مقالة منهجية

أخذ عينات فورية من السائل الخلالي الشريان الوريدي الشريان الفخذي الفلكي عن طريق وضع مسبار غسيل الكلى الدقيق

437 مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/69551

⸱

ديسمبر 30, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Beijing Hospital, National Center of Gerontology, Institute of Geriatric Medicine, Chinese Academy of Medical Sciences, 2Peking Union Medical College, 3The Key Laboratory of Geriatrics, Beijing Institute of Geriatrics, Institute of Geriatric Medicine, China Academy of Chinese Medical Sciences, 4Institute of Acupuncture and Moxibustion, China Academy of Chinese Medical Sciences

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

تقدم هذه الدراسة تقنية غسيل الكلى الدقيق تسهل أخذ عينات دقيقة تشريحية في الوقت الحقيقي من السائل الخلالي الظاهري (AISF) في الفئران المخدرة، كاشفة عن اختلافات أيضية مميزة ومؤكدة أهميته الفسيولوجية الفريدة. بالمقارنة مع طرق أخذ عينات السوائل البينية (ISF) الحالية، يوفر هذا النهج دقة جزيئية محسنة واستقرارا في أخذ العينات.

الملخص

السائل الخلالي (ISF) هو عنصر حيوي في البيئة الدقيقة خارج الخلية، حيث يسهل التبادل الأيضي والتواصل بين الخلايا. ومع ذلك، فإن العمق التشريحي والقرب الشديد من الهياكل الوعائية يجعل من الصعب بشكل خاص أخذ عينات من ISF العرضية (AISF) دون إحداث تلوث أو التسبب في اضطراب الأنسجة. في هذه الدراسة، نقدم طريقة لحظية وطفيفة التوغل لجمع AISF من خلال استخدام الغسيل الميكروي في فئران مخدرة. تم زرع مجسات قطع مزدوجة بقوة 20 كيلو دالتون جراحيا في الشريان الوريدي الفخذي والوريد الوداجي للسماح بأخذ عينات مستمرة من الوريد الوريدي الوردي والدم على التوالي. مكن التروية بالسائل خارج الخلوي الصناعي من الانتشار الانتقائي للمستقلبات منخفضة الوزن الجزيئي. من خلال تحليل المكونات الرئيسية (PCA) وتحليل المربعات الصغرى الجزئية المتعامدة (OPLS-DA)، لوحظ وجود تباعد أيضي واضح بين AISF والدم، حيث تم تحديد 146 مستقلبا تفريقيا ذا دلالة كبيرة. أكدت أنماط الإثراء في اللاكتات والسيروتونين الخصوصية التشريحية والموثوقية الوظيفية للطريقة. والأهم من ذلك، أن AISF تم إثراؤه بنواتج محلية صناعية لم تكن موجودة في البلازما، مما يبرز أهميته الفسيولوجية الفريدة. بالمقارنة مع منهجيات أخذ عينات السوائل البينية الحالية (ISF)، مثل الإبر الدقيقة، والبثور الشفطية، والفوريس الأيوني العكسي، يوفر الغسيل الميكروي دقة جزيئية محسنة، واستقرارا أكبر في أخذ العينات، وتقليل التوغل. تشكل هذه التقنية منصة موثوقة لتحليل المحللات في السائل الخلالي (AISF) وتظهر إمكانات كبيرة لتطوير اكتشاف المؤشرات الحيوية والبحث في فيزيولوجيا الأوعية الدموية.

المقدمة

يشكل سائل الأنسجة، أو السائل الخلالي (ISF)، عنصرا أساسيا في البيئة الدقيقة الخلوية، حيث تعود أبحاثه الأكاديمية إلى أواخر القرن التاسع عشر. في عام 1896، قدم ستارلينغ نظرية الترشيح وإعادة الامتصاص الشعرية، والتي وصفت ISF أولا بأنها سائل متجانس ينتج عن الترشيح الزائد للبلازما، ويلعب دورا حيويا في نقل المغذيات وإزالة النفايات الأيضية1. خلال العقدين الماضيين، عززت التطورات في تكنولوجيا التصوير المجهري وعلم الأحياء الجزيئي فهم الباحثين للتنوع الكبير في التوزيع التشريحي والتركيب والوظيفة ل ISF2.

وقد أوضحت الأبحاث حول السائل الخلالي (ISF) في مواقع تشريحية مختلفة وظائفه المميزة داخل الأنسجة المختلفة. على سبيل المثال، في الأنسجة الدماغية، يسهل ال ISF تطهير المستقلبات العصبية السامة، مثل β-الأميلويد، أثناء النوم عبر الجهاز الجلمفاوي3. وعلى العكس، يساهم السائل البيني للورم (TIF) في غزو الورم وتفادي المناعة من خلال تعزيز بيئة دقيقة حمضية من خلال تراكم حمض اللاكتيك4. تشير هذه النتائج إلى أن ISF لا يعمل فقط كوسيط للتبادل الأيضي، بل أيضا كمنظم نشط للعمليات الفيزيولوجية المرضية الخاصة بالنسيج. في هذا السياق، يمثل السائل الخلالي الفصلي (AISF) تحديا بحثيا فريدا بسبب توطينه التشريحي المحدد وتعقيده الوظيفي. يقع AISF عند الواجهة بين الأدفنتيسيا والأنسجة المحيطة5، ويلعب دورا حيويا في التفاعل بين الجدار الوعائي والجهاز العصبي والمناعي. ومع ذلك، فإن موقعه التشريحي العميق وقربه من الدم والسوائل اللمفاوية قد شكل تحديات تقنية كبيرة في أخذ العينات الميداني والتحليل التركيبي.

