يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

تنقية فعالة لببتيدات الإيلاستين الشبيهة بالإيلاستين (ELPs) من الإشريكية القولونية باستخدام طريقة الاستخلاص والترسيب المعتمدة على المذيب العضوي

2.2K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/69465

⸱

يناير 9, 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Bindley Bioscience Center, Department of Chemistry, Purdue Institute for Cancer Research, Purdue University

في هذه المقالة

ملخص

يصف هذا البروتوكول طريقة سريعة وقابلة للتكرار للاستخراج والترسيب، معتمدة على المذيب العضوي، لتنقية بولي الببتيد الشبيه بالإيلاستين (ELP) من الإشريكية القولونية، مما يوفر بديلا قابلا للتوسع المحتمل لطرق تنقية ELP التقليدية.

الملخص

الببتيدات الشبيهة بالإيلاستين (ELP) هي بوليمرات حيوية هندسية مبنية من تسلسلات خماسية الببتيدات المتكررة التي تحاكي الزخارف الموجودة في التروبولاستين الثديي. تجعلها خصائصها الفريدة مرشحة مثالية لمجموعة واسعة من التطبيقات الطبية الحيوية، بدءا من توصيل الأدوية والجينات إلى هندسة الأنسجة والتصوير الجزيئي المستهدف. طرق التنقية التقليدية من تعبير الإشريكية القولونية (E. coli) قد تكون غير فعالة لعلاج ELP بسبب تكوين أجسام احتواء. طرق أخرى، مثل دورة الانتقال العكسي (ITC)، تستخدم خصائص درجة حرارة المحلول الحرجة المنخفضة (LCST) لمادة ELP لفصله عن الملوثات مثل الدهون البوليسكاريدية (LPS)، لكنها عادة ما تتطلب عدة خطوات تسخين وتبريد تستغرق وقتا طويلا وقد تؤدي إلى استعادة منخفضة حسب تسلسل وتركيز ووزن جزيئي لتركيب ELP. لمواجهة هذه التحديات، طورنا سير عمل استخلاص وترسيب قائم على المذيب العضوي يستغل الرهاب المائي الفطري لELP لتمكين تنقية سريعة وقوية وواسعة التطبيق مباشرة من حبيبات خلايا الإشريكية القولونية . تستخدم هذه الطريقة المذيبات العضوية القطبية للمساعدة في تعطيل الخلايا وذوبان ELP بشكل انتقائي في خطوة واحدة. تقوم خطوة الترسيد التالية بإزالة المذيبات العضوية المتبقية، والشوائب منخفضة الوزن الجزيئي، والسموم الداخلية بشكل فعال، مما ينتج ELP نقي للغاية مع مستويات LPS أقل من 1 EU/mL في أقل من 3 ساعات. تشير بيانات المجهر بالقوة الذرية إلى أن بروتينات اندماج ELP المنقاة بهذه الطريقة يمكن أن تتجمع ذاتيا في هياكل شبيهة بالمسيل العكسي تحتفظ بوظيفة بروتين الاندماج. تقدم هذه الطريقة السريعة للباحثين طريقة مباشرة وقابلة للتوسع لتنقية ELP، مما يخلق إمكانيات جديدة لاستخدام ELP وبروتيناته كبنات مرنة للتطبيقات الطبية والمادية.

المقدمة

الببتيدات الشبيهة بالإيلاستين (ELPs) هي بوليمرات حيوية تتكون من زخارف متكررة (VPGXG) 1,2,3,4,5,6,7,8,9. يمكن أن يكون بقايا الضيف X في وحدة البنتابيتيد أي حمض أميني غير البرولين. يمكن استخدام التغيرات في X لضبط الكراهية للماء، وسلوك الانتقال الحراري، والخصائص الوظيفية لبناء ELP لإنشاء مواد متوافقة حيويا معيارية تم استكشافها على نطاق واسع في تطبيقات طبية حيويةمختلفة 10,11,12.

