يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

توليد وتوصيف سلالة ذبابة الفاكهة الميلانوغاستر بواسطة CRISPR وCas9

62 مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/69546

⸱

أغسطس 7, 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1College of Traditional Chinese Medicine, The Affiliated Hospital to Changchun University of Chinese Medicine, 2Innovative Team for Medicinal Plant Resources and Breeding, Institute of Special Agricultural Products, Chinese Academy of Agricultural Sciences

في هذه المقالة

ملخص

ناقل النيوكليوزيدات المتوازن 2 (ENT2) هو بروتين عابر للغشاء محفوظ يشارك في نقل النيوكليوزيدات وعملية الأيض الخلوي. في هذه الدراسة، تم إنشاء سير عمل لتحرير الجينوم يعتمد على CRISPR/Cas9 لتوليد أليل مستهدف ل Ent2 في ذبابة الفاكهة الميلانوغاستر. تم بناء وصيانة خط مستقر متغاير الزيجوت من نوع Ent2*/CyO باستخدام استراتيجية كروموسوم الموازن. يصف هذا العمل تصميم وتوليد والتحقق الجزيئي لخط الطفرات، بالإضافة إلى توصيفه الظاهري تحت ظروف حرارة مختلفة. يوفر سير العمل المعتمد والسلالة الطفرة إطارا عمليا لدراسة الجينات ذات الأنماط القاتلة المتماثلة ولدراسة التباين الظاهري المرتبط بدرجة الحرارة في ذبابة الفاكهة.

الملخص

في هذه الدراسة، تم استخدام نهج تحرير الجينوم القائم على CRISPR/Cas9 لإدخال طفرات في جين ناقل النيوكليوزيدات 2 (Ent2) في ذبابة الفاكهة الميلانوغاستر. تم تصميم RNA التوجيهي الذي يستهدف منطقة ترميز Ent2 وحقنه معا مع mRNA Cas9 في أجنة w1118. تم تحديد الأليلات الطفرة بواسطة تسلسل سانجر والحفاظ عليها كخط مستقر من نوع Ent2*/CyO متغاير الزيجوت باستخدام كروموسوم الموازن. بعد ذلك، قمنا بتقييم وزن الجسم، والقدرة على التسلق، ومعدل البقاء، وأنشطة إزياز السوبر أكسيد (SOD) والكاتالاز (CAT) في ذباب الفاكهة عند 22 درجة مئوية و25 درجة مئوية على التوالي. تشير النتائج إلى أنه عند كل من 22 درجة مئوية و25 درجة مئوية، انخفض طول ووزن جسم ذباب الفاكهة Ent2*/CyO بشكل ملحوظ مقارنة بw 1118، وتأخر تطورها. عند 22 درجة مئوية، كان العمر الافتراضي لذبابات Ent2*/CyO أطول قليلا من العمر الافتراضي للذبابةw 1118، بينما عند 25 درجة مئوية، لم يلاحظ فرق كبير. فيما يتعلق بالقدرة الحركية، كان أداء التسلق للذباب غير المتغاير في السطح أقل بكثير من ذباب w1118 عند كلا الحرارتين، حيث تأثر الذكور بشكل أكبر. بالإضافة إلى ذلك، انخفضت أنشطة الإنزيمات المضادة للأكسدة في الحمض المقطعي المقطعي وSOD في ذباب الفاكهة Ent2*/CyO، مما يشير إلى ضعف واضح في قدرة مضادات الأكسدة. تصف هذه النتائج الملف الظاهري لخط طفرات Ent2 مولدة بواسطة كريسبر وتظهر جدوى دمج تحرير الجينوم مع استراتيجيات كروموسومات الموازنة في ذبابة الفاكهة. توفر هذه الدراسة إطارا منهجيا وموردا جينيا للتحقيقات المستقبلية للجينات المرتبطة بالتمثيل الغذائي والاستجابات البيئية.

المقدمة

تظل ذبابة الفاكهة الميلانوغاستر واحدة من أكثر الكائنات النموذجية استخداما في علم الوراثة وعلم الأحياء التنموي.1. يتميز بدورة حياة قصيرة، وتكاثر سريع، وأدوات تلاعب جينية راسخة، وجينوم مشروح بالكامل 2,3. يتم تطبيق هذا النوع بشكل واسع في دراسات وظائف الجينات، وتنظيم الأيض، والتكيف البيئي 4,5. النيوكليوسيدات ومشتقاتها مثل ATP هي محور في توليد الطاقة الخلوية، وتخليق الأحماض النووية، ونقل الإشارات في ذبابة الفاكهة، مما يعكس التنظيم الأيضي المحفوظ عبر الميتازويات6. تسلط مسارات الإشارات البيورينرية في ذبابة الفاكه، التي تعتمد على آليات نقل الأدينوسين والنوكليوسيدات خارج الخلية، الضوء على الدور الوظيفي لحركة النيوكليوزيدات عبر الأغشية في تنسيق استجابات الطاقة ونقل الإشارة7. من بين هذه العمليات، يتم نقل النيوكليوسيدات عبر الغشاء السيتوبلازمي بشكل أساسي بواسطة عائلة ناقل النيوكليوزيدات المتوازنة (ENT)، حيث يظهر DmENT2 نشاط نقل وظيفي في ذبابة الفاكهة8.

