مقالة منهجية

تنقية الأرواح الغبية HLA-G+ من الأنسجة المشيمة البشرية لتحديد الظاهرة والتحليل الوظيفي

545 مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/69545

⸱

مارس 13, 2026

 ,  ,  , 
1Division of Immunobiology, Cincinnati Children's Hospital Medical Center, 2Department of Obstetrics and Gynecology, Faculty of Medicine, University of Toyama, 3Immunology Graduate Program, University of Cincinnati College of Medicine, 4Department of Pediatrics, University of Cincinnati College of Medicine

في هذه المقالة

ملخص

يتيح هذا البروتوكول تنقية وتوصيف وزراعة الخلايا التروسفونية الزائدة الشهيرة الأولية HLA-G+ (EVT) من الديسيدوآ القاعدية والغشاء المشيمي للمشيمة البشرية المصطلحة. تحافظ زراعة EVT الأولية على صلاحية النشاط لمدة 96 ساعة، مما يسمح بالزراعة المشتركة مع خلايا المناعة الأمومة المتطابقة مع العينة والتحليل الخلوي والجزيئي اللاحق لتفاعلاتها.

الملخص

تمثل واجهة الأم والجنين البشري بيئة مناعية فريدة حيث تتفاعل خلايا المناعة الأمومة والخلايا التروفوبولية خارج الشر (EVT) في اتصال خلوي مباشر لتأسيس والحفاظ على تحمل المناعة. تظهر EVT نمطا مناعيا مميزا يتميز بالتعبير عن جزيئات تحملت، بما في ذلك HLA-G وPD-L1 وPD-L2، والتي تلعب أدوارا محورية في تنظيم استجابات المناعة لدى الأم. بالإضافة إلى ذلك، يعبر EVT البشري عن HLA-C الذي يمكن التعرف عليه مباشرة بواسطة خلايا NK وT الأمومة ويعزز تفعيلها. ومن المهم أن لا توجد تعقيدات HLA-C أو HLA-G في نماذج الحيوانات المستخدمة في الأبحاث، كما أن التروفوبلاست في الفأر تفتقر إلى التعبير عن MHC. لذا، فإن دراسة الخصائص الظاهرية والوظيفية لEVT البشري من الأنسجة المشيمية، تحت كل من الظروف الفسيولوجية والمرضية، أمر ضروري لتوضيح الآليات الكامنة وراء الحفاظ على الحمل والفيزيولوجيا المرضية لالتهاب المشيمة المرتبط بتسمم الحمل، والولادة المبكرة، وتقييد نمو الجنين، وتراكم المشيمة. يحدد هذا البروتوكول منهجية شاملة لعزل وتوصيف EVT البشري الأولي من الأنسجة المشيمة الصحية وكذلك بعد الولادة المبكرة وتسمم الحمل. ويشمل ذلك: (1) تشريح أنسجة المشيمة والأغشية المشيمية؛ (2) الهضم الإنزيمي وتحضير معلقات خلية واحدة؛ (3) تنقية EVT بواسطة فرز FACS؛ (4) التوصيف الظاهري بواسطة قياس خلوي التدفق عالي الأبعاد؛ و(5) الزراعة قصيرة الأمد في المختبر والزراعة المشتركة مع خلايا المناعة الأمومة لمدة تصل إلى 96 ساعة. يركز على الحصول على EVT نقي وقابل للحياة مناسب للتطبيقات اللاحقة مثل الاختبارات المناعية الوظيفية، وتحليل البروتين والتعبير الجيني. يتيح تطبيق هذا البروتوكول منصة قوية وقابلة للتكرار لتعزيز فهم التفاعلات بين الخلايا المناعية والخلايا المناعية للأم وتأثيراتها على الحمل الصحي والمعقد.

المقدمة

تحتوي المشيمة البشرية على أربع فئات واسعة من أنواع الخلايا التفوبولوجية، والخلايا الجذعية للتروفوبلاست، والخلايا المشوهة المخلية، والخلايا التروفيروسية الزائدة (EVT)، ولكل منها وظائف وخصائص ظاهرية مميزة. من بينها، يظهر EVT خصائص مناعية فريدة، بما في ذلك التعبير العالي عن الجزيئات المثبطة للمناعة، مثل HLA-G، PD-L1، PD-L2، وأعضاء عائلة B7، بالإضافة إلى HLA-C متعدد الأشكال 1,2,3,4,5,6. تغزو EVT بعمق في نسيج الأم الساقي الشرقي والشرايين الحلزونية والعضلة العضلية، مما يضعها على اتصال مباشر مع خلايا المناعة الأمومة7. تتميز EVT بتعبير بارز عن HLA-C متعدد الأشكال، وهو وسيط رئيسي للتفاعلات مع خلايا الأم التائية وخلايا NK التي يجب التحكم بها للحفاظ على تحمل المناعة أثناء الحمل. وباعتباره الجزيء الكلاسيكي الوحيد لل MHC الذي يعبر عنه EVT، فإن HLA-C يتيح أيضا تقديم المستضد لخلايا الذاكرة الأمومية ويدعم الحماية المناعية8. ومع ذلك، أظهرت عدة دراسات أن EVT يزيد بشكل مباشر من خلايا CD4 التائية التنظيمية والحالات المسببة للتحمل لخلايا CD8 T وخلايا NK لحماية نفسها من السمية الخلوية ورفض المناعة 9,10,11,12,13. بالإضافة إلى ذلك، أبلغت بعض الدراسات عن تغيرات مناعية في خلايا المناعة الأمومة وEVT للمشيمة التي تم الحصول عليها بعد تسمم الحمل أو الولادة المبكرة أو الإجهاض مقارنة بالعدد الأصحاء14، 15، 16، 17، 18، 19، 20، 21. قد تكون هناك عدة احتمالات وراء هذه التغيرات المناعية، بما في ذلك 1) وجود خلل في خلايا T الأمومة مسبقا؛ 2) ضعف الوظائف المثبطة للمناعة في EVT؛ أو 3) تعطيل التفاعلات بين نوعي النوعين. لتوضيح الدوافع الميكانيكية الأساسية، فإن أنظمة النمذجة التجريبية خارج الجسم الحي التي تسمح بتقييم خلايا المناعة الأمومة وتفاعلات EVT ضرورية.

