Method Article

تحسين رسم الخرائط المكانية لطبقات عضلات المعدة لدى الفأر باستخدام تقنية الرول السويسري المعدلة

DOI:

10.3791/69673

⸱

November 25th, 2025

 ,  ,  ,  , 
1Enteric Neuroscience Program and Department of Physiology and Biomedical Engineering, Mayo Clinic College of Medicine and Science, 2Gastroenterology Research Unit, Division of Gastroenterology and Hepatology, Department of Medicine, Mayo Clinic College of Medicine and Science, 3Division of Gastroenterology and Hepatology, Department of Medicine, Mayo Clinic College of Medicine and Science

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يحدد هذا البروتوكول طريقة لصبغ المناعة في المعدة بأكملها معدلة من تقنية "لفافة سويسرية" التي تم تطويرها أصلا لأمعاء الفئران.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

توفر تقنيات "الأوميكس" المكانية فرصا غير مسبوقة لدراسة بيولوجيا وتفاعلات الخلايا الفردية في الجهاز العصبي العضلي المعدة في بيئة الأنسجة الأصلية. ومع ذلك، فإن التطبيق الناجح لهذه الأساليب وتقييم الفروق الهيكلية والجزيئية عبر القاع والجسم والجزيئية يتطلب أخذ عينات متسقة وتوجيها نسيجيا متساقا. هنا، نبلغ عن تقنية "لفة سويسرية" معدلة مصممة خصيصا لمعدة الفأر، مما يسمح بدمج ورؤية جميع المناطق التشريحية الرئيسية في عملية تجميد واحدة. يركز هذا النهج على التثبيت المسطح وتحديد المواقع بعناية لتوليد مقاطع ذات اتجاه وجودة قابلة للتكرار. كما حسنت هذه الدراسة ظروف التلوين المناعي الفلوري لضمان رؤية عالية الجودة للعلامات الخلوية. يتيح هذا البروتوكول مقارنات شاملة جنبا إلى جنب لمناطق المعدة مع تقليل فقدان الأنسجة والتفاوت التجريبي. من خلال تعزيز حفظ الأنسجة والتوجه المكاني، تقدم هذه الطريقة أداة عملية وقابلة للتوسع للباحثين الذين يدرسون علم الأحياء المعدة في كل من السياقات الفسيولوجية والمرضية.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المعدة عضو معقد على شكل حرف J يربط المريء بالاثنيعشر 1. ينقسم إلى ثلاث مناطق تشريحية رئيسية: القاع، الجسم الجسدي، والأنف1. تلعب كل منطقة من التونيكا العضلية المعدة دورا فسيولوجيا مميزا، تساهم في وظائف معدية رئيسية مثل التكيف، والامتثال، وتآكل الطعام، وتفريغ 1,2. يتطلب دراسة التغيرات في فسيولوجيا المعدة والأمراض تحليلا مفصلا لهذه المناطق وبنيتها الخلوية.

لتصور مساحات واسعة من الأنسجة، غالبا ما يتكيف الباحثون مع تقنية "لفافة سويسرية"، التي تم تطويرها أصلا لأمعاء الفئران 3,4,5,6. عدلت هذه الدراسة تقنية الرول السويسري لاستخدامها مع معدة الفأر لوضع بروتوكول جديد. يتم فصل المعدة أولا إلى مناطقها التشريحية وتثبيتها بشكل مسطح. ثم يتم لف النسيج بعناية ومعالجته للعملية التبريدية. يمكن أن يؤدي التدحرج السويسري غير السليم إلى إتلاف الهياكل الظهارية الهشة، خاصة في الأمعاء، مما يؤدي إلى تدني جودة الأنسجة اللازمة لصبغ المناعة. الحفاظ على نسيج ثابت ومتوازن بشكل صحيح مع هياكل خلوية سليمة أمر ضروري للتصوير عالي الدقة. يقدم هذا العمل طريقة جديدة لتوليد لفائف سويسرية تشمل جميع مناطق المعدة داخل كتلة تجميد واحدة. بالإضافة إلى ذلك، تم وصف بروتوكول تلوين فلوري مناعي محسن للتونيكا العضلية المعدية، مما يتيح تقييما تفصيليا لوظيفة المعدة. يوفر هذا البروتوكول دليلا شاملا للحصول على صور عالية الجودة من الفلورة المناعية من خلال التحضير الدقيق للأنسجة المعدية، ومعالجة اللفائف السويسرية، والتلوين. من خلال الحفاظ على الشكل المعقد للتونيكا العضلية المعدية، تسهل هذه الطريقة فهما أعمق لتركيبها ووظيفتها في الصحة والمرض.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أجريت تجارب على وفقا للإرشادات الموضحة في دليل المعاهد الوطنية للصحة لرعاية واستخدام المختبرية. تمت الموافقة على البروتوكولات من قبل لجنة رعاية واستخدام المؤسسية في مايو كلينك (A48315-15). تمت مراجعة برامج ومرافق رعاية واستخدام في مايو كلينك واعتمادها بالكامل من قبل جمعية تقييم واعتماد رعاية المختبرية الدولية (AAALAC). المواد المستخدمة والمواد المستخدمة مدرجة في جدول المواد.