بينما يمكن استخدام التخليق الكيميائي لإنتاج الببتيدات القصيرة، إلا أنه غير مناسب جيدا لبروتينات الاندماج ذات الوزن الجزيئي العالي أو للحفاظ على وظيفة بروتينات الاندماج13,14. لأسباب كهذه، عادة ما يتم التعبير عن ELPs بشكل مؤتلف في الإشريكية القولونية، مما يسمح بإنتاج التسلسل المعرفة بكميات كبيرة. ومع ذلك، يمكن أن يجلب هذا النهج تحديات أيضا. خلال تعبيرها في الإشريكية القولونية، غالبا ما تتراكم ELPs داخل أجسام احتواء كثيفة، مما يتطلب استراتيجيات استرداد فعالة لاستخراج البروتين الوظيفي15. علاوة على ذلك، يدخل التعبير البكتيري جزيئات حيوية غير مرغوب فيها مثل بروتينات خلايا المضيف، والأحماض النووية، والدهون متعددة السكريات (السموم الداخلية) التي يجب فصلها عن ELP أثناء التنقية. الاستراتيجيات التقليدية للذوبان باستخدام المنظفات (مثل كبريتات الصوديوم الدوديسيل (SDS) أو Triton X-100) أو العوامل الفوضوية مثل اليوريا حققت نجاحا محدودا لتسلسلات اندماج ELP لدينا. من خلال تجربتنا، فشل ترايتون واليوريا في استخراج ELPs من طور الحبيبات، بينما مكن SDS من الذوبان الجزئي لكنه تداخل مع تنقية الألفة في الأسفل وكان من الصعب إزالتها بالكامل من تسلسل ELP الكاره للماء.

حتى الآن، تظل دورة الانتقال العكسي (ITC) الطريقة الأكثر استخداما لتنقية الأنظمة الأرضية الأرضية (ELP). تستغل هذه التقنية سلوك LCST لديهم لترسيب وإعادة ذوبان ELP بشكل انتقائي عبر درجات الحرارة والملح16. ومع ذلك، مع بروتينات ذات وزن جزيئي أقل، يعد ITC عملية متعددة الخطوات تستغرق وقتا طويلا، وليست مناسبة جيدا للبروتينات المحيطة في أجسام الشمول، مما يتطلب عدة دورات ITC قد تؤدي إلى فقدان البروتين في كل خطوة 7,16.

لتجاوز هذه القيود، اعتمدنا سير عمل استخلاص وترسيبات قائم على المذيبات العضوية. بينما أظهر ياخنين وآخرون لأول مرة استراتيجية تقسيم مدفوعة بكره الماء لتنقية GFP باستخدام تدرجات الإيثانول والملح في عام 1998، فإن الطريقة الجديدة التي طورناها تستخدم خلطات المذيبات العضوية لاستخراج بروتينات اندماج ELP مباشرة من خلايا الإشريكية القولونية 7. قام سويت وآخرون ودارجي وآخرون بتكييف هذا النهج مع اندماجات ELP، وأظهروا أن استخراج المذيبات العضوية يتيح استعادة سريعة للبزوجات الوظيفية مع الحفاظ على السلامة الهيكلية والنشاط الحيوي 8,9. يستخدم هذا النهج السونيكيشن والمذيبات العضوية لتحليل الخلايا البكتيرية واستخراج ELPs في عملية واحدة، مع ترسيب معظم البروتينات والأحماض النووية في المضيف. استعادة الطور العضوي الغني ب ELP، تليها هطول سريع لعزل ELPs عن المذيبات والشوائب الذائبة، ينتج ELPs نقية للغاية. كما أن هذا النهج قادر على إنتاج ELP نقي من حبيبات الإشريكية القولونية ذات مستويات السموم الداخلية أقل من 1 EU/mL في أقل من ثلاث ساعات 7,8.