تواجه التقنيات التقليدية لأخذ عينات من ISF، بما في ذلك طريقة الفتيل والتصريف الجراحي، تحديات كبيرة في الحصول على عينات AISF عالية النقاء بسبب خطر تلوث الدم وتلف الأنسجة. على سبيل المثال، قد يسبب الإزالة الجراحية للظهارة الوعائية إصابة للأعصاب الطرفية أو الأوعية اللمفاوية، مما يؤدي إلى اختلاط جزيئات حيوية غيرمستهدفة 6. علاوة على ذلك، تقتصر هذه الطرق على انخفاض معدلات العينة، وعدم الاستقرار، والقابلية للتداخل، وضعف قابلية التكرار، وغالبا ما يعزى ذلك إلى الالتهاب الناتج عن إدخال الفتيلة تحت الجلد7 وتلف الخلايا أثناء زرع العضلات. يقدم تطوير الغسيل الميكروي نهجا أكثر فعالية لدراسات ISF. تسمح هذه التقنية بالالتقاط الديناميكي والميداني للجزيئات الصغيرة مثل المستقلبات والسيتوكينات داخل ISF دون التأثير على البنية الوعائية باستخدام مسبار غشائي شبه نفاذ. يمكن وضع المجس بدقة داخل المساحة الظهارية الوعائية، مما يقلل من خطر التلوث من الدم أو السوائل اللمفاوية. بالإضافة إلى ذلك، يسهل أخذ عينات مستمرة، مما يتيح مراقبة التغيرات الديناميكية في استقلاب ISF في الوقت الحقيقي تحت ظروف مختلفة. ضمان المراقبة المستمرة والمستقرة لهذه العمليات الأيضية أثناء التجربة.

البروتوكول

أجريت التجارب على بعد موافقة لجنة أخلاقيات في كلية بكين الطبية المتحدة. جميع الإجراءات ملتزمة بدقة بالبروتوكولات المعتمدة. المواد المستخدمة والمواد المستخدمة مدرجة في جدول المواد.

1. التحضير التجريبي

  1. يوضح نظام أخذ عينات الغسيل الدقيقي والأدوات الجراحية المرتبطة به كما هو موضح في الشكل 1.
  2. جهز سائل صناعي خارج الخلوي (aECF) يحتوي على 153.5 ملليمولار سيولة، 4.3 ملليمولار كيستامين، 0.41 ملليمولار ملغيوم، 0.71 ملم كسيليوم، 139.4 ملليمولار كلاريوم، و1.25 ملليمولار جلوكوز، وضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.4.
  3. جهز مسبارين بقدرة 20 كيلو دالتون وسمهما كمسبار 1 (مسبار سائل الأنسجة) ومسبار 2 (مسبار دم). ضع المسبار 1 في ماء معقم منزوع الأيونات (dH₂O) والمسبار 2 في هيبارين الصوديوم 1٪، لضمان بقاء أطراف المجس رطبة باستمرار.
  4. حدد زوجين من المسارات (المساران 1 و2) ل "تدفق داخل" و"تدفق خارج". ربط قطعتين من أنابيب FEP بقطر 1 متر باستخدام أنابيب PE50، مما يقلل من المساحة الميتة. قم بتوصيل كل أنبوب تدفق بحقنة Exmire بسعة 1 مل: املأ الحقنة 1 ب dH₂O والحقنة 2 بهيبارين الصوديوم 1٪. قم بتوصيل الحقن الدقيقة بالمجسات والاستعداد لحقن aECF بعد وضع المجسات في الوريد الوداجي.
  5. قم بتفعيل مضخة mD واضبط معدل التدفق على 1.5 ميكرولتر/دقيقة حتى يخرج السائل من أنبوب الخروج. وصل أنبوب التدفق الخارجي بخط جمع العينات.
  6. املأ حقنتين ميكروسنيجيتين بمحلول aECF مفلتر وابدأ الضخ بسرعة 1 ميكرولتر/دقيقة.

2. تحضير

  1. فئران سبريغ-داولي البالغة المختارة التي تزن 280 ± 20 جرام (n = 6).
  2. تحفز التخدير باستخدام إيزوفلوران 3٪ والحفاظ عليه مع 1.8٪-2.2٪ إيزوفلوران في خليط هواء/أكسجين أثناء مراقبة النشاط القلبي (وفقا لبروتوكولات معتمدة مؤسسيا). تأكيد التخدير العميق بتقييم غياب استجابة الألم وملاحظة انخفاض معدل ضربات القلب (340-390 نبضة في الدقيقة). ضع الفأر على بطانية حرارية وثبت الأطراف.
  3. ضع كريم إزالة الشعر على الرقبة والطرف الخلفي الأيسر، مع امتداد إلى أسفل البطن الأيسر. قم بتعقيم المناطق المقلدة مرتين باستخدام اليودوفور وإزالة اليود المتبقي باستخدام 75٪ كحول طبي.

3. وضع المجس في الموقع المزدوج (الأدفنتيسيا الفخذية والوريد الوداجي)