الطرق والأساليب المعروضة هنا لها عدة فوائد مقارنة بالطرق الحالية التي تستخدم خطوط الخلايا الجذعية الكلاسيكية أو نماذج الخلايا الجذعية للتروفوباست أو العضويات. والأهم من ذلك، أن خطوط الخلايا الكلاسيكية ونماذج الخلايا الجذعية للتروفوباست لا تعيد تلخيص السمات الأساسية لل EVT الأولي، بما في ذلك ملفات تعبير MHCالخاصة بها 3,5,22,23. ثانيا، المتطلبات المعقدة للوسط لخلايا الخلايا الجذعية الصبغية البشرية (hTSC) والمزارع العضوية التي تتضمن عدة مثبطات جزيئية تؤثر بشكل مباشر على وظائف الخلايا المناعية والنمط الظاهري، مما يمنع التقييم الكافي لتفاعلات الخلايا المناعيةوالخلايا المناعية 22,24,25,26,27 . أخيرا، يسمح التنوع الخلوي لثقافات hTSC بعد التمايز والطبيعة المقلوبة لهياكل الأعضاء المشيمية بالتفاعلات المناعية مع أنواع التروفوبلاست التي تفتقر إلى الصلة بالحياة الحية (innvivo)، مما يقلل من وضوح الدراسات22,27.

هنا، نستعرض طرقا لتنقية HLA-G+ EVT الأولي من أنسجة المشيمة البشرية، مما يمكن الزراعة لمدة تصل إلى 96 ساعة في وجود أو غياب تجمعات الخلايا المناعية. يفتقر الوسط إلى مثبطات جزيئية تؤثر على وظائف EVT وخلايا المناعة مع الحفاظ على قابليتها. يوفر هذا النهج منصة قيمة لدراسات مباشرة خارج الجسم الحي حول التفاعلات بين الخلايا البيضاء والخلايا المناعية في حالات الحمل الصحية والمعقدة. من المتوقع أن يساهم في اكتشاف المحركات الرئيسية لتحمل المناعة بين الأم والجنين وتحديد الأهداف العلاجية لعلاج التهاب المشيمة.

البروتوكول

وافق مجلس المراجعة المؤسسي في مستشفى سينسيناتي للأطفال على هذا البروتوكول البحثي (الموافقة #2021-0336)، والذي يفي بمتطلبات الاعتبارات الأخلاقية الحيوية، والتعامل مع المعلومات الشخصية، ومسببات الأمراض المعدية، وإجراءات الموافقة المستنيرة وفقا للقانون الأمريكي. يجب على كل مختبر الحصول على موافقة تتوافق مع الإرشادات الوطنية للبحث قبل بدء التجربة.

يركز هذا البروتوكول على زراعة HLA-G+ EVT الأولي الذي يحافظ على قابلية الفعالية حتى 96 ساعة للفحص الوظيفي الثانوي من خلال تحسين بروتوكولناالسابق 2,28. راجع هاميلتون وآخرون 2 لتحديد خط الخلايا الشبيه ب EVT في HLA-G+ وIkumi وآخرون 28 لتشمل الخلايا اللمفاوية المتساقطة للأم المتطابقة.

1. إعداد المختبر (اليوم 0).

ملاحظة: استخدم خزانة سلامة حيوية من الفئة الثانية (BSL2) للتعامل مع العينات.

  1. قم بإعداد حمامين مائيين عند 39 درجة مئوية و37 درجة مئوية. قم بتركيب حاضنة ثاني أكسيد الكربون 2 رطبة عند 37 درجة مئوية.
  2. حضر 1x PBS، غسل متوسط A، غسل متوسط B، زراعة EVT وسط A، B، و C (الجدول 1 والجدول 2).
  3. إذابة محلول 15 مل من محلول DNase I بتركيز 10 ملغ/مل (الجدول 1) و500 مل من 0.25٪ تريبسين/EDTA في حمام مائي عند 37 درجة مئوية.
  4. ضع حاوية مليئة بمحلول مبيد حيوي أو مبيض (مثل مبيض بنسبة 10٪) في خزانة BSL2 لجمع النفايات السائلة. ضع حاوية نفايات مع كيس خطر بيولوجي في خزانة BSL2 للنفايات الصلبة.
  5. جهز وسادات ماصة، وأدوات تشريح معقمة (ملقط ذو طرف منحني ومقص 6 1/2")، ومرشحات معدنية معقمة، ورفوف أنابيب، وأنابيب مخروطية معقمة بحجم 50 مل في خزانة BSL2.
  6. جهز ثلاثة أنابيب مخروطية بحجم 50 مل (اثنان مع 1x PBS لكل منهما وواحد مع Wash Medium A لجمع قطع نسيج المشيمة أثناء التشريح.

2. جمع العينات (اليوم 0)

ملاحظة: استخدم المشيمة البشرية مع أغشية تم الحصول عليها عن طريق الولادة القيصرية بين الأسبوع 24 إلى 42 من الحمل. المشيمة التي تولد مهبليا قد تنتج EVT أقل.

  1. ابدأ معالجة المشيمة فورا في خزانة BSL2، ويفضل خلال ساعة إلى ساعتين من الولادة، لتعظيم إنتاجية الخلايا الصالحة. حافظ على المشيمة في درجة حرارة الغرفة طوال الوقت.
  2. افحص المشيمة وإذا لزم الأمر، سجل حجمها ووزنها ومظهرها الشكلي الكلي.