1. تقنية الرول السويسري لعمليات التبريد المعدة المثبتة بالبارافورمالديهايد (PFA)

  1. تخدير فأر C57BL/6J (عمره 8-10 أسابيع) عن طريق استنشاق ثاني أكسيد الكربون (CO₂) لمدة لا تقل عن 3 دقائق، يتبعه خلع عنق الرحم لضمان القتل الرحيم (وفقا لبروتوكولات معتمدة مؤسسيا).
  2. اقطع المريء، والاثني عشر، والميزوغستريا البطني والظهري لإزالة المعدة.
  3. ضع المعدة في طبق مغطى بالسيليكون يحتوي على محلول ملحي بارد مخزن بالفوسفات (PBS). ثبت المريء، القاع، الجسم، والاثني عشر لتكون مرجعية للتوجيه (الشكل 1A). يتم تحديد اتجاه القطع بخط أحمر متقطع في الشكل 1A.
  4. قم بإزالة أي دهون متلصقة بعناية باستخدام مقص العصا والملاقط.
  5. اقطع على طول الميزنيريه البطني للاثني عشر والمعدة حتى الدبوس عند الجسم، ثم قم بتسطيح النسيج بلطف (الشكل 1B).
  6. استخدم ماصة نقل مملوءة ب PBS لطرد أي طعام متبقي من التلوين المعدي.
  7. قم بتمديد البطن المفتوح بلطف لتحقيق اتجاه مسطح (الشكل 1C).
    تحذير: تجنب التمدد الزائد (أي أكثر من 110٪ من الأبعاد الأصلية) للحفاظ على بنية الأنسجة.
  8. اغمر المعدة في مادة PFA باردة بنسبة 4٪ لمدة دقيقتين لتثبيت الأنسجة قليلا وتسهيل الدوران.
  9. ثبت النسيج مرة أخرى بعد التثبيت القصير.
  10. قم بقص البطن على طول الإطار المتقطع لإنشاء شكل موحد مناسب للدحرجة (الشكل 1C).
  11. ضع نسيج المعدة المقطوع على ورق مرشح مبلل ب PBS (الشكل 1D).
  12. لف المنديل في شكل لف سويسري وتثبيته بإدخال عود أسنان في المنتصف.
    تحذير: تأكد من أن الجانب المخاطي مواجها للأعلى أثناء عملية اللف. أمسك طرف الاثني عشر باستخدام الملقط بيد واحدة بينما توجه عود الأسنان باليد الأخرى، بعد تعديلات طفيفة على الطرق المنشورة.
  13. بعد لفها، أدخل إبرة 30G لتثبيت شكلها وثنيها بزاوية 90° لتثبيت المعدة الملفوفة (الشكل 1E).
  14. ثبت النسيج الملفوف في 4٪ PFA عند 4 درجات مئوية لمدة 6 ساعات.
  15. انقل النسيج الثابت إلى 30٪ سكروز في PBS وحضن عند 4 درجات مئوية لمدة 12-16 ساعة للحماية بالتبريد ومنع تكوين بلورات الجليد.
  16. أزل الإبرة المثبتة بلطف.
  17. قم بإدخال النسيج في مركب درجة حرارة القطع المثلى (O.C.T.) باستخدام قوالب قاعدة قابلة للتخلص منها، ثم تجميده على الثلج الجاف (الشكل 1F).
  18. بعد تجميده الكامل، خزن القالب عند -80 درجة مئوية.
    تحذير: تجنب فقاعات الهواء في ال O.C.T.، خاصة حول الأنسجة، لأنها تتداخل مع التقسيم. يمكن تخزين كتل الأنسجة عند -80 درجة مئوية لمدة لا تقل عن سنة واحدة.
  19. قبل التقسيم، قم بضبط الكتلة عند -20 درجة مئوية لمدة ساعة على الأقل.
  20. قم بتقسيم الأنسجة بسماكة 5 ميكرومتر باستخدام جهاز تجميد (كريوستات).
    تحذير: سمك 5-12 ميكرومتر مناسب عموما لأقسام المعدة في فئران 7,8، ويمكن تعديله بناء على الاحتياجات التجريبية. يمكن تخزين المقاطع عند -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 3 أشهر.