  1. استخدم مسبارا بنافذة غسيل كلى نشطة بحجم 10 مم (CMA-20، قطع 20 كيلو دالتون، قطر عمود 0.5 مم) كما هو موضح في الشكل 2A.
  2. جهز إبرة التوجيه وأنبوب التمزيق (الشكل 2B).
  3. قم بتمديد الطرف الخلفي للجرذ بحيث يكون الخط الذي يربط مفصل الركبة ومنتصف طية الإربية عموديا على المحور الطولي للجسم. قس مقطعا بطول 2 سم على طول جلد منطقة الإربية باتجاه الطرف الخلفي لتحديد المنطقة الجراحية المميزة (الشكل 2C). حدد نقطة منتصف هذه المنطقة الإربية كنقطة تحديد موقع النافذة الدقيقة. حدد موقع الثقب على بعد 2 سم جانبيا إلى نقطة التموضع هذه (الشكل 2D).
  4. ضع تحت المجهر التجريوي.
  5. قم بعمل شق بعرض 0.5-0.8 سم في منتصف طية الإربية لتسهيل الرؤية وضمان تحديد مكان المجس بدقة داخل الغشاء المحيط بالأوعية الدموية. قم بتقشير الأنسجة تحت الجلد بشكل مباشر لكشف الشريان الفخذي والوريد، والوريد الصافن، والوريد السطحي لجدار البطن (الشكل 2E).
  6. غلف الطبقة الخارجية لإبرة الثقب في أنبوب قابل للتمزق لتكوين إبرة توجيه.
  7. تأكد من عدم وجود أوعية دموية تحت الجلد في موقع الثقب. أدخل الإبرة عموديا عبر الجلد، ثم اضبط الزاوية إلى 45° لدخول المساحة النسيجية المحيطة بالوريد الصافن.
  8. تقدم الإبرة باتجاه تدفق الدم داخل الوريد الصافن الكبير، مع الحفاظ على اتصال وثيق بجدار الوعاء طوال العملية. استخدم المجهر المجسم لمراقبة وضع الإبرة في الوقت الحقيقي ومنع إصابة الأوعية الدموية أو تلوث الدم. بعد ذلك، وجه الإبرة إلى الوريد الفخذي الأدفنتيسيا (الشكل 2F).
  9. اسحب إبرة الثقب مع ترك أنبوب التمزيق في مكانه داخل النسيج (الشكل 2G).
  10. أدخل مسبار سائل الأنسجة في القسطرة القابلة للتمزيق، وافتح القسطرة بعناية لكشف موقع أخذ العينة واسترجاع عينة النسيج (الشكل 2H). تأكد من أن المجس في وضع دقيق داخل منطقة الأدفينتيسيا للشريان الفخذي والوريد (الشكل 2I). ثبت المسبار على الجلد قبل الخياطة (الشكل 2J). قم بجميع الإجراءات في ظروف معقمة صارمة، مع الحرص على تجنب اضطراب الأوعية الدموية الأدفينتيسيا ومنع التهاب الأنسجة أو ردود فعل الجسم الغريبة التي قد تؤثر على تجمع سوائل الأنسجة.
  11. تحقق من موقع المجس بتصوير مسطرة جراحية مع المسبار الثابت لتوثيق طول المعرض، وقدم هذه الصورة كما هو موضح في الشكل 2I.
  12. قم بعمل شق جلدي بطول 2 سم تقريبا 0.5 سم جانبيا من منتصف الرقبة، يبدأ ب 1 سم أعلى من الشق القصي.
  13. قم بشق العضلة القصية الترقاء بشكل غير مباشر لكشف الوريد الوداجي، الذي يقع جانبيا للشريان السباتي ويعرف بلونه الأزرق الداكن. استخدم مسحة قطنية مبللة لفصل اللفافة بلطف، مع الحرص على تجنب ملامسة العصب المبهم.
  14. باستخدام الملقط المجهري، ارفع الغشية الخارجية للوريد الوداجي بلطف وقم بإزالة الأنسجة الضامة المحيطة بحذر للحصول على طول أوعية حرة لا يقل عن 1 سم. ضع خياطة حريرية بقطر 4-0 بالقرب منها لتكون رباط احتياطي (الشكل 2K).
  15. للثقب الوريدي، قم بعمل شق مائل بزاوية 45°، أي حوالي ثلث قطر الوعاء. استخدم الملقط الدقيق لفتح الشق بلطف وخلق مدخل لإدخال المجس.
  16. أدخل رأس المجس بعناية في الوريد وتقدمه ببطء إلى عمق 3.5-4.0 سم، مع التأكد من وصول الطرف إلى مدخل الأذين الأيمن (الشكل 2L).
  17. ثبت المجس عن طريق شد رباط الحرير القريب بعقدة مزدوجة. أغلق طبقة العضلات باستخدام غرز فيكريل 4-0، ثم خيط الجلد بغرز متقطعة. ثبت الجزء الخارجي من المجس على سطح الجلد لمنع الإزاحة.

4. جمع العينات واستعادة المجسات

  1. جمع العينات: تقييم العلاقة بين غسيل الكلى النسجي ونقل العينات إلى أنبوب الجمع. حافظ على حجم إجمالي يبلغ 20 ميكرولتر بين المجس والمجمع.
    1. اترك فترة 20 دقيقة للعينة لتنتقل عبر المجس والأنبوب وتصل إلى نهاية الأنبوب ليتم جمعه بمعدل تدفق 1 ميكرولتر/دقيقة. اجمع كمية كافية من الحجم لتحقيق التركيز المطلوب للاختبار. اجمع 30 ميكرولتر من الغسيل لكل أنبوب تجميع.
  2. تخزين العينات: أنابيب جمع البولي بروبيلين 0.5 مل قبل التبريد حتى 4 درجات مئوية. مباشرة بعد الجمع، أغلق الأنابيب، وقم بتجميدها في النيتروجين السائل لمدة 30 ثانية، ثم انقلها إلى فريزر بدرجة -80 درجة مئوية خلال دقيقتين.
  3. عينة أساسية: التوازن الكامل للعينة قبل بدء جمع العينات. اجمع ثلاث عينات لكل فأر تحت التخدير لتحديد قاعدة قياس مستقرة.
  4. إزالة المجس: إزالة المجس من رأس بعد الانتهاء من جمع العينة وضعها في قارورة تخزين تحتوي على 1٪ هيبارين الصوديوم. قتل عن طريق استنشاق فائض من الأيزوفلوران.
  5. حفظ المجس: اشطف المجس جيدا بالمحلول الملحي وخزنه في قارورة تحتوي على محلول ملحي. غسل الأنابيب بالمحلول الملحي باستخدام حقنة لمنع نمو الميكروبات. أعد استخدام المجس فقط إذا حافظ على تدفق كاف وبقي الغشاء سليما.