3. تشريح الأنسجة (اليوم 0)

  1. تشريح الغشاء
    1. ضع المشيمة مواجها للجهة الجنينية للأعلى (جزء إدخال الحبل السري مرئي). إزالة السلى الأمنيون، وهو الطبقة الغشائية الأقرب إلى جانب الجنين، عن طريق تقشير يدوي من الغشاء الجانبي نحو موقع إدخال الحبل السري؛ اقطع وتخلص من الأمنيون.
    2. اقطع الغشاء المشيمي النفضي إلى شرائط بحجم 2 بوصة تبدأ من قاعدة المشيمة إلى الأعلى، مع ترك شريط الغشاء ملتصقا بالمشيمة.
    3. ضع شريط الغشاء المشيمي النفضي على الإصبعين الواجهان الجانب المتساقط للأعلى وكشط الشريط الجداري الأموي من المشيمية باستخدام ملقط الأطراف المنحني المعقم.
      ملاحظة: اعمل بكفاءة ولا تدع الغشاء المشيمي يجف.
    4. اجمع الغشاء المشيمي في أنبوب مخروطي بحجم 50 مل مع 20 مل من وسط الغسيل A.
    5. اجمع النسيج الجداري لعزل الخلايا اللمفاوية الساقية في أنبوب مخروطي بحجم 50 مل يحتوي على 20 مل من PBS واتبع البروتوكول الذي وصفه إيكومي وآخرون لعزل الخلايا اللمفاوية28.
    6. اقطع الغشاء المشيمي بالمقص في أنبوب 50 مم حتى يتحول إلى قطع صغيرة من <2 مم2.
      ملاحظة: الكمية الإجمالية للغشاء المستقر هي من المثالي 30 مل بعد القطع.
    7. تخلص من غسيل Medium A واغسل ب PBS عدة مرات حتى يصبح السائل صافيا.
  2. تشريح المشيمة
    1. ضع المشيمة موجهة للجانب الأمي للأعلى وأزل الجلطات الدموية. اقطع قطع صفيحة المشيمة القاعدية (الطول 2 سم، العرض 2 سم، العمق 0.5 سم) باستخدام مقص معقم، مع تجنب الأجزاء النخرية أو المتكلسة أو الإقفاري.
    2. ضع قطعة الديسيدوا بازاليس على الأصابع المواجهة للزغب (جانب الجنين) إلى الأعلى. قم بإزالة الزغب بعناية من الديسيدوا بازاليس باستخدام المقص للحصول على 2-3 مم من الغشاء مع تبقى طبقة رقيقة فقط من الزغابات على البازاليس.
    3. اجمع أنسجة القشرة البازالية في أنبوب مخروطي بحجم 50 مل يحتوي على 20 مل من PBS. اقطع الديسيدوا بازاليس حتى تصبح قطعا صغيرة من <2 مم2.
      ملاحظة: الكمية الإجمالية للنسيج المستقر هي من الأفضل 15 مل بعد التقطيع.
    4. تخلص من PBS واغسل البازاليس المتساقط ب PBS عدة مرات حتى يصبح الفائق شفافا دون وجود دم ظاهر.
    5. قسم 15 مل من تعليق الأنسجة إلى أنبوبين مخروطيين بحجم 50 مل (7.5 مل في كل أنبوب).
      ملاحظة: بروتوكول عزل الخلايا اللمفاوية من ديسيدوا بازاليس يختلف عن هذا البروتوكول. راجع البروتوكول المقدم في هاميلتون وآخرين.

4. هضم الأنسجة (اليوم 0)

  1. بعد الغسل النهائي للغشاء المشيمي وديسيدوآ بازاليس في القسم 3، املأ جميع الأنابيب ب 1x PBS، ثم قم بطرد مركزها عند 200 × جرام لمدة دقيقة واحدة، ثم صب السوبرناتانت.
  2. حضر كوكتيل إنزيم هضم الأنسجة (الجدول 1). أضف 150 مل من كوكتيل إنزيم الهضم الدافئ للأنسجة إلى زجاجة زجاجية بسعة 300 مل، ثم أضف 30 مل من الغشاء المشيمي إلى الزجاجة.
  3. أضف 20 مل من DMEM/F20 الدافئ و80 مل من كوكتيل إنزيم الهضم الدافئ إلى زجاجتين زجاجيتين بسعة 300 مل، ثم أضف 7.5 مل من البازاليس الديسيدوا في كل زجاجة.
  4. حضن الزجاجة بغشاء مشيمي في حمام الماء بدرجة حرارة 39 درجة مئوية، والزجاجتين مع ديسيدوا بازاليس في حمام الماء بدرجة حرارة 37 درجة مئوية. خلال فترة الحضانة التي تستمر 15 دقيقة، اهز جميع الزجاجات كل 3-4 دقائق (الهضم الأول).
  5. بعد الهضم، قم بترشيح الأنسجة المهضومة عبر مناخل معدنية (حجم الشبكة 40). أضف غسول ميديوم ب إلى المناديل للشطف وإذابة المادة الهلامية.
  6. قم بترشيح تعليق الخلايا فوق فلتر بحجم 100 ميكرومتر إلى أنابيب بحجم 50 مل معلمة بنوع الأنسجة ورقم الهضم.
  7. تابع الهضم الثاني بنقل الأنسجة غير المهضومة مرة أخرى إلى زجاجات متوسطة بسعة 300 مل، أضف كوكتيل إنزيم الهضم للأنسجة كما هو موضح في الخطوة 4.2، وكرر الخطوات 4.2-4.6.
    ملاحظة: جميع أنسجة الديسيدوا البازاليسية تنقل إلى زجاجة واحدة بسعة 300 مل. حافظ على فصل الخلايا التي تم الحصول عليها بعد الهضم الأول والهضم الثاني.
  8. قم بتدوير نظام التعليق الخلوي عند 650 × جرام لمدة 8 دقائق وتخلص من السوبرناتانت.
  9. ادمج الحبيبات (لكن اجعل الهضم الأول والثاني منفصلين) من نفس نوع النسيج ورقم الهضم في أنبوب واحد. املأ بغسيل متوسط B حتى 25 مل.

