يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة بحثية

تخفف تركيبة الحقنة الشرجية العشبية التهاب القولون التقرحي عن طريق تثبيط تنشيط النسيج الدبقي المعوي عبر مسار S100β/RAGE/NF-κB

563 مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/69571

⸱

نوفمبر 28, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Beijing University of Chinese Medicine

في هذه المقالة

ملخص

تم تقييم تركيبة شرجية عشبية تجمع بين Sanguisorba officinalis، Bletilla striata، والأكاسيا كاتيكو باستخدام تحليل التوصيف LC-MS/MS، وتوصيف S100β، ونموذج DSS لالتهاب القولون، والدبقية الدبقية المعوية المنشطة بواسطة LPS/IFN-γ. تفاعلت الصيغة مع S100β، وقللت من تنشيط الدبقية، وقللت من تعبير p-NF-κB/iNOS، مما يشير إلى التحسن عبر محور S100β-RAGE-NF-κB.

الملخص

يساهم تنشيط الخلايا الدبقية المعوية (EGCs) في التسبب في التهاب القولون التقرحي (UC). فحصت هذه الدراسة ما إذا كان سائل الحقنة الشرجية ديباي (DBE) - وهو حقنة شرجية عشبية تجمع بين Sanguisorba officinalis، Bletilla striata، والأكاسيا كاتيخو - يعدل الالتهاب المدفوع ب EGC. تم ربط ملفات LC-MS/MS لمكونات DBE والمركبات ذات الأولوية إلى S100β. تم تقييم فعالية التهاب القولون الفأري الناتج عن كبريتات الديكستران الصوديوم (DSS) باستخدام وزن الجسم، وطول القولون، وعلم الأمراض النسيجية، ومستويات السيتوكينات (ELISA). تم قياس علامات تنشيط النسيج الدبقي من خلال الكيمياء المناعية النسيجية، وتموضعي التألق المناعي، وتحليل الركض الكمي (qPCR)، والتخفيض المناعي. استخدم نموذج في المختبر دبقية دبقية معوية CRL-2690 مفعلة بالدهون البوليسكاريدية بالإضافة إلى الإنترفيرون-γ، مع مصل الجرذان المحتوي على DBE (15٪) كتدخل للعلاج. أشارت عملية الالتحام إلى ارتباط متوقع قوي لعدة مكونات DBE ب S100β. زاد DSS من TNF-α وIL-1β، واضطرر الوصلات الضيقة، ورفع S100β/GFAP عند مستويات mRNA والبروتين، بما يتوافق مع فرط التنشيط الدبقي المزمن؛ قام DBE بعكس هذه التغييرات بشكل كبير. في المختبر، خفض DBE S100β، RAGE، iNOS (NOS2)، وفسفرة NF-κB p65. بشكل عام، يبدو أن DBE يخفف من الالتهاب التقرحي العصبي من خلال تثبيط تنشيط EGC وخفض التنظيم لمحور S100β/RAGE/NF-κB/iNOS، مما يحافظ على سلامة المخاط.

المقدمة

التهاب القولون التقرحي (UC) هو نوع فرعي رئيسي من أمراض الأمعاء الالتهابية (IBD) يتميز بالتهاب مخاطي مزمن في القولون، مع عبء عالمي متزايد منذ عام 1990، ويمثل الالتهاب التقرحي نسبة كبيرة من حالات التهاب الأمعاء الالتهابيالمتكررة 1,2. تشمل المظاهر الشائعة آلام البطن والإسهال الدموي، مما يؤدي إلى ضيق جسدي كبير وتكاليف علاجية كبيرة.3. على الرغم من توسع خيارات العلاج، فإن التعرض طويل الأمد لمعدلات المناعة والأدوية البيولوجية التي تثبط المناعة الجهازية مرتبط بزيادة مخاطر الإصابة باللمفوما والعدوى الانتهازية، ويظل جزء من المرضى مقاومين للمقاومة أو عدم التحمل4. يعتبر التهاب الالتهاب التقرئي على نطاق واسع حالة تتوسط المناعة حيث يكون اضطراب التوازن المناعي المخاطي مركزيا في علم الأمراض5. ومع ذلك، تشير الأدلة المتراكمة إلى أن آليات المناعة المخاطية وحدها غير كافية لتفسير جميع خصائص مرض التهاب الأمعاء الالتهابي؛ يساهم الجهاز العصبي المعوي (ENS) في التهاب الأمعاء، مما يمتد مفهوم المرض إلى الالتهاب العصبي داخل التهاب الأمعاء6.

الخلايا الدبقية المعوية (EGCs)، التي تفوق عدد الخلايا العصبية المعوية في الثدييات البالغة، أصبحت الآن منظما رئيسيا لتوازن الأمعاء والالتهاب 7,8. تقوم EGCs بتعديل وظيفة الحاجز الظهاري عن طريق إطلاق وسطاء مثل GDNF، TGF-β1، S100β، و15d-PGJ2، مما يؤثر على نفاذية وسلامة الغذابالمخاطية 9. من بين هذه الوسطاء، يمكن ل S100β تنشيط سلاسل المسار اللاحق - بما في ذلك مسار RAGE/NF-κB - الذي يؤدي إلى إصابة الحاجز وتضخيم الالتهابات10،11. كما تشكل EGCs الاستجابات المناعية من خلال تنظيم النمط الظاهري للبلاعم والحساسية الحشوية عبر connexin-43 وM-CSF، ومن خلال ممارسة تأثيرات قمعية على الخلايا التائية في المختبر، مما يبرز تنشيط EGC كهدف علاجي قابل للتنفيذ في UC12,13.