تظهر الدراسات حتى الآن أن هذه الطريقة قادرة على تنقية تراكيب ELP وبروتينات اندماج ELP ذات وزن جزيئي ونقطة متساوية الكهرباء متفاوتة، دون تكرار دورات ITC أو خطوات ذوبان (الشكل 1). تشير التصوير باستخدام المجهر بالقوة الذرية (AFM) والتصوير الإلكتروني الناقل (TEM) إلى أن بروتينات اندماج ELP التي يتم تنقيها بهذه الطريقة تشكل هياكل عكسية شبيهة بالميسيل (الشكل 2)، مما يساعد في الحفاظ على بنية ووظيفة مجالات اندماج ELP أثناء استخراج المذيب العضوي. يتيح هذا السير المبسط تنقية ELP بشكل أسرع وأكثر موثوقية لتطبيقات طبية حيوية متنوعة 7,8. ومن الجدير بالذكر أن Aayush وآخرون أبلغوا أن تراكيب ELP التي تم تنقيها بهذه الطريقة تحتفظ بوظيفة ارتباط مستقبل عامل النمو البشري18، مما يبرز النقطة التي تقول إن هذه الطريقة لا تنتج فقط مادة ELP نقية، بل تحافظ أيضا على نشاط مجال بروتين الاندماج.

كدليل إضافي على فائدة هذه الطريقة في عزل اندماج إنزيم ELP، نصف طريقة مفصلة تعتمد على المذيب العضوي لتنقية بناء ELP-Intein-Chorismate Mutase 2 (ELP-I-Cm2) (الشكل 3). قد تكون هذه الطريقة مفيدة لتنقية أنواع ELP الأخرى بسرعة لتوصيل الأدوية وتطبيقات المواد النانوية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. تحضير المواد

  1. السلالة البكتيرية: استخدم الخلايا الكيميائية المؤهلة للتعبير عن الإشريكية القولونية BL21(DE3) كعميل تعبير.
    ملاحظة: تم اختيارها بسبب كفاءتها العالية في التحول وملاءمتها لإنتاج البروتينات المؤتلفة.
  2. البلازميد التعبيري: استخدم متجه pET21(+) يشفر بروتين اندماج ELP-I-Cm2 مع مقاومة للأمبيسيلين9. اشتر ناقل البلازميد من Addgene. أدخل جين Cm2 باستخدام موقع BsrG I في نهاية الإنتين.
    ملاحظة: تسلسل الحمض النووي البلازميدي لهذا البروتين مقدم في الملف التكميلي 1.
  3. وسائط النمو: تحضير وسائط المرق الرائع (TB) لوسائط 1200 مل
    1. تحضير الوسط (الجزء الأول) بإضافة 16 جرام من التريبتون، 32 جرام من مستخلص الخميرة، 16 جرام من البرولين، 6.8 مل من الجلسرول إلى 1100 مل من الماء فائق النقي. اخلط جيدا لإذابة جميع المكونات. اضبط الحجم النهائي إلى 1200 مل باستخدام ماء فائق النقي.
    2. جهز مخزن فوسفات البوتاسيوم (الجزء 2) بخلط 23.1 جرام من KH2PO4 و125.4 جرام من K2HPO4، ثم رفع الحجم إلى 1 لتر مع ماء فائق النقي.
    3. قم بعمل معقم المكونات (الجزءين 1 و2) بشكل منفصل. بعد التلقين التلقائي، قم بتجميع الوسائط بتقسيم قاعدة التيبراميل إلى أربعة أليكوات بحجم 300 مل. أضف 33 مل من حاجز الفوسفات إلى كل أليكوت في ظروف معقمة.
  4. الإضافات للتعبير
    1. IPTG: إجراء التحريض باستخدام IPTG بتركيز نهائي 1.2 مللي مولار (مثلا، إضافة 396 ميكرولتر من 1 مليون IPTG إلى 330 مل من الثقافة).
    2. مضاد حيوي: أضف الأمبيسيلين إلى تركيز نهائي يبلغ 100 ميكروغرام/مل لضمان اختيار البلازميد.
  5. عازل التحلل (pH 8.5): جهز مخزن التحلل ب 10 ملليمولار قاعدة تريس و22 ملليمولار إيثيلين ديامين تيتراأسيتيك حمض (EDTA). قم بضبط الرقم الهيدروجيني إلى 8.5 باستخدام HCl أو NaOH حسب الحاجة.
  6. المذيبات العضوية للاستخراج
    1. استخدم مجموعة متنوعة من المذيبات العضوية (الجدول 1) لاستخراج بروتين اندماج ELP-I-Cm2 من أجسام الشمول. اختبر هذه المذيبات بشكل فردي وفي تركيبات ثنائية (1:1 حجم: حجم) لتقييم الكفاءة ونقاء ELP.
      ملاحظة: جميع المذيبات المستخدمة كانت من درجة HPLC، باستثناء الأسيتونيتريل (درجة أوبتيما)، الإيثانول (درجة USP)، و1-بوتانول (نقي بنسبة 99٪).
      تحذير: جميع المذيبات المذكورة أعلاه قابلة للتطاير وقابلة للاشتعال. يجب التعامل معها داخل غطاء بخار كيميائي باستخدام معدات الحماية الشخصية المناسبة (معطف مختبر، قفازات نيتريل، وحماية للعين). العديد من أنواع الأدوات البلاستيكية غير متوافقة مع المذيبات العضوية. يوصى بشدة باستخدام أدوات البلاستيك البولي بروبيلين لتجارب الاستخلاص والترسيبات باستخدام المذيبات العضوية؛ وإلا، يجب اختبار الأدوات البلاستيكية المستخدمة بدون عينة قيمة لضمان ملاءمتها للاستخدام. يجب أن يتبع التخلص من نفايات المذيبات الإجراءات الموضحة في سياسات النفايات الخطرة المؤسسية ذات الصلة.