2. التلوين المناعي الفلوري لأنسجة عضلات المعدة

  1. باستخدام قلم حاجز كاره للماء، ارسم حاجزا طاردا للماء حول كل جزء من الأنسجة على شريحة المجهر.
  2. اغسل الأقسام بزيت PBS البارد لمدة 5 دقائق لإذابة مركب O.C.T. المتبقي.
  3. امنع الارتباط غير النوعي عن طريق حضنة الأقسام التي تحتوي على ألبومين مصل البقري بنسبة 1٪ في PBS لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة (RT؛ 21-23 درجة مئوية).
  4. أزل 1٪ BSA باستخدام الشفط، ثم اغسل الأقسام ثلاث مرات ب PBS البارد لمدة 10 دقائق لكل منها عند RT (21-23 درجة مئوية).
  5. قم أيضا بحظر الارتباط غير النوعي عن طريق حضن الأقسام بمحلول حجب IgG من الفأر على الفأر في PBS لمدة ساعة واحدة عند RT (21-23 درجة مئوية)، مما يقلل من ارتباط IgG الداخلي ويحسن الخصوصية عند استخدام الأجسام المضادة للفئران IgG.
  6. أزل محلول الانسداد باستخدام الشفط، ثم اغسل الأقسام ثلاث مرات باستخدام PBS بارد لمدة 10 دقائق لكل منها عند RT (21-23 درجة مئوية).
  7. كرر حجب BSA لمدة ساعة واحدة عند RT (21-23 درجة مئوية).
  8. حضن الأقسام التي تحتوي على الأجسام المضادة الأولية. أنوكتامين-1 (ANO1)، KIT، بيتا-توبولين من الفئة الثالثة (TUBB3) مخفف في 1٪ BSA بارد مع 0.3٪ ترايتون X-100. في تجربة منفصلة، استخدم سلسلة الميوسين الثقيلة 11 (MYH11)، وE-cadherin، وKIT. الحضانة طوال الليل (12-16 ساعة) عند 4 درجات مئوية.
  9. قم بإزالة محلول الأجسام المضادة الأساسي باستخدام شفط لطيف. اغسل الأقسام بمحلول PBS البارد ثلاث مرات لمدة 10 دقائق لكل منها عند RT (21-23 درجة مئوية).
  10. حضن الأقسام بالأجسام المضادة الثانوية. أليكسا فلور (AF) 488 مضاد ل-أرنب IgG، وIgG مضاد للفئران AF555، وIgG مضاد للماعز AF647 (جميعها عند 5 ميكروغرام/مل؛ 1:400) في 1٪ BSA لمدة ساعة واحدة عند RT (21-23 درجة مئوية).
  11. أزل محلول الأجسام المضادة الثانوي باستخدام الشفط، ثم اغسل الأقسام ثلاث مرات باستخدام PBS البارد لمدة 10 دقائق لكل منها عند RT (21-23 درجة مئوية).
  12. صبغ الأقسام بمحلول 4′,6-دياميدينو-2-فينيليندول (DAPI، عند تخفيف 1:300) لمدة ساعة واحدة عند RT (21°-23 °م).
    تحذير: عادة ما تظهر نوى الخلايا العصبية إشارات DAPI أضعف من أنواع خلايا الجهاز الهضمي الأخرى؛ يوصى بحضانة لا تقل عن ساعة واحدة للتصور الأمثل.
  13. اشطف الأقسام مرة واحدة بماء فائق النقي لإزالة الأملاح المتبقية.
  14. قم بتركيب الشرائح باستخدام تركيب Antifade Mountant.
  15. أغلقي زوايا الغطاء بطلاء أظافر غير فلوري. أزل أي وسط تركيب زائد باستخدام شفط لطيف. ثم أغلق كامل محيط الغطاء الداخلي.