5. تدرج كثافة فيكول (اليوم 0)

  1. جهز أربعة أنابيب مخروطية بحجم 50 مل تحمل نوع الأنسجة ورقم الهضم. صب 12 مل من Ficoll في الأنابيب.
  2. قم بتحميل معلقات الخلايا بحذر على جهاز Ficoll. قم بعمل الطرد المركزي للأنابيب عند 800 × جرام لمدة 20 دقيقة (درجة حرارة الغرفة) بدون فرامل.
  3. انقل بعناية طبقة الخلية عند واجهة فيكول-وسط إلى أنابيب مخروطية نظيفة بحجم 50 مل معلمة حسب نوع الأنسجة ورقم الهضم بعد الطرد المركزي.
    ملاحظة: اجمع الطبقة بعناية دون إزعاج الواجهة باستخدام معصمة نقل معقمة.
  4. املأ الأنابيب بغسيل ميديوم ب، وجهاز طرد مركزي بحرارة 650 × جرام لمدة 8 دقائق.
  5. تخلص من المادة الفائقة وأعد تعليق حبيبات الخلايا مع الوسط المتبقي (حوالي 0.5 مل). إذا لزم الأمر، احتفظ بحوالي 10٪ من تعليق الخلية منفصلا للنمذجة الظاهرية واستخدم 90٪ لفرز الخلايا. عد الخلايا لتحديد عدد الخلايا وقدرتها على البقاء.

6. فرز EVT (اليوم 0)

  1. ضع الحبيبات المعلقة الخلوية المعلقة في أنابيب FACS معقمة تحمل نوع الأنسجة ورقم الهضم. أضف مضاد CD45-BV785 (1:100)، ومضاد HLA-G-APC (1:125)، ومضاد EGFR1-BV711 (1:160) (الجدول 3). حضن الأنابيب لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
  2. أضف 1 مل من Wash Medium B وقم بطرد مركزه على 650 × جرام لمدة 8 دقائق.
  3. تخلص من المادة الفائقة وأعد تعليق حبيبات الخلايا باستخدام غسيل ميديوم B لتكوين تعليق خلوي تقريبا من 1 ×10 إلى 6 خلايا / مل.
  4. قم بترشيح الخلايا عبر مصفاة خلوية بقطر 40 ميكرومتر، مباشرة قبل فرز الخلية، وفرز CD45-HLA-G+EGFR+ EVT إلى أنابيب تحتوي على 1 مل من وسط زراعة EVT A وفقا لاستراتيجية البوابة الموضحة في الشكل 1A.
    ملاحظة: لتحقيق فعالية مثالية للتروفوبلاست، يجب استخدام فرز الخلايا النفاثة في الهواء (مثل بيغ فوت أو موفلو) مع فوهة بحجم 100 ميكرومتر. قد تقلل أجهزة الفرز المعتمدة على السيولة (مثل DB S6 أو Sony Nano) من فعالية الخلايا الغذرية، بينما قد تحافظ استراتيجيات فرز الخلايا المغناطيسية (مثل Easysep أو MACS) على البقاء لكنها ذات نقاء منخفض، مما يؤدي إلى فرط نمو الخلايا في الثقافات.
  5. قم بطرد أنابيب FACS بخلايا مرتبة من الخارج، وتخلص من السوبرناتانت، وأعد تعليق حبيبات الخلايا باستخدام EVT Culture Medium B.
    ملاحظة: تابع القسم التالي لتحضير ألواح الزراعة أثناء فرز الخلايا.

7. زراعة EVT الأولية من نوع HLA-G+ للفحص الثانوي (الأيام 0 - 1)

  1. غطى آبار ألواح زراعة الخلايا ذات القاع المسطح 96 بسعة 50 ميكرولتر من 20 ميكروغرام/مل فيبرونكتين (الجدول 2) في درجة حرارة الغرفة لمدة 45 دقيقة.
  2. قم بإزالة الفيبرونكتين وإضافة تعليق الخلية مع EVT Culture Medium B إلى الآبار. استهدف 0.5 × 10 خلايا EVTبازاليس/200 ميكرولتر من المتوسط/البئر، و1.0 ×10 5 خلايا EVT مشيمية/200 ميكرولتر من الوسط/البئر. حضن صفائح زراعة الخلايا لمدة 12-18 ساعة في حاضنة ثاني أكسيد الكربون المرطبة عند 37 درجة مئوية (حضانة اليوم 0).
  3. في اليوم الأول، أزل الوسط B، وغسل الخلايا بلطف ب 1x PBS، وأضف EVT Culture Medium C مع أو بدون خلايا T لمزيد من الزراعة (المشتركة) (راجع القسم 8).

8. الزراعة المشتركة لفيروس HLA-G+ EVT الأولي مع خلايا T المنشطة (الأيام 0 - 4)

