مقالة منهجية

الاختبار الصناعي إعادة تشكيل اليوبيكويتينية البكتيرية والقضاء بوساطة VCP/p97

DOI:

10.3791/69454

⸱

يناير 2, 2026

 ,  ,  , 
1Department of Biosciences and Bioengineering, Indian Institute of Technology Bombay

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول طريقة لتحويل المكورات الرئوية إلى اليوبيكويتين باستخدام محلل الخلايا الثديية أو مركب إنزيمات اليوبيكويتين النقي، تليها العلاج بمركب بروتين VCP/p97-UFD1-NPLOC4 المنقى لتقييم نشاطه التحلل للبكتيريا، مما يمكن دراسة المؤثرات المناعية المعتمدة على اليوبيكويتين.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

اليوبيكويتين هو تعديل متعدد الاستخدامات بعد الترجمة يلعب دورا حاسما في المناعة السيتوسولية. عند غزو الخلايا المضيفة، تحاصر البكتيريا الممرضة في البداية داخل إندوسوم، حيث تتحرر وتخرج إلى السيتوسول لتجنب التحلل الليزوسومي. بمجرد دخولها إلى السيتوسول، يتم وسم البكتيريا بسرعة بسلاسل يوبيكوتين بواسطة ليغازات E3 المضيفة، مما يجعلها تتخلى عن طريق عدة مسارات مؤثرة، بما في ذلك الالتهام الذاتي والبروتيازوم. لتحديد مساهمة المسارات الفردية في القضاء على البكتيريا، يقدم إعادة التكوين في المختبر نهجا مضبوطا وواضحا. هنا، باستخدام المكورات الرئوية العقدية (SPN) كنموذج لمسبب الأمراض البكتيري، نقدم بروتوكولا مفصلا لتوحيله باستخدام محللات الخلايا الثديية أو مركب إنزيم اليوبيكويتين النقي، يليه العلاج بمركب VCP/p97-UFD1-NPLOC4 المنقى لتقييم نشاطه التحللي البكتيريا بشكل مستقل عن العوامل الخلوية الأخرى. بشكل عام، تحمل هذه العملية القدرة على توضيح وظيفة ليغازات اليوبيكويتين المرتبطة بالمناعة والمؤثرات في سياق خال من الخلايا، حيث قد يكون تشريح مثل هذه الآليات تحديا في الخلايا السليمة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوبيكويتين (Ub) هو بروتين صغير بوزن 8.6 كيلو دالتون يعدل الركائز المستهدفة عن طريق الالتصاق بها تساهميا عند جليسين الطرف C الخاص به، مما يخلق رابطة إيزوببتيد مع مجموعة ε أمينية من بقايا الليسين في عملية تسمى اليوبيكويتينيشن1. تحكمها سلسلة من الخطوات المنسقة التي تتضمن إنزيما منشطا لليوبيكوتين من E1، وإنزيم E2 المدمج لليوبيكوتين، وإيبيكويتين ليغازE3 1,2,3. يمكن ربط Ub كمونومر أو كسلاسل بأطوال مختلفة عبر سبع بقايا ليسين (خطية/M1، K6، K11، K27، K29، K33، K48، و K63). تعمل هذه السلاسل الفريدة من نوعها كعلامات جزيئية لوظائف خلايا مختلفة، مثل تحلل البروتين، وحركة الخلايا، وإصلاح الحمض النووي، والتهام الذاتي الانتقائي3.