3. تصوير التألق المناعي باستخدام المجهر الكونفوكلي

  1. قم بإعداد اكتساب Z-stack متعدد القنوات في برنامج التصوير الكونفوكلي عن طريق تكوين الليزر والكواشف ل DAPI وAF488 وAF555 وAF647، مما يضمن الفصل الطيفي وتجنب تشبع الإشارة.
    تحذير: قم بضبط قوة الليزر ووقت التعريض لكل فلوروفور بشكل فردي لمنع التداخل والحفاظ على الإشارة ضمن النطاق الديناميكي عبر جميع القنوات (الشكل 2A).
  2. حدد معايير التعريض في برنامج التصوير الكونفوكال لتجنب تشبع البكسل والحفاظ على تفاصيل الإشارة في المناطق عالية الشدة (الشكل 2B).
    تحذير: تأكد من بقاء الإشارات في جميع القنوات ضمن النطاق الديناميكي ولا تصل إلى التشبع.
  3. لالتقاط كامل لفة السويسرا المعدية، استخدم إعداد التقاط صورة كبير (مثل 6 × 6 حقول) (الشكل 2C); ومع ذلك، يجب تعديل هذا الإعداد بناء على الحجم العام وضيق النسيج الملفوف.
  4. احصل على صور ثلاثية الأبعاد باستخدام اكتساب سلسلة Z في برنامج التصوير الكونفوكي. يتم توضيح سير العمل التفصيلي لاكتساب N-dimension (ND) في الشكل 2D.
  5. اختر خيار Z-stack لتفعيل تصوير سلسلة Z.
  6. حدد نطاق Z بضبط وضعية البؤرة العليا والسفلية التي تشمل كامل سمك المعدة بأكملها.
  7. ضع الجزء العلوي من البطن في التركيز واضغط على زر الأعلى لضبط الحد الأعلى للعد (Z).
  8. اضبط التركيز على أسفل عضلة المعدة واضغط على زر الأسفل لضبط الحد الأدنى للجاذبية.
  9. اضبط عدد خطوات Z-stack إلى 8 لتغطي كامل عمق عضلة المعدة.
  10. انقر على Run الآن لبدء اكتساب صور Z-stack.
  11. توليد إسقاطات شديدة القصوى لقنوات الفلورة الفردية والمدمجة لعرض بيانات ثلاثية الأبعاد في صورة ثنائية الأبعاد.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

باستخدام الطريقة الجديدة، شملت لفائف المعدة السويسرية في الفأر جميع المناطق الثلاث الرئيسية للمعدة: القاع، والجسم، والأنف، إلى جانب جزء صغير من المريء والاثني عشر في قسم واحد. إدراج المعدة كاملة في قسم واحد يسمح بتحليل إقليمي شامل (الشكل 1). أظهرت صبغات الهيماتوكسيلين والإيوزين (H&E) لصور كاملة للمعدة السويسرية أظهرت بنية معدية محفوظة جيدا في جميع المناطق، مما سمح برؤية واضحة لطبقات الغشاء المخاطي وتحت المخاطية والعضلية (الشكل 3). يظهر الشكل 4 التلوين المناعي الفلوري الممثل لخلايا كاخال البينية (ICC؛ خلايا منظم ضربات القلب التي تولد موجات بطيئة إيقاعية تحت حركة الأمعاء المرحلية؛ تم تحديدها بواسطة KIT وANO1)، والعصبونات المعوية (خلايا الجهاز العصبي المعوي التي تنسق حركة الجهاز الهضمي؛ يتم تحديدها بواسطة صبغة المناعة TUBB3)، والنوى (DAPI). في الغشاء المخاطي المعدي، يعبر KIT أيضا في خلايا بانيث والكأس كما تم الإبلاغ سابقافي 9,10,11. كما يعبر عن ANO1 بشكل كبير في الظهارة المعدية، خصوصا في الخلايا الظهارية العمودية للقاع، مما يتوافق مع دوره في نقل الكلوريد وإفراز المخاط11. بالإضافة إلى ذلك، يعبر عن TUBB3 في بعض خلايا الغدد الصماء المعدية والخلايا المفرزة للمخاط، وفقا لبيانات أطلس البروتين البشري 12,13. يظهر الشكل 5 تلوينا مميزا لخلايا العضلات الملساء الموسومة ب MYH11، وخلايا الظهارة المخاطية المعدة الموسومة ب E-cadherin، وICC الموسوم ب KIT. كما يعبر عن MYH11 في الأرومات الليفية العضلية في الغشاء المخاطي المعدي، كما تم الإبلاغ عنه سابقافي 14. معا، تؤكد هذه النتائج التألق المناعي أن بروتوكولنا يحافظ على بنية الأنسجة.