  1. تحفيز خلايا CD8+T من متبرعطرف ثالث (الأيام 0-1)
    1. أثناء فرز HLA-G+ EVT (اليوم 0)، يتم عزل مجموعات خلايا المناعة الطرفية من دم الأم أو المتبرعين بالدم غير المرتبطين بعينة معينة، باستخدام كوكتيل إثراء خلايا T البشرية CD8+ (انظر جدول المواد) يليه الطرد المركزي بتدرج كثافة Ficoll أو فرز FACS.
    2. تقوم خلايا T أو NK المنشطة مسبقا باستخدام خرزات أو سيتوكينات مضادة ل CD3/28 (مثل IL2، IL15، IL12، أو IL18) في وسط زراعة الخلايا اللمفاوية حسب الرغبة.
  2. الزراعة المشتركة EVT مع الخلايا التائية المنشطة (الأيام 1-4)
    1. عد عدد الخلايا اللمفاوية وصنع تعليق الخلايا باستخدام وسط زراعة خلايا اللمفاوية بتركيز 0.5 × 106 / مل. أضف 1 × 105 خلايا لمفاوية إلى آبار EVT الأولية (حجم وسط زراعة الخلايا الليمفاوية C: وسط زراعة الخلايا اللمفاوية = 1:1). حضن الصفائح لمدة 24-72 ساعة في حاضنة ثاني أكسيد الكربون 2 رطبة عند 37 درجة مئوية.
    2. جمع الخلايا اللمفاوية لتحليل التدفق الخلوي وجمع المواد الفائقة لتحليل السيتوكينات.
    3. احصد EVT باستخدام التريبسين واجمع EVT في أنابيب FACS لتحليل التدفق الخلوي في اليوم الرابع (راجع القسم 9).

9. التنمذة الظاهرية لتقنية HLA-G+ EVT الأولية

ملاحظة: تابع التلوين الخلوي فورا واحتفظ ب EVT وجميع المحاليل المطلوبة في درجة حرارة الغرفة في جميع الأوقات.

  1. قم بطرد المركزي بأنابيب FACS ذات EVT الأساسي عند 650 × جرام لمدة 7 دقائق ثم تخلص من السوبرناتانت.
  2. أضف محلول صبغ الكاسباز 3/7 (الجدول 3) إلى حبيبات الخلايا وامزجها بلطف.
  3. صبغ الخلايا بالأجسام المضادة (الجدول 3)، وامزجها بلطف، ثم حضن الخلايا لمدة 20 دقيقة إضافية (إجمالي 30 دقيقة حضانة).
  4. أضف 1 مل من EVT Culture Medium C، وقم بطرد مركزي بالأنابيب على 650 × جرام لمدة 7 دقائق، ثم تخلص من السوبرناتان.
  5. أعد تعليق حبيبة الخلية بسعة 0.4 مل من وسط زراعة EVT الخلوي C. أضف محلول صبغ 7-AAD (5 ميكرولتر/تعليق الخلية) في الأنابيب وتحليل المحلول فورا باستخدام مقياس تدفق خلوي.

النتائج

النتائج المتوقعة للخلايا

من 15 مل من الديسيدوا بازاليس، ينتج معدل HLA-G+ EVT المتوقع 0.1-0.3 × 106 خلايا من الهضم الأول و0.1-0.6 × 106 خلايا من الهضم الثاني (المجموع 0.2-0.8 × 106 خلايا). من 30 مل من الغشاء المشيموي، تكون نتائج HLA-G+ EVT المتوقعة 0.4-1.0 × 106 خلايا من الهضم الأول و0.4-1.5 × 106 خلايا من الهضم الثاني (المجموع 0.8-2.5 × 106 خلايا). من المتوقع أن تكون نسبة الكاسبز 3/7-7-AAD في العزل الحية من 90-95٪.

الثقافة الأساسية لتقنية HLA-G+ EVT

أظهر تحليل قياس التدفق الخلوي لعلامات النسب (HLA-G، HLA-C، EGFR) وعلامات موت الخلايا أن هذا البروتوكول يوفر زراعة EVT أولية فعالة حتى اليوم الرابع (بعد 96 ساعة من طلاء EVT المفرز) (الشكل 1B-D). تعرض صور المجهر الضوئي التمثيلي للمجهر المشيمي الأولي وd.basalis HLA-G+ EVT بعد 24 و48 و72 ساعة من الزراعة (الشكل 2A-F).

الزراعة المشتركة لفيروس HLA-G+ EVT الأولي مع الخلايا التائية

عزز هذا البروتوكول من فعالية EVT الأولي 96 ساعة بعد العزل عن المشيمة، وهو تحسن مقارنة بتقريرنا السابق 1,2,10. لذلك، يمكن تحليل استجابات EVT بعد الزراعة المشتركة مع الخلايا اللمفاوية المحفزة مسبقا، والتي تحاكي الالتهاب الحاد عند واجهة الأم والجنين. تعبر EVT عن HLA-C متعددة الأشكال بالإضافة إلى الجزيئات المثبطة المضادة المثبطة للمناعة، مثل PD-L1، PD-L2، PVR (المعروف أيضا باسم CD155)، B7H3، وHLA-E كما يحددها التلوين الخلوي خارج الخلية (الشكل 3A,B). زاد EVT من تعبير HLA-C، وكذلك PD-L1 وPD-L2 وHLA-E، لكنه لم يزيد من تعبير PVR وB7H3 عند زراعته مع الخلايا اللمفاوية المنشطة لمدة 72 ساعة وفقا للقسم 8 من البروتوكول (الشكل 4A,B). بالإضافة إلى ذلك، لم يلاحظ زيادة في وفيات EVT كما يظهر من تلوين 7AAD والكاسبيز 3/7 (الشكل 4C,D).

