مقالة منهجية

تصوير الخلايا الحية لنفاذية الغشاء الليزوزومي أثناء داء الننوبات

DOI:

10.3791/69495

⸱

نوفمبر 14, 2025

 ,  ,  , 
1Center for Regenerative Medicine, Heart Institute, Department of Internal Medicine, Morsani College of Medicine, University of South Florida

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول طريقة تصوير الخلايا الحية لمراقبة نفاذية الغشاء الليزوزومي أثناء التنخر ، باستخدام مجسات الفلورسنت التي تكتشف التغيرات في سلامة الغشاء الليزوزومي والتحماض.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتوج داء النخر ، وهو شكل من أشكال النخر المنظم ، في تمزق غشاء الخلية. اكتشف مختبرنا وآخرون أن نفاذية الغشاء الليزوزومي (LMP) هي حدث مبكر وحاسم في هذه العملية ، قبل تمزق الغشاء. يطلق Rapid LMP إنزيمات ليزوزومية قوية ، وخاصة البروتياز ، في العصارة الخلوية ، مما يعزز موت الخلايا بنشاط. يوفر التصوير بالخلايا الحية أداة لا تقدر بثمن للكشف عن LMP أثناء التكاثر في الوقت الفعلي. العديد من الأصباغ الفلورية فعالة للغاية: (1) تتعقب أصباغ LysoTracker الحساسة للأس الهيدروجيني التغيرات في درجة الحموضة الليزوسومية. يشير الانخفاض في إشارة التألق إلى فقدان تدرج الأس الهيدروجيني الليزوزومي ، وهو علامة أساسية على الخلل الوظيفي الليزوزومي ، والذي قد يكون مقدمة أو نتيجة مباشرة ل LMP. (2) يتم استيعاب حبات ديكستران المسمى بالفلورسين وتتراكم في الجسيمات الحالة. يؤدي إطلاقها في إشارات العصارة الخلوية إلى إكمال LMP وتسرب البضائع. هنا ، لاحظنا فقدانا تدريجيا لمضان Lysotracker ، مع انتشار مضان Dextran في العصارة الخلوية بعد تحريض الداء النباتي. وبالتالي ، فإن منهجية تصوير الخلايا الحية تمكن الباحثين من تتبع توقيت ومدى الخلل الوظيفي الليزوزومي بدقة ، مما يساهم في فهم أكثر شمولا لآليات الموت النباتي وإلقاء الضوء على التدخلات العلاجية المحتملة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

داء الننوبات هو شكل مستقل عن الكاسباس لموت الخلايا المنظم المتورط في العديد من الأمراض الالتهابية والاضطرابات التنكسية العصبية وأمراض الرئة والكبد والقلب1،2،3. يتم التوسط في هذا المسار من خلال سلسلة معقدة من التفاعلات التي تبلغ ذروتها في تنشيط بروتين كيناز 1 المتفاعل مع المستقبلات (RIPK1) ، والذي يتفاعل مع بروتين كيناز 3 المتفاعل مع المستقبلات (RIPK3) عبر مجالات شكل تفاعل RIP المتماثل (RHIM)4،5،6. RIPK3 ، بدوره ، يقوم بتجنيد البروتين الشبيه بالنسب المختلط (MLKL) لتشكيل النخر7،8. يؤدي فسفرة MLKL بواسطة RIPK3 إلى قلة القلة والبلمرة اللاحقة. ثم تنتقل بوليمرات MLKL إلى الأغشية الخلوية ، مما يؤدي في النهاية إلى تمزق غشاء الخلية وموت الخلايا9،10،11. ومع ذلك ، فإن الآليات التي تنتقل بها بوليمرات MLKL إلى مقصورات الغشاء وتسبب تعطيل الغشاء ليست مفهومة تماما.