تتكون عائلة ENT من عدة أنواع فرعية، من بينها ENT2 ناقل نيوكليوزيدات عبر الغشاء تم دراسته بشكل موسع. يسهل النقل المستقل عن الطاقة لنوكليوسيدات البيورين والبيريميدينات10,11. في الثدييات، يعد ENT2 ناقلا ثنائي الاتجاه يعبر عنه في كل مكان ويسهل امتصاص النيوكليوسيدات والنيوكليوزيدات والنيوكليوبيدات البيورين والبيريميدين الخلوي. يساهم هذا النشاط الناقل في إنقاذ النيوكليوتيدات ويساعد في الحفاظ على التوازن الأيضي الخلوي12. كما يتوسط ENT2 نقل مجموعة متنوعة من الأدوية المشتقة من النيوكليوسيد، مما يوسع أهميته الوظيفية إلى ما هو أبعد من حركة النيوكليوسايدات الداخلية، مما يبرز أهميته الفسيولوجية والسريرية الأوسع13. علاوة على ذلك، تم ربط ENT2 بالاضطرابات العصبية14، واستقلاب الأورام15، وخلل الأوعية الدموية16، وأيض الطاقة الخلوية لدى البشر17. ومع ذلك، لا تزال الدراسات التي تتناول الأدوار على مستوى الكائنات الحية، حيث يوجد Ent2 في ذبابة الفاكهة (ذبابة الفاكهة) محدودة.

لم يتم استكشاف أدوار ENT2 في النمو والتطور، واستقلاب الطاقة، وأداء الحركة، والقدرة المضادة للأكسدة تحت ظروف حرارة متغيرة بعد18. تؤثر درجة الحرارة بشكل كبير على معدل الأيض الأساسي وعمره في ذبابة الفاكه، حيث تؤدي درجات حرارة التربية الأعلى عموما إلى زيادة النشاط الأيضي وتقليل طول العمر19. يمكن أن تؤثر هذه التغيرات المعتمدة على درجة الحرارة في التعبير الجيني على المسارات الفسيولوجية وبالتالي قد تعدل التأثيرات الظاهرية للطفرات الجينية المحددة20.

تم تطبيق بروتين 9 المتكرر القصير المتباعد بانتظام بانتظام (CRISPR/Cas9) على نطاق واسع في ذبابة الفاكهة في عمليات تعديل الجينوم المختلفة مثل إزالة الإشارات الخاصة بالموقع والحذف، والاستبدال، وإدخال العلامات، مما يثبت كفاءته وموثوقيته 21,22,23. تشير أحدث التطورات إلى أن محررات القواعد المشتقة من كريسبر يمكن استخدامها أيضا لتعديلات قواعد دقيقة خاصة بالموقع في ذبابة الفاكهة، مما يوفر أداة جديدة للطفرات النقطية والتحكم الظاهري الدقيق24. طرق الطفرات التقليدية، بما في ذلك الطفرات الكيميائية والإشعاعية وكذلك الشاشات التي يتم تسواطها عبر الترانسبوزون، يمكن أن تولد طفرات جينية25. غالبا ما تكون هذه الأساليب محدودة بسبب انخفاض الكفاءة والعشوائية العالية في أحداث الطفرة. نتيجة لذلك، يجب على الباحثين فحص أعداد كبيرة من الأفراد لعزل أليلات محددة محل اهتمام26. يتيح CRISPR/Cas9 الانقسام الموجه بواسطة الحمض النووي الريبي الموجه (gRNA) المبرمج عند تسلسلات DNA محددة. يتم إصلاح الانقطاعات الناتجة ذات السلسلتين من خلال الربط النهائي غير المتماثل أو الإصلاح الموجه بالتماثل، مما يولد طفرات محددة وراثية ويقلل بشكل كبير من الطفرات الخلفية التي قد تربك التحليل الظاهري27،28. يمكن الحفاظ على الأليلات الطفرة الناتجة عن CRISPR/Cas9 في حالة متغاير الزيجوت من خلال الارتباط بكروموسومات الموازنة، مثل Curly O (CyO)29. لقد ثبت أن هذه الاستراتيجية تمنع بفعالية فقدان الأليلات القاتلة في الشكل المتماثل الزيجوت في جينات ذبابة الفاكهة. ونتيجة لذلك، يدعم التقييم الظاهري طويل الأمد ومنهجيا، بما في ذلك الدراسات الوظيفية تحت درجات حرارة أو ظروف بيئية متغيرة29,30. التصميم البسيط والكفاءة العالية ل CRISPR/Cas9 قللا بشكل كبير دورة بناء السلالات وعزز استقرار الخلفية الجينية. وهذا مهم بشكل خاص لدراسة العوامل البيئية طويلة الأمد مثل استجابة درجة الحرارة والتوازن التنموي.

استنادا إلى هذا الأساس، تم استبعاد جين Ent2 في ذبابة الفاكهة الميلانوغاستر باستخدام نظام CRISPR/Cas9، وتم تأسيس سلالة متحولة متغايرة متجانسة Ent2*/CyO موروثة بشكل مستقر. تم تقييم دورة التطور، ووزن الجسم، والقدرة الحركية، وأنشطة إنزيمات مضادات الأكسدة SOD وCAT بشكل منهجي. من خلال مقارنة الأنماط الظاهرية متعددة الأبعاد ل w1118 والذباب الطائر تحت ظروف حرارة متغيرة، تهدف هذه الدراسة إلى تقديم استراتيجية قابلة للتكرار لتوليد والحفاظ على خطوط الطفرات المشتقة من كريسبر وتقديم توصيف وصفي للأنماط الناتجة. يقدم هذا العمل إطارا منهجيا وموردا جينيا مفيدا للدراسات المستقبلية التي تبحث في الجينات المشاركة في الأيض والاستجابات البيئية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. تصميم أهداف CRISPR/Cas9 لجين Ent2

