يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

تحضير الأنسجة الوعائية الجديدة من أنسجة الورم الدبقي البشري لتحليل البروتيوميات الكمي لتكون الأورام

487 مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/69547

⸱

مارس 20, 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Shandong Provincial Key Laboratory of Precision Oncology, Shandong Cancer Hospital and Institute, Shandong First Medical University & Shandong Academy of Medical Science, 2Shandong Provincial Key Medical and Health Laboratory of Ovarian Cancer Multiomics, & Jinan Key Laboratory of Cancer Multiomics, Shandong First Medical University & Shandong Academy of Medical Science, 3School of Medicine, Wayne State University, 4Department of Pathology, The Second Xiangya Hospital, Central South University, 5Hunan Clinical Medical Research Center for Cancer Pathogenic Genes Testing and Diagnosis,, 6Department of The 1st General Surgery, The Third Xiangya Hospital, Central South University

في هذه المقالة

ملخص

نجح هذا البروتوكول في إعداد نسيج وعائي جديد عالي الجودة من عينات الورم الدبقي باستخدام التشريح الدقيق بالالتقاط بالليزر لتحليل بروتيوميات كمي لتكون الأوعية الدموية، متغلبا على قيود الدراسات التي تركز تقليديا بشكل رئيسي على العوامل المسببة للأوعية، وقدم ملفا واسع النطاق لبروتيوميات تكوين الأورام الدبقية.

الملخص

يمثل الورم الدبقي الأورام الخبيثة الأولية في الجهاز العصبي المركزي ذات معدلات حدوث ووفيات كبيرة. تكون الأوعية الدموية هو السمة المميزة لفيزيولوجيا مرض الورم الدبقي ويعد حدثا مهما في بيئة الورم. الهيكل الشاذ لعملية الورم الوعائية الجديدة يؤدي دورين: مصدر إمداد غذائي وبوابة نقلية تمكن خلايا الورم من غزو مجرى الدم. العلاج بمضادات تكوين الأوعية الوعائية هو موضوع ساخن في مجال السرطان. تركز معظم الدراسات السابقة على العوامل المنشطة والمثبطة لتكون الأومية؛ ومع ذلك، فإن هذا يوضح فقط تكون الأوعية الدموية في نطاق محدود جدا. تساهم التغيرات غير الطبيعية في التعبير البروتيني أو التعديلات بعد الترجمة في الشكل غير الطبيعي للأوعية الدموية في الورم الدبقي (glioma). استخدم هذا البروتوكول التشريح الدقيق بالالتقاط بالليزر (LCM) لعزل وتنقية كمية كافية من الأنسجة الوعائية الجديدة من أنسجة الورم الدبقي (glioma)، والذي استخدم في تحليل البروتينات الكمية الموسومة بالنظائر لتحديد البروتينات المعبر عنها بشكل مختلف في أنسجة الأوعية الدموية الجديدة للورم الدبقي مقارنة بالمجموعة الضابطة. توفر هذه البيانات أساسا علميا حيويا لتوضيح الآليات المرضية لتكون الأوعية الدموية، واكتشاف أهداف علاجية مضادة للأوعية، وبناء مؤشرات حيوية قائمة على تكوين الأوعية الدموية.

المقدمة

الأورام الدبقية هي أورام في الجهاز العصبي المركزي (CNS) شديدة التجانس، تنشأ من خلايا دبقية توفر الدعم البنيوي والأيضي للخلاياالعصبية 1، وتصنف نسيجيا إلى أنواع فرعية: الأورام النجمية، أورام التجود، والورم الظهري2. وفقا لنظام تصنيف منظمة الصحة العالمية، فإن الدرجتين الدبقية I وII هما الأورام الدبقية منخفضة الدرجة (LGG)، وتتميز عادة بمعدلات نمو بطيئة واستقرار طويل الأمد، وغالبا ما تكون قابلة للاستئصال الجراحي بناء على الموقع التشريحي. على النقيض من ذلك، الدرجتان الثالثة والرابعة هما الأورام الدبقية عالية الدرجة (HGG)، التي تكون في الغالب غير متمايزة وخبيثة ذات سلوك غازي شديد وتوقعات ضعيفة3. العلاجات الحالية لا تزال محدودة وغير فعالة إلى حد كبير؛ بينما يحسن الاستئصال الآمن القصوى مع العلاج الإشعاعي أو العلاج الكيميائي بعد العملية بشكل معتدل التوقعات بشكل معتدل، إلا أن القيود والسموم الكبيرة لا تزال موجودة بسبب نمو الأورام المنتشر والتسلل والحدود غير الواضحة التي تمنع الاستئصال الجذري 4,5. الأورام الدبقية البشرية، خاصة الدرجات العالية من الورم الدبقي المزمن، هي أورام خبيثة شديدة الأوعية الدموية تعتمد نموها وتكاثرها وغزوها بشكل كبير على التحول غير الطبيعي للأوعية الدموية، وهو علامة حاسمة لسرطان الأورام الدبقية 6,7. دراسة استهداف تكوين الأورام لها مزايا علمية كبيرة لتحقيق اختراقات علاجية.

