يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

الأساليب التجريبية للتحليل الكيميائي الحيوي للبروتين الحمضي الليفي الدبقي ومتغيرات المرض المرتبطة به

1.5K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/69523

⸱

نوفمبر 28, 2025

 , 
1Institute of Molecular Medicine, College of Life Sciences and Medicine, National Tsing Hua University

في هذه المقالة

ملخص

توضح هذه الدراسة طرقا تجريبية لتوصيف GFAP وطفراته المسببة للأمراض كيميائيا، مع التركيز على تجميع الخيوط، والتجميع، والتعديل بعد الترجمة. تم تحليل بروتينات GFAP عالية النقاء، مما كشف عن رؤى حول آليات مرض ألكسندر قد توفر إطارا لدراسة الأهداف العلاجية المحتملة وفهم طفرات GFAP والاضطرابات المرتبطة بها.

الملخص

البروتين الحمضي الليفي الدبقي (GFAP) هو بروتين خيوط وسيط رئيسي وحيوي للحفاظ على سلامة ووظيفة الخلايا النجمية في الجهاز العصبي المركزي. الطفرات في GFAP هي السبب الجذري لمرض ألكسندر (AxD)، وهو اضطراب تنكسي عصبي نادر وغالبا ما يكون قاتلا يتميز بارتفاع مستويات GFAP وتراكم GFAP على شكل ألياف روزنتال. هنا، نستعرض مجموعة شاملة من الأساليب التجريبية لتوصيف GFAP الكيميائي الحيوي ومتحوراته المسببة للأمراض. باستخدام التعبير المحسن وتقنيات التنقية المتقدمة، حققنا إنتاجية ونقاء عالية لكل من بروتينات GFAP البرية والطفرات. تم استخدام اختبارات كيميائية حيوية لتقييم تأثيرات الطفرات الممرضة على تجميع الخيط، وذوبانيتها، وتجمعها. بالإضافة إلى ذلك، استكشفنا دور التعديلات ما بعد الترجمة الشاذة في تجميع GFAP وتأثيرها على خصائص الخيوط. يتقدم هذا العمل في فهمنا لدور GFAP في AxD ويضع أساسا لتطوير استراتيجيات علاجية تستهدف خلل GFAP. علاوة على ذلك، تعد المنهجيات المعروضة هنا أدوات قيمة للتحقيق في العواقب الكيميائية الحيوية لطفرات GFAP وتعزيز التدخلات لاضطرابات GFAP.

المقدمة

مرض ألكسندر (AxD) هو اضطراب وراثي ناتج عن طفرات سائدة في الجين الذي يرمز للبروتين الحمضي الليفي الدبقي (GFAP)1، وهو بروتين خيوط وسيط من النوع الثالث (IF) يوجد بشكل رئيسي في الخلايا النجمية الناضجة. يتميز AxD بزيادة تنظيم GFAP2، والدبقية النجميةالتفاعلية 3، وتراكم ألياف روزنثال، وهي بروتينات تتكون أساسا من GFAP إلى جانب بروتينات مرتبطة مثل αB-crystallin4 ويوبيكويتين5. تؤدي الطفرات في جين GFAP إلى اضطراب تجميع الخيطالطبيعي 6، مما يؤدي إلى تجمع غير طبيعي، وتحفيز استجابات الإجهاد الخلوي7، ومزيد من عدم الاستقرار من خلال تعديلات ما بعد الترجمة الشاذة (PTMs) مثل الفسفرة8، الأكسدة9، واليوبيكوتينيشن10.

على الرغم من الدور المركزي ل GFAP في علم أمراض AxD، إلا أن الآليات الجزيئية التي يعطل بها GFAP الطائر تجمع الخيوط، ويعزز التجمع، وتسبب إجهاد خلوي لا تزال غير مفهومة جيدا. تعيق هذه الفجوة المعرفية تطوير علاجات مستهدفة لمعالجة تجمع GFAP وسميته. دراسة الخصائص الكيميائية الحيوية ل GFAP ومتغيرات AxD المرتبطة به أمر بالغ الأهمية لكشف الآليات الجزيئية التي تكمن وراء تقدم المرض. ومع ذلك، فإن خاصية GFAP المعرضة للتجمع وسلوكه المتنوع في التجميع في المتغيرات المرتبطة بالمرض تمثل تحديات فريدة للتحليل التجريبي. تتطلب الدراسات الكيميائية الحيوية المسيطر عليها GFAP منقى، يتم الحصول عليه إما من نماذج حيوانية أو من خلال التعبير المؤتلف، لدراسة تأثيرات طفرات AxD على تجميع الخيوط وتجميعها والتعديلات المرضية.