بينما كان الدور القانوني لليوبيكويتين مرتبطا منذ فترة طويلة بالحفاظ على التوازن الخلوي، مثل تحليل البروتينات غير المطوية عبر البروتيازومات أو توجيه شحنات محددة نحو الالتهام الذاتي الانتقائي 5,6، أصبح من الواضح الآن أن اليوبيكويتين يعمل أيضا كآلية استشعار حاسمة للجهاز المناعي السيتوزولي ضد العدوى البكتيرية. البكتيريا داخل الخلية تتسلل كثيرا إلى خلايا المضيف لتجنب اكتشافها من قبل الاستجابة المناعية خارج الخلية وتتكاثر في بيئة آمنة 7,8. تستخدم العديد من مسببات الأمراض أنظمة إفراز وسموم لإلحاق ضرر لا يمكن إصلاحه بالفكيولات التي تحملها، مما يتيح الهروب إلى السيتوسول للحصول على العناصر الغذائية 9,10. بمجرد دخولها السيتوسول، تزين هذه البكتيريا بسلاسل بوليوبيكوتين بواسطة غازات E3 محددة، تعمل ك "علامة موت" جزيئية، توجهها نحو القضاء الانتقائي. على سبيل المثال، يتفاعل ليغاز E3 SMURF1 مع البكتيريا الفطرية السلية عن طريق بدء البولي يوبيكويتين المرتبط ب K48 مباشرة على سطحه، مما يؤدي إلى تحلله عبر البروتياسوم11. يتراكم باركين في الفقاعات التي تحتوي على بكتيريا ويشكل سلاسل يوبيكويتين مرتبطة ب K6312، بينما تقوم ARIH1 وLRSAM1 بتعديل أسطح البكتيريا التي تحتوي على سلاسل K48 وK6 على التوالي، مما يثبط نمو البكتيريا13،14. بينما تستهدف غالبية ليغازات E3 بشكل أساسي ركائز البروتينات المضيفة، تظهر بعض الليغازات خصوصية ملحوظة للمكونات الميكروبية. يحدد RNF213 ويعطي اليوبيكوتينات الدهون البوليسكاريدية (LPS) الموجودة على سالمونيلا أنتيريكا المصلية Typhimurium15، ويتعرف مركبSCF FBXO2 على الجليكانات البكتيرية الموجودة في مجموعة A من المكورات العقدية كركيزة لليوبيكوتينيشن16، مما يسهل التحول الغريب. أما مركب SCFFBXW7، فيتعرف على زخارف الديغرون داخل البروتينات السطحية لمجمع المكورات الرئوية (SPN). تشمل هذه β-جالاكتوسيداز A (BgaA) وبروتين المكورات الرئوية A (PspA)، والتي، بعد وسم سلاسل البوليوبيكويتين المرتبطة ب K48، تم تأكيدها باستخدام أجسام مضادة خاصة ب Ub مرتبط ب K48، مما يفترض أنها تجذب النظام البروتيازومي، مما يسمح بالقضاء الفعال على البكتيريا17.

على الرغم من أن عملية تصنيف هذه الغزاة السيتوزوليين باليوبيكويتين مفهومة جيدا، إلا أن الآلية اللاحقة التي يزيل بها النظام البروتيازومي مثل هذه الكائنات الميكروبية الكبيرة لا تزال محل شك. كشفت الأبحاث الحديثة أن المضيف AAA+ ATPase، VCP/p97 (البروتين المحتوي على فالوسين)، يلعب دورا حيويا في هذه العملية. بالتعاون مع عوامل مساعدة مثل UFD1 وNPLOC4، يمكن ل VCP تحديد البكتيريا الموسومة بالبولييوبيكويتين واستخلاص البروتينات الشاملة من الغشاء البكتيري، مما يؤدي إلى تمزيقها والمساعدة في إزالتها من البيئة السيتوسولية دون الاعتماد على آلية البروتيازومات.

يحتوي السيتوسول المضيف على شبكة معقدة من المسارات المناعية التي تعمل بالتوازي وبطريقة آمنة لضمان إزالة مسببات الأمراض. هذا التكرار ضروري للدفاع القوي، لكنه يعقد الجهود لتحديد وفحص دور العوامل المناعية الفردية.19. وفي هذا الصدد، توفر أنظمة إعادة التكوين في المختبر منصة مفيدة لتحليل مسارات محددة تحت ظروف محكمة. هنا، نقدم نظاما خاليا من الخلايا يعيد تلخيص عملية التحول إلى الكل وفقدان قابلية البقاء في SPN باستخدام محللات الخلايا الثديية أو إنزيمات E1-E2-E3-Ub إلى جانب مركبات مؤثر المضيف المنقي. في هذا البروتوكول المكون من خطوتين، نسهل أولا اقتران سلاسل البولييوبيكويتين على البكتيريا، ثم تقييم إزالتها بواسطة VCP/p97 بالتعاون مع UFD1 وNPLOC4. من خلال إعادة بناء هذا المسار في المختبر، نتجاوز تعقيدات الخلايا ونبحث بشكل خاص في قدرة VCP على تحييد الممرض. يتيح هذا الإعداد الدقيق استكشاف مفصل للتعرف على الركيزة، وخصوصية السلسلة، وطريقة عمل المؤثر، والمكونات الأساسية اللازمة لبدء استجابة فعالة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. زراعة الخلايا وتحضير الليزات