الجسيمات الحالة هي عضيات مسؤولة عن تدهور المواد الخلوية وإعادة تدويرها. يوجد في تجويفها البروتياز والليباز والنوكليازات والهيدرولاز المسؤولة عن هضم الجزيئات الكبيرة ، وبالتالي الحفاظ على التوازن الخلوي12،13. لذلك ، فإن الحفاظ على سلامة الليزوزومات والوظيفة المناسبة أمر ضروري لضمان التصفية الخلوية الفعالة ، والتكيف مع الإجهاد ، وبقاء الخلية بشكل عام14،15،16. تشير الدراسات الحديثة إلى وجود ارتباط بين داء التكاثر ونفاذية الغشاء الليزوزومي (LMP) 17،18،19.

أظهرت ملاحظاتنا الأخيرة أن LMP هو حدث مبكر ومهم في عملية النخر ، قبل التمزق النهائي لغشاء الخلية19. على وجه التحديد ، تحفز بلمرة MLKL على الغشاء الليزوزومي LMP السريع لإطلاق إنزيمات ليزوزومية قوية ، وخاصة البروتياز ، بما في ذلك القسطرة ب ، في العصارة الخلوية. ثم تشقق هذه البروتياز البروتينات الحيوية لتعزيز موت الخلايا. الأهم من ذلك ، أن تثبيط نشاط CTSB يحمي بقوة من موت الخلايا19،20. تشير هذه البيانات إلى أن LMP هو معدل حاسم لمسار الاختراق. لذلك ، فإن مراقبة توقيت LMP أثناء الموت أمر ضروري لفهم الآليات الجزيئية وتحديد الأهداف العلاجية المحتملة.

تتطلب العديد من طرق الكشف عن LMP التقليدية ، مثل التلوين المناعي أو المجهر الإلكتروني الناقل (TEM) ، أو قياس التدفق الخلوي ، عينات ثابتة أو توفر معلومات نقطة النهاية فقط21،22،23 ، والفشل في التقاط العملية الديناميكية للاضطراب الليزوزومي ، لا سيما في سياق التطور السريع للنخر. في المقابل ، تتيح طريقة تصوير الخلايا الحية تصورا عالي الدقة في الوقت الفعلي ل LMP أثناء النواص. في هذا البروتوكول ، قمنا بدمج اثنين من العلامات الليزوزومية التكميلية وداء النخر المستحث في خلايا HT-29 لتحليل سلامة الغشاء الليزوزومي في الوقت الفعلي19. توفر هذه التقنية منصة قوية وقابلة للتكيف لدراسة LMP ليس فقط في التنخر ولكن أيضا في أشكال أخرى من إجهاد الخلية حيث تتعرض سلامة الليزوزومات للخطر ، لا سيما في سياق الأمراض أو استخدام علاجات استهداف الليزوزوم24،25،26.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. ثقافة الخلية - اليوم 0

  1. صفيحة 5,000 خلية في 2 مل من DMEM (وسط النسر المعدل من دولبيكو) مكملة بنسبة 10٪ مصل أبقار الجنين (FBS) و 1٪ بنسلين وستربتومايسين (P / S) في طبق زجاجي معقم.
  2. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 طوال الليل.

2. تحميل حبة ديكستران - اليوم 1

  1. قم بتخفيف حبات الديكستران الخضراء إلى 25 ميكروغرام / مل في DMEM الطازج مع 10٪ FBS و 1٪ P / S بإضافة 20 ميكرولتر من محلول المخزون 2.5 مجم / مل.
  2. قم بإزالة الوسط القديم واستبدله ب 2 مل من DMEM المحتوي على حبة مكمل ب 10٪ FBS و 1٪ P / S.
  3. احتضان الخلية لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 للسماح باستيعاب الخرزات في الجسيمات الحالة.

3. تلطيخ Lysotracker - اليوم 2 (يوم التجربة)

  1. قم بإعداد وسط تلطيخ عن طريق إضافة 2 ميكرولتر من محلول مخزون Lysotracker 1 ملي إلى 2 مل من DMEM الطازج المكمل ب 10٪ FBS و 1٪ P / S للحصول على تركيز نهائي يبلغ 1 ميكرومتر. استبدل الوسط القديم بمحلول التلوين هذا.
  2. احتضان عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة ساعتين ، بعد وقت الحضانة الموصى به (30 دقيقة إلى 2 ساعة) المنصوص عليه في إرشادات الاستخدام من المجسات الجزيئية بواسطة Life Technologies27. في تجاربنا ، أدت ساعتان من الحضانة في خلايا HT-29 إلى تلطيخ ثقب قوي مع توطين قوي مع حبات ديكستران ، مما يشير إلى مضان صبغة مستقرة.
    ملاحظة: قم بتشغيل المجهر متحد البؤر قبل 30 دقيقة من تصوير الخلايا الحية.