تقدم المناهج التجريبية المقدمة في هذه الدراسة عدة مزايا مقارنة بالتقنيات البديلة. على سبيل المثال، بينما توفر النماذج الخلوية11 ودراسات الكيمياء المناعية12 رؤى قيمة حول تعبير GFAP وتوطينه، إلا أنهما غالبا ما يفشلان في التقاط الآليات الكيميائية الحيوية الدقيقة لتجميع وتجميع الخيوط بسبب تعقيد البيئات الخلوية. على النقيض من ذلك، تتيح الطرق الموضحة هنا، مثل اختبارات تجميع الخيوط المختبرية ، وتحليلات الترسب، وتوصيف PTM، من تحقيق محكم في الخصائص الكيميائية الحيوية الجوهرية ل GFAP ومتحوراته المرتبطة بالمرض. تتيح هذه الأساليب للباحثين تحليل سلوك تجميع الخيوط وتجميعها في نظام مبسط، مما يسهل تحديد الآليات الجزيئية الكامنة وراء خلل GFAP. أظهرت دراسات سابقة فائدة هذه التقنيات الكيميائية الحيوية لتحليل بروتينات IF، بما في ذلك ديسمين13 والكراتينات14، مما يؤكد قابليتها للتطبيق في أبحاث GFAP.

بالإضافة إلى ذلك، توفر هذه المخطوطة معلومات تساعد القراء على تحديد ما إذا كانت الطرق الموصوفة مناسبة لتطبيقاتهم الخاصة. سيجد الباحثون المهتمون بدراسة الخصائص الكيميائية الحيوية ل GFAP، وسلوك تجميعه، أو PTMs هذه التقنيات مفيدة بشكل خاص في دراسة المتغيرات المرتبطة بالأمراض وتأثيراتها المرضية. من خلال دمج هذه الأساليب الكيميائية الحيوية مع أنظمة تجريبية أخرى، مثل الدراسات الخلوية أو النماذج الحيوانية، يمكن للباحثين تحقيق فهم أكثر شمولا لخلل GFAP في AxD وغيره من الاعتلال النجمي المرتبط به.

الهدف العام من هذه الطريقة هو تقديم طرق تجريبية للتحليل الكيميائي الحيوي ل GFAP ومتغيرات AxD، بما في ذلك تقنيات تنقية البروتينات، واختبارات تجميع الخيوط في المختبر ، وتحليلات الترسيب السطحي، وتوصيف PTM. توفر هذه الطرق رؤى حاسمة حول الأساس الجزيئي لخلل GFAP في AxD، مما يمهد الطريق لتطوير العلاج. علاوة على ذلك، فإن تطبيق هذه التقنيات التجريبية سيدفع فهمنا للكيمياء الحيوية ل GFAP في AxD ويساهم في مجال أبحاث الفصيل المتقطع الأوسع.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

المستخدمة في هذه الدراسة هي فئران نموذج AxD التي تحمل طفرة الضربة R237Hرقم 11. تمت الموافقة على جميع تجارب من قبل لجنة رعاية واستخدام المؤسسية في كلية علوم الحياة والطب في جامعة تسينغ هوا الوطنية (الموافقة رقم 109088 و111060 من الاتحاد الدولي للحيوانات الحيوانية (NTHU) ووفقا لإرشادات دليل الزراعة لرعاية واستخدام المختبرية.

1. تنقية GFAP المؤتلف من البكتيريا (الشكل 1)