  1. اختر مواقع كريسبر المرشحة في الإكسونات 2 و5 من Ent2 (معرف FlyBase: FBgn0263916) باستخدام CHOPCHOP (v3)31 وCCTop (v1.0)32.
  2. تم تعريف الجينوم المرجعي كذبابة الفاكهة الميلانوغاستر الإصدار 6 (dm6) (إضافة تجميع RefSeq: GCF_000001215.4). ثم تم تحديد مواقع gRNA المرشحة. وأخيرا، تم تصفية المواقع المحددة للحصول على أفضل gRNAs.
  3. تصفية الأهداف حسب درجة الخصوصية في معهد ماساتشوستس ≥ 80 (CHOPCHOP)، ودرجة CFD ≤ 0.1 (CCTop)، ومحتوى GC بين 40٪–60٪، ومسافة PAM الصغيرة.
  4. ترتيب الأهداف ذات الدرجة المرجحة (الكفاءة 50٪، الخصوصية 30٪، تحسين GC 20٪) واختيار gRNA اثنين.
  5. أضف "G" واحد إلى نهاية 5′ لكل gRNA لتلبية متطلبات المحفز T7. استخدم الأوليجوننيوكليوتيدات الأمامية الخاصة ب gRNA التالية لإنشاء قالب النسخ الكامل لل sgRNA بواسطة PCR:
    Ent2-sg1-F: TAATACGACTCACTAT
    AGGTGACGTTAAATCCATCGTGTTTTTTAGAGCTAGAAAATAGC
    Ent2-sg2-F: TAATACGACTCAC
    TATATTGCCGTTGGAATCATGGGGTTTAGAGCTAGAAAATAGC
  6. يتم توفير تسلسل سقالة sgRNA المتبقي بواسطة الأوليجونوكليوتيد العكسي العالمي أثناء PCR.

2. إعداد قوالب نسخ sgRNA

  1. إعداد قوالب نسخ sgRNA
    1. تجميع خليط تفاعل PCR بسعة 60 ميكرولتر باستخدام طريقة التلدين المزدوج الأوليجونكليوتيد وطريقة PCR33 حسب تعليمات الشركة المصنعة. اجمع الأوليجونكليوتيد الأمامي الخاص ب gRNA (Ent2-sg1-F أو Ent2-sg2-F) مع أوليغونيوكليوتيد عكسي عالمي يشفر سقالة sgRNA للحصول على قالب dsDNA الكامل للنسخ الصناعي.
    2. برمج جهاز الدراجة الحرارية: 95 درجة مئوية 3 دقائق؛ 35 دورة بمعدل 95 درجة مئوية 30 ثانية، 55 درجة مئوية 30 ثانية، 72 درجة مئوية 20 ثانية؛ ثم 72 درجة مئوية لمدة 10 دقائق؛ حافظ على درجة حرارة 12 درجة مئوية.
  2. تنقية قالب النسخ
    1. أضف 100 ميكرولتر أسيتات الأمونيوم (انظر جدول المواد) إلى منتج PCR بسعة 60 ميكرولتر؛ اخلط. أضف 400 ميكرولتر من الإيثانول اللامائع؛ اقلب لتخلط واحتضن عند -20 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
    2. الطرد المركزي عند 4 درجات مئوية، 20,000 × جرام لمدة 15 دقيقة؛ تخلص من السوبرناتانت.
    3. جفف الحبيبة بالهواء مع فتح الأنبوب لمدة 10 دقائق. أعد تعليق الحبيبة في 10 ميكرولتر من ddH₂O.
  3. النسخ الصناعي ل gRNA
    1. قم بإعداد تفاعل نسخ T7 في المختبر بقوة 10 ميكرولتر وفقا لتعليمات المجموعة (انظر جدول المواد).
    2. حضن عند 37 درجة مئوية لمدة 35 دقيقة. أضف 0.5 ميكرولتر DNase I (المرفق في مجموعة النسخ) ثم حضن عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
  4. Purify gRNA
    1. تخفيف خليط النسخ إلى 60 ميكرولتر مع ddH₂Oخالي من النوكلياز. أضف 60 ميكرولتر فينول/كلوروفورم مشبع بالماء (انظر جدول المواد)؛ دوامة لفترة وجيزة وجهاز الطرد المركزي عند 4 درجات مئوية، 16,000 × g لمدة 5 دقائق.
    2. نقل 45 ميكرولتر من الطور المائي إلى أنبوب جديد خال من RNase بسعة 1.5 مل. أضف 5 ميكرولتر من أسيتات الصوديوم؛ مختلطة.
    3. أضف 125 ميكرولتر من الإيثانول المبرد مسبقا؛ اخلط واحتضن عند -20 درجة مئوية لمدة 20–30 دقيقة. الطرد المركزي عند 4 درجات مئوية، 20,000 × جرام لمدة 15 دقيقة؛ تخلص من السوبرناتانت.
    4. غسل الحبيبة ب 200 ميكرولتر من 70٪ إيثانول (خالي من RNase)؛ الطرد المركزي عند 4 درجات مئوية، 20,000 × جرام لمدة 5 دقائق؛ أزل سوبرناتانت.
    5. جفف الحبيبة على حرارة 37 درجة مئوية حتى يتبخر الإيثانول تماما. أعد تعليقها في 20 ميكرولتر ddH₂O; التخزين عند -80 درجة مئوية.
    6. قس تركيز gRNA باستخدام مطياف NanoDrop وضبط التركيز إلى 250 ng/μL للحقن. ضمان نقاء gRNA بنسبة A260/A280 تقارب 2.0.
      ملاحظة: نؤكد أنه يجب ارتداء القفازات طوال العملية للحماية من RNase. يجب استخدام جميع المواد الاستهلاكية، بما في ذلك أنابيب الطرد المركزي الخالية من RNase المبردة مسبقا ورؤوس الماصات، بشكل متسق أثناء الإجراء. يجب جمع النفايات العضوية الناتجة أثناء العملية بشكل منفصل في حاويات نفايات مخصصة حسب نوعها ونقلها بانتظام إلى منشأة معتمدة للتخلص من النفايات الخطرة للتعامل السليم.