4. إعداد المجهر متحد البؤر

  1. قم بتشغيل مكونات النظام متحد البؤر بالترتيب التالي: مجهر الكمبيوتر ؛ قوة الماسح الضوئي قوة الليزر؛ انبعاث الليزر؛ قوة لايكا.
  2. قم بتشغيل الضوابط البيئية: المكعب - التحكم في درجة الحرارة ؛ وحدة التحكم في خلاط الغاز Brick - CO2 . افتح إمداد ثاني أكسيد الكربون2 و O2 .
  3. تعيين معلمات الغاز:
    1. اضبط وحدة التحكم في درجة الحرارة (المكعب) على 37 درجة مئوية.
    2. اضبط وحدة التحكم في الغاز والرطوبة (الطوب) على 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 و 95٪ رطوبة.
  4. قم بتجميع غرفة التصوير كما هو موضح في الشكل 1.
  5. قم بإعداد الهدف متحد البؤر:
    1. استخدم هدف غمر الزيت 63x / 1.40 NA.
    2. اضبط ليزر الإثارة على 488 نانومتر (فلوروفور أخضر) و 555 نانومتر (فلوروفور أحمر).
    3. بالنسبة لليزر 488 نانومتر ، حدد كاشف هجين (HyD) ، وبالنسبة لليزر 555 نانومتر ، حدد كاشف PMT.
      ملاحظة: تم تقليل الحديث المتبادل الفلوري باستخدام بوابات محددة مسبقا في البرنامج متحد البؤر ، مما أكد عدم وجود تداخل بين القنوات.

5. تحضير ما بعد التلوين (بعد حضانة LysoTracker)

  1. اغسل الخلايا بعناية ثلاث مرات باستخدام 2 مل من PBS.
  2. أضف 2 مل من DMEM الطازج مع 10٪ FBS و 1٪ P / S.
  3. ضع قطرة واحدة من زيت الغمر على العدسة الشيئية قبل التصوير.
  4. قم بتركيب الطبق على مرحلة المجهر.
  5. اضبط شدة الليزر والخلفية.
    1. اضبط شدة الليزر حتى 3٪ ، ولكن ليس أكثر من 5٪.
    2. اضبط كسب الكاشف في برنامج المجهر لتحسين الإشارة.
    3. لتصغير الخلفية، اضبط شريط التباين.
  6. احصل على صور أساسية للخلايا غير المعالجة (قبل إضافة T / S / Z) ، والتي تعمل كشرط تحكم.
  7. أعد اللوحة إلى غطاء التدفق الرقائقي وأضف 1 مل من DMEM مكملا ب 10٪ FBS و 1٪ P / S ، يحتوي على 100 نانوغرام / مل من TNF-α (T) ، و 500 نانومتر من محاكي SMAC (S) ، و 100 ميكرومتر من Z-VAD-FMK (Z).
  8. استمر في التصوير على المجهر متحد البؤر.
    ملاحظة: تمت إضافة T / S / Z عمدا بتركيزات أعلى من البروتوكولات القياسية. تم اتخاذ هذا الاختيار لتسريع LMP وموت الخلايا ، مما يسمح بالتقاط الأحداث المبكرة بشكل أكثر موثوقية في التصوير في الوقت الفعلي.