تتضمن التكوين الوعائي بشكل أساسي تكاثر الخلايا البطانية وهجرتها وتمايزها تحت محفزات محددة، مع تركيز البحث على المنظمات: (1) المحفزات، بما في ذلك عامل النمو البطاني الوعائي (VEGF)8، الفازورين (VASN)9، عامل نقص الأكسجين 1 (HIF1)10، عامل النمو المتحول β (TGF-β)11، إندوكان12، عامل النمو المشتق من الصفائح الدموية (PDGF)13، وعامل نمو البشرة (EGF)14; و(2) المثبطات، بما في ذلك الأنجيوستاتين15، الإندوستاتين16، مستقبل عامل تنشيط الصفائح الدموية-1 (TSP-1)17، ومثبطات الأنسجة للبروتينات المعدنية (TIMPs)18. في تجارب أورام الدماغ في المرحلة الأولى والثانية والثالثة السريرية، تستهدف معظم الأدوية المضادة لتوليد الأوعية إشارات VEGF بسبب دورها المركزي في تكون الأوعية، كما يتجلى بيفاسيزوماب، وهو جسم مضاد أحادي النسيلة يثبط التكوين الوعائي الجديد من خلال حجب VEGF 19,20,21. ومع ذلك، أظهرت التجارب الحديثة من المرحلة II/III عدم وجود فائدة إجمالية ذات دلالة كبيرة في البقاء لمرضى الورم الأرومي الدبقي المتقدم الذين يتلقون بيفاسيزوماب مع لوموستين مقارنة باللوموستين فقط 19,20,21,22. والأهم من ذلك، أن العلاج المضاد ل VEGF يحسن التشوهات الوعائية لكنه يثبط فقط تكوين الأوعية الدموية دون تسمم خلايا الورم مباشرة، وقد يحفز مقاومة العلاج. وبالتالي، فإن استهداف منظم واحد أو عدد قليل من منظمات الأوعية الدموية يفشل في تحقيق علاج جذري؛ تتطلب الاستراتيجيات الفعالة قمع تكويث الأوعية الدموية وحجب غزو الأورام وانتشارها عبر المسارات الوعائية. القيمة التشخيصية والتنبؤية للبروتينات في الأورام الدبقية مثبتة جيدا، ومع ذلك شهد علاج الورم الدبقي الخبيث تقدما محدودا على مدى عقود.

يمكن للبروتيوميات تحليل جميع البروتينات في العينات البيولوجية عالميا، بما في ذلك ملفات التعبير، والتعديلات بعد الترجمة (PTMs)، والتفاعلات، باستخدام تقنيات تعتمد على مطيافية الكتلة (MS)، بما في ذلك النهج من الأعلى إلى الأسفل (TDP) والأسفل إلى الأعلى (BUP). يمكن التصلب المتعدد عالي الإنتاجية من تحديد عشرات الآلاف من البروتينات في كل جرعة، مما يجعله ضروريا لدراسة آليات الأورام وتحديد الأهداف العلاجية. يمكن تحديد وفرة البروتين وPTMها في أنسجة الورم الدبقي والخزعات السائلة مثل الدم ومشتقاته23، 24، 25، السائل الدماغي الشوكي26، والبول27. بالنسبة للأوعية الدموية الورمية، فإن تعبيرات البروتين غير الطبيعية وPTMs هي التي تدفع التغيرات المرضية في الأوعية الدموية. يمكن تحديد التغيرات البروتينية في تحويل الأوعية الدموية الجديدة للورم الدبقي باستخدام علم البروتينيات، الذي يدفع تطوير البروتوكول لتحليل البروتيومية الدقيقة لعملية الوعاءات الدبقية الجديدة.

ومع ذلك، فإن الأنسجة الوعائية الجديدة هي فقط أحد المكونات في كامل أنسجة الورم الدبقي الطبيعي. يعد عزل وتنقية الأنسجة الوعائية الجديدة من كامل أنسجة الورم الدبقي هو الخطوة الأساسية لتحليل دقيق للبروتيوميات الكمية لتكون الأورام الدبقية. التشريح الدقيق بالالتقاط بالليزر (LCM)28,29,30,31 هو نهج فعال لعزل وتنقية الأنسجة الوعائية الجديدة من أنسجة الورم الدبقي بالكامل. من الصعب جدا الحصول على كمية كافية من بروتينات الأنسجة الوعائية الجديدة للبروتيوميات الكمية. في عام 2007، حاول فريق بحثي استخدام LCM لفصل الأنسجة الوعائية الجديدة عن الورم الدبقي من الدرجة الرابعة لتحليل البروتيوميات، والذي حدد أربعة بروتينات فقط مصابة بالتصلبالمتعدد 32. لاحقا، في عام 2012، استخدموا الطب المنخفض المنخفض بشكل مستمر لإثراء الأنسجة الوعائية الجديدة من الأورام الدبقية من الدرجة الرابعة لتحليل البروتينات الكمية، والتي حددت فقط 29 بروتينا مصابا بالتصلبالمتعدد 33. تظهر هاتان الدراتان لتكون الأوعية الدبقية بروتيوميا منخفضا جدا في تكوين الأوعية الدبقية، وهو ما لا يمكن تمثيل المشهد المعقد للبروتيومية لتكون الأوعية الدبقية.