لقد تم دراسة الطب الصيني التقليدي (TCM) بشكل متزايد في الجامعة وأظهرت فوائد واعدة في البيئات السريرية والتجريبية14,15. الاقتران الكلاسيكي بين سانغويسوربا أوفيسيناليس (دييو) وبليتيلا سترياتا (بايجي)، مع الأكاسيا كاتيتشو (إرشا)، موثق منذ زمن طويل لاضطرابات الزحار في مصادر الماتيريا الطبية وتم إدراجه في الدواء الصيني لمؤشرات التخمص والمسكنات وشفاء الجروح. تشير الدراسات المعاصرة إلى أنشطة مضادة للبكتيريا ومضادات الالتهاب ومضادات الأكسدة ومضادة للقرحة لهذه النباتات النباتاتية، بينما يظهر A. catechu أيضا خصائص حماية عصبية مع الكاتشين كمكون بارز16,17. مقارنة بالقمع المناعي الجهازي التقليدي، يمكن أن تقدم صياغة تتعامل مع المسارات المناعية العصبية المرتكزة على EGC فعالية تكميلية بآلية مميزة وربما تقليل المخاطر المرتبطة بالمناعة الجهازية18,19.

تقيم هذه الدراسة ما إذا كان التحضير المشترك لدييو، بايجي، وإرتشا (DBE) يخفف من التهاب القولون التقرحي عن طريق كبح تنشيط EGC. يستخدم نهج متكامل: تحليل غير مستهدف ب LC-MS/MS لترتيب المكونات، الالتحام الجزيئي مقابل S100β، التحقق في نموذج التهاب القولون الناتج عن كبريتات الدكستران الصوديوم، والاختبارات الميكانيكية في EGCs. يركز العمل على آلية مناعية عصبية - S100β/RAGE/NF-κB/iNOS بدون S100β/RAGE/NF-κB/iNOS تم استكشافها في علاجات الالتهاب التقرحي السابقة، وتوضح الآثار العملية لاختيار الجرعة، وتحسين الصياغة، والدراسات الترجمية اللاحقة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تمت الموافقة على جميع إجراءات من قبل لجنة أخلاقيات في جامعة بكين للطب الصيني [BUCM-2023-0912] وأجريت وفقا للإرشادات المؤسسية والوطنية لرعاية واستخدام المختبرية. لم يكن هناك أي أشخاص مشاركين.
المواد المستخدمة والمواد المستخدمة مدرجة في جدول المواد.

1. المواد والكواشف

تم استخدام مذيبات تحليلية وكواشف بدرجة علم الأحياء الجزيئي طوال الوقت. جميع المعلومات التجارية، بما في ذلك المصنعين، أرقام الكتالوج، وتفاصيل تراخيص البرمجيات، مقدمة في جدول المواد (xlsx). تم إزالة الأيونات من المياه لجميع التحضيرات وتصفيتها. تم تجهيز جميع المخازن المؤقت طازجة أو مخزنة تحت الظروف المحددة أدناه.

2. إعداد المعدات والبرمجيات

نظام UPLC-MS/MS مرتبط بمطياف كتلة رباعي الأقطاب؛ جهاز طرد مركزي مبرد مع دوار دلو متأرجح؛ حاضنة CO₂ تحافظ على 37 درجة مئوية، 5٪ CO₂، ورطوبة نسبية ≥95٪؛ قارئ ميكرو ليت (450 نانومتر)؛ جهاز دورة حرارة PCR في الوقت الحقيقي؛ الرحلان الكهربائي وجهاز التطهير؛ وتم استخدام مجهر فلوري مزود بمرشحات ثابتة للإثارة/الانبعاث. تم إجراء التحكم في الأجهزة وتحليل البيانات في MassLynx v4.2 لبيانات الكروماتوغرافية وتحليل الكتلة المطيافية في AutoDock 4.2 مع AutoDockTools 1.5.7 للالتحط. تم إجراء تحليل الصور في ImageJ/Fiji v1.53.

3. تحضير سائل الحقنة الشرجية ديباي (DBE)

تم سحق الخليط العشبي الذي يتكون من ديو (50 جرام)، وبيجي (50 جرام)، وإرتشا (20 جرام) بشكل خشن ونقعه في 1200 مل من ماء منزوع الأيونات في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة لضمان الترطيب الكامل. تم نقع الخليط المنقوع تحت غليان قوي لمدة 30 دقيقة مع تحريك متقطع لمنع الالتصاق. تم ترشيح المحلول الساخن عبر شاش طبي متعدد الطبقات معقم إلى زجاج معقم لإزالة المواد غير القابلة للذوبان. تم تركيز الترشيح في الفراغ في حمام ماء لا يتجاوز 45 درجة مئوية حتى يتم الحصول على تركيز نهائي للمخزون 1.98 جرام/مل (مخزون عالي الجرعة). تم تحضير محاليل العمل بجرعات متوسطة ومنخفضة عند 0.99 جرام/مل و0.50 جرام/مل عن طريق التخفيف باستخدام مياه معقمة منزوع الأيونات حتى حجم نهائي يبلغ 100 مل لكل منهما. كان يمر كل محلول عبر غشاء بحجم 0.22 ميكرومتر تحت ظروف معقمة، ويصرف في حاويات معقمة موسومة، ويخزن عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى سبعة أيام. قبل الاستخدام، كانت المحاليل تخلط بلطف؛ كان المظهر المقبول واضحا إلى قليل من العقيق بدون جزيئات ظاهرة.