  1. حول سلالة pLysS من الإشريكية القولونية BL21(DE3) باستخدام متجه pET 23b يحتوي على cDNA إما من WT أو GFAP طفر.
  2. البكتيريا في 1 لتر من وسط لوريا-بيرتاني مع إضافة 100 ميكروغرام/مل أمبيسيلين و34 ميكروغرام/مل كلوروأمفينيكول عند 37 درجة مئوية إلى OD600 ~0.2.
  3. أضف الأيزوبروبيل β-D-1-ثيوجالاكتوبيرانوزيد (IPTG، 0.5 M) إلى تركيز نهائي 0.5 ملم لتحفيز تعبير GFAP عند 37 درجة مئوية لمدة 4 ساعات.
  4. احصد البكتيريا عن طريق الطرد المركزي عند 6,371 ×جرام لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
  5. بكتيريا ليز في 50 مل من مخزن TEN (20 ملليموتر تريس-HCl، درجة حموضة 8، 5 ملليمولار EDTA، 150 ملليمولار NaCl) مدعمة بفلوريد 0.2 ملليمول فينيلميثانيسولففونيل فلوريد (PMSF) عن طريق التجانس في مجانس Dounce.
  6. يقوم بتحليل بكتيريا الطرد المركزي عند 22,045 xجرام لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية، ثم يستخرج الحبيبات في مخزن Triton X-100 (TEN مع 1٪ (v/v) Triton X-100).
  7. بعد الطرد المركزي تحت نفس الظروف، يتم استخراج الحبيبة الناتجة في مخزن الملح العالي (TEN مع 1٪ (v/v) Triton X-100 و1.5 M KCl).
  8. بعد الطرد المركزي تحت نفس الظروف، اغسل الحبيبة باستخدام مخزن TEN.
  9. قم بإذابة الحبيبات النهائية في 10 مل من مخزن اليوريا (8 مليون يوريا، 20 ملليمول تريس-HCl، درجة الحموضة 7.4، 5 ملليمول EDTA، و0.2 ملليمول PMSF) عن طريق التحريك لمدة 3 ساعات في درجة حرارة الغرفة.
  10. تستخرج اليوريا بالطرد المركزي بقوة 80,000 ×جرام في جهاز الطرد المركزي فوق الطرد المركزي على الطاولة عند درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة 20 دقيقة.
  11. أضف البولي إيثيلينامين (1٪ (v/v)) إلى الجزء القابل للذوبان في اليوريا إلى تركيز نهائي 0.06٪ (v/v) وحضن الثلج لمدة 5 دقائق.
  12. قم بالطرد المركزي عند 80,000x g عند 4 درجات مئوية لمدة 20 دقيقة، ثم تحليل الجزء الفائق السائل مقابل المخزن A (6 M يوريا، 20 mM MES، pH 6.0، 14.4 mM β-ميركابتوإيثانول).
  13. تحميل الغلى على عمود تبادل أيونات CM-Sepharose مسجل في المخزن A في نظام كروماتوغرافيا NGC.
  14. بروتينات إلوت ذات تدرج خطي بين 0-0.5 M NaCl في المخزن A على مدى ساعة واحدة بمعدل تدفق 1 مل/دقيقة.
  15. تجمع الكسور التي تحتوي على GFAP وتحليل الداليز ضد المخزن B (6 M يوريا، 10 mM Tris-HCl (pH 8.0)، و1 mM EDTA).
  16. تحميل أقراص الاستكشافات على عمود تبادل أنيون متوازن مسبقا في المخزن B. بروتينات إلوت ذات تدرج خطي بين 0-0.5 M NaCl في المخزن B على مدى ساعة واحدة بمعدل تدفق 1 مل/دقيقة.
  17. حلل كسور الأعمدة بواسطة SDS-PAGE وتلوين Coomassie الأزرق. اجمع تلك التي تحتوي على GFAP منقى وخزنها عند -80 درجة مئوية.
    ملاحظة: يمكن تسهيل تحلل البكتيريا من خلال عدة دورات تجميد وإذابة. يجب ألا يتجاوز التركيز النهائي لبولي إيثيلينامين 0.06٪ (v/v)، وفوق هذا التركيز، ترسب البروتينات أيضا. عند العمل مع المواد الخطرة مثل PMSF و β-ميركابتوإيثانول، من الضروري تضمين إرشادات وتعليمات واضحة للسلامة للتخلص من النفايات الخطرة. PMSF سام للغاية ويمكن أن يسبب تهيج الجلد والعينين والجهاز التنفسي. حضر حلول PMSF طازجة في غطاء بخار وتجنب الاتصال المباشر. استخدم β ميركابتوإيثانول في منطقة جيدة التهوية لأنه يطلق أبخرة قوية وسامة.

2. اختبار التجميع والترسيب في المختبر (الشكل 2)

