Method Article

تنقية فعالة لببتيدات الإيلاستين الشبيهة بالإيلاستين (ELPs) من الإشريكية القولونية باستخدام طريقة الاستخلاص والترسيب المعتمدة على المذيب العضوي

DOI:

10.3791/69465

⸱

January 9th, 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Bindley Bioscience Center, Department of Chemistry, Purdue Institute for Cancer Research, Purdue University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول طريقة سريعة وقابلة للتكرار للاستخراج والترسيب، معتمدة على المذيب العضوي، لتنقية بولي الببتيد الشبيه بالإيلاستين (ELP) من الإشريكية القولونية، مما يوفر بديلا قابلا للتوسع المحتمل لطرق تنقية ELP التقليدية.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الببتيدات الشبيهة بالإيلاستين (ELP) هي بوليمرات حيوية هندسية مبنية من تسلسلات خماسية الببتيدات المتكررة التي تحاكي الزخارف الموجودة في التروبولاستين الثديي. تجعلها خصائصها الفريدة مرشحة مثالية لمجموعة واسعة من التطبيقات الطبية الحيوية، بدءا من توصيل الأدوية والجينات إلى هندسة الأنسجة والتصوير الجزيئي المستهدف. طرق التنقية التقليدية من تعبير الإشريكية القولونية (E. coli) قد تكون غير فعالة لعلاج ELP بسبب تكوين أجسام احتواء. طرق أخرى، مثل دورة الانتقال العكسي (ITC)، تستخدم خصائص درجة حرارة المحلول الحرجة المنخفضة (LCST) لمادة ELP لفصله عن الملوثات مثل الدهون البوليسكاريدية (LPS)، لكنها عادة ما تتطلب عدة خطوات تسخين وتبريد تستغرق وقتا طويلا وقد تؤدي إلى استعادة منخفضة حسب تسلسل وتركيز ووزن جزيئي لتركيب ELP. لمواجهة هذه التحديات، طورنا سير عمل استخلاص وترسيب قائم على المذيب العضوي يستغل الرهاب المائي الفطري لELP لتمكين تنقية سريعة وقوية وواسعة التطبيق مباشرة من حبيبات خلايا الإشريكية القولونية . تستخدم هذه الطريقة المذيبات العضوية القطبية للمساعدة في تعطيل الخلايا وذوبان ELP بشكل انتقائي في خطوة واحدة. تقوم خطوة الترسيد التالية بإزالة المذيبات العضوية المتبقية، والشوائب منخفضة الوزن الجزيئي، والسموم الداخلية بشكل فعال، مما ينتج ELP نقي للغاية مع مستويات LPS أقل من 1 EU/mL في أقل من 3 ساعات. تشير بيانات المجهر بالقوة الذرية إلى أن بروتينات اندماج ELP المنقاة بهذه الطريقة يمكن أن تتجمع ذاتيا في هياكل شبيهة بالمسيل العكسي تحتفظ بوظيفة بروتين الاندماج. تقدم هذه الطريقة السريعة للباحثين طريقة مباشرة وقابلة للتوسع لتنقية ELP، مما يخلق إمكانيات جديدة لاستخدام ELP وبروتيناته كبنات مرنة للتطبيقات الطبية والمادية.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الببتيدات الشبيهة بالإيلاستين (ELPs) هي بوليمرات حيوية تتكون من زخارف متكررة (VPGXG) 1,2,3,4,5,6,7,8,9. يمكن أن يكون بقايا الضيف X في وحدة البنتابيتيد أي حمض أميني غير البرولين. يمكن استخدام التغيرات في X لضبط الكراهية للماء، وسلوك الانتقال الحراري، والخصائص الوظيفية لبناء ELP لإنشاء مواد متوافقة حيويا معيارية تم استكشافها على نطاق واسع....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. تحضير المواد

  1. السلالة البكتيرية: استخدم الخلايا الكيميائية المؤهلة للتعبير عن الإشريكية القولونية BL21(DE3) كعميل تعبير.
    ملاحظة: تم اختيارها بسبب كفاءتها العالية في التحول وملاءمتها لإنتاج البروتينات المؤتلفة.
  2. البلازميد التعبيري: استخدم متجه pET21(+) يشفر بروتين اندماج ELP-I-Cm2 مع مقاومة للأمبيسيلين9. اشتر ناقل البلازميد من Addgene. أدخل جين Cm2 باستخدام موقع BsrG I في نهاية الإنتين.
    ملاحظة: تسلسل الحمض النووي البلازميدي لهذا البروتين مقدم في الملف التكميلي 1.
  3. وسائط النمو: تحضير وسائط المرق الرائع (TB) لوسائط 1200 مل
    1. ت....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بعد المرور بالمراحل النهائية من البروتوكول، الخطوة التالية هي تصور نتيجة الاستخلاص والهطول من خلال تحليل SDS-PAGE وتلوين كوماسي الأزرق. عندما يكون هناك خطوة تحلل قبل الاستخلاص العضوي، يجب أن يكون هناك شريط ELP بارز. في حالة ELP-I-Cm2، يظهر هذا النطاق عند 100 كيلو دالتون (الشكل 3A).