3. تحضير الحمض النووي الريبي الريبي Cas9

  1. إعداد قالب النسخ
    ملاحظة: استخدم الأطراف والأنابيب الخالية من RNase خلال الخطوات المتعلقة بالRNA.
    1. إذابة بلازميد التعبير Cas9 MLM3613 (انظر جدول المواد) على الجليد. في أنبوب خال من RNase، اجمع DNA بلازميد بسعة 20 ميكروغرام، و7.5 ميكرولتر 10x مخزن تقييد، و1 ميكرولتر PmeI (10,000 U/mL)، وكمية ddH₂O خالية من النوكلياز إلى 75 ميكرولتر.
    2. حضن على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. تحقق من الخطية الكاملة عن طريق تحميل 5 ميكرولتر على جل أغاروز بنسبة 1٪ بجهد 120 فولت لمدة 30 دقيقة.
  2. تنقية قوالب النسخ
    1. أضف 23 ميكرولتر 2٪ من كبريتات الصوديوم الدوديسيل (SDS، انظر جدول المواد للتفاصيل) و0.5 ميكرولتر بروتيناز K (انظر جدول المواد للتفاصيل) إلى 70 ميكرولتر من الهضم؛ حضن عند 50 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
    2. أضف 45 ميكرولتر من الكلوروفورم و45 ميكرولتر من الفينول المشبع بتريس؛ فورتكس لفترة وجيزة؛ جهاز الطرد المركزي 13,800 × G، 5 دقائق.
    3. انقل طور مائي بسعة 90 ميكرولتر إلى أنبوب جديد. أضف 10 ميكرولتر من أسيتات الصوديوم (المقدم من الطقم) و200 ميكرولتر من الإيثانول اللامائي المبرد مسبقا؛ مكس؛ حضانة −20 درجة مئوية، 30 دقيقة.
    4. جهاز طرد مركزي 20,000 × جم، 4 درجات مئوية، 15 دقيقة؛ تخلص من السوبرناتانت. اغسل الحبيبة مرتين ب 100 ميكرولتر 70٪ إيثانول؛ الطرد المركزي 20,000 × جم، دقيقتين لكل واحد؛ جافة في الهواء.
    5. إذابة الحمض النووي في 20 ميكرولتر خالية من النوكلياز، ddH₂O؛ أكد >500 نانوغرام/ميكرولتر.
  3. النسخ في المختبر مع التداخل المشترك
    1. قم بإعداد التفاعل باستخدام مجموعة نسخ T7 في المختبر مع غطاء (انظر جدول المواد) وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
    2. حضن عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين لتوليد mRNA من Cas9 مغلق.
    3. بعد اكتمال تفاعل النسخ، أضف 1 ميكرولتر من DNase (المرفق في المجموعة، بتركيز 2 U/μL)، وامزجه جيدا، وحضن عند 37°C لمدة 15 دقيقة لتحلل قالب الحمض النووي.
  4. أضف ذيل بولي(A)
    1. ارفع الحمض النووي الريبي إلى 14 ميكرولتر dH₂O.
    2. أضف 2 ميكرولتر من 10x E. coli من Poly(A) Polymerase، 2 ميكرولتر ATP (10 ملليمتر)، 1 ميكرولتر مثبط RNase، و1 ميكرولتر بوليميراز.
    3. حضن على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة.
  5. تنقية ال mRNA
    1. تطبيق التفاعل على مجموعة RNA كلية ذات عمود دوران (انظر جدول المواد). تحميل العينة على عمود دوران غشائي سيليكا بحجم 2 مل؛ الطرد المركزي 8,000 × G، 15 ثانية; التخلص من تدفق المرور.
    2. أضف 500 ميكرولتر من مخزن RPE إلى عمود RNeasy، وقم بالطرد المركزي بقوة 8000 × g لمدة 15 ثانية، وتخلص من السائل المتبقي. كرر هذه الخطوة مرة واحدة، ثم استخدم الطرد المركزي لمدة دقيقتين وتخلص من السائل المتبقي.
    3. ضع عمود RNeasy في أنبوب طرد مركزي جديد بسعة 1.5 مل. أضف 30 ميكرولتر من ddH₂O، وهو جهاز طرد مركزي خالي من RNase بقوة 8000 × جرام لمدة دقيقة واحدة لاستخراج الحمض النووي الريبي. اضبط تركيز mRNA إلى 500 ng/μL للحقن. تخزين الحمض النووي الريبي الممزوج عند -80 درجة مئوية.

4. الحقن الدقيق لأجنة ذبابة الفاكهة

  1. تحضير عينات الحقن
    1. امزج 15 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي Cas9 مع 7.5 ميكروغرام gRNA مزدوج السلسلة بنسبة حجم 2:1.
    2. تعديل إلى 30 ميكرولتر باستخدام مياه خالية من RNase المعالجة ب DEPC؛ ابق على البرد.
  2. تربية ذبابة الفاكهة
    1. نقل سلالة ذبابة الفاكهة المحقونةمع 1118 إلى أنابيب غذائية كبيرة للتضخيم. تم استخدام ذباب W1118 كمرجع للتحكم لتمثيل الحالة الفسيولوجية الأساسية دون تأثيرات مرتبطة بالموازن.
    2. حافظ على الذباب في غرفة مناخ صناعية مضبوطة على 25 درجة مئوية مع رطوبة بين 60٪–70٪ ودورة من الإضاءة إلى الظلام 12:12 لمدة 14 يوما.
    3. في الساعة 17:00 من اليوم التالي لفترة التربية التي تستمر 14 يوما (اليوم 15)، اجمع الذباب البالغ لمزامنة وضع الأجنة بتوقيت. يضمن هذا الوقت الخاص للجمع أن تكون الأجنة المستخدمة للحقن في مرحلة تطور ثابتة. التحكم في وقت اليوم مهم لتقليل تأثيرات الإيقاع اليومي على تطور الأجنة وسلوك التكاثر، مما يضمن قابلية التكرار التجريبي وتقليل التفاوت الفسيولوجي بين الدفعات.
  3. حقن دقيق لذبابة الفاكهة
    1. اجمع الذباب البالغ لحقنه في أقفاص الذباب، مع حوالي 400 ذباب بالغ في كل قفص. جمع الأجنة على ألواح الأجار المغطاة بالخميرة؛ اجمع الأجنة خلال 60 دقيقة من وضع البيض وشطفها على أغطية البويض. لم يتم إجراء إزالة القطع قبل الحقن.
    2. اصطف الأجنة على أغطية الغطاء بحيث تكون الأقطاب الخلفية متجهة للخارج، مرتبة بشكل منظم من الأعلى إلى الأسفل. تأكد من أن إبرة الحقن تخترق القطب الخلفي إلى عمق مناسب (حوالي خمس طول الجنين) لتحقيق توصيل سيتوبلازمي متسق. تم استخدام ما مجموعه 300 جنين في هذه الدراسة.
    3. تحت المجهر المجسم، ركز رأس الإبرة والجنين في نفس المستوى.
    4. باستخدام أداة الحقن، اخترق القطب الخلفي وحقن 0.001 ميكرولتر من الخليط في كل جنين.
    5. نقل الأجنة المحقونة إلى قوارير الطعام؛ حضانة عند 25 درجة مئوية، ~70٪ رطوبة نسبية (RH) للحصول على توليد P₀ (البالغين المحقونين الذين ينجون لإنتاج نسل).