  1. قم بتخفيف الوزن الخام المنقى أو GFAP المتغير إلى 0.3 ملغ/مل في 6 ملسنة يوريا في محلول منخفض الملح (10 ملليموتر تريس-HCl، درجة الحموضة 8، 1 ملليمول EDTA، و14.4 ملليمولار β-ميركاباثانول).
  2. قم بتحليل العينات مقابل محلول منخفض الملح يحتوي على 4 M ثم 2 M يوريا لمدة 4 ساعات في درجة حرارة الغرفة.
  3. قم بتحليل عينات الداليز مقابل محلول منخفض الملح بدون يوريا طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
  4. افحص عينات الدياليس ضد مخزن التجميع (10 ملليموتر تريس-هيكربونيتل، درجة حموضة 7، 50 ململ ناكليل، و14.4 ملليموين β-ميركابيثانول) في درجة حرارة الغرفة لمدة 12-16 ساعة.
  5. نقل خلطات التجميع إلى سطح وسادة السكروز التي تحتوي على 0.2 مل من السكروز 0.85 ميل في مخزن التجميع.
  6. في اختبار الترسيب عالي السرعة، يتم طرد المركزي للخلطات عند 80,000× جرام لمدة 20 دقيقة عند 20 درجة مئوية باستخدام جهاز طرد مركزي دقيق فوق الطراز على الطاولة.
  7. تركيز GFAP غير المجمع في الجزء الفائق عن طريق إجراء ترسيب الميثانول/الكلوروفورم15. يعيد تعليق الترسيب في 0.2 مل من محلول عينة لايملي (25 ملليمول تريس-HCl (رقم الهيدروجين 6.8)، 1٪ (مع الوزن) كبريتات الصوديوم الدودسيل (SDS)، 12.5٪ (v/v) جليسرول، 0.01٪ (مع الوزن) البروموفينول الأزرق، و355 ملليمولار β-ميركابتوإيثانول).
  8. أعد تعليق GFAP المجمع في جزء الحبيبات في مخزن عينة Laemmli.
  9. شغل كل من الكسور الفائقة والحبيبات على جل 10٪ (بدون جهل) SDS بولي أكريلاميد هلام الرحلان الكهربائي (SDS-PAGE) وصبغ ب 10 مل من اللون الأزرق الكوماسي.
  10. في اختبار الترسيب منخفض السرعة، يتم تجميع الخلطات من الطرد المركزي عند 3000× جرام لمدة 5 دقائق عند 20 درجة مئوية باستخدام جهاز طرد مركزي على الطاولة.
  11. أضف 0.2 مل من مخزن عينة Laemmli إلى الأشكال غير المجمعة من GFAP في الجزء الفائق.
  12. أعد تعليق GFAP المجمع مباشرة في جزء الحبيبات في مخزن عينة Laemmli في حجم يتناسب مع الجزء الفائق.
  13. حلل كل من كسور الفائق والحبيبات بواسطة 10٪ (مع ضخامة) جل SDS-PAGE، يليه تلوين Coomassie الأزرق.
    ملاحظة: الميثانول والكلوروفورم مذيبان سامان ويمكن أن يسببهما آثار صحية شديدة. تجنب ملامسة الجلد والاستنشاق. تعامل معها بحذر في غطاء بخار لمنع التسكيب.

3. التلوين السلبي والمجهر الإلكتروني (الشكل 2)

  1. تفريغ التوهج في شبكات النحاس المطلية بالكربون من فورمفار/لمدة 45 ثانية عند 20 مللي أمبير في نظام تنظيف تفريغ توهج.
  2. توصيل خلطات التجميع إلى شبكة التفريغ المتوهج والسماح للعينات بالارتباط بفيلم الدعم لمدة 60 ثانية.
  3. قم بإزالة السائل الزائد عن طريق امتصاص حافة الشبكة بقطعة من ورق الصبغ.
  4. اغسل الشبكات بالماء المقطر، ثم صبغ ب 20 ميكرولتر من أسيتات اليورانيل بنسبة 1٪ لمدة 60 ثانية.
  5. أزل محلول التلوين الزائد ودع الشبكة تجف في الهواء لمدة 30 ثانية.
  6. فحص الشبكات تحت مجهر إلكترون النقل H-7600 (TEM) باستخدام وضع عالي الدقة عند جهد متسارع 100 كيلوفولت.
    ملاحظة: تفريغ الشبكات المتوهج في مبخر الفراغ قبل إضافة عينة البروتين يحسن امتصاص العينات إلى الشبكة. أسيتات اليورانيل هي مادة كيميائية مشعة وشديدة السمية تستخدم عادة في المجهر الإلكتروني للتلوين السلبي. يتطلب التعامل معه الالتزام الصارم ببروتوكولات السلامة وتعليمات التخلص من النفايات الخطرة لتقليل مخاطر التعرض للأفراد والبيئة. حضر محليلات أسيتات اليورانيل فقط في غطاء أبخرة لمنع استنشاق الجزيئات أو الأبخرة المحمولة في الهواء.

4. التعديل التأكسدي (الشكل 3)

  1. قم بتخفيف GFAP إلى 0.3 ملغ/مل في 6 ملجن يوريا في محلول منخفض الملح (10 ملليموتر تريس-HCl، درجة حموضة 8، 1 ملليمولار EDTA و14.4 ملليمولار β-ميركابانول) في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين.
  2. قم بتحليل الداليز ضد محلول منخفض الملح الذي يحتوي على 4 مليون يوريا لمدة 2.5 ساعة في درجة حرارة الغرفة. حرك المخزن بلطف باستخدام محرك مغناطيسي للحفاظ على توزيع منتظم ومنع تدرجات التركيز.
  3. بعد 2.5 ساعة، انقل غشاء الغسيل إلى المخزن منخفض الملح الذي يحتوي على 2 مليون يوريا لمدة 2.5 ساعة أخرى في درجة حرارة الغرفة، مع ضمان التحريك اللطيف طوال العملية.
  4. قم بتحليل الداليز ضد محلول منخفض الملح بدون يوريا عند 4 درجات مئوية لمدة 18 ساعة.
  5. عالج العينات المعدلة ب 10 مللي مولارH 2O2 لمدة 15 دقيقة، تليها المعالجة ب 10 أو 100 ملم من ديثيوثرايتول (DTT) لمدة 15 دقيقة إضافية في درجة حرارة الغرفة.
  6. تحليل عينات البروتين باستخدام معيار 10٪ (مع الزجاج) SDS-PAGE بدون β-ميركابانول وصبغ ب 10 مل من اللون الأزرق الكوماسي.
    ملاحظة: عند استخدامH2O2، تعامل معه بحذر لأنه عامل مؤكسد قوي وقد يسبب حروق. ارتد معدات الحماية الشخصية لتجنب ملامسة الجلد والعينين. يمكن أن يسبب DTT تهيجا للجلد والعينين والجهاز التنفسي. عند العمل مع DTT وH2O2، من الضروري اتباع بروتوكولات السلامة المناسبة لتقليل المخاطر.