2. تحلل الخلايا وتحضيرها (الشكل 4A)

  1. إعادة التعليق: وزن 1 جرام من حبيبات الخلية وأعد تعليقه في 4 مل من محلول التحلل الطازج. استخدم الدوامة بلطف حتى تتشتت الحبيبات بالكامل وتخلط مع المخزن الكهربائي.
  2. التحلل الإنزيمي: أضف ~5 ملغ من الليزوزيم للمساعدة في هضم جدار الخلية. اترك نظام التعليق يحتضن عند 4 درجات مئوية لمدة ساعة واحدة. هذا يسهل الهضم الإنزيمي الجزئي لتعزيز تحلل الخلايا.
  3. الصوت: بعد الحضانة، قم بتحويل العينة إلى صوت التحليل الكامل للخلية وقطع الحمض النووي الجيني القصي. استخدم دفعات قصيرة من صوت مجسات الميكروتيب (جهاز 350 واط، مستوى طاقة 3) مع فترات زمنية لتجنب ارتفاع درجة الحرارة (مثل تشغيل 5 ثوان / إيقاف/10 ثوان إيقاف، تكرار عند الحاجة). قم بسونيك العينات على الجليد وتطبيق الطاقة فوق الصوتية حتى يتم الحصول على تحلل منتظم خال من الجسيمات المرئية، عادة لمدة حوالي 5-8 دقائق.
    ملاحظة: بعد اكتمال السونيك، تخزين 100 ميكرولتر من العينة (أو الليزات) لتحليل تعبير ELP لمراقبة تقدم التنقية قبل وبعد خطوات الاستخراج والترسيب.
  4. الطرد المركزي وتحليل التعبير.
    1. قم بتوضيح الليزات عن طريق الطرد المركزي عند 10,000 جرام لمدة 10 دقائق عند 20 درجة مئوية، ثم فصل الفائق (الجزء القابل للذوبان) بعناية عن الحبيبة (جزء غير قابل للذوبان/الشمولية).
    2. تقييم تعبير ELP في كلا الجزئين بواسطة SDS-PAGE: سحب أليكوت (مثلا 10-20 ميكرولتر) من المادة الفائقة وإعادة تعليق كتلة حبيبات مكافئة في مخزن التحلل (50 ملم تريس-HCl pH 8.0، 150 ملي مولار NaCl، 1 مللي مولار EDTA) إلى نفس الحجم؛ اخلط كل واحدة مع 4x مخزن Laemmli إلى 1x نهائيا، سخن على 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، وحمل كميات متساوية لتمكين المقارنة المباشرة.
    3. إذا كان ELP المستهدف قابل للذوبان في الغالب، فتابع الاستخراج بالمذيب العضوي باستخدام الفائق الشفاف المصفى. إذا كان غير قابل للذوبان في الغالب (أجسام الاحتواء)، تخلص من المادة الفائقة واستمر في سير عمل جسم الشمول (الغسيل/الذوبان والاستخراج) عن طريق معالجة الحبيبة عن طريق استخراج المذيب العضوي.
  5. غسل وتجفيف الحبيبات (فقط للELP في أجسام الاحتواء): قلب أنابيب الطرد المركزي للسماح بتصريف أي مخزن تحلل متبقي بمساعدة الجاذبية. بمجرد أن ينتهي السائل المرئي (~1-2 دقيقة)، اترك الحبيبة لتجف في الهواء في درجة حرارة الغرفة لمدة 5-10 دقائق، مع التأكد من خلوها من الرطوبة الزائدة قبل الانتقال إلى الاستخراج العضوي.