5. تحليل البيانات

  1. إجراء تحليل المكونات الرئيسية (PCA)، والتحليل التمييزي الجزئي المتعامد للمربعات الصغرى (OPLS-DA)، وتحليلات إحصائية إضافية باستخدام MetaboAnalyst 6.0. استخدم OPLS-DA تحديدا لتحديد الأهمية المتغيرة في الإسقاط (VIP).
  2. تطبيق اختبارات غير معلمية، بما في ذلك تقييمات قيمة P وتحليل تغير الطية، لفحص المستقلبات التفاضلية. حدد عتبات حرجة لفحص المستقلبات التفاضلية كVIP > 1، FC ≥ 2، أو FC ≤ 0.5، وP < 0.05.
  3. قم بملاحظة على المستقلبات المحددة باستخدام قاعدة بيانات مركبات KEGG.

6. HPLC - MS/MS

  1. قم بقياس المستقلبات باستخدام مطياف كتلة ثلاثي الرباعي AB Sciex 6500+ مزود بمصدر تأين الارتعاش الكهربائي (ESI) يعمل في وضع الأيونات الموجب.
  2. اضبط معايير الجهاز كما يلي: غاز الستارة، 40 رطل لكل بوصة مربعة؛ غاز تصادم، 10 رطل لكل بوصة مربعة؛ غاز مصدر الأيونيات 1 (GS1)، 50 رطل لكل بوصة مربعة؛ غاز مصدر الأيون 2 (GS2)، 55 رطل لكل بوصة مربعة؛ جهد رش الأيون، 4500 فولت؛ ودرجة حرارة المصدر 550 درجة مئوية.
  3. تشغيل النظام في وضع مراقبة تفاعلات متعددة (MRM). تحسين انتقالات MRM، وإمكانات التفكيك، وطاقات التصادم بشكل فردي لكل استيض. قم بجمع البيانات باستخدام برنامج المحلل 1.7.1 والتحليل الكمي باستخدام MultiQuant 3.0.3.
  4. للفصل الكروماتوغرافي، استخدم عمود C18 (2.1 × 100 مم، 1.7 ميكرومتر) يحافظ عليه عند 45 درجة مئوية. جهز المراحل المتحركة ك (أ) حمض الفورميك 0.1٪ في الماء و(ب) حمض الفورميك 0.1٪ في الأسيتونيتريل. اضبط معدل التدفق إلى 0.35 مل/دقيقة وحجم الحقن إلى 6 ميكرولتر. حافظ على درجة حرارة العلابة الذاتية عند 4 درجات مئوية قبل التحليل.
    ملاحظة: في هذه الدراسة، استغرقت كل جولة حوالي 25 دقيقة إجمالا.

النتائج

تم تطبيع مجموعة البيانات من خلال تطبيق التحويلات الجمعية واللوغاريتمية، ثم خضعت لمجموعة شاملة من التحليلات الإحصائية. تم إجراء تحليل المكونات الرئيسية (PCA) (الشكل 3A)، الذي كشف عن انفصالات مميزة وأبرز الفروق الأيضية. لاحقا، تم تطوير نموذج تحليل تمييزي للمربعات الصغرى الجزئية المتعامدة (OPLS-DA)، مع النتائج الناتجة الموضحة في الشكل 3B، مما يوضح فعالية النموذج التمييزية. في تقييم 618 مستقلبا، حددت مخططات البركان التي قارنت عينات AISF وعينات الدم 146 مستقلبا تفريقيا، حيث أظهر سائل الأنسجة كل من المستقلبات التنظيمية للأسفل والرفع (الشكل 3C). بالإضافة إلى ذلك، تم إنشاء خريطة حرارية لتقديم نظرة مقارنة على أفضل 50 مستقلبا تفاضليا (الشكل 3D).

لتقييم موثوقية طريقة أخذ العينة، تم استخدام السيروتونين وحمض اللاكتيك كعوامل تحكم إيجابية تمثل مكونات السوائل النسيجية والدم على التوالي. توافقت النتائج مع أنماط التوزيع المعتمدة لهذه المكونات عبر سوائل الجسم المختلفة، كما هو موضح في الشكل 4. يوضح الشكل التكميلي 1 استقرار اللاكتات والسيروتونين في أليكوات الميكروغسيل الدقيقة المخزنة عند -80 درجة مئوية.

تم تصنيف 146 استقلبا تفاضليا بشكل منهجي إلى عدة فئات: النيوكليوسيدات، والنيوكليوتيدات، ونظيراتها المشابهة؛ الأحماض الدهنية ومشتقاتها؛ الأحماض الأمينية، الببتيدات، ونظيراتها المشابهة؛ الكربوهيدرات والكربوهيدرات المركبة؛ الأحماض العضوية ومشتقاتها؛ الأمينات البيولوجية؛ البيورينيس والبيريميدين؛ الفيتامينات والستيرويدات؛ وكذلك مركبات أخرى (الشكل 5A). يظهر الجدول التكميلي 1 وجود مستقلبات تفاضلية تم اكتشافها في الدم. توضح تحليلات خريطة الحرارة بشكل أكبر أنماط إثراء الأمينات الحيوية والأحماض الأمينية والببتيدات ونظيراتها عبر سوائل الجسم المختلفة (الشكل 5B,C). يتم عرض تحليل إثراء المستقلبات التفاضلية في الشكل 6. يسرد الجدول التكميلي 2 معامل التباين (CV) لخمسة عشر مستقلبا تم اختيارها عشوائيا في ثلاث عينات متتالية من نسيج وسوائل حول الأوعية الدموية.