أظهرت عمليات فحص تركيبات المذيبات العضوية المختلفة كفاءة استخلاص متغيرة (الشكل 3B)، حيث أنتج كل تركيبة تركيزات ونقاء مختل.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم استخدام ITC سابقا للتنقية غير الكروماتوغرافية ل ELP19؛ ومع ذلك، قد تكون طريقة تستغرق وقتا طويلا وذات عائد منخفض. في الطرق المفصلة أعلاه، نصف نهجا لتنقية بروتين اندماج ELP-I-Cm2 السريع، موضحين كيف يمكن استخدام طريقة الاستخلاص والترسيب المعتمدة على المذيب العضوي بفعالية لتنقية مجموعة واسعة من اندماجات ELP وELP. بروتوكول المذيب العضوي ليس فقط أسرع من ITC، بل هو أيضا أكثر فعالية بكثير لتسلسلات ELP القصيرة التي يمكن أن تتحدى طريقة ITC. قد يكون أيضا بديلا أكثر قابلية.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر معهد جامعة بوردو لأبحاث السرطان وبرنامج CCSG التابع للمعاهد الوطنية للصحة (CA23168) على دعمهم لهذا العمل.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
2-ميركابتوإيثانولبيو-راد161-0710مكون SDS-PAGE
30٪ أكريلاميد/بيس-أكريلاميدTCIA3218مكون SDS-PAGE
الأسيتونفيشر ساينتيفكA949مذيب عضوي
الأسيتونيتريلفيشر ساينتيفكA996مذيب عضوي
أمبيسيلينبيولوجيا الذهب - التكنولوجيا الحيوية للذهبA-301-25المضاد الحيوي
APS (بيرسلفات الأمونيوم)بيو-راد1610700مكون SDS-PAGE
بوتانولفيشر ساينتيفكL13171مذيب عضوي
EDTAكواشف فيشر الحيويةBP118-500مكون مخزن التحلل
الإيثانولمختبرات ديكونUN1170مذيب عضوي
إيثيل أسيتاتفيشر ساينتيفكE195مذيب عضوي
الجلسرولمنتجات البحث الدوليةG22020-0.5مكون وسائط المرق الرائع (TB)
حمض الهيدروكلوريكفيشر ساينتيفكA144SI-212مكون مخزن التحلل
صبغة كوماسي الفوريةأبكامab119211مكون SDS-PAGE
IPTGبيولوجيا الذهب - التكنولوجيا الحيوية للذهب12481C25مكون تعبير البروتين
إيزوبوبانولفيشر ساينتيفكA451-1مذيب عضوي
K2HPO4 (فوسفات البوتاسيوم أحادي القاعدة)علوم الواردز470302-246الجزء 2 مكون المخزن المؤقت
KH2PO4 (فوسفات بوتازيوم ديبيسيش)علوم الواردز470302-254الجزء 2 مكون المخزن المؤقت
إل-برولينمنتجات البحث الدوليةP5200-500.0مكون وسائط المرق الرائع (TB)
ليسوزيمبيولوجيا الذهب - التكنولوجيا الحيوية للذهبL-040-1مكون مخزن التحلل
الميثانولفيشر ساينتيفكA452مذيب عضوي
مخزن العينات الأصليبيو-راد161-0738مكون SDS-PAGE
سلم البروتينبيولوجيا الذهب - التكنولوجيا الحيوية للذهبP008-500مكون SDS-PAGE
محلول الجل المؤقتبيو-راد1610798مكون SDS-PAGE
كبريتات الصوديم الدودسيل (SDS)ثيرمو ساينتفيكJ18220-36مكون SDS-PAGE
هيدروكسيد الصوديومفيشر ساينتيفكS318-500مكون مخزن التحلل
مخزن جل التكديسبيو-راد1610799مكون SDS-PAGE
TEMEDبيو-راد1610801مكون SDS-PAGE
قاعدة تريسكواشف فيشر الحيويةBP-152مكون مخزن التحلل
التريبتونمنتجات البحث الدوليةT60065-1000.0مكون وسائط المرق الرائع (TB)
مستخلص الخميرةمنتجات البحث الدوليةY20025-1000.0مكون وسائط المرق الرائع (TB)

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Despanie, J., Dhandhukia, J. P., Hamm-Alvarez, S. F., MacKay, J. A. Elastin-like polypeptides: therapeutic applications for an emerging class of nanomedicines. J Control Release. 240, 93-108 (2016).
  2. MacEwan, S. R., Chilkoti, A. Applications of elastin-like ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Elastin Like PolypeptidesELP PurificationOrganic Solvent ExtractionProtein PrecipitationE Coli ExpressionInclusion BodiesEndotoxin RemovalSDS PAGE AnalysisFusion Protein ActivitySelf Assembling Nanoparticles

Related Articles