6. إعدادات الحصول على الصور

  1. في برنامج الاستحواذ ، قم بتعيين المعلمات على النحو التالي: الوضع: xyt ؛ الشكل: 512 × 512 ؛ السرعة: 400 ؛ التكبير: 3 ؛ متوسط الخط: 1 ؛ تراكم الخط: 3 ؛ تراكم الإطار: 1 ؛ الفاصل الزمني: 3 دقائق ؛ المدة: 8 ساعات ؛ تمكين التركيز البؤري التلقائي.
  2. انقر فوق ابدأ لبدء اكتساب اللقطات المتتابعة.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تتيح الإجراءات الموضحة في هذا البروتوكول الحصول على صور الخلايا الحية باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر لمراقبة LMP في الوقت الفعلي. يوضح الشكل 1 تمثيلا تخطيطيا للبروتوكول التجريبي ، من طلاء الخلايا إلى الحصول على الصور. في اليوم 0 ، تم طلاء 5,000 خلية HT-29 واحتضانها لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون2. بعد 24 ساعة (اليوم 1) ، تم تحضين الخلايا بخرز ديكستران المسمى بالفلورسين (25 ميكروغرام / مل) لمدة 24 ساعة إضافية في نفس الظروف. يتم استيعاب هذه الخرزات عن طريق الالتقام الخلوي وحركة المرور إلى الجسيمات الحالة ، حيث تتراكم وتظهر على شكل نقاط مشرقة. في اليوم 2 (يوم التجربة) ، تمت معالجة الخلايا بصبغة LysoTracker الحساسة للأس الهيدروجيني (1 ميكرومتر) لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون2. يركز LysoTracker ويظهر مضانا قويا داخل المقصورات الحمضية ، مثل الجسيمات الداخلية المتأخرة والجسيمات الحالة اللاتية. قبل ثلاثين دقيقة من التصوير ، تم تشغيل نظام المجهر متحد البؤر وتثبيته ، بما في ذلك أجهزة التحكم في درجة الحرارة والغاز والرطوبة ، كما هو موضح في الخطوة 4 من البروتوكول. تم تجميع غرفة التصوير ، كما هو موضح في الشكل 2. تم استخدام ليزر 488 نانومتر (أخضر) و 555 نانومتر (أحمر).

بعد الحضانة باستخدام LysoTracker ، تم غسل الخلايا بعناية ثلاث مرات باستخدام PBS ، وتمت إضافة 2 مل من DMEM الطازج المكمل ب 10٪ FBS و 1٪ P / S. تم نقل اللوحة إلى المجهر ، وتم تطبيق قطرة واحدة من زيت الغمر على هدف الغمر بالزيت 63x / 1.40 NA. ثم تم تعديل شدة الليزر ومستويات الخلفية لتحسين ظروف التصوير ، كما هو موضح في الخطوة 5.5. من البروتوكول. أكدت صورنا الأولية وجود نقاط ثابتة من Lysotracker و dextran المسمى بالفلوريسين ، مما يشير إلى الجسيمات الحالة السليمة (الشكل 3). تم الحصول على صور خط الأساس قبل T / S / Z واستخدمت كعنصر تحكم. لم يتم استخدام أي سيارة.

بعد إنشاء إعدادات التصوير والفحص المجهري الأولية ، تم إرجاع اللوحة إلى غطاء التدفق الصفحي ، وتمت إضافة 1 مل من DMEM مع 10٪ FBS و 1٪ P / S ، والتي تحتوي على 100 نانوغرام / مل TNF-α (T) ، و 500 نانومتر SMAC مقلد (S) ، و 100 ميكرومتر Z-VAD-FMK (Z). استمر التصوير على المجهر متحد البؤر باستخدام معلمة اكتساب التصوير الموضحة في الخطوة 6 من البروتوكول. كما هو موضح في الشكل 3 ، الفيلم التكميلي S1 ، والفيلم التكميلي S2 ، كان الانخفاض التدريجي في مضان LysoTracker في الخلايا المعالجة ب T / S / Z بمثابة مؤشر مبكر للتغيير الليزوزومي. تبع هذه الخسارة ، وحدثت أحيانا في وقت واحد ، تدفق الديكستران المسمى بالفلوريسين من الجسيمات الحالة إلى العصارة الخلوية (التحول من النقطة إلى الانتشار) ، مما يشير إلى LMP. في الساعة 8 ساعات ، اختفت جميع إشارات Lysotracker تقريبا ، ومع ذلك ، لا تزال العديد من الخلايا تحتفظ بالنقطة الخضراء مع إشارة خضراء العصارة الخلوية ، مما يشير إلى أن فقدان تدرج الأس الهيدروجيني الليزوزومي يسبق LMP الكامل وإطلاق البضائع.