الشكل 1
الشكل 1: صور الجهاز التجريبي. (أ) جامع الكسور المبرد. (ب) مضخة حقنة. (ج) الحقن الدقيقة. (د) الأدوات الجراحية، بما في ذلك المقص الوعائي والملاقط، وغيرها. (ه) جهاز التخدير. (و) مجسات غسيل الكلى الدقيق. (ز) مجسات غسيل الكلى الدقيق، إبرة دليل الأنسجة، وأنبوب قابل للتمزق. (ح) تجميعات إبر دليل الأنسجة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 2
الشكل 2: الخطوات الرئيسية في الدراسة. (أ) تمثيل تخطيطي يصور مخططا يوضح موقع موقع الجراحة واتجاه المجس. (ب) تحديد التقاطعات الوعائية الحرجة لضمان المراقبة الدقيقة لمواقع وضع المجسات. (ج) إدخال إبرة التوجيه التي تخترق الجلد وتتقدم إلى فضاء الأنسجة. (د) سحب إبر الإبر الإرشادية، تاركا الأنبوب القابل للتمزق داخل النسيج. (ه) يتم إدخال مسبار الغسيل الدقيقي إلى النسيج عبر القناة المعتمدة. (و) سحب لطيف للأنبوب القابل للتمزق. يتم سحب الأنبوب القابل للتمزق بلطف بعد تثبيت المجس في مكانه. (ز) تصور المجسات الموضوعة في ظهارة الأوعية الشريانية والوريدية الفخذية. (ح) فصل الأنسجة عن الوريد الوداجي. (1) وضع المجس في الوريد الوداجي. (J) مسبار الغسيل الدقيقي مثبت على سطح الجلد. (K) عزل الوريد الوداجي. (L) إدخال المجس في الوريد الوداجي. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 3
الشكل 3: تحليل إحصائي متعدد المتغيرات للسائل الخلالي (ISF) والدم. (أ) تم تقليل حجم البيانات لتأكيد الفوارق المهمة، مما يظهر فروقا واضحة بين مكونات السائل الخلالي والدم. (ب) تشير درجات نموذج التحليل التفصيلي المتعامد لأصغر مربعات المربع (OPLS-DA) إلى قيم R2Y وQ2 بقيمة 0.925 و0.811 على التوالي. (ج) يصور مخطط البراكين 146 مستقلبا تفاضلا، مع 85 استقبالا يتم تنظيمها بخفض و61 مرفوعة في ISF. (د) وبالمقابل، تكشف خرائط الحرارة التي تقارن بين أفضل 30 مستقلبا في ISF والدم عن تمييز واضح بين مجموعتي المكونات. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 4
الشكل 4: عرض سلسلة من مخططات الصندوق التي أوضحت مستويات تخصيب اللاكتات والسيروتونين في ISF والدم. جميع نقاط البيانات تمثل متوسط ± SEM؛ تظهر أشرطة الخطأ لجميع اللوحات الكمية. توضح اللوحة (أ) أن عينات ISF تظهر إثراء أكبر بشكل ملحوظ في اللاكتات مقارنة بعينات الدم. على النقيض من ذلك، تظهر اللوحة (B) أن السيروتونين أكثر إثراء في عينات الدم، التي تظهر في الوقت نفسه مستويات أقل من اللاكتات. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 5
الشكل 5: يتم تصوير مخطط الحلقة التصنيفية للمستقلبات التفاضلية وخريطة الحرارة للأحماض الأمينية والببتيدات والنظائر المماثلة، بالإضافة إلى الأمينات الحيوية الجينية. (أ) كل كتلة لونية تتوافق مع فئة مميزة من المستقلبات. تمثل الأحماض الأمينية، الببتيدات، والنظائر المشابهة أكبر فئة، حيث تشكل 19.29٪ من الإجمالي، تليها النيوكليوسيدات والنيوكليوتيدات والنظائر (15٪)، والأحماض الدهنية والمشتقات (12.86٪)، والكربوهيدرات والمرافق للكربوهيدرات (7.86٪)، والأحماض والمشتقات العضوية (10٪)، والأمينات الحيوية (7.14٪)، والبيورينات/البيريميدينات (5.71٪)، والفيتامينات والستيرويدات (8.57٪)، ومركبات أخرى مثل الإندولات، والأزيبينات، والبيريدينات، والبنزينات بنسبة 13.57٪. (ب) في السوائل الخلالية (ISF)، مستويات التخصيب في مركبات مثل ديوكسيكارنيتين وسبيرميدين ضمن فئة الأمين الحيوية مرتفعة بشكل ملحوظ مقارنة بتلك الموجودة في الدم، في حين أن مستويات السيروتونين (D4)، السيروتونين، التريبتامين، والمركبات ذات الصلة تنخفض بشكل ملحوظ. (ج) في ISF، الغالبية العظمى من المستقلبات المرتبطة بالأحماض الأمينية والببتيدات والنظائر أقل بكثير من تلك التي لوحظت في الدم. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 6
الشكل 6: كشف تحليل إثراء مجموعات المستقلبات (MSEA) للسائل الخلالي الطبيعي أن النشاط الأيضي موزع بشكل رئيسي عبر المسارات المتعلقة بإنتاج الطاقة، وتوازن الأكسدة والاختزال، ودوران الأحماض الأمينية. تشمل المسارات الأكثر غناء استقلاب البوتانوات، واستقلاب البيورين، وأيض الجلوتاثيون، مما يعكس الحفاظ على إمداد طاقة الميتوكوندريا وقدرتها المضادة للأكسدة في الظروف الفسيولوجية. بالإضافة إلى ذلك، تمثل عدة مسارات مرتبطة بالأحماض الأمينية، مثل استقلاب الأرجينين والبرولين، واستقلاب التريبتوفان، واستقلاب السيستين والميثيونين، مما يشير إلى التحول النشط للأحماض الأمينية وتنظيم توازن النيتروجين في البيئة الدقيقة خارج الخلية. تشير هذه النتائج إلى أن المستقرب الخلالي الطبيعي يحافظ على توازن ديناميكي بين العمليات الحيوية الطاقية، والدفاع التأكسدي، واستقلاب الأحماض الأمينية، مما يدعم توازن الأنسجة واستقرار الدورة الدموية الدقيقة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل الإضافي 1: استقرار اللاكتات والسيروتونين في أليكوات الميكروغسيل الدقيقة المخزنة عند -80 درجة مئوية. البيانات هي متوسط ± SEM (n = 6 تكرارات لكل نقطة زمنية). لم يخرج أي محلل عن الأساس بنسبة >5٪ خلال 72 ساعة. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الجدول التكميلي 1: المستقلبات التفاضلية التي تم اكتشافها في الدم والسائل الخلالي الميكروغسيل النفسي الجراحي. يشمل ذلك اسم المستقد، وتغيير الطي (FC)، وقيمة اختبار t P لطالب، وVIP (OPLS-DA). يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الجدول التكميلي 2: معامل التباين (CV) لخمسة عشر مستقلبا مختارة عشوائيا في ثلاث عينات متتالية من نسيج الوعاء-السوائل المحيطة بالأوعية الدموية. جميع السير الذاتية هي <20٪). يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