طور هذا البروتوكول إجراء يمكن من الحصول على كميات كافية من البروتينات الوعائية الجديدة لتحليل البروتينات الكمي لتكون الأوعية الدبقية، مما يخلق مشهدا بروتيوميا واسع النطاق لتكون الأوعية الدموية. وهذا له قيمة علمية كبيرة لاكتشاف مؤشرات حيوية فعالة قائمة على تكوين الأوعية الدموية وأهداف/أدوية علاجية مضادة لتكوين الأوعية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تمت الموافقة على هذا البروتوكول الذي يتضمن عينات أنسجة بشرية من قبل لجنة مراجعة الأخلاقيات الطبية في جامعة شاندونغ الطبية الأولى (رقم الموافقة R202211090133)، وتم الحصول على موافقة مستنيرة من المرضى وعائلات المرضى. تم الحصول على عينات الورم الدبقي المستخدمة في هذه الدراسة جميعها من عينات جراحية عصبية تم استئصالها في قسم جراحة الأعصاب بمستشفى شيانغيا بجامعة سنترال ساوث، بما في ذلك 7 حالات من أنسجة الورم النجمي من الدرجة الثالثة. تم أخذ الأوعية الضابطة الطبيعية (n = 3) من الأوعية الدقيقة داخل نسيج الدماغ التالف الذي أزيل بسبب إصابة دماغية. جميع المرضى كانوا من الحضور لأول مرة دون علاج إشعاعي أو كيميائي سابق قبل الجراحة، وتم تشخيصهم جميعا من قبل قسم علم الأمراض في مستشفى شيانغيا، جامعة سنترال ساوث. يتم الحصول على ثلاثة أنسجة أوعية دموية طبيعية من خلال استئصال جراحي للأمراض الدموية الصغيرة جدا من تضرر دماغي طبيعي بقوة خارجية (بدون ورم دبقي الدماغي) في مستشفى شيانغيا. المواد المستخدمة والمواد المستخدمة مدرجة في جدول المواد.

1. استخدام النسيج اللوقيي لعزل الأنسجة الوعائية الجديدة من أنسجة الورم الدبقي البشري

  1. تحضير شريحة LCM: غط غشاء البولي إيثيلين نفثالات (PEN) يدويا على شرائح معدنية قابلة لإعادة الاستخدام، وتخزين الشرائح المطلية في درجة حرارة -80 درجة مئوية.
    ملاحظة: سيتم استخدام شرائح معدنية مطلية مسبقا للصق أقسام الأنسجة المجمدة مباشرة.
  2. حضر محلول صبغة تولويدين الأزرق (0.5٪): ذيب 0.25 جرام من تولويدين بلو في 40 مل ddH₂O. أضف قرص مثبط بروتياز واحد وامزج حتى يذوب تماما. اضبط الحجم إلى 50 مل باستخدام ddH₂O، فلتر، وخزن على الثلج.
  3. أنسجة العينة: الحفاظ على التجميد عند درجة حرارة التشغيل (-25 درجة مئوية في الحجرة/رأس العينة). استرجاع أنسجة الورم الدبقي من تخزين بدرجة حرارة -80 درجة مئوية، انقله على الثلج، إزالة الدم باستخدام ورق المرشح، واختيار كتل الأنسجة المناسبة للغرس.
  4. بروتوكول تضمين الأنسجة: قرص العينة قبل التبريد. ضع وسط التضمين وقم بتثبيت كتلة الأنسجة بسرعة. جمد الكتلة بالكامل على درجة حرارة -25 درجة مئوية لمدة 10 دقائق للتصلب.
  5. نسيج مقطع وأوعية الشاشة: الأنسجة المقسمة بسماكة 8 ميكرومتر. قم بتركيب أقسام الأنسجة على شرائح قياسية، وصبغ الأنسجة بمحلول تلوين أزرق تولويدين، وفحص الأوعية الدموية الجديدة تحت المجهر البصري.
    ملاحظة: إذا لم تكتشف أي أوعية، تخلص من 3 إلى 5 أقسام أنسجة وكرر دورة التلوين حتى تظهر مناطق الأوعية الدموية الجديدة.
  6. تركيب قسم الأنسجة الموجبة للوعاء على شريحة LCM المحضرة: نقل الأقسام الموجبة للأوعية إلى شرائح LCM مطلية ب PEN، ختم، وضع علامة، وتخزينه عند -80 درجة مئوية.
  7. تثبيت أقسام الأنسجة المثبتة على شريحة LCM في إيثانول مبرد مسبقا بنسبة 70٪ (4 درجات مئوية، 1–2 دقيقة)؛ التصريف والصبغة بلون أزرق تولويدين بنسبة 0.5٪ (4 درجات مئوية، 30 ثانية)؛ قم بصبغة التصريف، وشطفها مرتين في محلول ddH₂O (4 درجة مئوية؛ حمامين منفصلين)، ثم تصريف، ثم حضنها في محلول مثبط للبروتيز (30 ثانية)، وتخزينها عند -80 درجة مئوية.
  8. شغل جهاز LCM مسبقا، ثم سخن مسبقا لمدة 30 دقيقة، ثم استخدم ليزر الأشعة تحت الحمراء الحالة الصلبة للتسخين لمدة 30 دقيقة أخرى، ثم قم بتركيب جهاز جمع أنابيب الطرد المركزي الدقيق بسعة 500 ميكرولتر.
  9. تحميل شرائح LCM المثبتة على عينات الأنسجة (المخزنة عند -80 درجة مئوية) على جهاز LCM المعد، وضبط التركيز على الأوعية الوعائية الجديدة في أنسجة الورم الدبقي بمساعدة البرنامج المتوافق.
  10. حدد بدقة خط العلامات بالليزر على الحافة الخارجية للوعاء الوعائي الجديد (تجنب الجدار الوعائي)، واستخدم الليزر لحرق وفصل الأوعية الوعائية الجديدة، ثم جمعها داخل غطاء أنبوب EP.
    ملاحظة: استخدم حرق الليزر الثاني للتأكد من أن الأوعية الوعائية الجديدة قد انفصلت تماما.
  11. قم بقلب وإغلاق أنبوب عينة الأوعية الدموية الجديدة المجمع، وتخزينه في فريزر بدرجة حرارة -80 درجة مئوية.

