مقالة منهجية

التصنيع الدقيق للركائز ذات التدرجات الصلابة المجهرية لتوجيه هجرة الخلايا اللحمية لنخاع العظم

DOI:

10.3791/69473

⸱

نوفمبر 14, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Oral & Maxillofacial Reconstruction and Regeneration, Key Laboratory of Oral Biomedicine Ministry of Education, Hubei Key Laboratory of Stomatology, School & Hospital of Stomatology, Wuhan University, 2School of Power and Mechanical Engineering, The Institute of Technological Science, Wuhan University, 3Department of Oral Implantology, School and Hospital of Stomatology, Wuhan University

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوضح هذا البروتوكول بالتفصيل تصنيع ركيزة ثنائية الطبقة من البولي ديميثيل سيلوكسان (PDMS) عبر الطباعة الحجرية الناعمة. تستخدم الطريقة الهياكل المجهرية المعدلة هندسيا في طبقة سفلية صلبة جنبا إلى جنب مع طبقة علوية مسطحة ناعمة لتوليد تدرجات صلابة فعالة على نطاق صغير ، مما يتيح دراسات علم الأحياء الميكانيكية الخلوية دون تداخل طبوغرافي.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعد فهم كيفية استجابة الخلايا للإشارات الميكانيكية أمرا بالغ الأهمية لتوضيح الآليات التي ينطوي عليها نمو الأنسجة وتطور المرض. ومع ذلك ، غالبا ما تفشل ركائز زراعة الخلايا الموجودة في المختبر في تكرار تدرجات الصلابة الفسيولوجية على النطاق الخلوي مع القضاء أيضا على الإشارات الطبوغرافية المربكة. في هذه الدراسة ، نقدم نموذج صلابة منفصل باستخدام ركيزة ثنائية الطبقة من ثنائي ميثيل سيلوكسان (PDMS). تتكون هذه الركيزة من طبقة ناعمة ومسطحة معلقة فوق طبقة سفلية صلبة تتميز بهياكل مجهرية ذات سلسلة من التلال والأخدود. تنقل الطبقة العليا بشكل فعال اختلافات الصلابة في الهيكل الأساسي مع الحفاظ على تضاريس وكيمياء موحدة على سطح ملامسة الخلية. يتم تحقيق تعديل الصلابة عن طريق تغيير عرض الحواف والأخاديد المتناوبة ، والتي يتم تباعدها بالتساوي. أكد المجهر الإلكتروني الماسح مورفولوجيا السطح المسطح وتضاريس التلامس المتسقة. أظهر الفحص المجهري للقوة الذرية أن تغيرات الصلابة كانت تعتمد على البنية المجهرية: بالنسبة لأنماط 20 ميكرومتر ، كانت المعامل المرنة حوالي 950 كيلو باسكال للتلال و 850 كيلو باسكال للأخاديد. بالنسبة لأنماط 50 ميكرومتر ، كانت هذه القيم حوالي 1070 كيلو باسكال و 950 كيلو باسكال على التوالي. التزمت خلايا نخاع العظم الأولية للفأر جيدا وانتشرت على الركيزة ، مما يدل على تفضيل التوطين النووي نحو مناطق التلال الأكثر صلابة في نمط 50 ميكرومتر (61.49٪ ، ص < 0.05) ، وبالتالي تأكيد الإدراك الخلوي الفعال للتدرج الميكانيكي. باختصار ، يقدم هذا البروتوكول طريقة قابلة للتكرار لبناء ركيزة زراعة الخلايا بتدرجات صلابة صغيرة الحجم ، مما يقلل من التداخل الكيميائي أو الطبوغرافي ، مما يتيح إجراء تحقيقات في النقل الميكانيكي للخلية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تتمتع الخلايا بالقدرة على استشعار المحفزات الميكانيكية والاستجابة لها داخل بيئتها المكروية الخارجية1،2،3 ، والتي تعتبر ضرورية لتنظيم العمليات الخلوية المختلفة ، بما في ذلك الالتصاق والهجرة والتكاثر والتمايز4. في الجسم الحي ، تظهر الخصائص الميكانيكية للبيئة المكروية للأنسجة عدم تجانس مكاني كبير ، مع وجود اختلافات في تصلب المصفوفة لوحظت في كل من السياقات الفسيولوجية - مثل تقاطعات العظام والعضلات - وفي الظروف المرضية ، مثل الأورام5،6،7. يعد التحقيق الشامل لهذه العوامل الميكانيكية أمرا ضروريا لفهم الآليات التنظيمية التي تحكم سلوك الخلية. هذه الآليات محورية في عمليات مثل نمو الأنسجة وتطور المرض وعملية التجديد والإصلاح8،9.