3. الاستخراج العضوي (الشكل 4B)

ملاحظة: لكل ELP شرط المذيب المفضل الخاص به لإنتاج استخلاص عالي النقاء (مثل أداء التيار المتردد في الشكل 1). لذلك، يجب اختبار فحص أولي ل 28 مذيبا عضويا وتركيباتها، وتحليل العزلات بواسطة PAGE لتحديد شروط كفاءة الذوبان المثلى للبناء المطلوب.

  1. فحص المذيبات. قم بفحص المذيبات الفردية المعروضة في الخطوة 1.6 وخلطاتها الثنائية 1:1 (v/v). قيم خلطات إضافية (مثل 1:2، 2:1، 4:1) لتعزيز فعالية العملية.
    ملاحظة: في الوقت الحالي، لا توجد إرشادات لاختيار أكثر المذيبات أو التركيبات فعالية بشكل منطقي، لذا هناك حاجة إلى حملة فحص لاختيار المذيبات التي حققت سابقا نجاحا في إذابة تجمعات البروتينات الكارهة للماء. يجب أن يستند الاختيار النهائي لمستخرج المذيب العضوي المستخدم في التنقية إلى تحليل SDS-PAGE للعزلات المستخرجة من هذه الشاشة.
  2. إجراء الاستخلاص
    1. إضافة المذيب: أضف 4 مل من المذيب العضوي أو خليط المذيب إلى الحبيبة/المادة الفائقة المجففة بالهواء التي تم الحصول عليها بعد التحلل. بالنسبة للتركيبات المختلطة، تأكد من نسب حجمية دقيقة (مثل 2 مل من كل منها لتركيبة 1:1).
    2. الدوامة: قم بتدوير التعليق بقوة لمدة دقيقة واحدة لضمان خلط واختراق المذيب بشكل جيد في الحبيبة.
    3. الحضانة (وقت الاحتفاظ): اترك التعليق يحتضن عند 20 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، مما يضمن وقت تفاعل كاف لتجمع البروتينات خارج الخلية وتترسيب بينما تذوب البروتينات الأرضية في المرحلة العضوية.
    4. الطرد المركزي: قم بطرد المركزي بالخليط على حرارة 13,000 × جرام لمدة 10 دقائق عند 20 درجة مئوية لفصل البروتينات الذائبة عن الحطام غير القابل للذوبان المتبقي.
    5. جمع السوبرناتانت: اجمع السوبرناتانت بعناية دون إزعاج الكريات. يحتوي الفائق على ELP المذاب، بينما تحتوي الحبيبة على بروتينات خلايا المضيف، والأحماض النووية، والدهون.
    6. قياس الحجم: سجل حجم المادة الفائقة المسترجعة بدقة. يجب توخي الحذر لضمان خلو المادة الفائقة من أي جزيئات حبيبات. هذا القياس ضروري لخطوة الهطول في المراحل النهائية.