الشكل 1
الشكل 1. استراتيجية البوابة لفرز خلايا EVT ومخططات قياس تدفق الخلايا بعد زراعة EVT الفرز. (أ) استراتيجية البوابات التمثيلية لفرز الشريحة الباقية الأرضية القابلة للطيران الداخلي (EVT) والإيبوتي المشيمية. R1 هو بوابة الخلايا الحية في مخطط التشتت الأمامي. R2 هو البوابة لاستبعاد كريات الدم البيضاء CD45+. R3 هو بوابة HLA-G+EGFR+EVT. R4 هو 7-AAD -caspase3/7- EVT حي. على الرغم من أن بوابة R4 ليست ضرورية بالضرورة للفرز، إلا أنها تظهر هنا لتظهر جدوى EVT الأساسي. (ب) مخططات قياس التدفق الخلوي التمثيلية لتحليل HLA-G+EGFR+EVT مرتب، بعد 96 ساعة من الزراعة في المختبر. (C,D) ترددات الكاسبيز 3/7 - 7-AAD - EVT حي خلال الفرز (اليوم 0) و96 ساعة من الزراعة (اليوم 4). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 2
الشكل 2. شكل EVT أثناء الزراعة المختبرية . صور المجهر الضوئي الممثل لحركة EVT المشيمية بعد (A) 24 ساعة، (B) 48 ساعة، و(C) 72 ساعة من الزراعة وDecidua Basalis EVT بعد (D) 24 ساعة، (E) 48 ساعة، و(F) 72 ساعة من الزراعة. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 3
الشكل 3. الأنماط المناعية للفيروس السابق الأولي. (أ) مخططات التدفق التمثيلية لجرئات HLA والجزيئات المثبطة المشتركة على EVT الأولي كما تم تحديدها بواسطة تلوين التدفق الخلوي خارج الخلية (اليوم 0). (ب) تظهر مخططات الخط المزدوجة المؤشر الخام للتحكم في IgG والتلوين الكامل لكل علامة من d. basalis EVT (الأزرق) وEVT المشيمي (الأخضر) في اليوم 0. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 4
الشكل 4. الأنماط المناعية للفتات الدماغية المبكرة مع أو بدون الخلايا اللمفاوية المنشطة (اليوم الرابع). (أ) مخططات تدفق ممثلة ل EVT بعد زراعة 72 ساعة (اليوم الرابع) مع أو بدون كريات لمفاوية طرف ثالث مفعلة. (ب) تظهر مخططات الخط المزدوجة وجود MFI في EVT مع أو بدون الخلايا اللمفاوية الخارجية المفعلة. تمثل القطع الزرقاء EVT البازيدو، والخضراء تمثل EVT المشيمية. (ج) مخططات قياس تدفق الخلايا التمثيلية للكاسبز 3/7- 7-AAD - EVT حي مع أو بدون الخلايا اللمفاوية الخارجية المنشطة في اليوم الرابع. (د) تظهر مخططات الخط المزدوجة ترددات الكاسبز 3/7-7-AAD - EVT حي مع أو بدون الخلايا اللمفاوية النشطة من طرف ثالث. تمثل القطع الزرقاء EVT البازيدو، والخضراء تمثل EVT المشيمية. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الجدول 1. كواشف رئيسية لتشريح الأنسجة وهضمها. انظر أيضا 1,2,24. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.

الجدول 2. كواشف رئيسية لزراعة EVT والزراعة المشتركة مع الخلايا التائية. انظر أيضا 1,2,24. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.

الجدول 3. الأجسام المضادة والمواد الكيميائية الرئيسية للفرز وتحليل قياس تدفق الخلايا. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.

المناقشة

خطوات حاسمة في البروتوكول

للحصول على EVT فعال، من الضروري البدء في عزل الخلايا من المشيمة فور الولادة، وإجراء جميع الإجراءات من العزل إلى الفرز في درجة حرارة الغرفة. نظرا لأن EVT أكبر وأكثر لاصقا مقارنة بالخلايا اللمفاوية، يجب اتخاذ الاحتياطات التالية للفرز لتجنب الانسداد: 1) تمرير تعليق الخلايا عبر مصفاة خلوية بقطر 40 ميكرومتر قبل الفرز، 2) استخدام وسط يحتوي على DNase لتعليق الخلايا، 3) تجنب تركيز التعليق الخلوي بشكل مفرط (يفضل ~1 × 10⁶ خلايا/مل)، 4) استخدام حجم فوهة لا يقل عن 100 ميكرومتر. يحقق فرز النفاثة في الهواء (مثل بيغ فوت، موفلو) إنتاجية EVT أعلى قابلة للتطبيق مقارنة بفرز الخلايا المعتمدة على السوائل (مثل فرز BD، سوني نانو).

التعديلات واستكشاف الأخطاء في الطريقة

أكثر أو ناقص الهضم بعد الهضم الأول لديسيدوا بازاليس EVT

تختلف كفاءة الهضم في نسيج decidua basalis بين المشيمة. الأنسجة المهضمة تشكل تجمعات كبيرة ولزجة يصعب مرورها عبر المنخل المعدني. عادة، يساعد إضافة 10-30 مل من محلول الغسيل المتوسط B في تشتت هذه الطبقات أثناء الترشيح. إذا لم يحل ذلك المشكلة، أضف 1-2 مل من DNase مباشرة إلى الأنسجة. إذا أدى الهضم الأول إلى فرط هضم، قلل تركيز كوكتيل إنزيم الهضم الأنسجي من 80٪ إلى 70٪ في الهضم الثاني. بعد ترشيح الهضم الأول، يجب تقليل حجم الأنسجة المتبقي إلى أقل من النصف تقريبا. إذا بقي حجم الأنسجة المتبقي دون تغيير، قم بزيادة تركيز كوكتيل إنزيم الهضم النسجي من 80٪ إلى 90-100٪ للهضم الثاني. يتم هضم أنسجة الغشاء المشيمية بشكل مستمر عبر المشيمة. لذلك، فإن تعديل تركيز مزيج إنزيم الهضم للأنسجة عادة غير ضروري.

لهضم أحجام أنسجة أكبر من تلك الموضحة في البروتوكول أعلاه

بالنسبة لهضمات تزيد عن 30 مل من الغشاء المشيمي أو أكثر من 15 مل من نسيج القاعدة النسائية، استخدم زجاجات إضافية تحتوي على كوكتيل إنزيم الهضم للأنسجة. زيادة حجم الأنسجة في زجاجة واحدة تؤدي عادة إلى سوء الهضم.

قيود الطريقة

من المتوقع انخفاض إنتاجية EVT من المشيمة التي تولد عن طريق المهبل. لا يمكن حفظ EVT بالتجميد قبل أو بعد الفرز، لأنها حساسة لضغط التجمد والذوبان، مما يحد بشكل كبير من صلاحيتها ووظيفتها. لذا، لا يتضمن هذا البروتوكول أي نقطة توقف.

