al. A high-throughput system for cyclic stretching of precision-cut lung slices during acute cigarette smoke extract exposure. Front Physiol. 11, 566(2020).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

تصحيح

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Generation of 3D Collagen-Embedded A549/MRC-5 Alveolar Organoids using a Mechanical Cell-Stretching Bioreactor
Posted by JoVE Editors on 8/19/2026. Citeable Link.

This corrects the article 10.3791/69447

الوسوم

A549 MRC 5
الفيديو قريباً

مقالات ذات صلة