  1. قم بإذابة خلايا A549 ونموها في قارورة T25 باستخدام DMEM كامل مع 10٪ مصل أبقار جنيني (FBS). حضن عند 37 درجة مئوية في بيئة رطبة تحتوي على 5٪ ثاني أكسيد الكربون. مرر الخلايا عبر ثلاثة ممرات للصيانة، ثم انقل 2 × 10إلى 6 خلايا إلى قارورة T75. استمر في الزراعة حتى تصل كثافة الخلايا إلى 8-10 × 10 6 خلايا.
  2. قم بكشط الخلايا من قارورة T75 عند 4 درجات مئوية باستخدام مخزن تفاعل يحتوي على 200 ململ HEPES، 100 ملليمولار MgCl2، 1 مليلي كيلو سيل، و5٪ جلسيرول عند درجة حموضة 7.4. قم بالطرد المركزي على الخلايا المكشوطة على حرارة 120 × جرام لمدة 10 دقائق لتفجيرها، ثم أعد تعليقها في مخزن التفاعل لتحقيق حجم نهائي يقارب 0.6 مل في أنبوب طرد مركزي بسعة 1.5 مل.
    ملاحظة: يجب معالجة العينة بالكامل في الثلج.
  3. قم بسونيكس تعليق الخلية باستخدام مسبار ضيق (طرف القطر، 2 مم) بسعة 40 ميكرومتر مع نبضات تشغيل/إيقاف لمدة 2-2.5 دقيقة، مع الحفاظ على الخليط على البرودة. قم بعمل طرد مركزي للعينات المعالجة بصوت 21,000 × جرام لمدة 45 دقيقة، ثم اجمع الفائق الناتج، وأضف 2-3 أضعاف من كوكتيل مثبط البروتياز بمقدار 50 ضعف.
    ملاحظة: إما أن تستخدم الليزات فورا لتفاعل اليوبيكوتينيشن في نفس اليوم أو تجميده بسرعة باستخدام النيتروجين السائل وتخزن عند -80 درجة مئوية؛ ومع ذلك، تأكد من استخدامه خلال ثلاثة أيام كحد أقصى للحصول على اليوبيكوتينيشن الفعال. تركيز اللايزات الذي يتراوح بين 2 إلى 4 ملغ/مل مناسب لليوبيكوتين.

2. الزراعة البكتيرية

  1. نما البكتيريا، سلالة Streptococcus pneumoniae (SPN) R6 (النمط المصلي II)، طوال الليل عند درجة حرارة 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربونفي وسط THY مكون من مسحوق مرق تود هيويت (3.7 جم/100 مل) ومسحوق مستخلص الخميرة (1.5 جم/100 مل).
    ملاحظة: تجنب تلقيح البكتيريا إذا تغير لون الوسط إلى بني داكن. تصنف المكورات الرئوية العقدية كمسبب مرض من مستوى السلامة الحيوية 2 (BSL-2)؛ اتخذ الاحتياطات واتبع بروتوكولات احتواء BSL-2 الصحيحة، بما في ذلك استخدام خزانة سلامة حيوية معتمدة.
  2. في اليوم التالي، قم بتطعيم الزراعة الليلية في وسط THY طازج (1:10) عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 ونمو SPN حتى تصل الكثافة البصرية عند 600 نانومتر (OD 600 نانومتر) إلى 0.4. جهز مخزون من الجلسرون من SPN (900 ميكرولتر من مزرعة SPN و600 ميكرولتر من الجليسرول (50٪) وتخزينه في -80 درجة مئوية.
  3. في يوم تجربة اليوبيكوتين، قم بإذابة مخزون جديد من SPN من -80 درجة مئوية وتلقيحه بالكامل في وسط THY بحجم 5 مل ودعه ينمو حتى يصل التيار الزائد600 نانومتر إلى 0.4.
    ملاحظة: تم نمو الزراعة البكتيرية إلى كمية OD600 نانومتر بمقدار 0.4، وهو ما يعادل حوالي10 خلايا SPN لكل مل. تم إثبات هذا الارتباط من خلال تعداد وحدات تكوين المستعمرات (CFUs)، التي تم تحديدها عن طريق تخفيف الزراعة بشكل تسلسلي في 1x PBS لتقليل تركيز الخلايا البكتيرية بحيث يمكن الحصول على مستعمرات قابلة للعد ورصد النقاط على صفائح BHI الأجار، وهو وسط أكثر ثراء من THY.