أهمية الطريقة بالنسبة للطرق الحالية

سبق أن أبلغنا عن بروتوكول إنشاء خطوط خلايا شبيهة ب HLA-G+ EVT من المشيمة المصطلحة باستخدام Tissue Culture Medium B والصفائح المغطاة بالكولاجين. ومع ذلك، قد تؤثر عدة مثبطات في الوسط والكولاجين على وظيفة الخلايا التائية في نظام الزراعة المشتركة2. سمح تقرير سابق آخر لم يستخدم وسط زراعة الأنسجة B بتقييم الخلايا التائية في الزراعة المشتركة، لكن لم يسمح بتقييم EVT بسبب التغير الخلوي 1,10. ميزة البروتوكول الحالي هي أنه يقلل من تأثير وسيط الزراعة مع تمكين زراعة التأثير المبكر القابل للتطبيق. يوفر هذا البروتوكول منصة تجريبية للتحقيق في الوظيفة المناعية لل EVT وتغيراتها الوظيفية استجابة للخلايا المناعية المحيطة - وهي منطقة لم يتم التحقيق فيها بشكل كاف.

الإفصاحات

لا يوجد تضارب مصالح مرتبط بهذه الدراسة.

شكر وتقدير

نود أن نشكر شيري ثورنتون ومركز أبحاث تدفق الخلايا في قسم الروماتيزم بمركز سينسيناتي الطبي للأطفال على كل مساعدتهم في قياس تدفق الخلايا وفرز الخلايا؛ جميع الممرضين والأطباء في المستشفيات المشاركة تقديرا لجهودهم في جمع مواد المشيمة؛ جميع أعضاء مختبر تيلبورغ وأعضاء هيئة التدريس في علم المناعة في CCHMC لمناقشاتهم المفيدة؛ وقد دعم هذا العمل من قبل NIH R01HD116852 (T.T.); مؤسسة أبحاث الأطفال في سينسيناتي (T.T.); جائزة بوروز ويلكوم لصندوق الجيل القادم للحمل #NGP10115 (T.T.); ومنحة التعاون من March of Dimes Ohio (T.T.). تحظى S.T. بدعم من أرقام منح JSPS KAKENHI 22KK0287 و25K12697.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
0.25% Trypsin/EDTAGibco25200-072
15 mL Centrifuge tubesThermo Fisher14-955-238
-20 °C freezerany supplier
37 °C 5% CO2 Incubatorany supplier
4 °C fridgeany supplier
50 mL Conical Centrifuge tubesThermo Fisher14-955-240
55 mM β-MercaptoethanolGibco21985-023
6 ½” scissorsany supplier
7-AAD Viability Staining SolutionBiolegend420403
-80 °C freezer any supplier
A83-01REPROCELL04-0014
AF700, mouse, IgG1 k Isotype ControlBiolegend400144
APC/Cy7 Rat IgG2a, κ Isotype ControlBiolegend400524
B7H3 PE/Dazzle594Biolegend351012
BD FACSymphony A5 SE Cell AnalyzerBD Biosciences
Bigfoot Spectral Cell SorterThermo Fisher
Bovine Serum Albumin (BSA)Sigma-AldrichA3294
BSL2 biosafety cabinetany supplier
BV605 Mouse IgG1, κ Isotype ControlBD Biosciences562652
BV750 Mouse IgG1, κ isotype Control Biolegend400105
BV785 Mouse IgG1, κ Isotype CotrolBiolegend400170
CD45 BV785Biolegend304048
Cell dissociation sieveMillipore Sigma CD1-1KT (mesh size 60)
Cell strainers 40µm, 70µm, 100µmThermo Fisher22363547; 22363548; 22363549
CellEvent caspase-3/7 Green Detection ReagentinvitrogenC10423
Centrifugeany supplier
CHIR99021, 3mMSigma-AldrichSML 1046-5MG
Curved tip tweezersany supplier
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)VWR Life Science97063-136
DMEM/F12ThermoFisher11320-033
DNAse ISigma-AldrichDN25
Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 for T Cell Expansion and ActivationThermo Fisher Scientific11131D
EGF, Human, Recombinant, Animal FreePeproTechAF-100-15-1MG
EGFR1 BV711Biolegend352920
FACS DIVA softwareBD Bioscienceshttps://www.bdbiosciences.com/ja-jp/products/software/instrument-software/bd-facsdiva-software
Ficoll Paque PlusCytivia17144003
FlowJo SoftwareFlowJohttps://www.flowjo.com/
HLA-C PEBD Biosciences566372
HLA-E PE/Cy7Biolegend342608
HLA-G APCabcamAB40915
Human AB serumCorning35060CI
Human chorionic gonadotropin (hCG) (2500IU/mL)Sigma-AldrichC1063
Human fibronectin (1mg/mL)Corning354008
Human recombinant IL-2PeproTech200-02
Insulin-Transferrin-Selenium, 100x (ITS-G)Thermo Fisher Scientific41400-045
ITGA6 APC/cy7Biolegend313627
L-Ascorbic AcidSigma-AldrichA0278
magnet separatorpromegaZ5342
Newborn Calf Serum (NCS)gibco16010-159
PD-L1 AF700invitrogen56-5983-42
PD-L2  BV750Biolegend345528
PE/Cy7 mouse, IgG1 k, Isotype ControlBiolegend400126
PE/Dazzle594 Mouse IgG1, κ Isotype CotrolBiolegend400176
Penicillin and Streptomycin Gibco15140-122
Phosphate Buffered Saline 10X SolutionThermoFisherBP399-4
PVR BV605BD Biosciences748276
Research grade FBSThermo Fisher ScientificFB12999102
RosetteSep Human CD8+ T Cell Enrichment CocktailStem Cell15023
SB431542. 10 mMApex-BioA8249
Shaking water bath 37 °Cany supplier
Tryple Express 1x No Phenol RedThermo Fisher Scientific12604013
VPASigma-AldrichP4543
X-VIVO 10 Serum-free Hematopoietic Cell MediumLonza04-380Q
Y27632Sigma-Aldrich688000-1MG