لمحاكاة هذه البيئة الدقيقة الميكانيكية المعقدة في المختبر ، تستخدم الهلاميات المائية أو اللدائن على نطاق واسع لإنشاء ركائز ذات صلابة متفاوتة عن طريق ضبط درجة الربط المتقاطع أو نسبة المكونات3،10،11،12،13. ومع ذلك ، غالبا ما تؤدي هذه الطرق إلى تغييرات منفصلة في الصلابة التي تفشل في إعادة إنتاج تدرجات الصلابة المستمرة الدقيقة التي تحاكي بدقة الظروف الفسيولوجية13،14،15،16،17. استكشفت الدراسات الحديثة تقنيات مثل الربط المتقاطع البصري (على سبيل المثال ، استخدام قناع ضوئي لتنظيم التعرض للأشعة فوق البنفسجية) 18 ، والخلط متعدد القنوات الموائع الدقيقة19،20 ، والوسائل المدفوعةبالانتشار 21 لبناء تدرجات الصلابة. لسوء الحظ ، يمكن أن تكون هذه الأساليب معقدة من الناحية الفنية وتقدم متغيرات إضافية ، مثل حجم الشبكة22 ، والتورم23،24 ، والتضاريس25. يؤدي إدخال عوامل الاضطراب إلى تعقيد تفسير الاستجابات الخلوية للتصلب. تم اعتماد نظام PDMS ثنائي الطبقة ، باستخدام مصفوفات العمود الدقيق أو أنماط رقعة الشطرنج كهيكل دعم ، لإنشاء ركائز زراعة الخلايا بتدرجات صلابة26،27. تعتمد هذه الأساليب على دعامات أساسية منفصلة تحت غشاء متجانس كيميائيا لتحقيق تعديل صلابة متناحي الخواص ، مما يوفر منصات قيمة للتحقيق في التصاق الخلية وانتشارها. ومع ذلك ، فإن البيئة المكروية الخلوية الأصلية في الجسم الحي غالبا ما تكون متباينة الخواص للغاية في خصائصها الميكانيكية28،29. يفترض أن هذه الإشارات الميكانيكية الاتجاهية تؤثر بشكل عميق على الأحداث البيولوجية الأساسية. لذلك ، فإن استراتيجيات التصنيع الحيوي الحالية محدودة في قدرتها على تكرار تفاعلات صلابة الخلية الدقيقة التي لوحظت في الجسم الحي ، والتي تعتمد على المحاكاة بدقة لتدرجات الصلابة على نطاق صغير وعدم التجانس المكاني داخل الركائز المحملة بالخلايا.

أظهرت الأبحاث السابقة أن الخلايا يمكن أن تدرك الصلابة الفعالة للأجسام الصلبة حتى عندما لا تكون في اتصال خلوي مباشر30. بناء على هذه الدراسة ، نقدم ركيزة جديدة لزراعة الخلايا ثنائية الطبقة (PDMS) التي تولد تدرجات صلابة خاضعة للرقابة على المقاييس المكانية تتراوح من 5 إلى 50 ميكرومتر ، بما يتماشى مع نطاق الحجم ذي الصلة بالاستشعار الميكانيكي تحت الخلوي والخلية الواحدة. تتكون الركيزة من طبقتين متميزتين: طبقة سفلية صلبة PDMS تتميز بهياكل مجهرية هندسية قابلة للضبط وطبقة علوية PDMS ناعمة موحدة ومسطحة تعمل كسطح ملامس للخلايا. يسمح هذا التصميم بالتعديل الميكانيكي فقط من خلال الاختلافات في هندسة البنية التحتية ، مع الحفاظ على كيمياء السطح والتضاريس المتسقة. وبالتالي ، فإنه يفصل بشكل فعال إشارة الصلابة عن الإشارات الفيزيائية والكيميائية الأخرى ، مما يوفر نظاما أكثر صلة بيولوجيا لتعديل الصلابة.

على عكس الركائز التقليدية القائمة على الهيدروجيل ، يتيح نهجنا دراسات ميكانيكية أحادية المتغير دون تدخل من التورم أو حجم الشبكة أو طوبولوجيا السطح. الركيزة سهلة التصنيع باستخدام الطباعة الحجرية الناعمة القياسية وقابلة للتكرار بدرجة كبيرة31. كما أنه متوافق مع الفحص المجهري عالي الدقة ، مما يجعله مناسبا بشكل خاص للتصوير في الوقت الحي والدراسات الكمية للاستجابات الخلوية لإشارات الصلابة المجهرية. تقدم هذه المخطوطة بروتوكول التصنيع الكامل ، وتوضح بالتفصيل استراتيجية التحكم في المعلمات ، وتوضح فائدة الركيزة مع تجارب زراعة الخلايا التمثيلية. في النهاية ، يوفر هذا النهج أداة قوية ويمكن الوصول إليها في المختبر لاستكشاف استجابات الخلايا لتدرج الصلابة على نطاق صغير.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم عزل الخلايا اللحمية الأولية لنخاع عظم الفئران (mBMSCs) من الظنبوب وعظم الفخذ للفئران (No. WP20230204 ، تمت الموافقة عليها من قبل لجنة الأخلاقيات في مركز جامعة ووهان للتجارب على).

1. تحضير القالب الرئيسي

ملاحظة: بروتوكولاتنا خاصة بمقاومة الضوء السلبية القائمة على الإيبوكسي المستخدمة خلال هذا البحث.