3. اختبار التوبيكوتينيشن في المختبر من تحلل الثدييات

  1. خذ حوالي 10 خلايا SPN من7 واغسله جيدا ثلاث مرات على الأقل باستخدام محلول التفاعل (200 ملليموتر HEPES، 100 ملليمولار MgCl2، 1 مليلي كيلو سيلتر، وجليسرول 5٪ عند درجة حموضة 7.4) عن طريق إعادة تعليق البكتيريا في المخزن التالي، تليها الطرد المركزي عند 21000 × جرام لمدة 5 دقائق، وأخيرا تدفئها بالطرد المركزي عند 21000 × جرام لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  2. أعد تعليق حبيبة SPN بمحلول A549 من تحليل الخلايا الثديية مع يوبيكويتين منقى (350 ميكرومول) و1 مللي مولار ATP وحضن لمدة ساعة إلى ساعتين عند 27 درجة مئوية.
    ملاحظة: تجنب تجميد وإذابة محلل الخلايا الثديية. من الأفضل تحضير الليزات في نفس يوم اختبار اليوبيكوتينشن.
  3. بعد الحضانة، غسل البكتيريا بمحلول تفاعل يحتوي على 1 مليون يوريا مرة واحدة، تليها غسلتين فقط مع مخزن تفاعل، ثم تثبيت ب 1٪ بارافورمالديهيد (PFA). بعد التثبيت، حضن الخلايا التي تحتوي PBS على الجليسين (1 ملغ/مل) لمدة 15 دقيقة، تليها غسلتين مرتين ب PBS.
    ملاحظة: يستخدم غسول اليوريا بسعة 1 M لتعطيل التفاعلات غير التساهمية بشكل طفيف، مما يضمن بقاء البكتيريا الشاملة تساهميا فقط. بعد ذلك، من المهم غسل اليوريا جيدا باستخدام عازل التفاعل لإزالة اليوريا المتبقية، حيث يمكن أن يتداخل وجودها مع اختبار القتل في المختبر .
    كوسيلة تحكم سلبية، جهز خليط التفاعل بالكامل وحضنه مع البكتيريا على الثلج لتثبيط النشاط الإنزيمي. بعد الحضانة مباشرة، شطف العينة ثم ثبتها باستخدام 1٪ PFA للحفاظ على حالة التفاعل.

4. اختبار اليوبيكوتينيشن في المختبر من مركب الإنزيمات E1-E2-E3

  1. جهز خليط تفاعل يتكون أولا من يوبيكويتين (350 ميكرومولار)، UBE1 (400-800 نانومولار)، UbE2C (3-5 ميكرومولار)، مركب Rbx1-Skp1-Cul1-Fbxw7 (500 نانومال) و2 مللي مولار ATP في مخزن التفاعل (200 مللي مولار HEPES، 100 ملليمولار MgCl2، 1 ملوا كيلو سيل، و5٪ جليسرول عند درجة حموضة 7.4)، ليصبح حجم التفاعل الكلي 100-150 ميكرولتر.
    ملاحظة: خزن جميع الإنزيمات عند -80 درجة مئوية. لتجنب فقدان النشاط من دورات تجميد وإذابة متعددة، أنشئ أليكوتات صغيرة واستخدم أليكوتات جديدة لكل تفاعل توبيكوتين.
  2. أعد تعليق البكتيريا (107 وحدة قدم مكعبة) في هذا الخليط التفاعلي المحتوي على إنزيم اليوبيكوتين وحضن البكتيريا لمدة ساعتين عند 27 درجة مئوية. بعد ذلك، غسل البكتيريا بمحلول تفاعل يحتوي على 1 مليون يوريا لمدة لا تقل عن 3 أضعاف، تليها تثبيت ب 1٪ بارافورمالديهيد (PFA). بعد التثبيت، حضن الخلايا التي تحتوي PBS على الجليسين (1 ملغ/مل) لمدة 15 دقيقة، تليها غسلتين مرتين ب PBS.
    ملاحظة: إذا حدث فقدان مفرط للخلايا، يمكن تقليل عدد الغسولات.

5. تصور البكتيريا الشاملة

  1. بعد تثبيت العينة ب 1٪ من PFA، حضنها في 3٪ BSA لمدة ساعة واحدة عند 27 درجة مئوية، ثم قم بغسلتين ب 1x PBS.
  2. أعد تعليق البكتيريا اليوبيكوتينية باستخدام جسم مضاد أولي بتركيزات أعلى من تلك المستخدمة عادة في اختبارات التألق المناعي. استخدم جسما مضادا خاصا بالبكتيريا مع جسم مضاد مضاد لليوبيكوتين (1:100)، مخفف في PBS يحتوي على 1٪ BSA، للصبغ عند 27 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.
    ملاحظة: للحصول على أفضل تلوين للأجسام المضادة، استخدم أنبوب طرد مركزي منخفض الارتباط بالبروتين لتقليل فقدان الأجسام المضادة أو استخدم تركيزا أعلى للأجسام المضادة للحصول على أفضل النتائج.
  3. بعد ذلك، اغسل البكتيريا مرتين ب 1x PBS ثم أعد تعليقها مع الجسم المضاد الثانوي المقابل المصاحب مع أليكسا فلور 488 و555 على التوالي، لمدة ساعة واحدة عند 27 درجة مئوية.
  4. ضع حوالي 10-20 ميكرولتر من عينة البكتيريا الموسومة عن طريق صب قطري وامزج 5-10 ميكرولتر من وسط التركيب مع أو بدون DAPI، ثم ضع غطاء فوقه واستخدم ورق المناديل لامتصاص أي سائل زائد. وأخيرا، راقب العينة تحت المجهر الكونفوكالي في نفس اليوم.