المراجع

  1. Papuchova, H., et al. Three types of HLA-G+ extravillous trophoblasts that have distinct immune regulatory properties. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (27), 15772-15777 (2020).
  2. Hamilton, I., Ikumi, N. M., Kshirsagar, S., Goodman, W. A., Tilburgs, T. Utilizing primary HLA-G+ extravillous trophoblasts and HLA-G+ EVT-like cell lines to study maternal-fetal interactions. STAR Protoc. 4 (2), 102276(2023).
  3. Tilburgs, T., et al. Human HLA-G+ extravillous trophoblasts: Immune-activating cells that interact with decidual leukocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (23), 7219-7224 (2015).
  4. Yu, J., et al. Progestogen-driven B7-H4 contributes to onco-fetal immune tolerance. Cell. 187 (17), 4713-4732.e19 (2024).
  5. Apps, R., et al. Genome-wide expression profile of first trimester villous and extravillous human trophoblast cells. Placenta. 32 (1), 33-43 (2011).
  6. Apps, R., Gardner, L., Hiby, S. E., Sharkey, A. M., Moffett, A. Conformation of human leucocyte antigen-C molecules at the surface of human trophoblast cells. Immunology. 124 (3), 322-328 (2008).
  7. Moffett, A., Loke, C. Immunology of placentation in eutherian mammals. Nat Rev Immunol. 6 (8), 584-594 (2006).
  8. Papúchová, H., Meissner, T. B., Li, Q., Strominger, J. L., Tilburgs, T. The dual role of HLA-C in tolerance and immunity at the maternal-fetal interface. Front Immunol. 10, 2730(2019).
  9. Vander Zwan, A., et al. Mixed signature of activation and dysfunction allows human decidual CD8+ T cells to provide both tolerance and immunity. Proc Natl Acad Sci U S A. 115 (2), 385-390 (2018).
  10. Salvany-Celades, M., et al. Three types of functional regulatory T cells control T cell responses at the human maternal-fetal interface. Cell Rep. 27 (9), 2537-2547.e5 (2019).
  11. Mahajan, S., et al. Antigen-specific decidual CD8+ T cells include distinct effector memory and tissue-resident memory cells. JCI Insight. 8 (17), e171806(2023).
  12. Crespo, ÂC., Strominger, J. L., Tilburgs, T. Expression of KIR2DS1 by decidual natural killer cells increases their ability to control placental HCMV infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (52), 15072-15077 (2016).
  13. Burton, G. J., Redman, C. W., Roberts, J. M., Moffett, A. Pre-eclampsia: Pathophysiology and clinical implications. BMJ. 366, 12381(2019).
  14. Inada, K., Shima, T., Nakashima, A., Aoki, K., Ito, M., Saito, S. Characterization of regulatory T cells in decidua of miscarriage cases with abnormal or normal fetal chromosomal content. J Reprod Immunol. 97 (1), 104-111 (2013).
  15. Tsuda, S., et al. Clonally expanded decidual effector regulatory T cells increase in late gestation of normal pregnancy but not in preeclampsia. Front Immunol. 9, 1934(2018).
  16. Tsuda, S., et al. CD4+ T cell heterogeneity in gestational age and preeclampsia using single-cell RNA sequencing. Front Immunol. 15, 1401738(2024).
  17. Pique-Regi, R., et al. Single-cell transcriptional signatures of the human placenta in term and preterm parturition. eLife. 8, e52004(2019).
  18. Yang, J., et al. Single-cell RNA-seq reveals developmental deficiencies in placentation and decidualization in late-onset preeclampsia. Front Immunol. 14, 1142273(2023).
  19. Morita, K., et al. Analysis of TCR repertoire and PD-1 expression in decidual and peripheral CD8+ T cells reveals distinct immune mechanisms in miscarriage and preeclampsia. Front Immunol. 11, 1082(2020).
  20. Sasaki, Y., et al. Proportion of peripheral blood and decidual CD4+ CD25bright regulatory T cells in pre-eclampsia. Clin Exp Immunol. 149 (1), 139-145 (2007).
  21. Sasaki, Y. Decidual and peripheral blood CD4+CD25+ regulatory T cells in early pregnancy and spontaneous abortion. Mol Hum Reprod. 10 (5), 347-353 (2004).
  22. Shannon, M. J., et al. Single-cell assessment of primary and stem cell-derived human trophoblast organoids as placenta-modeling platforms. Dev Cell. S1534-5807, 00043-00051 (2024).
  23. Apps, R., Murphy, S. P., Fernando, R., Gardner, L., Ahad, T., Moffett, A. HLA expression of primary trophoblast cells and placental cell lines. Immunology. 127 (1), 26-39 (2009).
  24. Okae, H., et al. Derivation of human trophoblast stem cells. Cell Stem Cell. 22 (1), 50-63.e6 (2018).
  25. Shimizu, T., et al. CRISPR screening in human trophoblast stem cells reveals shared and distinct aspects of placental development. Proc Natl Acad Sci U S A. 120 (51), e2311372120(2023).
  26. Hori, T., et al. Trophoblast stem cell-based organoid models of the human placental barrier. Nat Commun. 15 (1), 962(2024).
  27. Wang, M., et al. Single-nucleus multi-omic profiling of human placental syncytiotrophoblasts. Nat Genet. 56 (2), 294-305 (2024).
  28. Ikumi, N. M., Koenig, Z., Mahajan, S., Gray, C. M., Tilburgs, T. Purification of primary human placental leukocytes. STAR Protoc. 4 (2), 102277(2023).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

HLA G FACS

مقالات ذات صلة