الشكل 1
الشكل 1: تحضير "لف سويسري" لمعدة الفأر للتقطيع بالتجميد. (أ) يتم وضع المعدة بأكملها في طبق تشريح مغطى بالسيليكون الأسود ومملوء بمحلول ملحي بارد مخزن بالفوسفات (PBS) فور إزالته للحفاظ على سلامة الأنسجة. (ب) يفتح المعدة على طول منتصف الاثني عشر. (ج) يتم شد المعدة برفق وتثبيت داخل الطبق لتستلقي بشكل مسطح دون الحاجة إلى توتر زائد. يرسم خط أحمر متقطع على طول النسيج للدلالة على مكان قصه لتسهيل اللف. (د) يوضع المعدة المفتوحة والثابتة على ورق ترشيح مبلل ب PBS استعدادا للدرفها إلى تكوين مضغوط. السهم الأحمر يوضح اتجاه تقلب المعدة. (ه) تدمج قطع الأنسجة في مركب درجة حرارة القطع المثلى (O.C.T.) وتجمد على الثلج الجاف استعدادا للتقطيع بالتجميد. (F) تخزن الكتل المجمدة عند −80 درجة مئوية وتقطع بالتجميد بسماكة 5 ميكرومتر للتحليل اللاحق. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 2
الشكل 2: إعداد اكتساب ND وتصور التشبع أثناء تصوير Z-stack. (أ) إعدادات الليزر والكاشف المهيأة في برنامج التصوير الكونفوكالي للتصوير الطيفي متعدد القنوات. تم استخدام أربعة فلوروفورات: 4′,6-دياميدينو-2-فينيل ليندول (DAPI)، أليكسا فلور 488 (AF488)، أليكسا فلور 555 (AF555)، وأليكسا فلور 647 (AF647)، كل منها مرتبط بليزر الإثارة وكواشف الانبعاثات المقابلة. يعرض الرسم الطيفي منحنيات الإثارة والانبعاث، مما يسمح بالضبط لتقليل التداخل وتحسين اكتشاف الإشارة. (ب) يتم ضبط إعدادات التعريض بشكل فردي لكل فلوروفور لتجنب تشبع البكسل والحفاظ على التفاصيل في المناطق عالية الشدة. (ج) إعداد التقاط الصورة الكبير (مثل 6 × 6 حقل) يتيح تصور كامل لفة المعدة السويسرية؛ يجب ضبط حجم حقل الصورة حسب حجم وضغط النسيج الملفوف. (D) نافذة اكتساب ND تعرض إعدادات معلمات مكدس Z. يتم تعريف نطاق Z باختيار الوضعين العلوي والسفلي للعضلة المعدية، مع ثماني خطوات مهيأة لالتقاط العمق الكامل للأنسجة للتحليل ثلاثي الأبعاد (3D). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 3
الشكل 3: صورة لفة سويسرية من معدة الفئران الملطخة بالهيماتوكسيلين والإيوزين. يظهر مسح البلاط القدرة على تصور كامل اللف السويسري في المعدة من فأرة C57BL/6J عمرها 8 أسابيع. تشير المناطق التشريحية الرئيسية، بما في ذلك المريء (الخط الأحمر المنقط)، المصرة السفلية للمريء (خط أرجواني منقط)، قاع المريء (خط أسود منقط)، الجسم (الخط الأزرق المنقط)، الأنتروم (الخط الأخضر المنقط)، والاثني عشر (الخط المنقط البرتقالي). شريط المقياس: 1000 ميكرومتر. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 4
الشكل 4: صور كونفوكال لفافة سويسرية لمعدة فأر كاملة: ANO1، KIT، TUBB3. اللوحات العلوية: صور ممثلة مخيطة لفافة معدة سويسرية من فأر C57BL/6J أنثى عمرها 8 أسابيع، تظهر صبغة مناعة ل ANO1 (أخضر)، KIT (سماوي)، TUBB3 (أصفر)، ونوى (زرقاء). يتم تصور المعدة الملتوية بالكامل، بما في ذلك قاع القاعدة، الجسم الجسدي، والجذع الداخلي. أشرطة المقياس: 1000 ميكرومتر. اللوحات السفلية: مشاهد مكبرة للمنطقة محددة بمربع أبيض متقطع في الألواح العلوية، تبرز تفاصيل الخلايا الخلوية لخلايا كاخال (ANO1+ و KIT+؛ الأسهم الصفراء) والعصبونات المعوية (TUBB3⁺؛ الأسهم الحمراء). أشرطة المقياس: 100 ميكرومتر. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 5
الشكل 5: صور كونفوكال لفافة سويسرية لمعدة فأر كاملة: MYH11، KIT، E-cadherin. اللوحات العلوية: صور مخيطة ممثلة لفوط معدة سويسري من فأر C57BL/6J أنثى عمرها 8 أسابيع، تظهر صبغة مناعة ل MYH11 (أخضر)، KIT (سماوي)، E-cadherin (أصفر)، ونوى (زرقاء). يتم تصور المعدة الملتوية بالكامل، بما في ذلك قاع القاعدة، الجسم الجسدي، والجذع الداخلي. أشرطة المقياس: 1000 ميكرومتر. اللوحات السفلية: مشاهد مكبرة للمنطقة المحددة بالمربع الأبيض المتقطع في اللوحات العلوية. تحدد الخطوط البيضاء المنقطة الظهارة المخاطية (E-cadherin) والطبقة العضلية (MYH11). تشير الأسهم البيضاء إلى خلايا KIT+ البينية في كاخال (ICC). أشرطة المقياس: 100 ميكرومتر. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