  1. ضع رقاقة سيليكون نظيفة (50.8 ± 0.2 مم ، <100> موجهة ، 525 ± 25 ميكرومتر) على لوح التسخين لبضع دقائق حتى تجف.
  2. خذ رقاقة سيليكون واحدة من لوح التسخين وقم بتبريدها إلى درجة حرارة الغرفة قبل الشروع في طلاء الدوران. ضع 3-5 مل من مقاومة الضوء على مركز الرقاقة.
  3. للحصول على ارتفاع خاصية يبلغ 20 ميكرومتر ، قم بتطبيق بروتوكول الدوران التالي: الدوران لمدة 10 ثوان عند 7.1 جم × ، متبوعا بالدوران عند 410 × جم لمدة 30 ثانية. للحصول على ارتفاع ميزة يبلغ 30 ميكرومتر ، قم بتطبيق بروتوكول الدوران التالي: الدوران لمدة 10 ثوان عند 7.1 × جم ، متبوعا بالدوران عند 170 × جم لمدة 30 ثانية. استخدم مشرطا بعناية لإزالة أي حبة حافة قد تتشكل أثناء الطلاء الدوراني.
  4. اخبز طريا بالطريقة التالية: اضبط لوح التسخين على 95 درجة مئوية ، واترك الرقاقة تجلس على لوح التسخين لمدة 13 دقيقة. أخرج الرقاقة من لوح التسخين واتركها تبرد إلى درجة حرارة الغرفة بشكل طبيعي ، مع تجنب الانخفاض المفاجئ في درجة الحرارة.
  5. قم بمحاذاة القناع الضوئي على الرقاقة المطلية بمقاومة الضوء وقم بتعريضها للأشعة فوق البنفسجية بجرعة إجمالية تبلغ 120 مللي جول / سم2.
  6. اخبز بعد التعرض بالطريقة التالية: باستخدام لوحين للتسخين(65 درجة مئوية و 95 درجة مئوية) ، اسمح للرقاقة المطلية بمقاومة الضوء بالجلوس على لوح التسخين 65 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة قبل نقلها إلى لوح التسخين 95 درجة مئوية وتركها هناك لمدة 5 دقائق. انقل الرقاقة إلى كومة من الأنسجة المصنوعة من الألياف الدقيقة واتركها تبرد إلى درجة حرارة الغرفة.
  7. قم بتطوير الرقاقة عن طريق نقلها إلى طبق بتري مليء ب PGMEA ، واغمر الرقاقة بأكملها في المطور. تسريع التطوير عن طريق التحريض اليدوي.
    ملاحظة: PGMEA قابل للاشتعال ومهيج للعينين والجهاز التنفسي. تخلص منها على أنها "نفايات عضوية قابلة للاشتعال" في حاويات مخصصة.
  8. بعد التطوير ، أخرج الرقاقة من المطور واغسلها في الأيزوبروبانول. إذا تشكل تدفق أبيض حليبي في الأيزوبروبانول بالقرب من سطح العينة (لم يكتمل التطوير) ، فقم بغمر العينة مرة أخرى في المطور مرة أخرى لإكمال عملية التطوير. اغسل العينة المطورة في الأيزوبروبانول حتى لا يتشكل تدفق أبيض حليبي بالقرب من سطح العينة. بمجرد التطوير الكامل ، اخبز المقاومة للضوء بقوة عن طريق وضع الرقاقة على لوح تسخين 150 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
  9. قم بفلور الرقاقة لعمليات الطباعة الحجرية الناعمة التالية: قم بتعريض الرقاقة لبلازما الأكسجين تحت الفراغ لمدة 30 ثانية (100 واط) لتنشيط السطح ، ثم ضعه في مجفف فراغ. قم بإسقاط 30 ميكرولتر من ثلاثي كلورو (1H ، 1H ، 2H ، 2H-tridecafluoro-n-octyl) سيلان على شريحة زجاجية موضوعة داخل مجفف الفراغ. قم بإخلاء المجفف لمدة 2 دقيقة وحافظ على حالة التفريغ لمدة 30 دقيقة. اخبزي الرقاقة على حرارة 90 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة لإكمال عملية السيلانة.
    ملاحظة: تحكم صارم في الرطوبة النسبية المحيطة أقل من 60٪ طوال العملية. يمكن أن تؤدي الرطوبة الزائدة إلى التحلل المائي السريع للسيلان ، مما يولد رواسب بولي سيلوكسان بيضاء غير متطايرة. ستضعف الرواسب توحيد توزيع بخار السيلان ، مما يؤدي إلى فشل السيلانية. قم بإجراء المعالجة في غطاء محرك السيارة حيث يتفاعل سيلان ثلاثي كلورو (1H ، 1H ، 2H ، 2H-tridecafluoro-n-octyl) بعنف مع الماء ، ويطلق أبخرة حمض الهيدروكلوريك السامة. تحييد القلويات المخففة قبل التخلص منها كنفايات عضوية مفلورة / مكلورة. تحقق عملية silanization معدل نجاح 90٪.

2. التصنيع

ملاحظة: يمكن تقسيم عملية الطباعة الحجرية الناعمة المستخدمة لتصنيع ركيزة polydimethylsiloxane ثنائية الطبقة (PDMS) إلى خطوتين متميزتين: 1) تحضير كل من الطبقة السفلية المنظمة والطبقة العليا ، 2) الترابط بين طبقتي PDMS. عائد التصنيع الإجمالي أكثر من 80٪.