4. UPLC - تحليل MS/MS ل DBE

تم وزن المسحوق من كل مكون طبي بدقة 50 ملغ واستخرجه ب 1.0 مل من 80٪ ميثانول (v/v) بواسطة تحريك بالموجات فوق الصوتية لمدة 30 دقيقة في درجة الحرارة المحيطة. تمت إعادة المستخلصات إلى درجة حرارة الغرفة بعد السونيك، وتم طرد مركزها بحرارة 15,000 × جرام لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية، وتم ترشيح المواد الفائقة عبر أغشية قطرها 0.22 ميكرومتر إلى قوارير سامبلر تلقائية. تم إجراء فصل كروماتوغرافي على عمود طور معكوس (2.1 × 100 مم، 1.8 ميكرومتر؛ نوع C18 ذو نهاية قطبية) يحافظ على درجة حرارة 35 °م؛ يتم توفير العلامة التجارية للعمود أو الطراز ورقم الكتالوج في جدول المواد. المرحلة المتنقلة A: حمض الفورميك 0.1٪ في الماء؛ المرحلة المتنقلة B: الأسيتونيتريل. معدل التدفق: 0.30 مل/دقيقة؛ حجم الحقن: 10 ميكرولتر. التدرج: 5٪ B لمدة 0-2 دقيقة؛ 5→95٪ B من 2 إلى 20 دقيقة؛ 95٪ B لمدة 20-23 دقيقة؛ 95→5٪ B من 23.0 إلى 23.1 دقيقة؛ إعادة التوازن عند 5٪ B حتى الدقيقة 26 (جدول التدرج الكامل مقدم في الجدول 1).

استخدم مطيافية الكتلة التأين بالرش الكهربائي مع التبديل الموجب/السالب، والحصول على البيانات من خلال المسح منخفض وعالي الطاقة (MSE). نطاق الكتلة: m/z 100-1,500; جهد الشعيرات الدموية: 2.0 كيلوفولت؛ مخروط العينة: 20 فولت؛ درجة حرارة المصدر: 120 درجة مئوية؛ درجة حرارة الذوبان: 360 درجة مئوية؛ غاز المخروط: 50 لتر/ساعة؛ غاز الذوبان: 600 لتر/ساعة. تستخدم دالة الطاقة العالية طاقة تصادم متدرجة تتراوح بين 20-50 إلكترون فولت. تمت معالجة البيانات في MassLynx v4.2 مع تصحيح الكتلة القفلية ومعايير كشف الذروة القياسية. قائمة شاملة تضم 105 مكونات محددة (الصيغ الجزيئية، الملاحظة في الجزء، أوقات الاحتفاظ، ودرجات الثقة) في الجدول التكميلي 1.

5. الالتحام الجزيئي

تم إجراء الالتحام في أوتودوك 4.2 وفق بروتوكول تركيب مستحث. تم إعداد البنية ثلاثية الأبعاد ل S100β (PDB 3HCM) عن طريق إزالة جزيئات الماء البلورية، وإضافة الهيدروجينات القطبية، وتعيين شحنات كولمان. تم بناء هياكل ليغاند تمثل مكونات DBE المميزة، وتم تحويلها إلى بروتونات عند درجة حموضة فسيولوجية، وتم تقليل الطاقة. تم تحديد موقع الربط بواسطة إحداثيات الليغاند الأصلية؛ تم التعامل مع بقايا حمض الأمين ضمن 6 أنجلوست من الليغاند الأصلي على أنها مرنة أثناء الالتحام. كانت صناديق الشبكة تغطي الجيب بأكمله بمسافة شبكية تبلغ 0.375 أنجلوستروم (Å). كانت معلمات خوارزمية الوراثة اللاماركية: حجم السكان 150؛ تقييمات طاقة تصل إلى 2.5 × 10⁶؛ 100 جري مستقل لكل ليجند. تم تصنيف الوضعيات النهائية حسب الطاقة الحرة المتوقعة للارتباط وتجميعها بواسطة RMSD؛ تم تصور أنماط التفاعل (الروابط الهيدروجينية، الاتصالات الكارهة للماء، تفاعلات π-π) لتحقيق الاتساق مع مجمعات S100β المعروفة.

6. نموذج لعلاج التهاب القولون الناتج عن DSS وعلاج DBE

تم تأقلم ذكور فئران C57BL/6J (8 أسابيع، 20-22 جرام) لمدة لا تقل عن 7 أيام عند 22 ± 2 درجة مئوية، رطوبة نسبية 50٪-60٪، دورة 12 ساعة من الضوء إلى الظلام، مع تناول الطعام والماء بحرية اللازم. تم تقسيم عشوائيا إلى ست مجموعات (n = 10/مجموعة): ضابطة، نموذج كبريتات الصوديوم (DSS)، دليل إيجابي للسلفاسالازين (SASP)، وعلاجات DBE بجرعات منخفضة ومتوسطة وعالية. كان الموظفون المسؤولون عن تقييم النسيجات وقياس الصور غير مبالين بتوزيع المجموعات.

تم تحفيز التهاب القولون التجريبي بواسطة DSS بنسبة 2.0٪ (مع الخصم/الجسم) في مياه الشرب لمدة 7 أيام، تلاها 1.0٪ DSS لمدة 3 أيام، ثم ماء منتظم لمدة 4 أيام قبل القتل الرحيم. تم إعطاء DBE مرة واحدة يوميا عن طريق حقنة شرجية بقوة 10 مل/كغ باستخدام قسطرة مرنة تم إدخالها على بعد 2.5 سم في المستقيم؛ تم الاحتفاظ بالحيوانات عموديا لمدة 30 دقيقة لتقليل التسرب. كانت جرعات DBE اليومية 12.35، 27.4، و49.4 جرام/كغ/يوميا للمجموعات المنخفضة والمتوسطة والعالية على التوالي؛ تم إعطاء SASP بجرعة 0.5 جرام/كغ/يوميا كحالة ضابطة إيجابية. تم تسجيل وزن الجسم، وقوام البراز، ودم البراز الخفي يوميا لحساب مؤشر نشاط المرض. في النهاية، تم تخدير الفئران ببنتوباربيتال الصوديوم 50 ملغ/كغ i.p.؛ تم جمع الدم من الجيب الرجعي الحجاجي باستخدام الشعيرات الدموية الهيبارينية؛ تم إعدام بالقتل الرحيم بسبب خلع عنق الرحم. تم استئصال القولون من الوصلة اللفائفي إلى المستقيم، وتم تمديده بلطف، وتم قياس الطول تحت ضغط ضئيل. تم تثبيت المقاطع التمثيلية في 4٪ بارافورمالديهايد؛ تم تجميد الأنسجة المتبقية في النيتروجين السائل وتخزينها عند درجة حرارة −80 درجة مئوية.