4. ترسيب البروتين

  1. إضافة مضاد للمذيبات: أضف الأسيتون أو الأسيتونيتريل إلى المادة العضوية الفائقة بحجم 2.33 ضعف حجم المادة الفائقة.
  2. الحضانة: حضن الخليط عند 20 درجة مئوية لمدة 5-7 دقائق.
  3. الطرد المركزي: الطرد المركزي عند 10,000 جرام لمدة 10 دقائق عند 20 درجة مئوية.
  4. التعامل مع الحبيبات: بعد الطرد المركزي، تخلص من المادة الفوقية بعناية وجفف العينة بالهواء بترك الأنبوب مفتوحا تحت تيار غاز نيتروجين لطيف لمدة 10-15 دقيقة، أو حضن أنابيب الطرد المركزي غير المغطاة مقلوبة على مناديل خالية من الوبر في غطاء أبخرة لمدة ساعة واحدة عند 20 درجة مئوية (لا تضع الحرارة).

5. التعامل مع حبيبات البروتين وإعادة التعليق

  1. إعادة التعليق: بعد الترسيب والتجفيف بالهواء، أعد تعليق حبيبات البروتين في 50 ميكرولتر من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS). استخدم الماصة بلطف للأعلى والأسفل لضمان ذوبان الحبيبة بالكامل.
  2. التخزين: تخزين البروتين المعلق عند -20 درجة مئوية للاستخدام القصير إلى المتوسط. تجنب تكرار دورات التجميد والذوبان للحفاظ على سلامة وظيفة البروتين.

6. التحقق عبر SDS-PAGE

  1. تحضير العينة: اخلط البروتين المنقى مع 4× SDS-PAGE تحميل بنسبة 3:1 ودوامة لفترة وجيزة لضمان التجانس.
  2. شروط الرحلان الكهربائي: قم بتحميل الطلاء على جل SDS-PAGE بنسبة 15٪ ل ELP-I-Cm2 وشغل بجهد 100-120 فولت حتى يصل صبغة التتبع إلى القاع.
    ملاحظة: يجب أن تعتمد نسبة الربط المتقاطع في الجل على حجم الهيكل المطلوب من ELP
  3. التلوين والتصوير: صبغ الجل باستخدام صبغة Instant Blue Coomassie أو أي صبغة مناسبة أخرى لمدة ساعتين عند 20 درجة مئوية. قم بإزالة الصبغة بشطفه بالماء منزوع الأيونات حتى تحصل على خلفية واضحة. اختبر البروتين المعزول في اختبارات النشاط للتحقق من أن احتفاظ النشاط حدث بعد سير عمل تنقية المذيب العضوي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

بعد المرور بالمراحل النهائية من البروتوكول، الخطوة التالية هي تصور نتيجة الاستخلاص والهطول من خلال تحليل SDS-PAGE وتلوين كوماسي الأزرق. عندما يكون هناك خطوة تحلل قبل الاستخلاص العضوي، يجب أن يكون هناك شريط ELP بارز. في حالة ELP-I-Cm2، يظهر هذا النطاق عند 100 كيلو دالتون (الشكل 3A).

أظهرت عمليات فحص تركيبات المذيبات العضوية المختلفة كفاءة استخلاص متغيرة (الشكل 3B)، حيث أنتج كل تركيبة تركيزات ونقاء مختلفة. نختار أفضل التركيبات للاستخلاص...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

تم استخدام ITC سابقا للتنقية غير الكروماتوغرافية ل ELP19؛ ومع ذلك، قد تكون طريقة تستغرق وقتا طويلا وذات عائد منخفض. في الطرق المفصلة أعلاه، نصف نهجا لتنقية بروتين اندماج ELP-I-Cm2 السريع، موضحين كيف يمكن استخدام طريقة الاستخلاص والترسيب المعتمدة على المذيب العضوي بفعالية لتنقية مجموعة واسعة من اندماجات ELP وELP. بروتوكول المذيب العضوي ليس فقط أسرع من ITC، بل هو أيضا أكثر فعالية بكثير لتسلسلات ELP القصيرة التي يمكن أن تتحدى طريقة ITC. قد يكون أيضا بديلا أكثر قابلية...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