6. تعبير وتنقية البروتين

  1. للتعبير عن النوع البري VCP/p97، تحول بلازميد pET28a المحتوي على VCP إلى سلالة الإشريكية القولونية BL21-DE3 عبر بروتوكول تحويل الإشريكية القولونية القياسية 20. تكونت مستعمرات الحضانة بعد التحول طوال الليل في مرق لوريا (LB) عند درجة حرارة 37 درجة مئوية. في اليوم التالي، قم بتطعيم 1:50 في قارورة تحتوي على LB جيدة التهوية ودعها تنمو حتى تصل كمية OD600 نانومتر إلى 0.7-0.8. أضف 200 ميكرومولار من IPTG إلى الزراعة وحضانة لمدة 5 ساعات عند 37 درجة مئوية مع هز عند 180 دورة في الدقيقة؛ تأكيد تعبير البروتين باستخدام SDS-PAGE.
    ملاحظة: طوال خطوة نمو وتعبير البكتيريا، تم استخدام كاناميسين (50 ميكروغرام/مل) كضغط انتقائي.
  2. للتعبير عن UFD1 من النوع البري، قم بتحويل بلازميد pET41b الذي يحتوي على UFD1 إلى سلالة الإشريكية القولونية BL21-Rosetta عبر بروتوكول تحويل الإشريكية القولونية القياسية 20. تكونت مستعمرات الحضانة بعد التحول طوال الليل في مرق لوريا (LB) عند درجة حرارة 37 درجة مئوية. في اليوم التالي، قم بتطعيم 1:50 في قارورة تحتوي على LB جيدة التهوية ودعها تنمو حتى تصل كمية OD600 نانومتر إلى 0.7-0.8. أضف 1 مللي مولار من IPTG إلى الزراعة وحضن لمدة 5 ساعات عند 37 درجة مئوية مع هز عند 180 دورة في الدقيقة؛ تأكيد تعبير البروتين باستخدام SDS-PAGE.
  3. للتعبير عن NPLOC4 من النوع البري، يتم إدخال بلازميد pET41b المحتوي على NPLOC4 في سلالة الإشريكية القولونية BL21-Rosetta باستخدام طريقة تحويل الإشريكية القولونية القياسية 20. حضن المستعمرات الناتجة عن التحول في مرق لوريا (LB) خلال الليل عند درجة حرارة 37 درجة مئوية. في اليوم التالي، نقل تخفيف بنسبة 1:50 للثقافة إلى قارورة مهوية جيدا مملوءة ب LB، ودعها تنمو حتى تصل الكثافة البصرية عند OD600 نانومتر إلى 0.7-0.8. بعد ذلك، أضف 1 مللي مولار من IPTG إلى الزراعة واستمر في الحضانة لمدة 16 ساعة عند 18 درجة مئوية مع الرج عند 180 دورة في الدقيقة؛ تحقق من تعبير البروتين من خلال إجراء تحليل SDS-PAGE.
    ملاحظة: في كامل خطوة نمو وتعبير البكتيريا التي تمت في سلالة الإشريكية القولونية BL21-روزيتا، تم استخدام الكاناميسين (50 ميكروغرام/مل) والكلورامفينيكول (20 ميكروغرام/مل) كضغط انتقائي. تم توفير تسلسلات pET28a-p97 و pET41b-NPLOC4 في الملف التكميلي 1.