7. تحضير مصل يحتوي على الأدوية

تم تقسيم ذكور فئران سبراج-داولي عشوائيا إلى مجموعات ضابطة ومجموعات DBE (n = 6/مجموعة). تلقت مجموعة DBE 12.34 جم/كغ/يوم عن طريق التميح الفموي مرة واحدة يوميا لمدة 7 أيام؛ تلقت عناصر التحكم ماء نقيا بنفس الحجم. بعد أربع وعشرين ساعة من الجرعة النهائية، تم تخدير، وجمع الدم الكامل من الشريان الأبهر البطني. تم فصل المصل بعد التجلط لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، تلاها الطرد المركزي عند 1500 × جرام لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. تم تعطيل المصل حراريا عند درجة حرارة 56 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة وترشيح عبر أغشية بحجم 0.22 ميكرومتر تحت ظروف معقمة قبل التخزين. تم إدخال المصل إلى أنابيب معقمة وتخزينه عند −80 درجة مئوية. تم استبعاد العينات المحللة من الهيمول، والتي تم تحديدها من خلال ارتفاع الامتصاص بالقرب من 414 نانومتر.

8. الفحص الأنسجي (H&E)

تم تجفيف نسيج القولون المثبت في بارافورمالديهيد بنسبة 4٪ لمدة 24 ساعة عبر الإيثانول المصنف، وتم تطهيره في الزيلين، وغرس في البارافين. تم قطع الأقسام (5 ميكرومتر) وإزالة البارافين وإعادة ترطيبها وصبغها بالهيماتوكسيلين لمدة 5 دقائق، ثم تم تلوينها في ماء جاري لمدة 5 دقائق، وصبغها بالإيوزين لمدة دقيقتين. تم تركيب شرائح باستخدام الراتنج وفحصها من حيث بنية القبو، وكثافة خلايا الكأس، واستمرارية الظهارة، والتسرب الالتهابي. سيتم الإشارة إلى التعديلات التمثيلية باستخدام الأسهم/رؤوس الأسهم ومعرفة في أساطير الشخصيات؛ سيتم تحديد أشرطة المقياس (مثل 200 ميكرومتر) والعتبات البصرية المحددة مسبقا في الأساطير.

9. الكيمياء المناعية (IHC)

خضعت أقسام البارافين لسحب المستضدات في محلول السيترات (pH 6.0) لمدة 15-20 دقيقة عند 95-98 درجة مئوية، وتبريد بيروكسيداز داخلي بنسبة 3٪ بيروكسيد الهيدروجين لمدة 10 دقائق، وتم تقييد المحلول بنسبة 5٪ مصل طبيعي لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. تم حضان الأجسام المضادة الأولية طوال الليل عند درجة حرارة 4 درجات مئوية في غرفة رطبة. بعد الغسيل، تمت معالجة المقاطع باستخدام نظام كشف ستريبتافيدين-بيروكسيداز، تم تطويره باستخدام DAB لمدة دقيقتين (مراقبة مجهرية)، ثم صبغ بالهيماتوكسيلين، ثم جفف، وتم تركيبه. تم تضمين الضوابط السلبية التي تفتقر إلى الجسم المضاد الأساسي في كل دفعة.

10. تحليل التألق المناعي (IF)

تم إزالة البارافينات من القطع المدمجة بالبارافين وتعرضها لاسترجاع المستضدات في مخزن EDTA (pH 8.0). بعد التبريد، تم حجب الارتباط غير النوعي بألبومين مصل البقري بنسبة 3٪ لمدة ساعة في درجة حرارة الغرفة. تم حضنة الأقسام طوال الليل عند 4 درجات مئوية مع الأجسام المضادة الأولية ضد GFAP (1:500) و S100β (1:200)، تلتها أجسام مضادة ثانوية متقاربة بالفلوروفور (1:500) لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. تم تلوين النوى بتقنية DAPI، وتم تركيب الشرائح في وسط مضاد للتلاشي. تم التقاط الصور باستخدام أهداف متطابقة، وزمن تعريض ثابت يبلغ 100 مللي ثانية، وكسب كاشف 1.0 عبر المجموعات. تم قياس متوسط شدة الفلورة في ImageJ/Fiji v1.53 بعد معايرة حجم البكسل، وطرح الخلفية (نصف قطر كرة الدوران 50 بكسل)، والتطبيع إلى منطقة إيجابية DAPI. تم تحليل ما لا يقل عن خمس نسخ بيولوجية لكل مجموعة وثلاثة حقول غير متداخلة لكل نسخة.

11. زراعة الخلايا والعلاجات

تم زراعة خلايا الفئران الدبقية المعوية (التسمية CRL-2690) في DMEM مع 10٪ مصل بقري جنيني و1٪ بنسلين-ستريبتوميسين عند 37 درجة مئوية في حاضنة رطبة تحتوي على 5٪ CO₂. تم تأكيد هوية الخلية من خلال التحليل المتكرر القصير المتتالي، وكانت الزراعة خالية من الميكوبلازما. أجريت التجارب في الفقرات 5-15. تم زرع الخلايا في صفائح ذات 6 آبار بحجم 2.0 × 10⁵ خلايا/بئر في وسط 2.0 مل/بئر وسمح لها بالالتصاق لمدة 24 ساعة. كانت المجموعات التجريبية هي: ضابط غير معالج، ضابط مركبة، نموذج، مصل DBE، ومثبط.