5. تنقية GFAP من دماغ فئران AxD (الشكل 4A,B)

  1. استخلاص أنسجة الدماغ التي تحتوي على 10 مل من TEN buffer (10 mM Tris-HCl، pH 7.4، 100 mM NaCl، و5 mM EDTA) باستخدام متجانس Douce.
  2. يقوم بالطرد المركزي في الدماغ بالتجانس عند 76,000× جرام عند 4 درجات مئوية لمدة 20 دقيقة، ثم استخرج الحبيبة الناتجة باستخدام 10 مل من مخزن Triton X-100 (1٪ (v/v) Triton X-100 في مخزن TEN).
  3. قم بالطرد المركزي عند 76,000x g عند 4 درجات مئوية لمدة 20 دقيقة، ثم استخرج الحبيبة الناتجة باستخدام 10 مل من محلول السكروز (0.85 مليون سكروز و0.5٪ (v/v) ترايتون X-100 في مخزن TEN).
  4. قم بالطرد المركزي عند 76,000× جرام عند 4 درجات مئوية لمدة 20 دقيقة، ثم استخرج الحبيبة الناتجة باستخدام 10 مل من محلول الملح العالي (1.5 مليون كيلو سيلتر و0.5٪ (v/v) ترايتون X-100 في مخزن TEN).
  5. قم بالطرد المركزي عند 76,000x جرام عند 4 درجات مئوية لمدة 20 دقيقة، ثم استخرج الحبيبة النهائية باستخدام 10 مل من حاجز اليوريا (8 مليون يوريا، 10 ملليمول تريس-HCl، درجة الحموضة 7.4، و5 ملليمول EDTA).
  6. اجمع الجزء الفائق وقم بتحليل الديل مقابل مخزن عمود Q (6 M يوريا، 10 mM Tris-HCl، pH 8، 5 mM EDTA، و14.4 mM β-ميركابتوإيثانول).
  7. تحميل الغسيل على عمود تبادل الأنيون في نظام كروماتوغرافيا NGC.
  8. قم بإخراج البروتين المرتبط بتدرج خطي يتراوح بين 0-0.5 M NaCl في مخزن Q بمعدل تدفق 1 مل/دقيقة.
  9. تجمع الكسر المحتوي على GFAP وتحلل الديالة ضد عازل عمود S (6 M يوريا، 20 mM MES، pH 6، و14.4 mM β-ميركابتوإيثانول).
  10. تطبيق الغلىيات على عمود تبادل الكاتيونات، ثم تفريغ البروتينات المرتبطة بتدرج خطي بين 0-1 M NaCl في مخزن S بمعدل تدفق 1 mL/min.
  11. حلل الكسور المائلة بواسطة SDS-PAGE وصبغة Coomassie الزرقاء الزرقة، وجمع تلك التي تحتوي على GFAP منقى.

6. تحليل اليوبيكويتين GFAP عن طريق الحقن المناعي (الشكل 4C)

  1. شغل GFAP منقى على جل SDS-PAGE بنسبة 10٪ (بدون معادلة).
  2. انقل البروتينات من الجل إلى غشاء نيتروسيلولوز.
  3. قم بحضنه بغشاء 10 مل من ألبومين مصل البقري بنسبة 3٪ (مع الوزن/ضج) في محلول ملحي مخزن بتريس (TBS: 20 ملليموتر تريس-HCl، pH 7.4، 150 ملليمولار NaCl) يحتوي على 0.1٪ (v/v) Tween 20 (TBST) لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.
  4. حضن الغشاء ب 5 ميكرولتر من مضاد GFAP و5 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية المضادة لليوبيكوتين المخففة بمقدار 5 مل من TBST عند 4 درجات مئوية خلال الليل. اغسل الغشاء ثلاث مرات باستخدام TBST.
  5. حضن الغشاء ب 5 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية المتوافقة مع أصباغ فلورية، مخففة ب 5 مل من TBST، في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة على الأقل. اغسل الغشاء ثلاث مرات باستخدام TBST.
  6. التقاط الصور باستخدام نظام كشف الصور الفلورية.
  7. تحليل التجميع الصناعي ل GFAP الأصلي بواسطة اختبارات TEM والترسيب (الشكل 5) باستخدام نفس الإجراء الموضح في الخطوات 2.1 إلى 2.13 والخطوات 3.1 إلى 3.6.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