المناقشة

السائل الخلالي (ISF) هو البيئة المائية الدقيقة التي تغطي كل خلية نسيج ويشكل حوالي 75٪ من حجرة السائل خارج الخلية 8,9. تنتج عن طريق ترشيح الشعيرات الدموية للبلازما، تفتقر ISF إلى المحتوى الخلوي والعالي من البروتين في الدم لكنها تحتفظ بالإلكتروليتات والمذابات الصغيرة والماء9. تضع هذه التركيبة ISF كواجهة محورية بين العالمين الوعائي والخلوي. وظيفيا، يعد ISF وسيلة نقل ديناميكية. ينقل الأكسجين والجلوكوز والأحماض الأمينية والمغذيات الدقيقة من مجرى الدم إلى الخلايا، بينما يجمع في الوقت نفسه ثاني أكسيد الكربون واليوريا والنفايات الأيضية الأخرى لإعادتها إلى الدورةالدموية. يعمل السائل أيضا كمادة تشحيم وحاجز، حيث يثبت الضغط الأسموزي الخلالي، ودرجة الحموضة، والتوازن الأيوني11. بعيدا عن الأيض، يدعم ISF المراقبة المناعية من خلال نقل كريات الدم البيضاء والأجسام المضادة والسيتوكينات عبر فراغات الأنسجة، ويعمل كطريق تواصل للهرمونات والإشارات الباراكرينية12،13. مقارنة بالدم، فإن ISF هو في الأساس ترشيح خال من الخلايا ومنخفض البروتين14. الدم، المحصور في شجرة الأوعية، يحتوي على خلايا حمراء وبيضاء، وصفائح دمية، وتركيزات عالية من الألبومين وعوامل التجلط. مستويات الأكسجين والمغذيات تكون أعلى في الدم وتنخفض تدريجيا في ISF بسبب امتصاص الخلايا، بينما تتراكم الفضلات في ISF قبل دخول العائد اللمفاوي أو الوريدي10. غياب البروتينات والخلايا الكبيرة في القاعدة الأرضية الأرضية الطبيعية يقلل الضغط الأوراكي ويسمح بانتشار سريع، لكن الحالات الالتهابية يمكن أن تغيرهذا الملف بشكل مؤقت.

ومع ذلك، لا تزال دراسة ISF محدودة بسبب غياب منهجيات أخذ عينات مباشرة وسريعة وموثوقة. تشمل الطرق الحالية لصقات الإبر الدقيقة (MN)، وبثور الشفط، والرحلان الأيوني العكسي، والاستئصال الحراري، وغسيل الكلى الدقيق. تخلق رقع MN قنوات دقيقة لاستخراج ISF عبر الجلد، حيث تستخرج أنواع القشرة الأساسية ISF في أقل من 30 ثانية، وMNs الهيدروجيل الأسموزي في حوالي 3 دقائق. يمكن دمج هذه مع حساسات للتحليل أثناء الرقعة، لكنها محدودة بالحجم وتتطلب توازنا بين القوة والتورم. توفر البثور الشفطية الشعاعية النقية مع تلوث دم بسيط لكنها غازية ومؤلمة وبطيئة 16,17,18. يستخدم الرفوريس الأيوني العكسي (RI) تيارات كهربائية منخفضة لنقل المحللات المشحونة، مثل أيونات الجلوكوز والليثيوم، إلى سطح الجلد للمراقبة غير الغازية. ومع ذلك، يواجه تحديات مثل انخفاض معدل الإنتاجية، والتفاوت بين الأفراد، واحتمال تهيج الجلد 19,20. الإعطاء عبر الجلد (TA) يسبب تعطيل الطبقة القرنية من خلال التسخين الموضعي للسماح للانفجار الشعاعي بالدخول إلى القنوات الدقيقة المحبة للماء بشكل سلبي. على الرغم من أبسط تصميم الجهاز، إلا أنه يجمع أقل من 5 ميكرولتر من السائل، مما يتطلب اكتشافا عالي الحساسية وإدارة حرارية دقيقة لتجنب الحروق21,22. على النقيض من ذلك، يوفر الغسيل الدقيق (MD)، الذي يعتمد على الانتشار عبر مجسات شبه نفاذة مزروعة، انتقائية جزيئية فريدة من خلال أغشية قطع الوزن الجزيئي القابل للتعديل (MWCO)، مثل 10 كيلو دالتون للجلوكوز و100 كيلو دالتون للبروتينات والسيتوكينات23,24. تدعم هذه التقنية أخذ عينات مستمرة وقليلة التوغل. ومع ذلك، فإن MD معقد من الناحية التشغيلية، ويتطلب معايرة في الجسم الحي، ويظهر معدلات استرداد متغيرة للأنواع الكارهة للماء. ومن الجدير بالذكر أن MD هي التقنية الوحيدة القادرة على العزل الانتقائي حسب الحجم للجزيئات الحيويةالكبيرة 25. أظهرت الدراسات المقارنة للغسيل الذي جمعت بجوار الأدفنتيسيا الوعائي مقابل الدم وجود ملفات لاكتات وسيروتونين مميزة، مما يؤكد استقرار وخصوصية نهج MD.