في التحفيز النموذجي، تعرضت الخلايا لبوليسكاريد الدهون (LPS، 1 ميكروغرام/مل) بالإضافة إلى IFN-γ (20 نانوغرام/مل) لمدة 24 ساعة في وسط كامل؛ القيمة المقابلة ل U/mL ل IFN-γ تذكر في جدول المواد وفقا للقوة الخاصة بالدفعة. في معالجة مصل DBE، تلقت الخلايا مصل جرذ محبط بالحرارة بنسبة 15٪ (56 درجة مئوية، 30 دقيقة)، و0.22 ميكرومتر يحتوي على DBE مصفى في وسط كامل لمدة 24 ساعة (يستخدم نطاق الجرعة 5٪-20٪ لتحسين الصلاحية كما هو محدد في قسم CCK-8). لمعالجة المثبط، تم تطبيق مثبط S100β الانتقائي SBI-4211 (10-50 ميكرومولار؛ 45 ميكرومولار للقراءات الرئيسية) لمدة 24 ساعة. تطابقت ضوابط المركبات مع محتوى المذيب (0.1٪ DMSO (v/v)) مع وسط متطابق في الخارج. ما لم يذكر خلاف ذلك، كانت العلاجات تحضر في وسط دافئ مسبقا (37 درجة مئوية)، وكانت الخلايا تغسل 2× ب PBS قبل استبدال العلاج. بعد العلاج، تم جمع الخلايا لاستخراج الرنا، وتحليل البروتينات، والفلورة المناعية كما هو موضح في الأقسام التالية. كان التكاثر البيولوجي ≥ خمس ثقافات مستقلة لكل حالة.

12. اختبار بقاء خلايا CCK-8

تم زرع الخلايا في صفائح بحجم 96 بئر بحجم 5 × 10³ في بئر في وسط 100 ميكرولتر وتركت لتثبت طوال الليل. تم استبدال الوسط بوسط يحتوي على مصل معالج ب DBE بنسبة 5٪ أو 10٪ أو 15٪ أو 20٪ (v/v) لمدة 24 ساعة. أضيف كاشف CCK-8 (10 ميكرولتر/بئر)، وتم حضن الألواح لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية. تمت قراءة الامتصاص عند 450 نانومتر مع طرح فارغ (وسط + كاشف، بدون خلايا). تم التعبير عن الجدوى كنسبة مئوية من التحكم في المركبات. كل حالة استخدمت n ≥ 5 نسخ بيولوجية (مزارع مستقلة) مع ثلاث نسخ تقنية لكل مزرعة.

13. ELISA للسيتوكينات الأنسجة

تم تجانس نسيج القولون على الثلج في PBS (1:9، بدون زجاج) يحتوي على مثبطات بروتيياز. تم توضيح التجانسات ب 12,000 × جرام لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية؛ تم اختبار الفائقين للكشف عن IL-1β وTNF-α وفقا لبروتوكولات المجموعة. تم تشغيل المعايير والعينات بشكل مكرر، وتم تزويد المنحنيات بنموذج لوجستي من أربعة معاملات (4PL) بمعدل R² ≥ 0.99؛ تم قبول المعايير المحسوبة بعكس الحساب ضمن 85٪-115٪ من النسبة الاسمية. تمت قراءة الامتصاص عند 450 نانومتر مع مرجع 620-650 نانومتر عند توفره. تم تطبيع تركيزات السيتوكين إلى وزن النسيج (نسيج pg/mg). شملت كل مجموعة n ≥ 5 نسخ بيولوجية.

14. PCR الكمي في الوقت الحقيقي (qPCR)

تم عزل الحمض النووي الريبي الكلي من نسيج القولون (أو الخلايا، حسب الاقتضاء) باستخدام مجموعة عمود دوران من غشاء السيليكا. تم التحقق من سلامة الحمض النووي الريبي بواسطة A₂₆₀/A₂₈₀ = 1.8-2.1 وفحص أجاروز-جيل. تم تصنيع cDNA للسلسلة الأولى من 1 ميكروغرام RNA مع إزالة الحمض النووي الجيني. استخدم qPCR مزيج SYBR Green Master على جهاز دورة حرارية معاير مع البرنامج: 95 °C 30 ثانية؛ 40 دورة بمعدل 95 درجة مئوية 5 ثوان، 60 درجة مئوية 30 ثانية؛ منحنى الانصهار 65-95 درجة مئوية في 0.5 درجة مئوية/5 خطوات ثانية. عمل GAPDH كضابط داخلي. تم حساب التعبير النسبي بواسطة 2⁻ΔΔCt بعد التحقق من كفاءة البادئات (90٪-110٪، من منحدرات المنحنى القياسي). تم تضمين عناصر التحكم بدون RT وبدون قالب. تسلسلات البادئات مدرجة في الجدول 2. كل مجموعة كان لديها n ≥ 5 نسخ بيولوجية وتكراران تقنيان لكل عينة.