لدراسة كيفية تأثير الطفرات المسببة ل AxD على خصائص تجميع GFAP، قمنا بإنتاج بروتينات مؤتلفة في البكتيريا باستخدام نظام تعبير قائم على PET. نشرح بروتوكولات التعبير والتنقية من GFAP، باستخدام WT GFAP كمثال. بعد إدخال IPTG (الشكل 1A، المسار 2)، تم تنقية GFAP من خلال عملية من ثلاث خطوات تشمل تحضير جسم الشمول (الشكل 1B) وكروماتوغرافيا تبادل الأيونات مع عمود CM (الشكل 1C، المسار 1) وعمود Q (الشكل 1C، المسارات ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يضع هذا البروتوكول إطارا تجريبيا شاملا لتوصيف GFAP وطفراته المرتبطة بالمرض في الخصائص الكيميائية الحيوية. من خلال توفير نهج موثوق وموحد، تعد هذه الطريقة موردا قيما يعزز فهمنا للأدوار البيولوجية ل GFAP وتداعياته المرضية، خاصة في سياق AxD. في هذا القسم، نناقش عدة جوانب حاسمة من البروتوكول، بما في ذلك التعديلات المحتملة واستراتيجيات استكشاف المشكلات، وقيود الطريقة، وأهميتها مقارنة بالمناهج الحالية، وأهميتها الأوسع وتطبيقاتها في مجالات بحثية محددة.

في هذه الدراسة،...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

نشكر الدكتور تريسي هاجمان (مركز وايزمان، جامعة ويسكونسن-ماديسون) على توفير فئران R237H التي تصادف النوم. الاقتراح والدعم من البروفيسور ألبي ميسينغ (مركز وايزمان، جامعة ويسكونسن-ماديسون) لهذه الدراسة محل تقدير كبير. وقد تم دعم هذا العمل بمنح من وزارة العلوم والتكنولوجيا (111-2320-B-007-008 و112-2320-B-007-006 إلى N.-H. L. و M.-D.P.). نشكر أيضا BioTEM في جامعة تسينغ هوا الوطنية (MOST-104-2731-M-007-002) على استخدام المعدات في هذه الدراسة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
30٪ محلول أكريلاميد/بيس 37.5:1بيوراد1610158
بيرسلفات الأمونيوم (APS)بيوراد1610700
الأمبيسيلينUSB11259
الأجسام المضادة المضادة ل GFAPتقنية الإشارة الخلوية12389
الأجسام المضادة المضادة لليوبيكوتينميليبورST 1200نسخة مستنسخة FK2
جهاز الطرد المركزي Avanti J-26S XPبيكمان
الكلوروأمفينيكولUSB23660
سي إم-سيفروزسيتيفا1707 1901
صبغة كوماسي الزرقاءUSB32826
شبكة النحاستيد بيلا01753-F
CS 150 NX Micro ultracentrfugeهيتاشيNA
متجانس العودويتون
DTTURDTT
سلالة الإشريكية القولونية BL21(DE3) pLysSأجيلينت
إيزي غلوتيد بيلا
كاشف ECLبيركينإلمر105001 نيل
EDTAUSB15699
H2O2سيغما-ألدرتش18312
عمود HiRes Sسيتيفا2927 5877
عمود HiTrap Qسيتيفا1711 5301
IPTGURIPTG
KClهانيويل12636
LB متوسط (LB Agar)USB75851
LB متوسط (LB Broth)بي دي ديفكو244620
ميركابتوإيثانولسيغما-ألدرتشM3148
MESسيغما-ألدرتشM8250
NaClهانيويل31434S
نظام الكروماتوغرافيا NGCبيوراد
أوبتيما XE-90 ألترا تفريغبيكمان
PMSFأكروس أورجانيكس215740050
بوليإهتايلينيمينسيغما-ألدرتشP3143
الدواربيكمان
دوار S55Sهيتاشي
دوار S80AT3هيتاشي
SDSUSB75819
صفحة SDSبيوراد
StarBright Blue 520 مضاد للفأر IgG بيوراد12005867
StarBright Blue 700 ضد الأرانب IgG بيوراد12004161
سكروزسيغما-ألدرتشS5391
TEMEDUSB76320
المجهر الإلكتروني الناقل H-7700)هيتاشيNA
تريسUSB75825
ترايتون X-100سيغما-ألدرتشT9284
أسيتات يورانيلعلوم المجهر الإلكتروني  22400
اليورياهانيويل15604ه