أظهرت الدراسات الحيوانية أنه، إذا نظمته القلب والرئتين بشكل تآزري، يمكن أن يتدفق في الأدفنتيسيا المرتبطة بالشرايين الكبيرة والأوردة والأعصاب الطرفية. عادة ما يحتوي ISF على مستقلبات مشتقة مباشرة من البلازما ويتم تصنيعها محليا داخل الأنسجة26، 27، 28. لذا، من المعقول أن التداخلات والاختلافات المحددة بين المستقلبات في AISF والبلازما تمثل تورط الجهاز الدوري في ISF في نقل وتطهير العناصر الغذائية والمستقلبات في الأنسجة على طول الأوعية الدموية. ستعزز التقنية المعتمدة على الغسيل الدقيقي التي تم تقديمها هنا لأخذ عينات من AISF الدراسات بشكل كبير على دراسة الدورة الدموية الجهازية ل ISF في تنظيم الأيض في عدة أعضاء وأنسجة في جميع أنحاء الجسم.

الغشاء الجزئي القابل للقطع بوزن جزئي (MWCO) المستخدم في هذه الدراسة 20 كيلو دالتون مصمم بشكل مثالي للاسترداد الكمي للمستقلبات الصغيرة، بما في ذلك الجلوكوز، واللاكتات، والبيروفات، والأحماض الأمينية. ومع ذلك، فإنه يقلل باستمرار من عينات أو يستبعد تماما العديد من الجزيئات الكبيرة ذات الأهمية البيولوجية، مثل السيتوكينات، الكيموكينات، عوامل النمو، والإنزيمات خارج الخلية. أبرزت المراجعات السريرية والمنهجية أن القسطرة القياسية بقدرة 20 كيلو دالتون فعالة في جمع المستقلبات المحبة للماء الصغيرة، لكنها تظهر معدلات تعافي ضعيفة للبروتينات والوسطاء الالتهابيين29. وبالتالي، فإن الأغشية ذات MWCO أعلى (مثل 100 كيلو دالتون) أو استراتيجيات أخذ عينات بديلة ضرورية لقياس دقيق للسيتوكين30,31. لذلك، ستستخدم الأبحاث المستقبلية التي تجريها مجموعتنا أغشية ذات MWCOs أكبر لتوصيف التركيب الجزيئي الكبير للسائل الخلالي المحيطي. في هذه الدراسة، تم جمع غسيل الكلى تحت التخدير العام. تم التحقق من صحة الغسيل الميكروي سابقا في المستيقظة والحركة بحرية، وتم تكييف عدة تقنيات تدفقات دقيقة "مفتوحة التدفق" للاستخدام في النماذجالواعية 32. ومع ذلك، فإن تكييف تصميم المجس وبروتوكول الزرع لاستخدامه في المستيقظة سيتطلب معالجة تحديات تتعلق بالربط الداخلي، وضغط، وثبات المجسات، وآثار الحركة، والاستقرار طويل الأمد. نحن حاليا في طور تطوير نظام خفيف الوزن للربط والدوران ونخطط لأخذ عينات واعية في دراستنا القادمة.

الإفصاحات

لا توجد تضارب مصالح مالية يمكن الإفصاح عنها.

شكر وتقدير

تم تمويل هذا العمل من قبل البرنامج الوطني الرئيسي للبحث والتطوير في الصين (2025YFC3507601) وصناديق البحوث الأساسية لمعاهد البحوث المركزية للرعاية العامة (رقم. ZZ-YC2023007).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
نظام مراقبة تخطيط القلبشركة AD Instruments، أسترالياباورلابالمعدات
الملقطأدوات العلوم الدقيقة (F.S.T) ألمانيا11252-00الأدوات الجراحية
صوديوم الهيبارينسيغما-ألدريتش، الولايات المتحدة الأمريكية9041-08-1المادة
مطياف الكتلة المزدوج عالي الأداء للكروماتوغرافيا السائلة (HPLC-MS/MS)SCIEX، الولايات المتحدة الأمريكيةإكسون LC-20ACالمعدات
مقص IRIS القياسيأدوات العلوم الدقيقة (F.S.T) ألمانيا14060-09الأدوات الجراحية
إيزوفلورانعلوم الحياة في RWD، جمهورية الصين الشعبيةR510-22-10المادة
نظام التخدير منخفض التدفقكنت ساينتفيك، الولايات المتحدة الأمريكيةSomnoSuiteالمعدات
سائل تدفق الغسيل الميكروي T1غسيل الكلى الميكروي CMA، السويدP000034المادة
مسبار غسيل الكلى الدقيق، 20 إيليتغسيل الكلى الميكروي CMA، السويد8010436المادة
حقن الغسيل الميكروي 1 مل من الإغلاقغسيل الكلى الميكروي CMA، السويد8309020المادة
جامع الكسور المبردغسيل الكلى الميكروي CMA، السويد470المعدات
الأنابيب المنقسمة لمجسات CMA 20غسيل الكلى الميكروي CMA، السويد8309019المادة
المجهر المجسمأوليمبوس، اليابانSZ61المعدات
مضخة الحقنةسي إم إيه إم دي AB، السويد800310المعدات