الشكل 1
الشكل 1: التمثيل التخطيطي للبروتوكول التجريبي. (تم إنشاؤه في عام BioRender.com) في البداية ، تم طلاء 5,000 خلية (0 ساعة) واحتضانها لمدة 24 ساعة ؛ بعد ذلك ، تمت إضافة حبات ديكستران (25 ميكروغرام / مل) واحتضانها لمدة 24 ساعة إضافية. في 48 ساعة ، تمت إضافة LysoTracker (1 ميكرومتر) واحتضانه لمدة ساعتين. تم غسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام PBS (الخطوة 1) ، تليها إضافة 2 مل من DMEM الطازج المكمل ب 10٪ FBS و 1٪ P / S (الخطوة 2). تم تعديل إعدادات الفحص المجهري (الخطوة 3) ، وتمت معالجة الخلايا باستخدام TNF-α (T) ، ومحاكي SMAC (S) ، ومثبط عموم الكاسبيز Z-VAD-FMZ (Z) (الخطوة 4) ، قبل الحصول على صورة الخلية الحية (الخطوة 5). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2: رسم تخطيطي لإعداد غرفة التصوير. (أ) حامل العينة ، (ب) غرفة حضانة الغاز ، و (ج) الغطاء العلوي. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3
الشكل 3: صور تمثيلية لخلايا HT29 قبل وبعد علاج T / S / Z. تم تلطيخ الخلايا بحبيبات Lysotracker الحمراء والخضراء Dextran ومعالجتها ب TNF-α (T) ، ومحاكي SMAC (S) ، ومثبط عموم الكاسبيز Z-VAD-FMZ (Z). شريط المقياس: 10 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الفيلم التكميلي S1: الفاصل الزمني لخلايا HT29 المحتضنة بخرز Dextran الأخضر ومعالجتها ب T / S / Z. تمت مراقبة الخلايا لأكثر من 6 ساعات لتقييم الاستجابة الخلوية. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الفيلم.

الفيلم التكميلي S2: الفاصل الزمني لخلايا HT29 المحتضنة باللون الأحمر LysoTracker ومعالجتها ب T / S / Z. تمت مراقبة الخلايا لأكثر من 6 ساعات لتقييم الاستجابة الخلوية. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الفيلم.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أظهر هذا البروتوكول أن الجمع بين كل من LysoTracker وخرز ديكستران الذي يحمل علامة الفلوريسين يتيح المراقبة المتزامنة لدرجة الحموضة الليزوزومية وإطلاق البضائع في الوقت الفعلي. تؤكد النتائج التمثيلية (الشكل 3 ، الفيلم التكميلي S1 ، والفيلم التكميلي S2) أن الخلايا غير المعالجة تحافظ على إشارة بونكتا مستقرة لكلا العلامتين. في المقابل ، يشير علاج T / S / Z إلى فقدان تدريجي لشدة Lysotracker وتحول ديكستران من puncta إلى توزيع العصارة الخلوية المنتشر ، بما يتفق مع LMP.