5. بناء سلالات التعبير المستقرة في ذبابة الفاكهة

  1. تقاطع P₀ مغلق مع ذباب Bc/CyO .
    1. حقن مزيجا من gRNA مستهدفا الجين المعني وبروتين Cas9 في 300 جنين من سلالة ذبابة الفاكهة w1118 . بعد الحقن، احصل على ما مجموعه 30 بالغا P0 صالحين وخصبين. تداخل كل قوارير P0 بالغة (موزاييك) بشكل فردي مع ذباب من سلالة w1118 ، مما ينتج 16 تهجينا من زوج واحد (8 قوارير مع ذكور P0 مع إناث عذراء و8 قوارير مع إناث P0 مع ذكور). حافظ على جميع التقاطعات عند 25 درجة مئوية تحت ظروف زراعة مستمرة.
    2. بعد ظهور يرقات F1، قم بإزالة ذباب P0 الوالدين. استخراج الحمض النووي الجينومي من نسل F1 وإخضاعه لتحليل PCR لتحديد الأنماط الجينية البالغة ل F1 (Ent2/+).
    3. ولد نسل F2 عن طريق تهجين فردي بين ذباب Bc/CyO . اختر الأفراد البالغين من F2 وقم بتعيينهم لتحديد الذباب مع النمط الجيني Ent2/CyO .
    4. يطير إنتركروس F3 (Ent2/CyO) لتقييم وجود طفرات متماثلة الزيجوت. إذا لم يتم العثور على ذباب متماثل الزيجوت، فإن ذباب Ent2/CyO المتقاطع لجيل إضافي لتحديد ما إذا كان النمط الجيني المتماثل قاتلا.
  2. استخراج الحمض النووي الجيني من ذبابة الفاكهة
    1. اجمع ذبابة أو ذبابتين بالغتين في أنبوب EP بسعة 1.5 مل وأضف 110 ميكرولتر من محلول استخلاص الحمض النووي النباتي PA.
    2. قم بتجانس العينات جيدا باستخدام مطحنة الأنسجة لمدة لا تقل عن 3 دقائق.
    3. حضن الذرات المتجانسة في حمام معدني بدرجة حرارة 65 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 30 دقيقة.
    4. أضف 100 ميكرولتر من الكلوروفورم، ثم اقلب الخليط بلطف ليتم خلطه، ثم استمر دوامة لمدة 10 ثوان. قم بعمل الطرد المركزي للعينات عند سرعة 14,000 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    5. انقل بحذر حوالي 65 ميكرولتر (أو أكثر) من المادة الفائقة إلى أنبوب جديد، وأضف مجلدين من الإيثانول المطلق المبرد مسبقا (محضن مسبقا عند 4 درجات مئوية لمدة لا تقل عن 10 دقائق)، ثم اقلب بلطف للخلط، وحضن على درجة حرارة -20 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 15 دقيقة.
    6. قم بأخذ عينات الطرد المركزي عند 14,000 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية وتخلص من السوبرناتانت بعناية.
    7. جفف الحبيبة في الهواء في درجة حرارة الغرفة أو في الحاضنة حتى تجف تماما، ثم أعد تعليقها في حجم مناسب من مخزن PB. بالنسبة لعينات الإناث (f)، أضف 50 ميكرولتر من مخزن PB، بينما للعينات الذكورية (m) أضف 15 ميكرولتر.
  3. تضخيم PCR وتسلسل سانجر
    1. قم بتضخيم PCR باستخدام بادئات محددة مصممة لتغطية المناطق العليا والأسفلية من موقع هدف gRNA.
    2. قم بتنقية منتجات PCR وخضعها لتسلسل سانجر. تحليل كروماتوغرافات التسلسل باستخدام برنامج SnapGene34 ومحاذاة تسلسل المرجع من النوع البري للتحليل المقارن.
    3. افحص مخططات القمم بالقرب من موقع هدف gRNA بحثا عن قمم متداخلة تشير إلى طفرات الإندل. إجراء تقسيم القمم لحل الإشارات المختلطة وتأكيد نوع الطفرة، بما في ذلك الإدخالات أو الحذف في الموقع المستهدف.
    4. الانتقال إلى الذكور من نوع BC/CyO لمدة 4 أجيال لتأسيس Ent2/CyO.
      ملاحظة: لوحظ أن Ent2*/Ent2* و CyO/CyO قاتلان في مراحل التطور المبكرة؛ لذلك، يتم الحفاظ على متغاير الزيجوت Ent2*/CyO .
  4. بعد تأسيس تغاير الزيجوت Ent2*/CyO ، اجمع عينات من نفس دفعة Ent2*/CyO المتغاير تحت المجهر المجسم.
  5. اختر عشوائيا 20 ذبابة بالغة، ووزنها باستخدام توازن دقيق بدقة 0.001 جم. قم بتصوير العينات لتوثيق الخصائص الظاهرية.