15. تحليل البقعة الغربية

تم استخراج البروتينات من نسيج القولون (أو الخلايا) في مخزن RIPA باستخدام مثبطات البروتياز/الفوسفاتاز وتم قياسها بواسطة اختبار BCA. تم تفكيك البروتين المتساوي (30 ميكروغرام/مسار)، وحل على SDS-PAGE بتدرج 4-20٪، ونقله إلى PVDF (0.45 ميكرومتر؛ 0.2 ميكرومتر لأهداف ≤ 20 كيلو دالتون). تم حجب الأغشية في حليب خالي الدسم بنسبة 5٪ لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة وحضنتها طوال الليل عند 4 درجات مئوية مع الأجسام المضادة الأولية ضد GFAP (1:1,000)، S100β (1:1,000)، iNOS (1:1,000)، NF-κB p65 (1:1,000)، فوسفو-NF-κB p65 (Ser536، 1:1,000)، أوكلودين (1:1,000)، كلودين-1 (1:1,000)، وGAPDH (1:5,000). تم تطبيق الأجسام المضادة الثانوية المترافقة مع HRP (1:5,000) لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. تم تطوير الإشارات باستخدام ECL؛ كانت أوقات التعريض مقيدة بالنطاق الديناميكي الخطي (10-90 ثانية). تم التحقق من النقلات من خلال تلوين الغشاء العكسي قبل الحصر. تم قياس شدة النطاق في ImageJ/Fiji v1.53 بعد طرح الخلفية وتم تطبيعه إلى GAPDH. الأوزان الجزيئية المتوقعة: GFAP ~49 كيلو دالتون، S100β ~10-12 كيلو دالتون، NF-κB p65 ~65 كيلو دالتون، iNOS ~130 كيلو دالتون، أوكلودين ~65 كيلو دالتون، كلودين-1 ~22 كيلو دالتون، GAPDH ~36-37 كيلو دالتون. شمل كل تحليل n ≥ 5 نسخ بيولوجية.

16. التحليل الإحصائي

تم تحليل البيانات في GraphPad Prism 8.0 وتم تقديمها كمتوسط ± SEM. للمقارنات بين مجموعات متعددة، تم استخدام تحليل أنوفاي أحادي الاتجاه متبوعا باختبار توكي بعد الاختبار؛ للمقارنات الزوجية، تم تطبيق اختبارات t للطالب ذات الذيلين غير المقرنين عند الاقتضاء. بالنسبة للتصاميم ذات المسار الزمني أو التصاميم ذات العوامل الثنائية (مثل العلاج × الجرعة أو العلاج × الوقت)، تم استخدام ANOVA ثنائي الاتجاه (مقاييس متكررة عند الاقتضاء) مع تصحيح توكي أو دانيت كما هو محدد في أسطوانات الأشكال. استخدمت اختبارات شابيرو-ويلك وليفين لفحص الطبيعية والتجانسة قبل الاختبارات البارامترية؛ عندما تم انتهاك الافتراضات، كانت البيانات تحول إلى سجل أو تحلل باستخدام اختبارات غير معلمية مناسبة (كروسكال-واليس مع اختبار دان بعد الاستخدام؛ مان-ويتني U للزوج). يتم الإبلاغ عن قيم p الدقيقة ومقاييس حجم التأثير (η² ل ANOVA، وd كوهين لاختبارات t) في أساطير الأشكال حيثما كان ذلك مناسبا. اعتبر الp ذو الجانبين < 0.05 ذا دلالة إحصائية. تستخدم أساطير الأشكال الرموز التالية للدلالة: *p<0.05، **p<0.01، *** p<0.001 مقابل Control; # p<0.05, ## p<0.01, ### p<0.001 مقابل DSS; NS، غير مهم.

17. النتائج المتوقعة ومراقبة الجودة

من المتوقع أن يؤدي DSS إلى تقصير طول القولون، ورفع مؤشر نشاط المرض، وإحداث تلف نسيجي (تشوه معماري القدافة، استنزاف خلايا الكأس، تآكل الظهارة). يجب أن يحسن علاج DBE هذه المؤشرات اعتمادا على الجرعة ويقلل من مؤشرات تنشيط الأمعاء الدبقية. يجب أن تظهر البقع الغربية نطاقات عند الأوزان الجزيئية المذكورة أعلاه، مع زيادة الإشارات في DSS والتوهين باستخدام DBE أو SBI-4211؛ يجب أن تبقى التعريضات ضمن النطاق الديناميكي الخطي. يجب أن يظهر التألق المناعي ل GFAP و S100β شدة متوسطة مرتفعة في DSS وانخفاضا بعد علاج DBE. يجب أن تعرض كروماتوغرامات LC-MS/MS أوقات احتفاظ مستقرة (انحراف ≤ 0.2 دقيقة) ودقة كتلة ضمن ± 5 جزء في المليون للأيونات المرجعية، مع أيونات شظايا مميزة للمكونات الرئيسية. يجب ألا تعطي الضوابط السلبية (مثل حذف الأجسام المضادة الأولية) إشارة محددة. يجب أن تبقى معلمات اكتساب التصوير (الهدفية، التعريض، الكسب، الغاما) ثابتة عبر المجموعات لتمكين المقارنات الكمية الصحيحة.

18. ملاحظات استكشاف الأخطاء

العكارة أو الجسيمات في محاليل DBE تشير إلى عدم كفاية الترشيح أو الترطيب؛ كرر ترشيح 0.22 ميكرومتر وتأكد من الرقم الهيدروجيني 6.5-7.5. الوفاة المفرطة أو فقدان الوزن الشديد أثناء التعرض لمتلازمة DSS تشير إلى الإفراط في التحفيز؛ تقليل تركيز DSS، وتحقق من الوزن الجزيئي الدفعي، واستبدال محاليل DSS يوميا. عادة ما يعكس القياس غير المتسق للفوضى المناعية التعريض المتغير؛ حدد وقت التعريض والكسب، وأضف شريحة مرجعية للمعايرة الدفعية. قد تعكس نطاقات البقع الغربية الضعيفة انخفاض التحميل أو عدم كفاءة النقل؛ تحقق من كمية البروتين، واختر نسبة الجل المناسبة أو التدرج، وتأكد من النقل عبر التلوين الغشائي العكسي. ملاءمة ELISA السيئة (R² < 0.99 أو الحساب العكسي القياسي خارج 85-115٪) تستدعي تكرار المنحنى القياسي وإعادة تقييم العينات المخففة. بالنسبة لتشغيل qPCR بكفاءة برايمر تتجاوز 90-110٪، أعد تحسين درجة حرارة التلدين أو تركيز البرايمر قبل التحليل.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