المراجع

  1. Brenner, M., et al. Mutations in GFAP, encoding glial fibrillary acidic protein, are associated with Alexander disease. Nat Genet. 27 (1), 117-120 (2001).
  2. Hagemann, T. L., et al. Gene expression analysis in mice with elevated glial fibrillary acidic protein and Rosenthal fibers reveals a stress response followed by glial activation and neuronal dysfunction. Hum Mol Genet. 14 (16), 2443-2458 (2005).
  3. Hagemann, T. L. Alexander disease: models, mechanisms, and medicine. Curr Opin Neurobiol. 72, 140-147 (2022).
  4. Iwaki, T., et al. Alpha B-crystallin and 27-kd heat shock protein are regulated by stress conditions in the central nervous system and accumulate in Rosenthal fibers. Am J Pathol. 143 (2), 487-495 (1993).
  5. Goldman, J. E., Corbin, E. Rosenthal fibers contain ubiquitinated alpha B-crystallin. Am J Pathol. 139 (4), 933-938 (1991).
  6. Yang, A. W., Lin, N. H., Yeh, T. H., Snider, N., Perng, M. D. Effects of Alexander disease-associated mutations on the assembly and organization of GFAP intermediate filaments. Mol Biol Cell. 33 (8), ar69(2022).
  7. Chen, Y. S., Lim, S. C., Chen, M. H., Quinlan, R. A., Perng, M. D. Alexander disease-causing mutations in the C-terminal domain of GFAP are deleterious both to assembly and network formation with the potential to both activate caspase 3 and decrease cell viability. Exp Cell Res. 317 (16), 2252-2266 (2011).
  8. Battaglia, R. A., et al. Site-specific phosphorylation and caspase cleavage of GFAP are new markers of Alexander disease severity. Elife. 8, e47789(2019).
  9. Viedma-Poyatos, A., Gonzalez-Jimenez, P., Pajares, M. A., Perez-Sala, D. Alexander disease GFAP R239C mutant shows increased susceptibility to lipoxidation and elicits mitochondrial dysfunction and oxidative stress. Redox Biol. 55, 102415(2022).
  10. Lin, N. H., Jian, W. S., Snider, N., Perng, M. D. Glial fibrillary acidic protein is pathologically modified in Alexander disease. J Biol Chem. 300 (7), 107402(2024).
  11. Kondo, T., et al. Modeling Alexander disease with patient iPSCs reveals cellular and molecular pathology of astrocytes. Acta Neuropathol Commun. 4 (1), 69(2016).
  12. Hagemann, T. L., et al. Antisense therapy in a rat model of Alexander disease reverses GFAP pathology, white matter deficits, and motor impairment. Sci Transl Med. 13 (620), eabg4711(2021).
  13. Bar, H., et al. Severe muscle disease-causing desmin mutations interfere with in vitro filament assembly at distinct stages. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (42), 15099-15104 (2005).
  14. Gu, L. H., Coulombe, P. A. Defining the properties of the nonhelical tail domain in type II keratin 5: insight from a bullous disease-causing mutation. Mol Biol Cell. 16 (3), 1427-1438 (2005).
  15. Wessel, D., Flugge, U. I. A method for the quantitative recovery of protein in dilute solution in the presence of detergents and lipids. Anal Biochem. 138 (1), 141-143 (1984).
  16. Ralton, J. E., Lu, X., Hutcheson, A. M., Quinlan, R. A. Identification of two N-terminal non-alpha-helical domain motifs important in the assembly of glial fibrillary acidic protein. J Cell Sci. 107 (Pt 7), 1935-1948 (1994).
  17. Nagai, K., Thogersen, H. C. Synthesis and sequence-specific proteolysis of hybrid proteins produced in Escherichia coli. Methods Enzymol. 153, 461-481 (1987).
  18. Vorgias, C. E., Traub, P. Isolation of glial fibrillary acidic protein from bovine brain white matter and its purification by affinity chromatography on single-stranded DNA-cellulose. Biochem Biophys Res Commun. 115 (1), 68-75 (1983).
  19. Vorgias, C. E., Traub, P. Nucleic acid-binding activities of the intermediate filament subunit proteins desmin and glial fibrillary acidic protein. Z Naturforsch C J Biosci. 41 (9-10), 897-909 (1986).
  20. Lin, N. H., Jian, W. S., Perng, M. D. Deletions in glial fibrillary acidic protein leading to alterations in intermediate filament assembly and network formation. Int J Mol Sci. 26 (5), 1913(2025).
  21. Herrmann, H., Kreplak, L., Aebi, U. Isolation, characterization, and in vitro assembly of intermediate filaments. Methods Cell Biol. 78, 3-24 (2004).
  22. Kim, B., Kim, S., Jin, M. S. Crystal structure of the human glial fibrillary acidic protein 1B domain. Biochem Biophys Res Commun. 506, 2899-2905 (2018).