  1. إعداد PDMS
    1. بالنسبة للطبقة السفلية الهيكلية ، قم بإعداد سلائف PDMS عن طريق خلط البوليمر المسبق وعامل المعالجة بنسبة 10: 1 بالوزن ، متبوعا بالتفريغ تحت الفراغ. صب 1.5 مل من سلائف PDMS (10: 1) على القالب الرئيسي SU8 ، الذي يغطي السطح بالكامل ، متبوعا بالتفريغ تحت الفراغ والراحة لمدة 30 دقيقة. انقله بحذر إلى الفرن وعالج عند 90 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. قم بإزالة القالب من الطبقة السفلية PDMS الهيكلية من القالب الرئيسي.
    2. بالنسبة للطبقة العليا ، قم بإعداد سلائف PDMS عن طريق خلط البوليمر المسبق وعامل المعالجة بنسبة 30: 1 بالوزن والتفريغ تحت الفراغ. صب سلائف PDMS على رقاقة سيليكون مفلورة. للحصول على سمك 9 ميكرومتر ، قم بتطبيق بروتوكول طلاء الدوران التالي: الدوران عند 7.1 × جم لمدة 10 ثوان ، متبوعا بالدوران عند 2,300 × جم لمدة 60 ثانية.
    3. بعد الطلاء الدوراني ، افحص بصريا فيلم PDMS تحت الضوء المحيط للتحقق من التوحيد - وفحص أي عيوب مرئية على وجه التحديد مثل الخطوط أو الفقاعات أو تراكم الحواف غير المستوية. إذا بدا الفيلم شفافا بشكل موحد مع انعكاسية ثابتة عبر سطح الرقاقة بالكامل ، فانتقل إلى الخطوة التالية ؛ إذا لم يكن الأمر كذلك ، كرر عملية طلاء الدوران باستخدام رقاقة جديدة. ضع الرقاقة المطلية على سطح مستو لضمان سمك فيلم PDMS متجانس. انقله بحذر إلى الفرن وعالج عند 90 درجة مئوية لمدة 3 ساعات.
      ملاحظة: تم الحصول على أفلام بسمك 9.11 ± 0.34 ميكرومتر.
  2. الترابط
    1. ضع الطبقة السفلية PDMS المنظمة (10: 1) مع الجانب المزخرف متجها لأسفل على فيلم الطبقة العلوية PDMS ، مما يضمن اتصالا جيدا بين الطبقتين بدون فقاعات في الواجهة.
    2. انقل المجموعة إلى الفرن وعالجها على حرارة 90 درجة مئوية لمدة 3 ساعات.
    3. اترك التجميع يبرد إلى درجة حرارة الغرفة على كومة من الأنسجة المصنوعة من الألياف الدقيقة. افصل الهيكل النهائي ذو الطبقة المزدوجة عن الرقاقة ، واحفظه في طبق بتري لمزيد من الاستخدام.
      ملاحظة: إذا تشكلت فقاعات بين الطبقة العليا والطبقة السفلية أثناء التقشير ، فعادة ما يشير ذلك إلى التصاق غير مكتمل بين الطبقتين. تأكد من التفريغ الشامل لسلائف PDMS قبل الطلاء الدوراني ، وتحقق من خلو سطح الفيلم من الغبار أو الملوثات قبل تطبيق الطبقة السفلية PDMS للتلامس الكامل. تأكد من أن رقاقة السيليكون مستوية أثناء الطلاء والتجميع والمعالجة. قد يحدث تمزق الفيلم بسبب السيلانية غير المتساوية للرقاقة أو سمك PDMS غير المنتظم. لحل المشكلة ، تحكم صارم في الرطوبة البيئية أثناء السيلانية تحت 60٪ رطوبة نسبية. تحقق عملية silanization معدل نجاح 90٪.