2. استخراج البروتينات من أنسجة الأورام الدبقية الوعائية الجديدة المعزولة في LCM وقياس محتوى البروتين

  1. حضر محلول استخلاص البروتين الذي يحتوي على 4٪ صوديوم دوديسيل كبريتات (SDS)، و1 ملليمولار ديثيوثريتول (DTT)، و150 ملليمول تريس-HCl (درجة حموضة 8.0).
    ملاحظة: SDS هو غبار خطير يهيج بشدة العينين والجلد والجهاز التنفسي، ويجب وزنه في غطاء أبخرة؛ وDTT هو مهيج، ويجب أن يزن في غطاء بخار.
  2. أعد تعليق أنسجة الأوعية الدموية الجديدة التي جمعتها LCM في منطقة العزل الخلفي. استخدم سونيكيت على حمام ماء مثلج لمدة دقيقة واحدة للتحلل الكامل.
  3. قم بالطرد المركزي بقوة 16,000 x g لمدة 10 دقائق، ثم نقل المادة الفائقة إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيقة الجديدة.
  4. Aliquot أدنى مادة فائقة للبروتينات لقياس كمية البروتين. أضف DTT إلى الفائق المتبقي (التركيز النهائي: 1 ملليموتر DTT)، ثم اخلط بلطف عن طريق التوصيل لتجنب الفقاعات. أليكوت وخزن عند -80 درجة مئوية.
  5. قم بإجراء اختبار بروتين حمض البيسينشونيك (BCA) باتباع الخطوات التالية:
    1. تحضير الحل العامل (المادة A:B = 50:1).
    2. تحضير معيار ألبومين المصل البقري (BSA) (0.5 ملغ/مل).
    3. أضف الحلول المقابلة وفقا للجدول 1.
    4. اخلط العينات/المعايير مع المحلول العامل، ثم انقله إلى صفيحة بسعة 96 بئرا.
    5. حضن على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
    6. قس الامتصاص عند 562 نانومتر.
    7. احسب التركيزات مقابل المنحنى القياسي.