6. التوصيف الظاهري الوصفي

  1. في الخلف 120 ذكرا و120 أنثى (تم اختبار ثلاث قوارير لكل مجموعة، كل قارورة تحتوي على 20 ذبابة) لكل من Ent2*/CyO وW1118 عند 22 درجة مئوية و25 درجة مئوية.
  2. سجل عدد الوفيات أسبوعيا ورسم منحنيات البقاء.
  3. قم بإعداد 30 زوجا عشوائيا للتزاوج لكل مجموعة؛ السماح بالتزاوج لمدة 24 ساعة؛
  4. نقل البالغين إلى أنابيب جديدة؛ النسل الخلفي.
  5. بعد 7 أيام من الإخراج، قيم نجاح التسلق (≥8 سم خلال 30 ثانية) مع ست نسخ لكل مجموعة.
  6. تم تسجيل جميع الملاحظات كخصائص وصفية للخط الطافور ولم تستخدم لاستنتاج وظيفة الجينات.

7. قياس أنشطة الإنزيمات المضادة للأكسدة

  1. اجمع 300 ذبابة ذكر و300 أنثى بالغة (اختبروا ثلاث قوارير لكل مجموعة، كل قارورة تحتوي على 100 ذبابة) من نوع Ent2*/CyO وذبابالتحكم w 1118 بعد 5 أيام من الإخراج، لضمان النضج الفسيولوجي وعمر مماثل.
  2. نقل الذباب إلى أنابيب فارغة بدون طعام وجوع لمدة ساعتين لتوحيد الحالة الأيضية قبل إجراء الفحوصات الكيميائية الحيوية.
  3. أضف خرزة/أنبوب فولاذي واحد؛ التجانس عند 60 هرتز، دقيقتين.
  4. جهاز الطرد المركزي 4 درجات مئوية، 161 × جاذب، 10 دقائق؛ اجمع السوبرناتانت.
  5. قم بقياس إجمالي إزامات الفائق الأكسجين (SOD، انظر جدول المواد للتفاصيل) والكتالاز (CAT، انظر جدول المواد للتفاصيل) وفقا لتعليمات الطقم.

8. إحصائيات البيانات وتحليلها

  1. عبر عن جميع البيانات كمتوسط ± خطأ معياري للمتوسط (figure-protocol-1± SEM).
  2. استخدم تحليل النوفاع المعاد الأحادي لمقارنة بيانات نشاط الإنزيمات؛ طبق تحليل الأنفاس التقريبية ثلاثية الاتجاهات (عوامل: النمط الجيني، درجة الحرارة، الجنس) على وزن الجسم، القدرة على التسلق، وطول الجسم. قم بإجراء اختبار HSD بعد الارتياح من توكي عند الاقترابمن 35.
  3. عرف الدلالة ك P < 0.05 لجميع الاختبارات الإحصائية.
  4. تحليل بيانات العمر باستخدام منحنيات البقاء وإجراء اختبار التصنيف اللوغاريتمي (Mantel-Cox)، الذي يقيم ما إذا كانت هناك فروق ذات دلالة في مسارات البقاء بين مجموعات التجارب36.
  5. قم بإجراء جميع التحليلات والرسم التخطيطي باستخدام برنامج GraphPad Prism 9.5.0 وفقا لإرشادات البرمجيات37.
  6. أجريت جميع التحليلات الإحصائية للمقارنة الوصفية فقط وليس لإثبات العلاقات السببية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

تصميم وتحليل التحقق من فعالية مواقع استهداف جينات Ent2
تم تصميم مواقع الهدف المرشحة لجين Ent2 باستخدام منصات CHOPCHOP وCCTop (الشكل 1). تم اختيار جرن RNA يستهدفان منطقتي الإكسون 2 والإكسون 5 بناء على معايير الخصوصية والكفاءة. للتحقق من نجاح تعديل الجينوم، تم تضخيم الحمض النووي الجينومي من أفراد مختارة عشوائيا من خط Ent2*/CyO المعروف وخضعه لتسلسل سانجر. أظهرت كروماتوغرامات التسلسل قمم متداخلة تبدأ بالقرب من الموقع المستهدف، متوافقة مع طفرات ا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

الأنف والأذن والحنجرة هو بروتين محفوظ تطوريا يؤثر على عدة عمليات بيولوجية38. عند التعبير عنه في بويضات Xenopus laeves، يظهر Ent2 نشاط نقل النيوكليوزيدات8. أظهرت الدراسات أن الطفرة المتماثلة في Ent2 قاتلة خلال المرحلة اليرقية المتأخرة أو العذراء المبكرة10. في هذه الدراسة، تم إنشاء سير عمل تحرير جينوم قائم على CRISPR/Cas9 لتوليد أليلات مستهدفة ل Ent2 في ذبابة الفاكهة الم...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

جميع المؤلفين ليس لديهم تضارب مصالح ليعلنوا عنه.

شكر وتقدير

ادعم هذا البحث من خلال برنامج تطوير العلوم والتكنولوجيا في مقاطعة جيلين (رقم المشروع 20230505044ZP).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
Acetate الأمونيومSigma A1542
مجموعة اختبار الكاتلاز (CAT) (طريقة الضوء المرئي) (طريقة موليبدات الأمونيوم)معهد نانينج جيانشينغ للهندسة الحيويةA007-1-1
كبريتات الدودسيلSigmaL3771
جهاز الحقنEppendorf FemtoJet 4i
البلاسميدات الخطية: MLM3613Addgene42251
المجهرOLYMPUS CKX3-SLP
مجموعة mMESSAGE mMACHINE T7Thermo FisherAM1344
مجموعة ترجمة mMESSAGE mMACHINE T7Thermo FisherAM1344
إنزيم التقييد PmeINEB R0560S
بوليميراز Poly(A)NEBM0276S
البروتيناز KThermo FisherEO0491
مجموعة RNeasy MiniQIAGEN74104
نظام إنتاج RNA واسع النطاق T7 RiboMAX ExpressPromega P1320
مجموعة T7 RiboMAXPromega P1320
مجموعة اختبار ديسموتاز الفائق الكلي (T-SOD) (طريقة هيدروكسيلامين)معهد نانينج جيانشينغ للهندسة الحيويةA001-1
w1118 Drosophila Fangjing Biology
الفينول المشبع بالماء/الكلوروفورمSigmaP2069