3. التوصيف

  1. الفحص المجهري الإلكتروني الماسح (SEM)
    1. قطع العينة بشفرة حادة للحصول على حواف نظيفة.
    2. قم بتركيب العينات على مراحل 90 درجة و 0 درجة SEM باستخدام شريط كربوني موصل لتمكين توصيف المقطع العرضي والسطحي ، على التوالي.
    3. قم بتغطية العينات بالذهب لمدة 120 ثانية لتحسين جودة تصوير SEM وجمع صور SEM للعينات.
  2. مجهر القوة الذرية (AFM)
    ملاحظة: حدد مسبار ScanAsyst-Air لرسم الخرائط الميكانيكية النانوية الكمي للمعامل.
    1. ضع طرف ناتئ AFM في منتصف حقل العرض. ضع بقعة الليزر في نهاية الكابولي عن طريق محاذاة نظام الرافعة البصرية.
    2. قبل قياسات رسم الخرائط النانوية الميكانيكية الكمية من PeakForce (PeakForce QNM) ، قم بمعايرة ناتئ AFM لتحديد المعلمات الأساسية التالية: ثابت زنبرك ناتئ: 0.40135 نيوتن / م ؛ حساسية الانحراف: 28.993 نانومتر / فولت (يتم تحديدها عن طريق إجراء منحنى قوة على عينة مرجعية صلبة) ؛ نصف قطر الطرف: ~ 21 نانومتر (تمت معايرته باستخدام الطريقة النسبية مقابل عينة مرجعية ذات معامل معروف).
    3. ضمن لوحة المسح الضوئي في قائمة معلمات المسح الضوئي ، قم بتكوين إعدادات المسح الأولي التالية: اضبط حجم المسح الضوئي على 70 ميكرومتر للعينات التي تتميز بخطوط دورية مع تباعد 50 ميكرومتر. اضبط حجم المسح الضوئي على 50 ميكرومتر للعينات التي تتميز بخطوط دورية مع تباعد 20 ميكرومتر. اضبط Samples/Line and Lines على 256 (مما ينتج عنه صورة 256 × 256 بكسل).
    4. افتح إعدادات التفاعل في المجهر واضبط نقطة ضبط Peak Force Engage الافتراضية للأداة في معلمات المشاركة.
    5. انقر فوق أيقونة المشاركة على شريط أدوات سير العمل واستمر في مراقبة إشارات الوقت الفعلي أثناء النهج التلقائي.
    6. تأكد من ضبط التحكم التلقائي في ScanAsyst على الوضع الفردي. اضبط نقطة ضبط PeakForce على قيمة مناسبة لتحقيق نطاق التشوه المطلوب: بالنسبة للطبقة العليا، تكون نقطة ضبط PeakForce هي 0.020 nN; بالنسبة للطبقة السفلية المنظمة ، تكون نقطة ضبط PeakForce هي 5 nN.
    7. ابدأ الفحص بالنقر فوق الأزرار من أعلى إلى أسفل أو من أسفل إلى أعلى .
    8. مراقبة وتصحيح منحنى القوة: إذا ظهرت منحنيات القوة مشوهة أو لوحظت مشكلات في المزامنة (على سبيل المثال ، أشكال غير منتظمة ، خطوط أساس غير متناسقة) ، انقر بزر الماوس الأيمن داخل نافذة Force Monitor وحدد التكوين التلقائي لتصحيح محاذاة منحنى القوة وحساسيتها تلقائيا.
    9. ضمن إعدادات قناة حساب المعامل ، حدد نموذج DMT ليناسب جزء التراجع من منحنى القوة لحساب معامل المرونة.
    10. انقر فوق زر الالتقاط للحصول على التضاريس عالية الدقة وخريطة الخصائص النانوية الميكانيكية وحفظها.
    11. قم بإجراء تحليل ما بعد الاستحواذ باستخدام برنامج معالجة وتحليل الصور AFM. افتح ملفات بيانات AFM المحفوظة واستخرج قيم المعامل عن طريق تحديد المناطق عبر سطح العينة. احسب متوسط معامل المعامل والانحراف المعياري وملفات تعريف التوزيع لكل من الطبقة العليا والطبقة السفلية باستخدام أدوات التحليل الإحصائي المضمنة في البرنامج. تصدير خرائط معامل معالجة وبيانات كمية.
    12. عدد عمليات مسح AFM لكل عينة: قم بإجراء ثلاث عمليات مسح مستقلة لكامل المنطقة لكل عينة. تأكد من أن كل مسح يغطي منطقة تطابق حجم الميزة الهيكلية للعينة ، 70 ميكرومتر × 70 ميكرومتر للعينات ذات الخطوط الدورية المتباعدة 50 ميكرومتر ، و 50 ميكرومتر × 50 ميكرومتر لتلك التي تحتوي على خطوط متباعدة بمقدار 20 ميكرومتر. لقياسات معامل الهيكل الأساسي (10: 1 PDMS) وفيلم الطبقة العليا (30: 1 PDMS) ، قم بتنفيذ استراتيجية أخذ العينات التالية لضمان موثوقية البيانات.
      1. فيلم الطبقة العليا (30: 1 PDMS): قم بقياس المعامل 2x بشكل مستقل مع كل قياس يتكون من مسحتين غير متداخلتين 5 ميكرومتر × 5 ميكرومتر.
      2. الهيكل الأساسي (10: 1 PDMS): بالنظر إلى تكوينيه الشريطيين الدوريين المتميزين (تباعد 20 ميكرومتر و 50 ميكرومتر) ، قم بقياس المعامل 2x بشكل مستقل لكل تكوين.

4. تجربة زراعة الخلايا في المختبر

ملاحظة: PDMS هي مادة كارهة للماء تحتاج إلى الطلاء لتعزيز التصاق الخلايا قبل زراعة الخلايا ، ويجب اختيار طريقة الطلاء المناسبة وفقا لنوع الخلية. يجب الحصول على الموافقة الأخلاقية إذا تم استخدام الخلايا الأولية للتجربة الخلوية.