3. استخدام البروتيوميات الكمية لتحليل البروتينات الوعائية الجديدة المحضرة

  1. تحضير عينات ببتيد تريبتيكية من البروتينات الوعائية الجديدة المستخرجة.
    1. أضف الأسيتون البارد جدا إلى كل عينة بروتين مستخرجة (ورم؛ ضابط) (العينة: الأسيتون = 1:5، v/v)، وامزجه جيدا، وحضن عند -20 درجة مئوية لمدة ساعة. الطرد المركزي عند 12,000 × جرام (4 درجات مئوية) لمدة 15 دقيقة. تخلص من المادة الفائقة لإزالة كواشف استخراج البروتين (SDS، DTT، وTris-HCL)، وأعد تعليق الحبيبات في مخزن ذوبان 20 ميكرولتر مع 1 ميكرولتر 1٪ SDS.
      ملاحظة: استخدم الأسيتون مع تهوية كافية أثناء ارتداء نظارات الأمان، وابتعد عن مصادر الإشعال، وتخلص من النفايات في حاوية مخصصة مقاومة للشرارات.
    2. أضف 2 ميكرولتر من كاشف الاختزال (DTT) إلى كل عينة، وامزج جيدا، وحضن على حرارة 60 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. أضف 1 ميكرولتر كاشف حاجب السيستين (يودوأسيتاميد)، ثم حضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.
    3. أضف التريبسين (البروتين: تريبسين = 20:1، v/v) إلى كل عينة. خلط الدوامة واحتضن عند 37 درجة مئوية خلال الليل.
  2. استخدم التارجات متساوية الضغط لمادة القياس النسبي والمطلق (iTRAQ) لوضع علامات على الببتيدات التريبتيكية المحضرة.
    ملاحظة: في هذا البروتوكول، تستخدم كواشف iTRAQ ذات الستة أرقام (علامات plex 113، 114، 115، 116، 117، و118) لوضع علامات على عينات الببتيد التريبتي (ورم؛ ضابطة)، ويتم تصنيف كل نوع من العينة ثلاث مرات (الجدول 2).
    1. أعد تشكيل كل أنبوب كاشف iTRAQ باستخدام 50 ميكرولتر إيزوبروبانول.
    2. أضف عينات من الببتيدات التريبتيكية إلى أنابيب الكواشف المقابلة، ثم حضن في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة.
    3. أنهي التفاعلات بإضافة ماء فائق نقي بحجم 3×، ثم حضن لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    4. اجمع العينات الست المصنفة بنفس الطريقة، وامزج جيدا، وقم بتحميم الليوفيل.
  3. استخدم تبادل كاتيوني قوي (SCX) لتقسيم عينة الببتيد التريبتيكية الموسومة ب iTRAQ.
    1. إعادة تكوين الببتيدات المحببة لليوفيليت في محلول A بحجم 2 مل (10 ملليموتر KH₂PO₄، 25٪ ACN، رقم الهيدروجينات 2.7). تحميل على عمود تبادل كاتيوني وظيفي بالسلفوإيثيل (4.6 × 100 مم، 5 ميكرومتر، 200 أوغو.
    2. الأنبوب بمعدل تدفق ثابت 1 مل/دقيقة باستخدام المحلول B (500 ملليمولار KCl، 10 ملليمولار KH₂PO₄، 25٪ ACN، الرقم الهيدروجيني 2.7): 0٪→10٪ (دقيقتين) → 10٪→20٪ (25 دقيقة) → 20٪→45٪ (5 دقائق) → 50٪→100٪ (5 دقائق). راقب على 214 نانومتر طوال العملية، واجمع كل دقيقة لكل أنبوب، ليصبح المجموع 30 جزءا.
    3. تركيز كل جزء بواسطة الطرد المركزي الفراغي، ثم أعد التكوين ب 40 ميكرولتر من حمض ثلاثي فلورو أسيتيك 0.1٪ (v/v) (TFA). يتم تخزين جميع الأجزاء الثلاثين في فريزر بدرجة حرارة -80 درجة مئوية.
      ملاحظة: TFA شديدة التآكل والسمية، وتسبب أضرارا شديدة للجلد والعين، وتهيج الجهاز التنفسي؛ يجب التعامل معه بغطاء أبخرة مع معدات حماية مناسبة تشمل قفازات مقاومة للأحماض ونظارات واقية ومعطف مختبر، ويجب جمع النفايات كنفايات حمضية.
  4. استخدم LC-MS/MS لتحليل كل عينة ببتيد مجزأة.
    1. استخدم خرطوشة استخراج الطور الصلب معكوسة من C18 (كثافة قياسية، معرف القاعدة 7 مم، حجم 3 مل) لإزالة الأملاح.
    2. استخدم عمود كروماتوغرافيا سائل عكسي الطور (LC) من C18 (طول 10 سم، قطر 75 ميكرومتر، راتنج 3 ميكرومتر) لسحب 10 ميكرولتر من كل جزء باستخدام محلول C (0.1٪ حمض الفورميك) وتدرج محلول D (80٪ أسيتونونتريل و0.1٪ حمض فورميك) بمعدل 250 نانولتر/دقيقة لمدة 140 دقيقة.