  23. Lin, N. H., Messing, A., Perng, M. D. Characterization of a panel of monoclonal antibodies recognizing specific epitopes on GFAP. PLoS One. 12 (7), e0180694(2017).
  24. Eliasson, C., et al. Intermediate filament protein partnership in astrocytes. J Biol Chem. 274 (34), 23996-24006 (1999).
  25. Jing, R., et al. Synemin is expressed in reactive astrocytes in neurotrauma and interacts differentially with vimentin and GFAP intermediate filament networks. J Cell Sci. 120 (Pt 7), 1267-1277 (2007).
  26. Thomsen, R., Pallesen, J., Daugaard, T. F., Borglum, A. D., Nielsen, A. L. Genome-wide assessment of mRNA in astrocyte protrusions by direct RNA sequencing reveals mRNA localization for the intermediate filament protein nestin. Glia. 61 (11), 1922-1937 (2013).
  27. Perng, M. D., et al. Intermediate filament interactions can be altered by HSP27 and alphaB-crystallin. J Cell Sci. 112 (Pt 13), 2099-2112 (1999).
  28. Tian, R., Gregor, M., Wiche, G., Goldman, J. E. Plectin regulates the organization of glial fibrillary acidic protein in Alexander disease. Am J Pathol. 168 (3), 888-897 (2006).
  29. Lin, N. H., Yang, A. W., Chang, C. H., Perng, M. D. Elevated GFAP isoform expression promotes protein aggregation and compromises astrocyte function. FASEB J. 35 (5), e21614(2021).
  30. Hagemann, T. L., Connor, J. X., Messing, A. Alexander disease-associated GFAP mutations in mice induce Rosenthal fiber formation and a white matter stress response. J Neurosci. 26 (43), 11162-11173 (2006).
  31. Eng, L. F. The glial fibrillary acidic protein: the major protein constituent of glial filaments. Scand J Immunol Suppl. 9, 41-51 (1982).
  32. Yen, S. H., Dahl, D., Schachner, M., Shelanski, M. L. Biochemistry of the filaments of brain. Proc Natl Acad Sci U S A. 73 (2), 529-533 (1976).
  33. Goldman, J. E., Schaumburg, H. H., Norton, W. T. Isolation and characterization of glial filaments from human brain. J Cell Biol. 78 (2), 426-440 (1978).
  34. Tsukita, S., Ishikawa, H., Kurokawa, M. Isolation of 10-nm filaments from astrocytes in the mouse optic nerve. J Cell Biol. 88 (1), 245-250 (1981).
  35. Rasmussen, S., Sensenbrenner, M., Devilliers, G., Schousboe, A., Bock, E. Isolation of intermediate filaments from rat astrocytes in culture. Neurosci Lett. 25 (2), 119-124 (1981).
  36. Yang, Z. W., Babitch, J. A. Factors modulating filament formation by bovine glial fibrillary acidic protein, the intermediate filament component of astroglial cells. Biochemistry. 27 (18), 7038-7045 (1988).
  37. Liem, R. K., Hutchison, S. B. Purification of individual components of the neurofilament triplet: filament assembly from the 70 000-dalton subunit. Biochemistry. 21 (13), 3221-3226 (1982).
  38. Dahl, D., Bignami, A. Glial fibrillary acidic protein from normal and gliosed human brain: demonstration of multiple related polypeptides. Biochim Biophys Acta. 386 (1), 41-51 (1975).
  39. Fukuyama, R., Fushiki, S., Fujita, S. Purification of glial fibrillary acidic protein (GFAP) from normal bovine brain. J Neurosci Methods. 40 (2-3), 133-137 (1991).
  40. Dahl, D., Crosby, C. J., Gardner, E. E., Bignami, A. Purification of the glial fibrillary acidic protein by anion-exchange chromatography. Anal Biochem. 126 (1), 165-169 (1982).
  41. Dahl, D., Bignami, A. Glial fibrillary acidic protein from normal human brain: purification and properties. Brain Res. 57 (2), 343-360 (1973).
  42. Perng, M., et al. The Alexander disease-causing glial fibrillary acidic protein mutant, R416W, accumulates into Rosenthal fibers by a pathway that involves filament aggregation and the association of alpha B-crystallin and HSP27. Am J Hum Genet. 79 (2), 197-213 (2006).
  43. Hsiao, V. C., et al. Alexander-disease mutation of GFAP causes filament disorganization and decreased solubility of GFAP. J Cell Sci. 118 (Pt 9), 2057-2065 (2005).
  44. Rueger, D. C., Dahl, D., Bignami, A. Purification of a brain-specific astroglial protein by immunoaffinity chromatography. Anal Biochem. 89 (2), 360-371 (1978).
  45. Bignami, A., Dahl, D. Isolation of GFA protein from normal brain-a comment. J Histochem Cytochem. 27 (2), 693-696 (1979).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

GFAP SDS
الأساليب التجريبية للتحليل الكيميائي الحيوي للبروتين الحمضي الليفي الدبقي ومتغيرات المرض المرتبطة به
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.