  1. طلاء بولي دي يسين (PDL)
    1. تعقيم الركيزة عن طريق الغمر بالكحول لمدة 10 دقائق ؛ ثم اغسلها لمدة 3 × 5 دقائق باستخدام PBS.
    2. قم بإذابة PDL (الوزن الجزيئي 150,000 إلى 300,000 دالتون) باستخدام PBS بتركيز 0.1 مجم / مل. بالنسبة للركيزة ذات حجم اللوحة المكونة من 24 بئرا ، أضف 1 مل من محلول عمل PDL وضعه في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 4 ساعات لتغطية سطح الركيزة بالكامل.
    3. بعد اكتمال الطلاء ، قم بإزالة محلول عمل PDL ، وقم بإزالة أي PDL متبقي عن طريق غسله 3x باستخدام PBS. استخدم الركيزة لتجارب الخلايا اللاحقة. إذا لم يتم استخدام الطلاء على الفور ، جففه واحفظه عند 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: قدم الطلاء الناجح سطحا متجانسا عديم الملامح تحت الفحص المجهري التباين الطور ، مع عدم وجود رواسب بلورية مرئية أو قطع أثرية جافة. تم التخلص من الركائز التي تحتوي على أي علامات تبلور أو طلاء غير منتظم.
  2. عزل وزراعة الخلايا اللحمية الأولية لنخاع عظم الفأر (mBMSCs)
    1. عزل الخلايا اللحمية الأولية لنخاع عظم الفأر (mBMSCs) من الظنبوب وعظم الفخذ للفئران.
    2. زراعة الخلايا في وسط نمو يتكون من α-MEM مكمل ب 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) ، 1٪ مضاد حيوي مضاد للفطريات ، و 1٪ بيروفات الصوديوم.
    3. الخلايا البذرية عند المرور 3 على الركائز التي تم الحصول عليها في الخطوة 4.1.3 بكثافة 5,000 خلية / سم2 لتقليل التأثيرات المربكة المحتملة من ملامسة الخلية.
  3. تلطيخ التألق المناعي والتصوير
    1. بعد 16 ساعة من الثقافة (37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون2) ، قم بتثبيت الخلايا بنسبة 4٪ بارافورمالديهايد لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة واغسلها 3 مرات باستخدام PBS. بعد ذلك ، تخلل الخلايا بنسبة 0.1٪ Triton X-100 لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة واغسلها 3x باستخدام PBS.
    2. لتصور الهيكل الخلوي ، قم بتلطيخ F-actin باستخدام الفالويدين (تخفيف 1: 500) لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، واغسله 3 مرات باستخدام PBS وافر لإزالة أي صبغة متبقية.
    3. قم بتركيب الركيزة مع تلطيخ متزامن لنوى الخلية. ضع قطرة من الجلسرين مع DAPI لتغطية الخلايا. بعد ذلك ، ضع غطاء بعناية أعلى الركيزة وأغلق الهوامش باستخدام طلاء الأظافر. تجنب الفقاعات قدر الإمكان.
    4. الحصول على صور مضان تلتقط التشكل الخلوي وتحديد المواقع النووية باستخدام مجهر مضان مقلوب.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم استخدام الطباعة الحجرية الضوئية لتصنيع قوالب رئيسية من السيليكون قابلة لإعادة الاستخدام تتميز بهياكل مجهرية متوازية من التلال والأخدود. تم إنشاء تصميمين ، يتميزان بعرض الأخدود (عرض التلال مطابق لعرض الأخدود) من 20 و 50 ميكرومتر ، على التوالي. يبلغ قياس كل منطقة منقوشة 7 مم × 7 مم. أدت دقة قوالب السيليكون وإعادة استخدامها إلى تبسيط عملية تصنيع الركيزة المتكررة بشكل كبير. ثم تم استخدام القالب الرئيسي لتكرار الهياكل المجهرية في PDMS. تم تشكيل تركيبة PDMS الصلبة مقابل السيليكون لإنشاء الطبقة السفلية ، والتي تم ربطها لاحقا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تقدم هذه الدراسة نهجا جديدا لهندسة ركيزة ثنائية الطبقة قائمة على PDMS مصممة لإدخال اختلافات صلابة موضعية مع الحفاظ على سطح طبوغرافي موحد عديم الملامح. يسمح هذا النهج بالتعديل الميكانيكي فقط من خلال الاختلافات في هندسة البنية التحتية ، مع الحفاظ على كيمياء السطح والتضاريس المتسقة. وبالتالي ، فإنه يفصل بشكل فعال إشارة الصلابة عن الإشارات الفيزيائية والكيميائية الأخرى ، مما يوفر نظاما أكثر صلة بيولوجيا لتعديل الصلابة.

في هذه الدراسة ، يتم تحقيق تعديل الصلابة عن ط...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذه الدراسة ماليا من قبل صناديق البحوث الأساسية للجامعات المركزية في الصين (رقم 2042024YXB018 إلى W. Ji).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
  4٪ بارافورمالديهيدتقنية سيرفيسبايوG1101
أسيتونشنغهاي علاء الدين10000418
مضاد المعارضينجيبكو15240-062مضاد حيوي-مضاد فطريات
وسيط تركيب مضاد التدرج مع DAPIبيوتايم بيوتكنولوجيP0131الجلسرين مع DAPI 
لوحة زراعة الخلاياعش70200124 بئرا
جهاز إزالة المجففشركة سيتشوان شوبو (المجموعة) المحدودة913354-30SNالقطر الداخلي = 180 مم
مصل الأبقار الجنينيهايكلونSV30208.02
مجهر الفلورة المقلوبأوليمبوسDP74
إيزوبوبانولشنغهاي علاء الدين80109218GC≥ 99.7%
تقوية القناعشركة سيتشوان نانغوانغ لتقنية الفراغ المحدودةH94-37
تعديل MEM ألفاهايكلونSH30265.01
تحليل النانوسكوببروكرالإصدار 3.0برنامج معالجة وتحليل الصور AFM.
نظام التصوير عالي المحتوى أوبرا فينيكس بلسبيركين إلمر2400L23248 مجهزة بهدف جوي 10 أضعاف
PGMEAشركة سوتشو للتكنولوجيا النانوية الدقيقة المحدودة171011-1المطور السلبي فوتوريست؛ المواصفات: UL; النسبة المئوية: min99.7٪
فالويدينUelandy YP0052L594-فالويدين
محلول ملحي مخزن بالفوسفاتهايكلونSH30256.01
منظف البلازماتكنولوجيا البلازما (ألمانيا)فليكتو 10 
بولي-دي-ليسينبيوتايم بيوتكنولوجيST508رقم CAS 27964-99-4
مجهر المجسات الماسحةبروكرأيقونة البعديستخدم برنامج التحكم في النانوسكوب، بما في ذلك مساحات العمل التجريبية للتخطيط النانوي الميكانيكي الكمي من PeakForce (PF-QNM) ومساحات العمل التجريبية بتقنية التوجيه والتصويب.
نصيحة السيليكون حول رافعة النتريدبروكرسكاناسيست-يتميز المسبار بأنبوب واحد على شكل حرف V مطلى ب Al reflex; k= 0.4 N/m (اسمي)، f0 = 70 كيلوهرتز.
رقائق السيليكونشركة شنتشن للتكنولوجيا الصارمة المحدودة-50.8&00 وأكثر; قطر 0.3 مم، (100) مجهز، 525&n; 25 & mu; سمك m
بيروفيات الصوديومجيبكو11360-070
طبقة الطلاء الدوارةمعهد الإلكترونيات الدقيقة التابع للأكاديمية الصينية للعلومKW-4A
SU-8 3025شركة سوتشو للتكنولوجيا النانوية الدقيقة المحدودة-المقاومة الضوئية السلبية؛ 72.3٪ من المواد الصلبة؛ اللزوجة 4400؛ الكثافة 1.143 جرام/مل
مجموعة سيلغارد 184 سيليكون إيلاستومرشركة داو للكيماويات01673921
ثلاثي كلورو (1H,1H,2H,2H-ترايديكافلوورو-ن-أوكتيل)سيلانشنغهاي علاء الدين78560-45-9
ترايتون X-100BioFroxx1139ML1000.1٪ ترايتون X-100 للنفاذية
تريبسين-إيدتاجيبكو25200-0720.25٪ تريبسين-إيدتا (مرة واحدة)
فرن التفريغميميرت (ألمانيا) VO 200 