    3. يتم إدخال الببتيدات المنفصلة عن LC عبر الإنترنت إلى مطياف كتلة عالي الدقة لتحليل MS/MS.
    4. تحويل ملفات الطيف الخام (.raw) التي تولدها Q Exactive إلى صيغة .mgf باستخدام Proteome Discoverer 1.4، ثم إرسال ملفات .mgf إلى خادم MASCOT 2.2، وهو الوحدة المدمجة في البرنامج للبحث في قواعد البيانات.
      ملاحظة: قاعدة بيانات Uniprot البشرية (146,704 تسلسلات إجمالية؛ تم تحميلها في 20 يوليو 2025 من http://www.uniprot.org) تستخدم مع معلمات بحث مفصلة (الجدول 3).
    5. استرجاع ملفات البحث الناتجة (.dat) من خادم MASCOT مرة أخرى إلى Proteome Discoverer 1.4. بيانات الترشيح عند عتبة معدل اكتشاف خاطئ (FDR) تبلغ <0.01 للحصول على تعريفات عالية الثقة.
    6. تحديد تسلسل الأحماض الأمينية البروتينية باستخدام بيانات MS/MS، وقياس وفرة البروتين باستخدام شدة أيونات iTRAQ reporter.
    7. احسب قابلية التكرار التجريبي لتحديد قيمة القطع للبروتينات المعبر عنها بشكل تفاضلي (DEPs) بالإضافة إلى دلالة p<0,05.
      ملاحظة: في هذه الدراسة، يتم تحديد قيمة القطع كتغيير الطي (FC) > 1.4، مما يمكنه إزالة الأخطاء المنهجية بشكل فعال.
  5. تحليل الخصائص الوظيفية لحالات DEPs الوعائية الجديدة الورم الدبقي (دبقية الأوعية الدموية).
    1. يمكنك الوصول إلى الصفحة الرئيسية ل DAVID (قاعدة بيانات التعليق والتصور والاكتشاف المتكامل، الإصدار 6.7؛ https://david.ncifcrf.gov/) واختر Start Analysis في شريط القائمة لبدء التحليل.
    2. اختر اللوحة اليسرى التي تعمل كواجهة رفع؛ أدخل معرفات البروتين أو الجينات في مربع إدخال الخطوة 1 حسب الطلب (باستخدام وظيفة النسخ واللصق).
    3. في الخطوة 2، اختر نوع المعرف الذي يطابق البروتينات المرفوعة؛ استخدمت هذه الدراسة نظام UniProt Accession.
    4. في الخطوة 3، اختر قائمة الجينات أو إعدادات الخلفية: يتطلب تحليل إثراء الجينات اختيار مجموعة جينات خلفية. النظام يعرض بشكل افتراضي الجينوم الكامل للنوع، أو يمكن للمستخدمين رفع قائمة بروتين/جينات مخصصة كخلفية.
    5. انقر على قائمة الإرسال لتقديم المشاركات وبدء التحليل.
      ملاحظة: تعرض نتائج التحليل على الجانب الأيمن من لوحة "نتائج ملخص التعليقات". يمكن للمستخدمين اختيار المخرجات حسب الاحتياجات التحليلية؛ استخدمت هذه الدراسة قائمة GOTERM_BP_FAT بشكل خاص لتحليل العمليات البيولوجية التي تشمل DEPs.
    6. الحصول على العمليات البيولوجية (BPs)، والمكونات الخلوية (CCs)، والوظائف الجزيئية (MFs)، ومسارات KEGG لأنظمة DEP النيووعائية الناتجة عن الورم الدبقي الوعائي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

تم الحصول على كمية كافية من عينات البروتين المعزولة بواسطة LCM للبروتيوميات الكمية

للحصول على ملفات بروتيومية موثوقة للبروتينات المعبر عنها بشكل مختلف في أنسجة الأوعية الدموية الجديدة، اختارت هذه الدراسة النوع الفرعي الأكثر انتشارا من الورم الدبقي الدرج، وهو الورم النجمي من الدرجة الثالثة، والأنسجة الوعائية الجديدة المعزولة باستخدام الورم العميق المنخفض بسبب توفر الأوعية الدموية الجديدة المخصية. علاوة على ذلك، يتطلب البروتيوميات الكمية ≥400 مي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

حدد الميكروفون المنخفض مع البروتيوميات الكمية التي تميز النظائر أول ملف بروتيومي واسع النطاق لتكون الأورام الدبقية

تكوين الأورام الوعائية هو علامة مرضية حاسمة للأورم الدبقية، مرتبط ارتباطا وثيقا بغزوله العالي ومقاومته العلاجية 6,7. تظهر العلاجات التقليدية المضادة للأمراض الدموية (مثل مثبطات VEGF) فعالية سريرية محدودة بسبب الرتابة المستهدفة والمقاومة التعويضية 19,20,21,22.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يعلن المؤلفون عدم وجود مصالح متنافسة.