تتمثل الخطوة الأولى الحاسمة في هذا البروتوكول في اختيار الخلايا للحصول على الصور. توضح بياناتنا السابقة أن علاج T / S / Z يتسبب في موت ما يقرب من 80٪ من خلايا HT-29 في غضون 24 ساعة ، مع بقاء 20٪ المتبقيةعلى قيد الحياة 19. نظرا لأن LMP غير موجود في بداية التجربة ، يتم اختيار الخلايا في البداية بناء على التشكل وإشارتها الإيجابية المزدوجة لكل من LysoTracker و Dextran Beads. على الرغم من أن هذه الطريقة لا يمكنها التنبؤ بالخلايا المحددة التي ستخضع ل LMP ، فقد لاحظنا باستمرار أن ما يقرب من 60٪ من السكان الذين تمت مراقبتهم يظهرون في النهاية LMP خلال فترة التصوير التي تبلغ 8 ساعات. ينبع التحدي الآخر من الطبيعة المتأصلة للتصوير المتسلسل. يمنع الانجراف الطفيف في موضع Z للخلية ، والذي يحدث أثناء الحصول على الصورة كل 3 دقائق ، التتبع المستمر لنفس إشارة النقاط على مدار التجربة بأكملها. بالإضافة إلى ذلك ، تهاجر الخلايا وتخضع لتغيرات مورفولوجية استجابة لعلاج T / S / Z28. وبالتالي ، من المستحيل متابعة ديناميكيات الجسيمات الحالة الفردية طوال فترة التصوير. في تصوير الخلايا الحية على المدى الطويل ، تعد المساهمة المحتملة للسمية الضوئية كوسيط لموت الخلايا أحد الاعتبارات المهمة. يمكن أن تولد الإثارة المستمرة أثناء الجلسات الممتدة أنواعا تفاعلية من الأكسجين وتضعف بقاء الخلية29 ، مما قد يتداخل مع الاستجابة النيمروبتوتيكية الحقيقية. لتقليل هذا التأثير ، قمنا بتطبيق طاقة ليزر منخفضة وأوقات تعرض قصيرة. بالإضافة إلى ذلك ، تم إعطاء تركيز خمس مرات من T / S / Z لتسريع عملية موت الخلايا. ومع ذلك ، لا يمكننا استبعاد مساهمة الإجهاد الناجم عن الضوء تماما في التغيرات الليزوزومية الملحوظة.

تتمثل إحدى المزايا المهمة لبروتوكول تصوير الخلايا الحية هذا في قدرته على مراقبة تغير الأس الهيدروجيني الليزوزومي و LMP في الوقت الفعلي ، والتقاط الأحداث الديناميكية التي تفوتها تحليلات نقطة النهاية ، مثل TEM وقياس التدفق الخلوي والتلوين المناعي. بينما يقدم TEM رؤية هيكلية عالية الدقة ، إلا أنه لا يمكنه التقاط التقدم الزمني ل LMP. تعد طرق الخلايا الحية البديلة ، مثل فحوصات نقل أكريدين برتقالي30 أو تكوين جاليكتين-بونكتا31 ، أدوات قيمة لمراقبة سلامة الليزوزومات ، ولكن لكل منها قيود عند استخدامها بمعزل عن غيرها. يشير اختبار برتقال الأكريدين إلى إعادة توزيع الصبغة من العضيات الحمضية إلى العصارة الخلوية ، والتي تتأثر بكل من تغيرات الأس الهيدروجيني الليزوزومي ونفاذية الغشاء ، وبالتالي لا ترتبط ارتباطا مباشرا بإطلاق البضائع. وبالمثل ، يعكس تكوين الجاليكتين-بونكتا تعرض الجليكانات اللمعة للعصارة الخلوية وبالتالي يشير إلى تلف الغشاء الليزوزومي31،32 ، لكنه لا يميز بين النفاذية الجزئية والتمزق الليزوزومي الكامل.