  4. بعد التعبير عن البروتين، يتم طرد الخلايا البكتيرية عند 21,000 × جرام لمدة 10 دقائق وإعادة تعليق الحبيبة في محلول تحلل يحتوي على 50 ملليمولار تريس-كل، 300 ملليمولار NaCl، 5 ملليمو β-ميركابتوإيثانول، 1 ملليمولار PMSF، 5٪ جلسيرول، pH 8.
  5. قم بتحويل الخلايا إلى الصوت لمدة ساعة واحدة باستخدام مسبار ضيق (قطر الطرف، 6 مم) بسعة 50 ميكرومتر، ونبضة تشغيل/إيقاف لمدة 20 ثانية عند 4 درجات مئوية. اسقط الحطام باستخدام 15,000 × جرام لمدة ساعة واحدة واجمع السوبرناتانت.
    ملاحظة: تم تنفيذ الصوتية الكلية لمدة ساعة واحدة (30 دقيقة تشغيل و30 دقيقة إيقاف كنبضات 20 ثانية)، واستمر العملية حتى تحول تعليق الخلية العكرة إلى شفاف إلى شفاف. يتطلب الأمر إجراء الطرد المركزي عالي السرعة لضمان بقاء الحطام الخلوي كحبيبات وعدم انفصاله أثناء تحميل الليزات على عمود تنقية البروتين.
  6. مرر المادة الفائقة عبر مرشح بحجم 0.4 ميكرومتر وحملها على العمود المعبأ بحبيبات Ni-NTA لتنقية الألفة، موازنة مسبقا بمخزن التنقية (50 ملليموتر تريس-كل، 300 ملليمولار NaCl، 5 ملم-ميركابتوإيثانول β، 5٪ جلسرول، pH 8).
  7. اغسل عمود البروتين الغني باستخدام محلول غسيل يحتوي على 50 ملليمولار تريس-كل، 300 ملليمولار ناكل، 5 ملليمولار β-ميركابتوإيثانول، 5٪ جليسرول، درجة حموضة 8، و30-60 ملليمولار إيميدازول بحوالي 400 مل، ثم اغسل البروتين بمحلول إخلاء يحتوي على 50 ملليمولار تريس-كل، 300 ملليمولار ناكلير، 5 مللي β مو-ميركابتوإيثانول، 5٪ جليسرول، درجة حموضة 8، و250 ملليمولار إيميدازول.
    ملاحظة: قد يختلف تركيز الإيميدازول وحجم الغسيل بناء على البروتين المحدد الذي يتم تحليله. لتقييم النقاء، يجب إجراء SDS-PAGE. من الضروري غسل العمود جيدا حتى يظهر السائل تفاعلا سلبيا مع كاشف برادفورد. يظهر الجزء المبذول شريطا بارزا ومركزا من البروتين المستهدف، والذي يجب أن يمثل العينة بشكل أساسي، مع وجود آثار طفيفة فقط، إن وجدت، من بروتينات أخرى.
  8. اجمع الكسور المختلفة، وحللها باستخدام SDS PAGE لتحديد أي الكسور تحتوي على البروتينات النقية، ثم قم بإجراء تبادل مخزن مؤقت إلى مخزن التفاعل (200 ملليموتر HEPES، 100 ملليموتر MgCl2، 1 مليلي كيلوكلورينتر، وجلسرول 5٪ عند درجة حموضة 7.4) باستخدام عمود PD-10.
    ملاحظة: قس تركيز البروتين باستخدام كاشف برادفورد (Coomassie Brilliant Blue G-250). يجب تجميد جميع البروتينات بسرعة في النيتروجين السائل وتخزينها عند -80 درجة مئوية.