نشكر معهد جامعة بوردو لأبحاث السرطان وبرنامج CCSG التابع للمعاهد الوطنية للصحة (CA23168) على دعمهم لهذا العمل.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
2-ميركابتوإيثانولبيو-راد161-0710مكون SDS-PAGE
30٪ أكريلاميد/بيس-أكريلاميدTCIA3218مكون SDS-PAGE
الأسيتونفيشر ساينتيفكA949مذيب عضوي
الأسيتونيتريلفيشر ساينتيفكA996مذيب عضوي
أمبيسيلينبيولوجيا الذهب - التكنولوجيا الحيوية للذهبA-301-25المضاد الحيوي
APS (بيرسلفات الأمونيوم)بيو-راد1610700مكون SDS-PAGE
بوتانولفيشر ساينتيفكL13171مذيب عضوي
EDTAكواشف فيشر الحيويةBP118-500مكون مخزن التحلل
الإيثانولمختبرات ديكونUN1170مذيب عضوي
إيثيل أسيتاتفيشر ساينتيفكE195مذيب عضوي
الجلسرولمنتجات البحث الدوليةG22020-0.5مكون وسائط المرق الرائع (TB)
حمض الهيدروكلوريكفيشر ساينتيفكA144SI-212مكون مخزن التحلل
صبغة كوماسي الفوريةأبكامab119211مكون SDS-PAGE
IPTGبيولوجيا الذهب - التكنولوجيا الحيوية للذهب12481C25مكون تعبير البروتين
إيزوبوبانولفيشر ساينتيفكA451-1مذيب عضوي
K2HPO4 (فوسفات البوتاسيوم أحادي القاعدة)علوم الواردز470302-246الجزء 2 مكون المخزن المؤقت
KH2PO4 (فوسفات بوتازيوم ديبيسيش)علوم الواردز470302-254الجزء 2 مكون المخزن المؤقت
إل-برولينمنتجات البحث الدوليةP5200-500.0مكون وسائط المرق الرائع (TB)
ليسوزيمبيولوجيا الذهب - التكنولوجيا الحيوية للذهبL-040-1مكون مخزن التحلل
الميثانولفيشر ساينتيفكA452مذيب عضوي
مخزن العينات الأصليبيو-راد161-0738مكون SDS-PAGE
سلم البروتينبيولوجيا الذهب - التكنولوجيا الحيوية للذهبP008-500مكون SDS-PAGE
محلول الجل المؤقتبيو-راد1610798مكون SDS-PAGE
كبريتات الصوديم الدودسيل (SDS)ثيرمو ساينتفيكJ18220-36مكون SDS-PAGE
هيدروكسيد الصوديومفيشر ساينتيفكS318-500مكون مخزن التحلل
مخزن جل التكديسبيو-راد1610799مكون SDS-PAGE
TEMEDبيو-راد1610801مكون SDS-PAGE
قاعدة تريسكواشف فيشر الحيويةBP-152مكون مخزن التحلل
التريبتونمنتجات البحث الدوليةT60065-1000.0مكون وسائط المرق الرائع (TB)
مستخلص الخميرةمنتجات البحث الدوليةY20025-1000.0مكون وسائط المرق الرائع (TB)