باستخدام طريقة سويسر-رول المعدية المحسنة حديثا، يتم تضمين جميع الأجزاء الثلاثة من المعدة (قاع القاعدة، الجسم، والأنف)، إلى جانب المريء والاثني عشر، في شريحة واحدة. يتيح هذا التضمين الشامل للباحثين تحليل التغيرات الهيكلية والجزيئية في جميع أنحاء المعدة ويقلل من تكلفة التقسيم والمواد الصبغية (الشكل 1).

تعريض جميع مناطق المعدة لنفس المحاليل التلوينية في نفس الوقت أثناء التلوين المناعي يضمن الاتساق وتحسين الدقة. تلوين عضلات المعدة السويسري يكشف بوضوح عن الطبقات المميزة لجدار المعدة. كما هو موضح في الشكل 4 والشكل 5، تتيح هذه الطريقة تصور الفروق الشكلية بين أجزاء المعدة وتسمح بالكشف عن ICC (KIT و ANO1)10، الخلايا العصبية (TUBB3)15، خلايا العضلات الملساء (MYH11)، خلايا الظهارة المخاطية (E-cadherin)، والنوى.

قد يتم إجراء تعديلات طفيفة حسب حالة الأنسجة وغرض البحث. على سبيل المثال، إزالة الدهون الزائدة المثبتة يمكن أن تساعد في الحفاظ على شكل اللفة أثناء التثبيت. قد يساعد تعديل سمك المقطع أيضا في الحفاظ على بنية الأنسجة أو تحسين التصاق الشريحة بالزلاجة. من التعديلات المحتملة الأخرى استخدام قالب معدني لقطع أكثر اتساقا، كما هو الحال مع لفائف سويس16 المعاوي. على الرغم من أن هذا البروتوكول يركز على عمليات التجميد بالتبريد، إلا أنه قد يكون مناسبا للأنسجة المدمجة في البارافين. بينما يحافظ تضمين البارافين على سلامة النسيج الهيكلي، يسمح التبريد بمعالجة أسرع وحفظ أفضل للمستضدات، مما يجعله أكثر ملاءمة للتألق المناعي.