المراجع

  1. Tolwinski, N. S. Introduction: Drosophila-A Model System for Developmental Biology. J Dev Biol. 5 (3), (2017).
  2. Ogienko, A. A., et al. Drosophila as a Model Organism to Study Basic Mechanisms of Longevity. Int J Mol Sci. 23 (19), (2022).
  3. Lu, T. C., et al. Aging Fly Cell Atlas identifies exhaustive aging features at cellular resolution. Science. 380 (6650), eadg0934(2023).
  4. Koyama, T., Texada, M. J., Halberg, K. A., Rewitz, K. Metabolism and growth adaptation to environmental conditions in Drosophila. Cell Mol Life Sci. 77 (22), 4523-4551 (2020).
  5. Moraes, K. C. M., Montagne, J. Drosophila melanogaster: A Powerful Tiny Animal Model for the Study of Metabolic Hepatic Diseases. Frontiers in Physiology. 12, 2021(2021).
  6. Chatterjee, N., Perrimon, N. What fuels the fly: Energy metabolism in Drosophila and its application to the study of obesity and diabetes. Sci Adv. 7 (24), (2021).
  7. Volonté, C., Alberti, F., Vitale, G., Liguori, F. Delineating Purinergic Signaling in Drosophila. International Journal of Molecular Sciences. 23 (23), 15196(2022).
  8. Machado, J., Abdulla, P., Hanna, W. J., Hilliker, A. J., Coe, I. R. Genomic analysis of nucleoside transporters in Diptera and functional characterization of DmENT2, a Drosophila equilibrative nucleoside transporter. Physiol Genomics. 28 (3), 337-347 (2007).
  9. Ho, H. T., Xia, L., Wang, J. Residue Ile89 in human plasma membrane monoamine transporter influences its organic cation transport activity and sensitivity to inhibition by dilazep. Biochem Pharmacol. 84 (3), 383-390 (2012).
  10. Knight, D., et al. Equilibrative nucleoside transporter 2 regulates associative learning and synaptic function in Drosophila. J Neurosci. 30 (14), 5047-5057 (2010).
  11. Sidorov, R., Kucerova, L., Kiss, I., Zurovec, M. Mutation in the Drosophila melanogaster adenosine receptor gene selectively decreases the mosaic hyperplastic epithelial outgrowth rates in wts or dco heterozygous flies. Purinergic Signal. 11 (1), 95-105 (2015).
  12. Naes, S. M., Ab-Rahim, S., Mazlan, M., Abdul Rahman, A. Equilibrative Nucleoside Transporter 2: Properties and Physiological Roles. Biomed Res Int. 2020, 5197626(2020).
  13. Boswell-Casteel, R. C., Hays, F. A. Equilibrative nucleoside transporters-A review. Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids. 36 (1), 7-30 (2017).
  14. Wu, K. C., Lee, C. Y., Chou, F. Y., Chern, Y., Lin, C. J. Deletion of equilibrative nucleoside transporter-2 protects against lipopolysaccharide-induced neuroinflammation and blood-brain barrier dysfunction in mice. Brain Behav Immun. 84, 59-71 (2020).
  15. Rattray, Z., et al. ENT2 facilitates brain endothelial cell penetration and blood-brain barrier transport by a tumor-targeting anti-DNA autoantibody. JCI Insight. 6 (14), (2021).
  16. Chiang, H. L., et al. The Critical Role of Equilibrative Nucleoside Transporter-2 in Modulating Cerebral Damage and Vascular Dysfunction in Mice with Brain Ischemia-Reperfusion. Pharm Res. 40 (11), 2541-2554 (2023).
  17. Chen, M., et al. SLC29A1 and SLC29A2 are human nicotinamide cell membrane transporters. Nat Commun. 16 (1), 1181(2025).
  18. Bajgar, A., et al. Extracellular adenosine mediates a systemic metabolic switch during immune response. PLoS Biol. 13 (4), e1002135(2015).
  19. Mołoń, M., et al. Effects of Temperature on Lifespan of Drosophila melanogaster from Different Genetic Backgrounds: Links between Metabolic Rate and Longevity. Insects. 11 (8), (2020).
  20. Chen, J., Nolte, V., Schlötterer, C. Temperature-Related Reaction Norms of Gene Expression: Regulatory Architecture and Functional Implications. Mol Biol Evol. 32 (9), 2393-2402 (2015).
  21. Gratz, S. J., Rubinstein, C. D., Harrison, M. M., Wildonger, J., O'Connor-Giles, K. M. CRISPR-Cas9 Genome Editing in Drosophila. Curr Protoc Mol Biol. 111, 31.32.31-31.32.20 (2015).
  22. Bassett, A., Liu, J. L. CRISPR/Cas9 mediated genome engineering in Drosophila. Methods. 69 (2), 128-136 (2014).
  23. Port, F., Muschalik, N., Bullock, S. L. Systematic Evaluation of Drosophila CRISPR Tools Reveals Safe and Robust Alternatives to Autonomous Gene Drives in Basic Research. G3 Genes|Genomes|Genetics. 5 (7), 1493-1502 (2015).
  24. Clark, M., et al. Expanding the CRISPR base editing toolbox in Drosophila melanogaster. Communications Biology. 7 (1), 1126(2024).
  25. Venken, K. J., Bellen, H. J. Chemical mutagens, transposons, and transgenes to interrogate gene function in Drosophila melanogaster. Methods. 68 (1), 15-28 (2014).
  26. Port, F., Boutros, M. Drosophila: Methods and Protocols. Dahmann, C. , Springer US. 157-176 (2022).
  27. Liao, H., Wu, J., VanDusen, N. J., Li, Y., Zheng, Y. CRISPR-Cas9-mediated homology-directed repair for precise gene editing. Mol Ther Nucleic Acids. 35 (4), 102344(2024).