المراجع

  1. Reed, R. K., Rubin, K. Transcapillary exchange: role and importance of the interstitial fluid pressure and the extracellular matrix. Cardiovasc Res. 87 (2), 211-217 (2010).
  2. Wiig, H., Swartz, M. A. Interstitial fluid and lymph formation and transport: physiological regulation and roles in inflammation and cancer. Physiol Rev. 92 (3), 1005-1060 (2012).
  3. Iliff, J. J., et al. A paravascular pathway facilitates CSF flow through the brain parenchyma and the clearance of interstitial solutes, including amyloid β. Sci Transl Med. 4 (147), 147ra111(2012).
  4. Jain, R. K. Antiangiogenesis strategies revisited: from starving tumors to alleviating hypoxia. Cancer Cell. 26 (5), 605-622 (2014).
  5. Li, H., et al. Regulation of interstitial fluid flow in adventitia along vasculature by heartbeat and respiration. iScience. 27 (4), 109407(2024).
  6. Clough, G. F. Microdialysis of large molecules. AAPS J. 7 (3), E686-E692 (2005).
  7. Fadnes, H. O., Aukland, K. Protein concentration and colloid osmotic pressure of interstitial fluid collected by the wick technique: Analysis and evaluation of the method. Microvasc Res. 14 (1), 11-25 (1977).
  8. Brinkman, J. E., Dorius, B., Sharma, S. Physiology, body fluids. , StatPearls. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK482447/ (2025).
  9. Li, H., et al. Active interfacial dynamic transport of fluid in a network of fibrous connective tissues throughout the whole body. Cell Prolif. 53 (2), e12760(2020).
  10. Kaur, J., et al. Waste clearance in the brain. Front Neuroanat. 15, 665803(2021).
  11. Hussain, N. M., Amin, B., O'Halloran, M., Elahi, A. Development and characterization of interstitial-fluid-mimicking solutions for pre-clinical assessment of hypoxia. Diagnostics. 13 (19), 3125(2023).
  12. Handly, L. N., Pilko, A., Wollman, R. Paracrine communication maximizes cellular response fidelity in wound signaling. eLife. 4, e09652(2015).
  13. Fan, D., Creemers, E. E., Kassiri, Z. Matrix as an interstitial transport system. Circ Res. , (2014).
  14. Friedel, M., et al. Opportunities and challenges in the diagnostic utility of dermal interstitial fluid. Nat Biomed Eng. 7 (12), 1541-1555 (2023).
  15. Levick, J. R., Michel, C. C. Microvascular fluid exchange and the revised Starling principle. Cardiovasc Res. 87 (2), 198-210 (2010).
  16. Jiang, X., et al. Microneedle-based sampling of dermal interstitial fluid using a vacuum-assisted skin patch. Cell Rep Phys Sci. 5 (6), 101975(2024).
  17. Wu, Z., et al. Interstitial fluid-based wearable biosensors for minimally invasive healthcare and biomedical applications. Commun Mater. 5 (1), 33(2024).
  18. Samant, P. P., Prausnitz, M. R. Mechanisms of sampling interstitial fluid from skin using a microneedle patch. Proc Natl Acad Sci U S A. 115 (18), 4583-4588 (2018).
  19. Sieg, A., Guy, R. H., Delgado-Charro, M. B. Electroosmosis in transdermal iontophoresis: implications for non-invasive and calibration-free glucose monitoring. Biophys J. 87 (5), 3344-3350 (2004).
  20. Nair, A. B., Goel, A., Prakash, S., Kumar, A. Therapeutic drug monitoring by reverse iontophoresis. J Basic Clin Pharm. 3 (1), 207-213 (2012).
  21. O'Brien, D. J., et al. A needle-free transdermal patch for sampling interstitial fluid. IEEE Trans Biomed Eng. 70 (9), 2573-2580 (2023).
  22. Yang, J., et al. Microneedle-integrated sensors for extraction of skin interstitial fluid and metabolic analysis. Int J Mol Sci. 24 (12), 9882(2023).
  23. Stenken, J. A., et al. How minimally invasive is microdialysis sampling? A cautionary note for cytokine collection in human skin and other clinical studies. AAPS J. 12 (1), 73-78 (2009).
  24. Dorothee, S., et al. Negligible in vitro recovery of macromolecules from microdialysis using 100 kDa probes and dextran in perfusion fluid. Neurochem Res. 49 (5), 1322-1330 (2024).
  25. Kho, C. M., et al. A review on microdialysis calibration methods: the theory and current related efforts. Mol Neurobiol. 54 (5), 3506-3527 (2017).
  26. Oharazawa, A., et al. Metabolome analyses of skin dialysate: insights into skin interstitial fluid biomarkers. J Dermatol Sci. 114 (3), 141-147 (2024).
  27. Samant, P. P., et al. Sampling interstitial fluid from human skin using a microneedle patch. Sci Transl Med. 12 (571), eaaw0285(2020).
  28. Niedzwiecki, M. M., et al. Human suction blister fluid composition determined using high-resolution metabolomics. Anal Chem. 90 (6), 3786-3792 (2018).
  29. Hillman, J., et al. Microdialysis of cytokines: methodological considerations, scanning electron microscopy, and determination of relative recovery. J Neurosci Methods. 179 (1), 29-33 (2009).
  30. Buchholtz, D. A., et al. Negligible in vitro recovery of macromolecules from microdialysis using 100 kDa probes and dextran in perfusion fluid. Neurochem Res. 49 (8), 1942-1951 (2024).
  31. Klein, J., et al. Enhanced microdialysis relative recovery of inflammatory cytokines using antibody-coated microspheres. Anal Chem. 82 (18), 7850-7855 (2010).
  32. Scheller, H., et al. Observational evaluations of mice during cerebral microdialysis for pediatric brain tumor research. PLoS One. 9 (5), e98256(2014).

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

السائل الخلالي الغشائي الخارجيالشريان الفخذي للجرذالتوصيف الأيضيتحليل المكونات الرئيسيةالمستقلبات ذات الوزن الجزيئي المنخفضاكتشاف المؤشرات الحيويةالفسيولوجيا المرضية الوعائية
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.