شكر وتقدير

وقد دعم هذا العمل الصندوق الوطني الصيني للعلوم الطبيعية (81272798 إلى X.Z.، و 82203592 إلى NL.)، ومؤسسة العلوم الطبيعية الإقليمية في شاندونغ (ZR2022QH112 إلى N.L.)، وصناديق مشروع الهندسة العلمية العلمية في مقاطعة شاندونغ (NO.tstp2021143 إلى X.Z.)، وبرنامج الخبراء الأجنبيين الوطني رفيع المستوى في الصين (H20240743؛ خبير أجنبي: X.Z.)، ومشروع البحث العلمي العلمي في الزراعة العلمية لجامعة شاندونغ الطبية الأولى في الحقول الاستراتيجية الناشئة (202403).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
صفيحة 96-بئرثيرمو فيشر العلمي (الولايات المتحدة الأمريكية)468667المواد الاستهلاكية
الأسيتونكاشف نانجينغ (الصين)C0720114023المادة الكيميائية
الأسيتونيتريلميرك (الصين)CN34892المادة الكيميائية
مجموعة اختبار بروتين BCAأبكام (المملكة المتحدة)ab102536المادة الكيميائية
معيار الألبومين المصلي البقري (BSA)سولاربيو (الصين)PC0001-1المادة الكيميائية
أنبوب الطرد المركزي (50 مل)كيرغن (الصين)KG2811المواد الاستهلاكية
كريستات ميكروتوملايكا (ألمانيا)حوالي 1900المعدات
السيستينعلاء الدين (الصين)C108238المادة الكيميائية
DL-ديثيوثرايتول (DTT)أمريسكو (الولايات المتحدة الأمريكية)D8220المادة الكيميائية
عمود HPLC الطور المعكوس EASY-Spray C18ثيرمو ساينتفيك (الولايات المتحدة الأمريكية)ES800Aالمواد الاستهلاكية
التوازن الإلكترونيسارتوريوس (الولايات المتحدة الأمريكية)BSA224Sالمعدات
وسيط التضمينلايكا (ألمانيا)39475237المواد الاستهلاكية
خرطوشات إمبور SPE C18سيغما-ألدريتش (الولايات المتحدة الأمريكية)66872-Uالمواد الاستهلاكية
أنبوب إيبندورفكيرغن (الصين)KG2211المواد الاستهلاكية
ورق الفلترسايتيفا (الولايات المتحدة الأمريكية)الصف 42المواد الاستهلاكية
حمض الفورميكعلاء الدين (الصين)F112032المادة الكيميائية
زجاج بيكرشوبو (الصين)1015479المواد الاستهلاكية
أسطوانة زجاجية متدرجةشوبو (الصين)1601المواد الاستهلاكية
‌ الكروماتوغرافيا السائلة عالية الدقة - مطيافية الكتلةثيرمو ساينتفيك (الولايات المتحدة الأمريكية)Q-Exactiveالمعدات
الحاوية المعزولةفهيفون (الصين)LCZYX-12المواد الاستهلاكية
المجهر المقلوب  لايكا (ألمانيا)XDS-1المعدات
يودوأسيتاميدسولاربيو (الصين)I8010المادة الكيميائية
إيزوبوبانولعلاء الدين (الصين)I112018المادة الكيميائية
كواشف iTRAQسيغما-ألدريتش (الولايات المتحدة الأمريكية)4381663المادة الكيميائية
KClبيوتايم (الصين)ST1596المادة الكيميائية
KH2PO4شانغهاي يوان يي (الصين)S24278المادة الكيميائية
التشريح الدقيق بالليزرلايكا (ألمانيا)LMD 6000المعدات
شريحة التشريح الدقيق بالليزرلايكا (ألمانيا)3800040المواد الاستهلاكية
شفرات لايكا ذات الملف العالي القابل للتخلص منهالايكا (ألمانيا)14035838926المواد الاستهلاكية
حاوية النيتروجين السائلكييكريو (الصين)YDS-3المعدات
محرك اللوحة الساخنة المغناطيسيةشنغهاي سيل (الصين)LAB-0002-0068-SHSLالمعدات
قارئ اللوحة الدقيقةتيكان (سويسرا)إنفنايت F200المعدات
PEN  الغشاءلايكا (ألمانيا)11505189المواد الاستهلاكية
مقياس الرقم الهيدروجينيسارتوريوس (الولايات المتحدة الأمريكية)PB-10المعدات
بيبيتيإبندورف (ألمانيا)3123000268المعدات
بيبيتيإبندورف (ألمانيا)3123000241المعدات
بيبيتيإبندورف (ألمانيا)3123000225المعدات
بولي سلفوإيثيل Aبولي إل سي إنك (الولايات المتحدة الأمريكية)104SE0303المواد الاستهلاكية
مثبط البروتيزروش (سويسرا)05892791001المادة الكيميائية
الطرد المركزي المبردبيكمان (الولايات المتحدة الأمريكية)أليغراTM X-22Rالمعدات
الثلاجةميلينغ (الصين)BCD-180KCTالمعدات
كبريتات الصوديوم الدوديسيل (SDS)أمريسكو (الولايات المتحدة الأمريكية)1027P033المادة الكيميائية
برطمان التلوينبيوتايم (الصين)FG005المواد الاستهلاكية
مغرفة من الفولاذ المقاوم للصدأموزيكسينغ (الصين)XYS-101المواد الاستهلاكية
نصائحكيرغن (الصين)KG1313المواد الاستهلاكية
محلول صبغة التوليدين الأزرقسيغما-ألدريتش (الولايات المتحدة الأمريكية)198161-5G/198161-25Gالمادة الكيميائية
حمض ثلاثي فلورو أسيتيكعلاء الدين (الصين)T103293المادة الكيميائية
تريس-HClأمريسكو (الولايات المتحدة الأمريكية)T8230المادة الكيميائية
حل تريبسين-إيدتاسولاربيو (الصين)T1300المادة الكيميائية
فريزر فائق الحرارةسانيو (اليابان)MDF-382Eالمعدات
منقي المياه فائق النقاءإلغا (المملكة المتحدة)بيورلاب فليكسالمعدات
معطل الخلايا فوق الصوتيةQSONICA (الولايات المتحدة الأمريكية)Q500المعدات
مجفف بالتجميد بالتفريغثيرمو (الولايات المتحدة الأمريكية)SNL 315SVالمعدات
خلاط الدوامةتقنية الكريستال & الصناعات (الولايات المتحدة الأمريكية)HYQ-3110المعدات
حاضنة حمام الماءأداة تكنولوجيا شنغهاي ييهنغ (الصين)HWS-26المعدات
ورق الوزنكول-بارمر (الولايات المتحدة الأمريكية)133802المواد الاستهلاكية