تكمن القوة الأساسية لهذا البروتوكول في الجمع بين LysoTracker وخرز ديكستران ، مما يتيح التحقيق المتزامن لتحمض الليزوزومات وتسرب البضائع. يوفر هذا قراءة فريدة ومزدوجة لكل من وظائف الليزوزما والسلامة الهيكلية. يعمل تلاشي LysoTracker كمؤشر على التغير في درجة الحموضة الليزوزومية ، بينما يبلغ إطلاق ديكستران مباشرة عن التسرب المادي للمحتوى الليزوزومي. باستخدام هاتين العلامتين معا ، فإننا نعزز بشكل كبير اكتشاف كل من LMP الجزئي والكامل. لذلك ، فإن استراتيجية تصوير الخلايا الحية هذه قابلة للتطبيق على نطاق واسع. يمكن للباحثين تكييفه لاستخدامه مع أنواع الخلايا الأخرى ومجسات الفلورسنت المختلفة لدراسة سلامة الليزوزومات في ظل ظروف تجريبية مختلفة ، بما في ذلك الاضطرابات الدوائية أو الجينية. هذه القدرة هي المفتاح لتعزيز فهمنا لآليات النخر وتحديد التدخلات العلاجية المحتملة.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون عدم وجود تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم دعم البحث في مختبر الدكتور Zhigao Wang من خلال منح المعاهد الوطنية للصحة R35GM158455 و R01GM147474.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
خلايا HT-29ATCCHTB-38خلايا سرطان القولون
طبق زجاجي قاع بقطر 35 ممشركة ماتيكP35G-1.5-14-C-GRD
حاضنة ثاني أكسيد الكربونPHCBIMCO-170AICUVL
المجهر الكونفوكليلايكاSP8WLL
خرزات خضراء دكسترانثيرموفيشرD1820ديكستران، فلورسين، 10,000 ميغاواط، أنيونيك، ليسين قابل للإصلاح
دولبيكو الوسيط المعدل (DMEM)كورنينغ 10-013-CV
مصل الأبقار الجنيني (FBS)سايتيفا SH30910.03
لايزوتراكر الأحمر DND-99إنفيتروجينL7528
نوع الغمر بالزيت HFعلوم المجهر الإلكتروني16915-01
البنسلين والستربتوميسين (P/S) سيغما-ألدرتشP4333
محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)كورنينغ21-040-CV
سماك ميميتيك (S)BV6، ApexBio، الكتالوجB4653التركيز النهائي، 1 ملليموتار
ذا بريك & nbsp;خدمات تصوير الحياة13685وحدة تحكم ثاني أكسيد الكربون بخلاط الغاز
المكعبخدمات تصوير الحياةCBO2Aمجاهر غرفة التحكم في درجة الحرارة
عامل نخر الورم ألفا (TNF-α - T)بيبروتيك30001A100UGالتركيز النهائي، 20 نانوغرام/مل
z-VAD-FMK (Z)أبيكس بيوA1902التركيز النهائي، 20 ملليمتر