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Vining, K. H., Mooney, D. J. Mechanical forces direct stem cell behaviour in development and regeneration. Nat Rev Mol Cell Biol. 18 (12), 728-742 (2017).
  2. Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. L. Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate. Science. 310 (5751), 1139-1143 (2005).
  3. Yeung, T., et al. Effects of substrate stiffness on cell morphology, cytoskeletal structure, and adhesion. Cell Motil Cytoskeleton. 60 (1), 24-34 (2005).
  4. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
  5. Deymier, A. C., et al. Micro-mechanical properties of the tendon-to-bone attachment. Acta Biomater. 56, 25-35 (2017).
  6. Wang, Z., et al. Multi-omics investigations revealed underlying molecular mechanisms associated with tumor stiffness and identified sunitinib as a potential therapy for reducing stiffness in pituitary adenomas. Front Cell Dev Biol. 10, 820562(2022).
  7. Stylianou, A., Voutouri, C., Mpekris, F., Stylianopoulos, T. Pancreatic cancer presents distinct nanomechanical properties during progression. Ann Biomed Eng. 51 (7), 1602-1615 (2023).
  8. Cambria, E., et al. Linking cell mechanical memory and cancer metastasis. Nat Rev Cancer. 24 (3), 216-228 (2024).
  9. Mittelheisser, V., et al. Evidence and therapeutic implications of biomechanically regulated immunosurveillance in cancer and other diseases. Nat Nanotechnol. 19 (3), 281-297 (2024).
  10. Sridharan, R., Cavanagh, B., Cameron, A. R., Kelly, D. J., O'Brien, F. J. Material stiffness influences the polarization state, function and migration mode of macrophages. Acta Biomater. 89, 47-59 (2019).
  11. Yi, B., Xu, Q., Liu, W. An overview of substrate stiffness guided cellular response and its applications in tissue regeneration. Bioact Mater. 15, 82-102 (2022).
  12. Engler, A., et al. Substrate compliance versus ligand density in cell on gel responses. Biophys J. 86 (1), 617-628 (2004).
  13. Song, Y., et al. Biphasic regulation of epigenetic state by matrix stiffness during cell reprogramming. Sci Adv. 10 (7), eadk0639(2024).
  14. Taufalele, P. V., et al. Matrix stiffness enhances cancer-macrophage interactions and M2-like macrophage accumulation in the breast tumor microenvironment. Acta Biomater. 163, 365-377 (2023).
  15. Xie, J., Bao, M., Hu, X., Koopman, W. J. H., Huck, W. T. S. Energy expenditure during cell spreading influences the cellular response to matrix stiffness. Biomaterials. 267, 120494(2021).
  16. Wu, B., et al. Stiff matrix induces exosome secretion to promote tumour growth. Nat Cell Biol. 25 (3), 415-424 (2023).
  17. Driscoll, T. P., et al. Integrin-based mechanosensing through conformational deformation. Biophys J. 120 (20), 4349-4359 (2021).
  18. Sunyer, R., Jin, A. J., Nossal, R., Sackett, D. L. Fabrication of hydrogels with steep stiffness gradients for studying cell mechanical response. PLoS One. 7 (10), 9(2012).
  19. Soliman, B. G., et al. Droplet-based microfluidics for engineering shape-controlled hydrogels with stiffness gradient. Biofabrication. 16 (4), 045026(2024).
  20. Kosmidis Papadimitriou, A., et al. Fabrication of gradient hydrogels using a thermophoretic approach in microfluidics. Biofabrication. 16 (2), 025023(2024).
  21. Isomursu, A., et al. Directed cell migration towards softer environments. Nat Mater. 21 (9), 1081-1090 (2022).
  22. Xia, J., et al. Regulation of cell attachment, spreading, and migration by hydrogel substrates with independently tunable mesh size. Acta Biomater. 141, 178-189 (2022).
  23. Caliari, S. R., Burdick, J. A. A practical guide to hydrogels for cell culture. Nat Methods. 13 (5), 405-414 (2016).
  24. Li, X., et al. 3D culture of chondrocytes in gelatin hydrogels with different stiffness. Polymers. 8, 269(2016).