المراجع

  1. Despanie, J., Dhandhukia, J. P., Hamm-Alvarez, S. F., MacKay, J. A. Elastin-like polypeptides: therapeutic applications for an emerging class of nanomedicines. J Control Release. 240, 93-108 (2016).
  2. MacEwan, S. R., Chilkoti, A. Applications of elastin-like polypeptides in drug delivery. J Control Release. 190, 314-330 (2014).
  3. Jenkins, I. C., Milligan, J. J., Chilkoti, A. Genetically encoded elastin-like polypeptides for drug delivery. Adv Healthc Mater. 10 (13), e2100209(2021).
  4. Ju, Y., et al. Molecular targeting of immunosuppressants using a bifunctional elastin-like polypeptide. Bioconjug Chem. 30 (9), 2358-2372 (2019).
  5. Nettles, D. L., Chilkoti, A., Setton, L. A. Applications of elastin-like polypeptides in tissue engineering. Adv Drug Deliv Rev. 62 (15), 1479-1485 (2010).
  6. Meyer, D. E., Chilkoti, A. Purification of recombinant proteins by fusion with thermally responsive polypeptides. Nat Biotechnol. 17 (11), 1112-1115 (1999).
  7. VerHeul, R., Sweet, C., Thompson, D. H. Rapid and simple purification of elastin-like polypeptides directly from whole cells and cell lysates by organic solvent extraction. Biomater Sci. 6 (4), 863-876 (2018).
  8. Sweet, C., Aayush, A., Readnour, L., Solomon, K. V., Thompson, D. H. Development of a fast organic extraction-precipitation method for improved purification of elastin-like polypeptides that is independent of sequence and molecular weight. Biomacromolecules. 22 (5), 1990-1998 (1990).
  9. Darji, S., Aayush, A., Estes, K. M., Strock, J. D., Thompson, D. H. Unravelling the mechanism of elastin-like polypeptide-enzyme fusion stabilization in organic solvents. Biomacromolecules. 25 (1), 272-281 (2024).
  10. Urry, D. W. Physical chemistry of biological free energy transduction as demonstrated by elastic protein-based polymers. J Phys Chem B. 101 (51), 11007-11028 (1997).
  11. Guo, Y., Liu, S., Jing, D., Liu, N., Luo, X. The construction of elastin-like polypeptides and their applications in drug delivery system and tissue repair. J Nanobiotechnology. 21, 418(2023).
  12. Yi, A., Sim, D., Lee, S. -B., Sarangthem, V., Park, R. -W. Application of bioengineered elastin-like polypeptide-based system for targeted gene delivery in tumor cells. Biomater Biosyst. 6, 100050(2022).
  13. Clement, H., et al. Comparison between the recombinant expression and chemical synthesis of a short cysteine-rich insecticidal spider peptide. J Venom Anim Toxins Trop Dis. 21, 19(2015).
  14. Miranda, L. P., Alewood, P. F. Accelerated chemical synthesis of peptides and small proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (4), 1181-1186 (1999).
  15. Eweje, F., et al. Self-assembling protein nanoparticles for cytosolic delivery of nucleic acids and proteins. Nat Biotechnol. , (2025).
  16. Hassouneh, W., Christensen, T., Chilkoti, A. Elastin-like polypeptides as a purification tag for recombinant proteins. Curr Protoc Protein Sci. 6 (11), 1-16 (2010).
  17. Yakhnin, A. V., Vinokurov, L. M., Surin, A. K., Alakhov, Y. B. Green fluorescent protein purification by organic extraction. Protein Expr Purif. 14 (3), 382-386 (1998).
  18. Aayush, A., Darji, S., Estes, K. M., Yeh, E., Thompson, D. H. Development of an elastin-like polypeptide-based nucleic acid delivery system targeted to EGFR+ bladder cancer cells using a layer-by-layer approach. Biomacromolecules. 25 (9), 5729-5744 (2024).
  19. Christensen, T., et al. Fusion order controls expression level and activity of elastin-like polypeptide fusion proteins. Protein Sci. 18 (7), 1377-1387 (2009).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

تنقية البروتينات الشبيهة بالإيلاستين (ELP)الاستخلاص بالمذيبات العضويةترسيب البروتينالتعبير في بكتيريا E. Coliالأجسام الاشتماليةإزالة السموم الداخليةتحليل SDS-PAGEنشاط البروتين الاندماجيالجسيمات النانوية ذاتية التجميع
تنقية فعالة لببتيدات الإيلاستين الشبيهة بالإيلاستين (ELPs) من الإشريكية القولونية باستخدام طريقة الاستخلاص والترسيب المعتمدة على المذيب العضوي
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.