تحديد مكونات DBE والمصل المحتوي على الأدوية

حدد LC-MS/MS 105 مكونات كيميائية فريدة في DBE، مع خطأ كتلي < 10 جزء في المليون. تم تأكيد التعرف من خلال الصيغة الجزيئية، ونمط النظائر، ومطابقة الشظايا. شملت الفئات الرئيسية الترايتيربينات، والفلافونويدات، والبيفينانثرينات، والأحماض العضوية. كشف المصل المحتوي على الأدوية عن 59 مكونا مشتقا من DBE بعد طرح فارغ. تظهر الرموز التمثيلية التمثيلية في ال...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

التهاب القولون التقرحي (UC) هو مرض التهابي مزمن في الأمعاء ينشأ بعدة عوامل. بالإضافة إلى الاستجابات المناعية غير المنظمة، يعد خلل حاجز الظهارة المعوية واضطراب ميكروبيوم الأمعاء من العوامل المعروفة جيدا، بينما يتم تحديد اضطرابات الجهاز العصبي المعوي (ENS) بشكل متزايد كعامل رئيسي في تقدم التهاب القولون التقرفي23. على وجه التحديد، يمكن أن يؤدي كل من الاضطراب الهيكلي والوظيفي لالتهاب الغشاء المخاطي وشدة المرضإلى تفاقم الالتهاب المخاطي وشدة المر...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

وقد دعم هذا البحث مشروع بناء التخصصات الطبية الرئيسية عالية المستوى التابع للإدارة الوطنية للطب الصيني التقليدي (ZYYSZX-2023256).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
أوتودوك 4.2برنامج الالتحام الجزيئي-معهد سكريبس للأبحاث
كبريتات الدكستران الصوديوم (DSS)مادة كيميائية لتحفيز التهاب القولون في الفئران9011-18-1سيغما-ألدرتش
سائل الحقنة الشرجية ديباي (DBE)خليط عشبي لعلاج التهاب القولون التقرحي-جامعة بكين للطب الصيني
DMEM (المتوسط المعدل من دولبيكو)وسط زراعة الخلايا11965-092ثيرمو فيشر
مصل الأبقار الجنيني (FBS)مكمل لزراعة الخلايا16000-044ثيرمو فيشر
المجهر الفلوريأداة لتصوير التألق المناعي-أوليمبوس
نظام LC-MS/MSمطياف الكتلة لتحليل LC-MS-شركة ووترز
ليبوبوليسكاريد (LPS)محفز الالتهاب في زراعة الخلاياL2630سيغما-ألدرتش
PCR Thermal Cyclerمعدات qPCRT100بيو-راد
الأجسام المضادة الأولية (S100)الأجسام المضادة للكشف عن بروتين S100ABC1234أبكام
مجموعة اختبار البروتين (BCA)مجموعة قياس البروتين23225ثيرمو فيشر
الإنترفيرون المؤتلف - (IFN)السيتوكين لتنشيط EGC في زراعة الخلايا-سيغما-ألدرتش
الأجسام المضادة الثانوية (مرتبطة ب HRP)الأجسام المضادة الثانوية للكيمياء المناعيةXYZ5678ثيرمو فيشر
السلفازالازين (SASP)التحكم الإيجابي في التهاب القولون التقرحي-سيغما-ألدرتش
معدات البقعة الغربيةنظام الرحلان الكهربائي لتحليل البروتينات-بيو-راد