  28. Shumega, A. R., et al. CRISPR/Cas9 as a Mutagenic Factor. International Journal of Molecular Sciences. 25, 823(2024).
  29. Miller, D. E., Cook, K. R., Hawley, R. S. The joy of balancers. PLoS Genet. 15 (11), e1008421(2019).
  30. Muron, S., Kucera, S., Oliver, B., Benner, L. Creation of a new Drosophila melanogaster X chromosome balancer, First Multiple 8 ( FM8 ), using the CRISPR/Cas9 gene-editing system. MicroPubl Biol. 2022, (2022).
  31. Labun, K., et al. CHOPCHOP v3: expanding the CRISPR web toolbox beyond genome editing. Nucleic Acids Res. 47 (W1), W171-W174 (2019).
  32. Stemmer, M., Thumberger, T., Del Sol Keyer, M., Wittbrodt, J., Mateo, J. L. CCTop: An Intuitive, Flexible and Reliable CRISPR/Cas9 Target Prediction Tool. PLoS One. 10 (4), e0124633(2015).
  33. Bassett, A. R., Tibbit, C., Ponting, C. P., Liu, J. L. Highly efficient targeted mutagenesis of Drosophila with the CRISPR/Cas9 system. Cell Rep. 4 (1), 220-228 (2013).
  34. Wang, H., Zheng, S., Yu, X., Wu, K., Zhao, M. Clinical characteristics and genotypes of patients with Congenital fibrinogen disorders. Zhonghua Yi Xue Yi Chuan Xue Za Zhi. 42 (3), 264-273 (2025).
  35. Chotcomwongse, P., et al. The Impact of Various Surface Treatments on Adhesion Between Co-Cr Alloy and Acrylic Teeth. Int J Dent. 2026, 2199689(2026).
  36. Prakash, S., Havard, M., Hodges, E., Agrawal, A., Ahuja, S. In the artificial intelligence age, is Oswestry spinal risk index still useful? an external validation of Oswestry spinal risk index applied to radiotherapy patients and its relevance. Br J Neurosurg. , 1-9 (2026).
  37. Anaya-Ayala, J. E., et al. Analysis of Inflammatory and Angiogenic Activities in Patients with Abdominal Aortic Aneurysms with the Radiotracers (99m)Tc-HYNIC-CCR2-L and (99m)Tc-RGD with Single-Photon Emission Computed Tomography. Ann Vasc Surg. 124, 312-317 (2026).
  38. Rose, J. B., Coe, I. R. Physiology of nucleoside transporters: back to the future. Physiology (Bethesda). 23, 41-48 (2008).
  39. Niveditha, S., Deepashree, S., Ramesh, S. R., Shivanandappa, T. Sex differences in oxidative stress resistance in relation to longevity in Drosophila melanogaster. Journal of Comparative Physiology B. 187 (7), 899-909 (2017).
  40. Carvalho, G. B., et al. The 4E-BP growth pathway regulates the effect of ambient temperature on Drosophila metabolism and lifespan. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (36), 9737-9742 (2017).
  41. Martelli, F., Alves, A. N., Yang, Y. T., Batterham, P., Wedell, N. Genotype and sex affect the combined impact of temperature and low-dose insecticide exposure on insect survival. Insect Sci. , (2024).
  42. Goh, G. H., Blache, D., Mark, P. J., Kennington, W. J., Maloney, S. K. Daily temperature cycles prolong lifespan and have sex-specific effects on peripheral clock gene expression in Drosophila melanogaster. J Exp Biol. 224 (10), (2021).
  43. Robillard, K. R., Bone, D. B. J., Hammond, J. R. Hypoxanthine uptake and release by equilibrative nucleoside transporter 2 (ENT2) of rat microvascular endothelial cells. Microvasc Res. 75 (3), 351-357 (2008).
  44. Kropotov, A., et al. Equilibrative Nucleoside Transporters Mediate the Import of Nicotinamide Riboside and Nicotinic Acid Riboside into Human Cells. Int J Mol Sci. 22 (3), (2021).
  45. Katsyuba, E., et al. De novo NAD(+) synthesis enhances mitochondrial function and improves health. Nature. 563 (7731), 354-359 (2018).
  46. Suman, R., et al. Deregulation of mitochondrial reverse electron transport alters the metabolism of reactive oxygen species and NAD+/NADH and presents a therapeutic target in Alzheimer's disease. Ageing Neur Dis. 4 (1), 4(2024).
  47. Pérez, S. E., Gooz, M., Maldonado, E. N. Mitochondrial Dysfunction and Metabolic Disturbances Induced by Viral Infections. Cells. 13 (21), (2024).
  48. Ballard, J. W., Melvin, R. G., Miller, J. T., Katewa, S. D. Sex differences in survival and mitochondrial bioenergetics during aging in Drosophila. Aging Cell. 6 (5), 699-708 (2007).
  49. Yi, Y., Xu, W., Fan, Y., Wang, H. X. Drosophila as an emerging model organism for studies of food-derived antioxidants. Food Res Int. 143, 110307(2021).
  50. Tiberi, J., et al. Sex differences in antioxidant defence and the regulation of redox homeostasis in physiology and pathology. Mechanisms of Ageing and Development. 211, 111802(2023).
  51. Gratz, S. J., et al. Genome engineering of Drosophila with the CRISPR RNA-guided Cas9 nuclease. Genetics. 194 (4), 1029-1035 (2013).
  52. Yan, Y., Schetelig, M. F. Protocol for genetic engineering in Drosophila suzukii using microinjection. STAR Protocols. 5 (3), 103248(2024).
  53. Aguilar, G., et al. Seamless knockins in Drosophila via CRISPR-triggered single-strand annealing. Developmental Cell. 59 (19), 2672-2686.e5 (2024).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

234 234
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.