  25. Yang, Y., Wang, K., Gu, X., Leong, K. W. Biophysical regulation of cell behavior-cross talk between substrate stiffness and nanotopography. Engineering. 3 (1), 36-54 (2017).
  26. Lee, S., Hong, J., Lee, J. Cell motility regulation on a stepped micro pillar array device (SMPAD) with a discrete stiffness gradient. Soft Matter. 12 (8), 2325-2333 (2016).
  27. Hong, J., Lee, S., Park, S., Lee, J. Micro checkerboard patterned polymeric surface with discrete rigidity for studying cell migration. J Micromech Microeng. 25 (4), 045012(2015).
  28. Mostert, D., Van Der Putten, C., Sahlgren, C. M., Kurniawan, N. A., Bouten, C. V. C. Bioengineering structural anisotropy in living tissues. Nat Rev Bioeng. 3 (9), 727-741 (2025).
  29. Khuu, N., Kheiri, S., Kumacheva, E. Structurally anisotropic hydrogels for tissue engineering. Trends Chem. 3 (12), 1002-1026 (2021).
  30. Buxboim, A., Rajagopal, K., Brown, A. E., Discher, D. E. How deeply cells feel: methods for thin gels. J Phys: Condens Matter. 22 (19), 194116(2010).
  31. Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. Soft lithography in biology and biochemistry. Annu Rev Biomed Eng. 3, 335-373 (2001).
  32. Leong, P. L., Morgan, E. F. Measurement of fracture callus material properties via nanoindentation. Acta Biomater. 4 (5), 1569-1575 (2008).
  33. Grant, C. A., Twigg, P. C., Tobin, D. J. Static and dynamic nanomechanical properties of human skin tissue using atomic force microscopy: effect of scarring in the upper dermis. Acta Biomater. 8 (11), 4123-4129 (2012).
  34. Wang, Z., Volinsky, A. A., Gallant, N. D. Crosslinking effect on polydimethylsiloxane elastic modulus measured by custom-built compression instrument. J Appl Polym Sci. 131 (22), 41050(2014).
  35. Even-Ram, S., Artym, V., Yamada, K. M. Matrix control of stem cell fate. Cell. 126 (4), 645-647 (2006).
  36. Wang, D., et al. A novel approach for PDMS thin films production towards application as substrate for flexible biosensors. Mater Lett. 221, 228-231 (2018).
  37. Tonin, M., Descharmes, N., Houdré, R. Hybrid PDMS/glass microfluidics for high resolution imaging and application to sub-wavelength particle trapping. Lab Chip. 16 (3), 465-470 (2016).
  38. Zhu, M., Lerum, M. Z., Chen, W. How to prepare reproducible, homogeneous, and hydrolytically stable aminosilane-derived layers on silica. Langmuir. 28 (1), 416-423 (2012).
  39. Psarski, M., et al. Hydrophobization of epoxy nanocomposite surface with 1H,1H,2H,2H-perfluorooctyltrichlorosilane for superhydrophobic properties. Cent Eur J Phys. 10 (5), 1197-1201 (2012).
  40. Pham, J. T., Xue, L., Del Campo, A., Salierno, M. Guiding cell migration with microscale stiffness patterns and undulated surfaces. Acta Biomater. 38, 106-115 (2016).
  41. Miranda, I., et al. Properties and applications of PDMS for biomedical engineering: a review. J Funct Biomater. 13, 2(2022).
  42. Zhang, W., Choi, D. S., Nguyen, Y. H., Chang, J., Qin, L. Studying cancer stem cell dynamics on PDMS surfaces for microfluidics device design. Sci Rep. 3 (1), 2332(2013).
  43. Toworfe, G. K., Composto, R. J., Adams, C. S., Shapiro, I. M., Ducheyne, P. Fibronectin adsorption on surface-activated poly(dimethylsiloxane) and its effect on cellular function. J Biomed Mater Res A. 71 (3), 449-461 (2004).
  44. Wang, L., Sun, B., Ziemer, K. S., Barabino, G. A., Carrier, R. L. Chemical and physical modifications to poly(dimethylsiloxane) surfaces affect adhesion of Caco-2 cells. J Biomed Mater Res A. 93 (4), 1260-1271 (2010).
  45. Lu, M., Ding, L., Zhong, T., Dai, Z. Improving hydrophilicity and adhesion of PDMS through dopamine modification assisted by carbon dioxide plasma. Coatings. 13, 126(2023).
  46. Jiang, B., Guo, H., Chen, D., Zhou, M. Microscale investigation on the wettability and bonding mechanism of oxygen plasma-treated PDMS microfluidic chip. Appl Surf Sci. 574, 151704(2022).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

PDMS

مقالات ذات صلة