المراجع

  1. Lin, D., et al. Global, regional, and national burden of inflammatory bowel disease, 1990-2021: Insights from the global burden of disease 2021. Int J Colorectal Dis. 39 (1), 139(2024).
  2. Le Berre, C., Honap, S., Peyrin-Biroulet, L. Ulcerative colitis. Lancet. 402 (10401), 571-584 (2023).
  3. Cui, Y., et al. Integrated network pharmacology, molecular docking and animal experiment to explore the efficacy and potential mechanism of Baiyu decoction against ulcerative colitis by enema. Drug Des Devel Ther. 17, 3453-3472 (2023).
  4. Rosh, J. R., Gross, T., Mamula, P., Griffiths, A., Hyams, J. Hepatosplenic T-cell lymphoma in adolescents and young adults with Crohn's disease: A cautionary tale. Inflamm Bowel Dis. 13 (8), 1024-1030 (2007).
  5. Pastorelli, L., De Salvo, C., Mercado, J. R., Vecchi, M., Pizarro, T. T. Central role of the gut epithelial barrier in the pathogenesis of chronic intestinal inflammation: Lessons learned from animal models and human genetics. Front Immunol. 4, 280(2013).
  6. Capoccia, E., et al. Enteric glia: A new player in inflammatory bowel diseases. Int J Immunopathol Pharmacol. 28 (4), 443-451 (2015).
  7. Sharkey, K. A., Mawe, G. M. The enteric nervous system. Physiol Rev. 103 (2), 1487-1564 (2023).
  8. Fung, C., Boesmans, W., Cirillo, C., Foong, J. P. P., Bornstein, J. C., Vanden Berghe, P. VPAC receptor subtypes tune purinergic neuron-to-glia communication in the murine submucosal plexus. Front Cell Neurosci. 11, 118(2017).
  9. Bubeck, M., Becker, C., Patankar, J. V. Guardians of the gut: Influence of the enteric nervous system on the intestinal epithelial barrier. Front Med. 10, 1228938(2023).
  10. Da Silva Sousa, J. J., et al. Colonic mast cells trigger enteric neuronal death through the S100β/RAGE/NFκB pathway on inflammatory bowel diseases. Med Hypotheses. 170, 111004(2023).
  11. Xie, H., et al. Enteric glial cells aggravate the intestinal epithelial barrier damage by secreting S100β under high-altitude conditions. Mol Biomed. 4 (1), 31(2023).
  12. Grubišić, V., et al. Enteric glia modulate macrophage phenotype and visceral sensitivity following inflammation. Cell Rep. 32 (10), 108100(2020).
  13. Kermarrec, L., Durand, T., Neunlist, M., Naveilhan, P., Neveu, I. Enteric glial cells have specific immunosuppressive properties. J Neuroimmunol. 295 - 296, 79-83 (2016).
  14. Liu, D., et al. Flos lonicerae flavonoids attenuate experimental ulcerative colitis in rats via suppression of NF-κB signaling pathway. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 393 (12), 2481-2494 (2020).
  15. Zhao, Y., et al. Gegen Qinlian decoction maintains colonic mucosal homeostasis in acute/chronic ulcerative colitis via bidirectionally modulating dysregulated Notch signaling. Phytomedicine. 68, 153182(2020).
  16. Zhu, L., Gu, P., Shen, H. Protective effects of berberine hydrochloride on DSS-induced ulcerative colitis in rats. Int Immunopharmacol. 68, 242-251 (2019).
  17. Zhang, S., et al. International clinical practice guideline on the use of traditional Chinese medicine for ulcerative colitis by Board of Specialty Committee of Digestive System Disease of World Federation of Chinese Medicine Societies (2023). Phytother Res. 38 (2), 970-999 (2024).
  18. He, X., et al. Bletilla striata: Medicinal uses, phytochemistry and pharmacological activities. J Ethnopharmacol. 195, 20-38 (2017).
  19. Kumari, M., et al. Acacia catechu (L.f.) Willd.: A review on bioactive compounds and their health promoting functionalities. Plants. 11 (22), 3091(2022).
  20. Yasueda, A., et al. Sanguisorba officinalis L. derived from herbal medicine prevents intestinal inflammation by inducing autophagy in macrophages. Sci Rep. 10 (1), 9972(2020).
  21. Garg Jyoti, V. Acacia catechu Willd. and Acacia arabica Willd. decrease the extent of anxiety behavior by reducing oxidative stress and moderating neurochemicals. J Ethnopharmacol. 312, 116496(2023).
  22. Ban, J. Y., et al. 3,4-Dihydroxybenzoic acid from Smilacis chinae rhizome protects amyloid β protein (25-35)-induced neurotoxicity in cultured rat cortical neurons. Neurosci Lett. 420 (2), 184-188 (2007).
  23. Olech, M., Ziemichód, W., Nowacka-Jechalke, N. The occurrence and biological activity of tormentic acid: A review. Molecules. 26 (13), 3797(2021).
  24. Wang, Q., et al. Hyperoside: A review on its sources, biological activities, and molecular mechanisms. Phytother Res. 36 (7), 2779-2802 (2022).
  25. Xun, L., et al. Physcion and physcion 8-O-β-glucopyranoside: A review of their pharmacology, toxicities and pharmacokinetics. Chem Biol Interact. 310, 108722(2019).
  26. Cirillo, C., et al. Increased mucosal nitric oxide production in ulcerative colitis is mediated in part by the enteroglial-derived S100B protein. Neurogastroenterol Motil. 21 (11), 1209-e112 (2009).
  27. Li, Y., et al. Inhibiting the activation of enteric glial cells alleviates intestinal inflammation and comorbid anxiety- and depressive-like behaviors in the ulcerative colitis mice. Neurochem Int. 178, 105789(2024).
  28. Cirillo, C., et al. S100B protein in the gut: The evidence for enteroglial-sustained intestinal inflammation. World J Gastroenterol. 17 (10), 1261-1266 (2011).
  29. Esposito, G., et al. Enteric glial-derived S100B protein stimulates nitric oxide production in celiac disease. Gastroenterology. 133 (3), 918-925 (2007).
  30. Yang, Y. H., Qian, W., Hou, X. H., Dai, C. B. Bifidobacterium bifidum and Bacteroides fragilis induced differential immune regulation of enteric glial cells subjected to exogenous inflammatory stimulation. Inflammation. 45 (6), 2388-2405 (2022).
  31. Le Berre, C., Naveilhan, P., Rolli-Derkinderen, M. Enteric glia at center stage of inflammatory bowel disease. Neurosci Lett. 809, 137315(2023).
  32. Schroeter, M. L., et al. Mood disorders are glial disorders: Evidence from in vivo studies. Cardiovasc Psychiatry Neurol. 2010, 780645(2010).
  33. Kaplan, G. G. The global burden of IBD: From 2015 to 2025. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 12 (12), 720-727 (2015).
  34. Fan, M., et al. Electroacupuncture at ST36 relieves visceral hypersensitivity based on the vagus-adrenal axis in the remission stage of ulcerative colitis. Neuromodulation. 28 (5), 812-824 (2025).
  35. Lechner, M., Lirk, P., Rieder, J. Inducible nitric oxide synthase (iNOS) in tumor biology: The two sides of the same coin. Semin Cancer Biol. 15 (4), 277-289 (2005).
  36. Nomura, Y. NF-kappaB activation and IkappaB alpha dynamism involved in iNOS and chemokine induction in astroglial cells. Life Sci. 68 (15), 1695-1701 (2001).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

S100 RAGE NF B DSS

تم نشر هذه المقالة

الفيديو قريباً

اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.