7. اختبار قتل البكتيريا في المختبر

  1. ادمج 6 ميكرومولار من VCP/p97 مع 1 ميكرومولار لكل من NPLOC4 وUFD1، ثم املأ الحجم بمخزن التفاعل حتى حوالي 90 ميكرولتر. دع هذا الخليط ليحتضن على الجليد لمدة ساعتين.
  2. أضف 1-2 مللي مول من ATP إلى خليط التفاعل الذي يتضمن p97-UFD1-NPLOC4، ثم دمجها مع SPN اليوبيكوتيني (10خلايا 7 ) لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية.
  3. لتقييم فعالية البكتيريا، مباشرة بعد العلاج، خذ 1 ميكرولتر من خليط التفاعل، وقم بتخفيف تسلسلي (1:1، 1:10، 1:10، و1:100، و1:100)، ووضع 10-2 ميكرولتر من كل تخفيف على ألواح الأجار الخاصة بحقن القلب في الدماغ (BHI). كرر هذا الإجراء باستخدام 1 ميكرولتر أليكوت من التفاعل بعد ساعتين من الحضانة.
    ملاحظة: حدد جميع التخفيفات للحصول على نتائج أفضل.
  4. قيم وحدات تشكيل المستعمرة (CFUs) بين نقاط الزمن 0 ساعة و2 ساعت. احسب جدوى البكتيريا (٪) عن طريق قسمة عدد الوحدات المعتمدة عند ساعتين على عدد الوحدات عند 0 ساعة، ثم ضرب النتيجة في 100.
    ملاحظة: لتحقيق نتائج أكثر موثوقية، استخدم VCP/p97 المتحول للحرارة، أو VCP/p97 الذي يفتقر إلى مركب UFD1-NPLOC4، أو نسخة من VCP/p97 التي تفتقر إلى ATPase للمقارنة كعامل تحكم سالب.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوضح بروتوكولنا تفاصيل استخدام خلايا A549 الثديية لإنتاج محلل خلوي غني بالمكونات اللازمة لبدء عملية التحول إلى الجميع (الشكل 1A). يتم خلط هذا الليزات، سواء في حالة مركزة أو استبداله بمكونات منقاء مثل UBE1 (إنزيم تنشيط اليوبيكويتين E1)، وUbE2C (إنزيم E2 المدمج لليوبيكوتين)، ومركب Rbx1-Skp1-Cul1-Fbxw7 (ليغاز E3 يوبيكويتين)، مع اليوبيكويتين النقي وATP لتسهيل التكوينات الكيميائية في المختبر (الشكل 1B). لتقييم الاستجابة التحل...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بينما يوفر نظام إعادة التكوين في المختبر الموضح هنا إطارا قويا لاستكشاف التعقيدات الجزيئية لإيصال البكتيريا وإقصاؤها، يجب النظر في عدة قيود مهمة. الاعتماد على تركيزات فوق فيزيولوجية للبروتينات المنقاة، والتي تتكون من آليات اليوبيكوتينيشن (E1، E2، E3 ليغازات، يوبيكوين) ومعقد مؤثر المضيف (VCP/p97، UFD1، NPLOC4)، يقدم رؤى ميكانيكية رئيسية حول اليوبيكوتينيشن وإزالة مسببات الأمراض، لكنه قد لا يعكس فعليا الظروف الفسيولوجية داخل الخلية الحية.

يتكون جهاز المن...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المؤلفون لا يفرضون أي تضارب مصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نعبر عن امتناننا لمنشأة السلامة الحيوية المستوى 2 ومرفق المجهر الكونفوكال في معهد IIT بومباي. سوراف غوش. (17/06/2018(i) EU-V)، سوميت راكشيت (221610197857) وأوديت كومار داس (24D0061) حصلوا على زمالات من CSIR وUGC وحكومة الهند وIIT بومباي على التوالي. حصل أنيربان بانيرجي على تمويل بحثي من مجلس أبحاث العلوم والهندسة في حكومة الهند (رقم المنحة SPR/2019/000808) ومؤسسة Ignite Life Science (رقم المنحة IGNITE/FG-OC/2021/004). لم تلعب الهيئات الممولة أي دور في تصميم الدراسة أو جمعها وتحليلها أو قرار النشر أو إعداد المخطوطة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
كوكتيل مثبط بروتياز 50Xبروميغا G6521
6x-His-UbiquitinUBPBioE1100
A549 خط الخلية ATCCATCC CCL-185
أليكسا فلور 488إنفيتروجينA21202 
أليكسا فلور 555إنفيتروجينA-31572   
الأجسام المضادة المضادة لأوبيكويتينإنزوBML-PW8810-0100
مضاد مضاد K48 خاص بمضاد يوبيكوين، جسم مضاد Apu2 مستنسخسيغما ألدريتشZRB2150
رابطة محترفي التنسسيغما ألدريتشA6419
BHIHiMedia M210
DMEM (ارتفاع الجلوكوز)HiMedia AL251
FBSجيبكو (أصل أمريكي)38220090
الجلسرولPureSynth PSR37325
هيبسسيغما ألدريتشH4034-100G
KClسيغما ألدريتشP3911
MgCl2سيغما ألدريتشTC006
بارافورمالديهايد سيغما ألدريتشE6148
بلازميد pET28a-p97مختبرناالبلازميد متوفر عند الطلب
بلازميد pET41b-NPLOC4مختبرناالبلازميد متوفر عند الطلب
بلازميد pET41b-UFD1أدجينالبلازميد #117107
Rbx1-Skp1-Cul1-Fbxw7 سيغما ألدريتش23-030
المكورات العقدية الرئوية سلالة R6ATCCATCC BAA-255ممرض مجموعة المخاطر -2، سيتم التعامل معه في منشأة BSL-2
مسحوق مرق تود هيويتHiMedia M313
UBE1UBPBioB1100
UbE2CUBPBioC1300
اليورياHiMedia MB032
مسحوق مستخلص الخميرة  HiMedia RM027