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Shan, B., Pan, H., Najafov, A., Yuan, J. Necroptosis in development and diseases. Genes Dev. 32, 327-340 (2018).
  2. Kang, K., Park, C., Chan, F. K. Necroptosis at a glance. J Cell Sci. 135 (17), jcs260091(2022).
  3. Ai, Y., Meng, Y., Yan, B., Zhou, Q., Wang, X. The biochemical pathways of apoptotic, necroptotic, pyroptotic, and ferroptotic cell death. Mol Cell. 84, 170-179 (2024).
  4. Zhang, D. W., et al. RIP3, an energy metabolism regulator that switches TNF-induced cell death from apoptosis to necrosis. Science. 325, 332-336 (2009).
  5. He, S., et al. Receptor interacting protein kinase-3 determines cellular necrotic response to TNF-α. Cell. 137 (6), 1100-1111 (2009).
  6. Cho, Y. S., et al. Phosphorylation-driven assembly of the RIP1-RIP3 complex regulates programmed necrosis and virus-induced inflammation. Cell. 137 (6), 1112-1123 (2009).
  7. Sun, L., et al. Mixed lineage kinase domain-like protein mediates necrosis signaling downstream of RIP3 kinase. Cell. 148, 213-227 (2012).
  8. Zhao, J., et al. Mixed lineage kinase domain-like is a key receptor interacting protein 3 downstream component of TNF-induced necrosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (14), 5322-5327 (2012).
  9. Chen, X., et al. Translocation of mixed lineage kinase domain-like protein to plasma membrane leads to necrotic cell death. Cell Res. 24 (1), 105-121 (2014).
  10. Cai, Z., et al. Plasma membrane translocation of trimerized MLKL protein is required for TNF-induced necroptosis. Nat Cell Biol. 16, 55-65 (2014).
  11. Liu, S., et al. MLKL forms disulfide bond-dependent amyloid-like polymers to induce necroptosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 114, E7450-E7459 (2017).
  12. Lawrence, R. E., Zoncu, R. The lysosome as a cellular centre for signalling, metabolism and quality control. Nat Cell Biol. 21, 133-142 (2019).
  13. Ballabio, A., Bonifacino, J. S. Lysosomes as dynamic regulators of cell and organismal homeostasis. Nat Rev Mol Cell Biol. 21, 101-118 (2020).
  14. Aits, S., Jaattela, M. Lysosomal cell death at a glance. J Cell Sci. 126, 1905-1912 (2013).
  15. Repnik, U., Hafner Cesen, M., Turk, B. Lysosomal membrane permeabilization in cell death: concepts and challenges. Mitochondrion. 19 (Pt A), 49-57 (2014).
  16. Alu, A., et al. The role of lysosome in regulated necrosis. Acta Pharm Sin B. 10 (10), 1880-1903 (2020).
  17. Werneburg, N. W., Guicciardi, M. E., Bronk, S. F., Gores, G. J. Tumor necrosis factor-α-associated lysosomal permeabilization is cathepsin B dependent. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 283, G947-G956 (2002).
  18. Vanden Berghe, T., et al. Necroptosis, necrosis and secondary necrosis converge on similar cellular disintegration features. Cell Death Differ. 17, 922-930 (2010).
  19. Liu, S., et al. MLKL polymerization-induced lysosomal membrane permeabilization promotes necroptosis. Cell Death Differ. 31, 40-52 (2024).
  20. Guicciardi, M. E., Miyoshi, H., Bronk, S. F., Gores, G. J. Cathepsin B knockout mice are resistant to tumor necrosis factor-α-mediated hepatocyte apoptosis and liver injury: implications for therapeutic applications. Am J Pathol. 159, 2045-2054 (2001).
  21. Aits, S., Jaattela, M., Nylandsted, J. Methods for the quantification of lysosomal membrane permeabilization: a hallmark of lysosomal cell death. Methods Cell Biol. 126, 261-285 (2015).
  22. Barral, D. C., et al. Current methods to analyze lysosome morphology, positioning, motility and function. Traffic. 23, 238-269 (2022).
  23. Huang, K., Jiang, X., Du, J., Zeng, H. Protocol for detecting lysosome quantity and membrane permeability in acute myeloid leukemia cell lines. STAR Protoc. 5, 103309(2024).
  24. Ferrari, V., et al. Lysosome quality control in health and neurodegenerative diseases. Cell Mol Biol Lett. 29, 116(2024).
  25. Otoda, T., Aihara, K. I., Takayama, T. Lysosomal stress in cardiovascular diseases: therapeutic potential of cardiovascular drugs and future directions. Biomedicines. 13, (2025).
  26. Cao, M., Luo, X., Wu, K., He, X. Targeting lysosomes in human disease: from basic research to clinical applications. Signal Transduct Target Ther. 6, 379(2021).
  27. Fisher, T. LysoTracker and LysoSensor probes. Thermo Fisher Scientific. , https://documents.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/mp07525.pdf (2013).
  28. Wang, Z., Jiang, H., Chen, S., Du, F., Wang, X. The mitochondrial phosphatase PGAM5 functions at the convergence point of multiple necrotic death pathways. Cell. 148 (1-2), 228-243 (2012).
  29. Kiepas, A., Voorand, E., Mubaid, F., Siegel, P. M., Brown, C. M. Optimizing live-cell fluorescence imaging conditions to minimize phototoxicity. J Cell Sci. 133 (4), jcs242834(2020).
  30. Eriksson, I., Vainikka, L., Persson, H. L., Ollinger, K. Real-time monitoring of lysosomal membrane permeabilization using acridine orange. Methods Protoc. 6 (4), 72(2023).
  31. Aits, S., et al. Sensitive detection of lysosomal membrane permeabilization by lysosomal galectin puncta assay. Autophagy. 11, 1408-1424 (2015).
  32. Hoyer, M. J., Swarup, S., Harper, J. W. Mechanisms controlling selective elimination of damaged lysosomes. Curr Opin Physiol. 29, 100590(2022).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Necroptosis MechanismsLysosomal DysfunctionFluorescent ProbesLysoTracker DyesDextran BeadsConfocal MicroscopyTime Lapse ImagingCell Death Induction

مقالات ذات صلة