المراجع

  1. Lapointe, S., Perry, A., Butowski, N. A. Primary brain tumours in adults. Lancet. 392 (10145), 432-446 (2018).
  2. Pienkowski, T., et al. Proteomic profiling reveals dynamic regulation of vesicle trafficking across glioma grades. J Neurooncol. 175 (2), 585-598 (2025).
  3. Louis, D. N., et al. The 2021 WHO classification of tumors of the central nervous system: A summary. Neuro Oncol. 23 (8), 1231-1251 (2021).
  4. Kan, L. K., et al. Potential biomarkers and challenges in glioma diagnosis, therapy and prognosis. BMJ Neurol Open. 2 (2), e000069(2020).
  5. Bertolini, G., et al. Prognostic impact of second surgical resection in IDH wildtype recurrent glioblastoma following chemo-radiation therapy: a propensity score analysis cohort study. J Neurooncol. 174 (3), 789-798 (2025).
  6. Ma, X., et al. Long non-coding RNA HOTAIR enhances angiogenesis by induction of VEGFA expression in glioma cells and transmission to endothelial cells via glioma cell derived-extracellular vesicles. Am J Transl Res. 9 (11), 5012-5021 (2017).
  7. Wang, R., et al. MCPIP1 promotes cell proliferation, migration and angiogenesis of glioma via VEGFA-mediated ERK pathway. Exp Cell Res. 418 (1), 113267(2022).
  8. Seyedmirzaei, H., Shobeiri, P., Turgut, M., Hanaei, S., Rezaei, N. VEGF levels in patients with glioma: a systematic review and meta-analysis. Rev Neurosci. 32 (2), 191-202 (2021).
  9. Zhong, Y., et al. Vasorin exocytosed from glioma cells facilitates angiogenesis via VEGFR2/AKT signaling pathway. Mol Cancer Res. 22 (7), 668-681 (2024).
  10. Domènech, M., Hernández, A., Plaja, A., Martínez-Balibrea, E., Balañà, C. Hypoxia: The cornerstone of glioblastoma. Int J Mol Sci. 22 (22), 12608(2021).
  11. Chen, Z., et al. Prrx1 promotes stemness and angiogenesis via activating TGF-β/smad pathway and upregulating proangiogenic factors in glioma. Cell Death Dis. 12 (6), 615(2021).
  12. Bastola, S., et al. Endothelial-secreted Endocan activates PDGFRA and regulates vascularity and spatial phenotype in glioblastoma. Nat Commun. 16 (1), 471(2025).
  13. Krenzlin, H., et al. Cytomegalovirus promotes murine glioblastoma growth via pericyte recruitment and angiogenesis. J Clin Invest. 129 (4), 1671-1683 (2019).
  14. Hong, G., et al. EGFL7: Master regulator of cancer pathogenesis, angiogenesis and an emerging mediator of bone homeostasis. J Cell Physiol. 233 (11), 8526-8537 (2018).
  15. Feldo, M., et al. Effect of diosmin administration in patients with chronic venous disorders on selected factors affecting angiogenesis. Molecules. 24 (18), 3316(2019).
  16. Anakha, J., Dobariya, P., Sharma, S. S., Pande, A. H. Recombinant human endostatin as a potential anti-angiogenic agent: therapeutic perspective and current status. Med Oncol. 41 (1), 24(2023).
  17. Kaur, S., et al. Functions of thrombospondin-1 in the tumor microenvironment. Int J Mol Sci. 22 (9), 4570(2021).
  18. Qi, J. H., Anand-Apte, B. Deglycosylation increases the aggregation and angiogenic properties of mutant tissue inhibitor of metalloproteinase 3 protein: Implications for sorsby fundus dystrophy. Int J Mol Sci. 23 (22), 14231(2022).
  19. Sandmann, T., et al. Patients with proneural glioblastoma may derive overall survival benefit from the addition of bevacizumab to first-line radiotherapy and temozolomide: Retrospective analysis of the AVAglio trial. J Clin Oncol. 33 (25), 2735-2744 (2015).
  20. Funakoshi, Y., et al. Update on chemotherapeutic approaches and management of bevacizumab usage for glioblastoma. Pharmaceuticals (Basel). 13 (12), 470(2020).
  21. Sferruzza, G., Malcangi, M., Bosco, L., Finocchiaro, G. Reassessing the efficacy of bevacizumab in newly diagnosed glioblastoma: A systematic review and external pseudodata-based analysis. Neurooncol Adv. 6 (1), vdad174.31(2024).
  22. Ahir, B. K., Engelhard, H. H., Lakka, S. S. Tumor development and angiogenesis in adult brain tumor: glioblastoma. Mol Neurobiol. 57 (5), 2461-2478 (2020).
  23. Hallal, S., et al. A comprehensive proteomic SWATH-MS workflow for profiling blood extracellular vesicles: A new avenue for glioma tumour surveillance. Int J Mol Sci. 21 (13), 4754(2020).
  24. Westphal, M., Lamszus, K. Circulating biomarkers for gliomas. Nat Rev Neurol. 11 (10), 556-566 (2015).
  25. Santangelo, A., Tamanini, A., Cabrini, G., Dechecchi, M. C. Circulating microRNAs as emerging non-invasive biomarkers for gliomas. Ann Transl Med. 5 (13), 277(2017).
  26. Gahoi, N., et al. Multi-pronged proteomic analysis to study the glioma pathobiology using cerebrospinal fluid samples. Proteomics Clin Appl. 12 (2), 201870013(2018).
  27. Hao, X., et al. Urinary protein biomarkers for pediatric medulloblastoma. J Proteomics. 225, 103832(2020).
  28. Mustafa, D., Kros, J. M., Luider, T. Combining laser capture microdissection and proteomics techniques. Methods Mol Biol. 428, 159-178 (2008).
  29. Zheng, P. P., et al. Differential expression of splicing variants of the human caldesmon gene (CALD1) in glioma neovascularization versus normal brain microvasculature. Am J Pathol. 164 (6), 2217-2228 (2004).
  30. Miyai, M., Iwama, T., Hara, A., Tomita, H. Exploring the vital link between glioma, neuron, and neural activity in the context of invasion. Am J Pathol. 193 (6), 669-679 (2023).
  31. Komiyama, K., et al. Glioma facilitates the epileptic and tumor-suppressive gene expressions in the surrounding region. Sci Rep. 12 (1), 6805(2022).
  32. Mustafa, D. A. N., et al. Identification of glioma neovascularization-related proteins by using MALDI-FTMS and nano-LC fractionation to microdissected tumor vessels. Mol Cell Proteomics. 6, 1147-1157 (2007).
  33. Mustafa, D. A. N., et al. A proteome comparison between physiological angiogenesis and angiogenesis in glioblastoma. Mol Cell Proteomics. 11 (6), M111.008466(2012).
  34. Li, C., et al. Accurate qualitative and quantitative proteomic analysis of clinical hepatocellular carcinoma using laser capture microdissection coupled with isotope-coded affinity tag and two-dimensional liquid chromatography mass spectrometry. Mol Cell Proteomics. 3 (4), 399-409 (2004).
  35. Woo, J., Schoenfeld, M., Sun, X., Iraguha, T., Zhou, Z., Zhang, Q. Mouse paneth cell-enriched proteome enabled by laser capture microdissection. Proteome Res. 21 (10), 2435-2442 (2022).
  36. Zhang, Y., et al. Quantitative phosphoproteomics reveals molecular pathway network alterations in human early-stage primary hepatic carcinomas: potential for 3P medical approach. EPMA J. 14 (3), 477-502 (2023).
  37. Yang, H., et al. Ubiquitinomics revealed disease- and stage-specific patterns relevant for the 3PM approach in human sigmoid colon cancers. EPMA J. 14 (3), 503-525 (2023).
  38. Wen, S., et al. Quantitative acetylomics revealed acetylation-mediated molecular pathway network changes in human nonfunctional pituitary neuroendocrine tumors. Front Endocrinol (Lausanne). 12, 753606(2021).
  39. Su, J., Yang, L., Sun, Z., Zhan, X. Personalized drug therapy: Innovative concept guided with proteoformics. Mol Cell Proteomics. 23 (3), 100737(2024).
  40. Yang, L., et al. What does one-dimensional gel electrophoresis-based western blotting data really mean in the reality of proteoforms. Talanta. 295, 128266(2025).
  41. Fang, Z., et al. Proteoformics: Current status and future perspectives. J Proteomics. 321, 105524(2025).
  42. Lu, M., Zhan, X. The crucial role of multiomic approach in cancer research and clinically relevant outcomes. EPMA J. 9 (1), 77-102 (2018).
  43. Jia, W., Gong, X., Ye, Z., Li, N., Zhan, X. Nitroproteomics is instrumental for stratification and targeted treatments of astrocytoma patients: Expert recommendations for advanced 3PM approach with improved individual outcomes. EPMA J. 14 (4), 673-696 (2023).
  44. Gong, X., et al. Glioma angiogenesis phosphoproteome landscape and biomarker sets identified with phenome-centered multiomics toward 3P medical approaches. EPMA J. 16 (4), 831-856 (2025).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

تكون الأوعية الدموية في الورم الدبقيالتشريح الدقيق بالالتقاط الليزريالأوعية الدموية الورميةالتعبير البروتيني التفاضليتحليل LC-MS/MSشبكة التفاعل البروتينيالمؤشرات الحيوية للأورامالعلاج المضاد لتكون الأوعية الدموية
تحضير الأنسجة الوعائية الجديدة من أنسجة الورم الدبقي البشري لتحليل البروتيوميات الكمي لتكون الأورام
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.