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ciechanover, A. The unravelling of the ubiquitin system. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (5), 322-324 (2015).
  2. Ciechanover, A. Proteolysis: from the lysosome to ubiquitin and the proteasome. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (1), 79-87 (2005).
  3. Damgaard, R. B. The ubiquitin system: from cell signalling to disease biology and new therapeutic opportunities. Cell Death Differ. 28 (2), 423-426 (2021).
  4. Deol, K. K., Lorenz, S., Strieter, E. R. Enzymatic logic of ubiquitin chain assembly. Front Physiol. 10, 835(2019).
  5. Kikkert, M., et al. Human HRD1 is an E3 ubiquitin ligase involved in degradation of proteins from the endoplasmic reticulum. J Biol Chem. 279 (5), 3525-3534 (2004).
  6. Korac, J., et al. Ubiquitin-independent function of optineurin in autophagic clearance of protein aggregates. J Cell Sci. 126 (Pt 2), 580-592 (2013).
  7. Asmat, T. M., Agarwal, V., Saleh, M., Hammerschmidt, S. Endocytosis of Streptococcus pneumoniae via the polymeric immunoglobulin receptor of epithelial cells relies on clathrin- and caveolin-dependent mechanisms. Int J Med Microbiol. 304 (8), 1233-1246 (2014).
  8. Ercoli, G., et al. Intracellular replication of Streptococcus pneumoniae inside splenic macrophages serves as a reservoir for septicaemia. Nat Microbiol. 3 (5), 600-610 (2018).
  9. Chakravortty, D., Rohde, M., Jäger, L., Deiwick, J., Hensel, M. Formation of a novel surface structure encoded by Salmonella pathogenicity island 2. EMBO J. 24 (11), 2043-2052 (2005).
  10. Surve, M. V., et al. Heterogeneity in pneumolysin expression governs the fate of Streptococcus pneumoniae during blood-brain barrier trafficking. PLoS Pathog. 14 (7), e1007168(2018).
  11. Franco, L. H., et al. The ubiquitin ligase SMURF1 functions in selective autophagy of Mycobacterium tuberculosis and anti-tuberculous host defense. Cell Host Microbe. 22 (3), 421-423 (2017).
  12. Manzanillo, P. S., et al. The ubiquitin ligase Parkin mediates resistance to intracellular pathogens. Nature. 501 (7468), 512-516 (2013).
  13. Polajnar, M., Dietz, M. S., Heilemann, M., Behrends, C. Expanding the host cell ubiquitylation machinery targeting cytosolic Salmonella. EMBO Rep. 18 (9), 1572-1585 (2017).
  14. Huett, A., et al. The LRR and RING domain protein LRSAM1 is an E3 ligase crucial for ubiquitin-dependent autophagy of intracellular Salmonella typhimurium. Cell Host Microbe. 12 (6), 778-790 (2012).
  15. Otten, E. G., et al. Ubiquitylation of lipopolysaccharide by RNF213 during bacterial infection. Nature. 594 (7861), 111-116 (2021).
  16. Yamada, A., Hikichi, M., Nozawa, T., Nakagawa, I. FBXO2/SCF ubiquitin ligase complex directs xenophagy through recognizing bacterial surface glycan. EMBO Rep. 22 (11), e52584(2021).
  17. Apte, S., et al. An innate pathogen sensing strategy involving ubiquitination of bacterial surface proteins. Sci Adv. 9 (12), eade1851(2023).
  18. Ghosh, S., et al. Host AAA-ATPase VCP/p97 lyses ubiquitinated intracellular bacteria as an innate antimicrobial defence. Nat Microbiol. , (2025).
  19. Mitchell, G., Isberg, R. R. Innate immunity to intracellular pathogens: balancing microbial elimination and inflammation. Cell Host Microbe. 22 (2), 166-175 (2017).
  20. Hanahan, D. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. J Mol Biol. 166 (4), 557-580 (1983).
  21. Blythe, E. E., Olson, K. C., Chau, V., Deshaies, R. J. Ubiquitin- and ATP-dependent unfoldase activity of p97/VCP-NPLoc4-UFD1L is enhanced by a mutation that causes multisystem proteinopathy. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (22), E4380-E4388 (2017).
  22. Ducker, C., Ratnam, M., Shaw, P. E., Layfield, R. Comparative analysis of protein expression systems and PTM landscape in the study of transcription factor ELK-1. Protein Expr Purif. 203, 106216(2023).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

UFD1 NPLOC4

مقالات ذات صلة