هذه الطريقة لها قيود. المعدة المتضخمة أو الليفية أو المتكلسة، التي تظهر عادة في حالات مثل الالتهاب أو السمنة أو السكري أو الشيخوخة، قد تكون أصعب في اللف وقد تشكل تحديات في التلوين الأمثل 17,18,19,20. على الرغم من هذا القيد، تقدم هذه التقنية مزايا كبيرة مقارنة بالتضمين التقليدي حسب المنطقة. معالجة جميع مناطق المعدة تحت ظروف متطابقة تحسن الاتساق، وتقلل من التباين، وتوفر الوقت والمواد الكيميائية.

يعد هذا النهج مفيدا بشكل خاص في دراسات التغيرات الخاصة بالمنطقة. كما يدعم التحليل المكاني لأنواع خلايا متعددة ويمكن قمنه مع القياس المعتمد على الصور. بشكل عام، توفر هذه الطريقة المحسنة حديثا لرول المعدة منصة عملية وقابلة للتوسع لتحليل شامل للأنسجة المعدية في الصحة والأمراض.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد دعم هذا العمل جزئيا منح المعاهد الوطنية للصحة R01 DK057061 (T.O.)، وR01 DK121766 (Y.H.)، وR01 DK126827 (T.O.)، وR01 DK131455 (T.O.)، وP30 DK084567 (مركز علم الجينوم والبيولوجيا المكانية، مركز مايو كلينك لإشارات الخلايا في أمراض الجهاز الهضمي). لم يكن لوكالات التمويل أي دور في تصميم الدراسات، أو تحليل البيانات، أو إعداد المخطوطات. المحتوى هو مسؤولية المؤلفين فقط. نشكر الدكتور دارين ج. بيكر وأعضاء مختبر الدكتور بيكر (قسم الكيمياء الحيوية وعلم الأحياء الجزيئي، مايو كلينك، روتشستر، مينيسوتا) على مشاركتهم الموارد المخبرية والدعم الفني لتلوين H&E.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
#5SF الملقطأدوات العلوم الدقيقة11252-00
مصل البقر الألبومين سيغما-ألدريتشA7906
مصدر ضوء LED من كولد فيجن MC-LSشوتMC-LS
برمجيات كونفوكال  نيكونبرنامج نيكون للتصوير البصري من NIS-Elements
XYL المصنوع من العلامة الكريوسيلإبريديدا9312-4
DAPI (4',6-دياميدينو-2-فينيليندول، ديلاكتات)ثيرمو فيشر العلميD3571
أطباق التشريح، كبيرةأنظمة الحياة   التوزيع الموسيقيوحدة الصورة: DD-90
حمار مضاد للماعز AF647 pAbتقنيات الحياةA21447المجموعة: 1739289 RRID:AB_2535864
حمار مضاد للفأر AF555 pAbتقنيات الحياةA31570اللوط: 1774719 RRID:AB_2536180
حمار مضاد للأرنب AF488 pAbتقنيات الحياةA21206العدد الكبير: 2668665 RRID:AB_2535792
كادارين (تخفيف 1:400)بكالوريوس علوم الحيوية610181المجموعة: 25510 RRID:AB_397580
إيوسينمجموعة ELITechGroup$SS-071C
الملقط المطلي بالإيبوكسيأدوات العلوم الدقيقة11210-10
الإيثانولسيغما-ألدريتش459828-4L
أنبوب مرن 1.5 ملإبندورف22364111
إسفنجيات الشاشفيشرساينتيفك22-362-178
مقص دقيق ومقوىأدوات العلوم الدقيقة14090-09
الهيماتوكسيلينإبريديا7211
مجموعة (0.2 وميكرو؛ g/mL; تخفيف 1:1000)R& دي سيستمزAF1356المجموعة: IEO0217101 RRID: AB_354750
محلول تنظيف العدسات زجاجة بخاخ سعة 1 أونصةنيكون77013066
زجاج المجهرفيشر ساينتيفك12541016
شرائح المجهركاردينال هيلثM6133A
دبابيس الدقيقةأدوات العلوم الدقيقة26002-20
MYH11 (تخفيف 1:400)التقنيات الطبية الحيويةBT-562RRID:AB_10013421
طلاء الأظافرألوان خاطئة7.33855E+11
إبرة 30 جرام × نصف بوصة  بكالوريوس علوم الحيوية305106
بارافورمالديهايدسيغما-ألدريتش158127-500G
شفرات بيرسونا ذات الحافة الواحدةشركة رايزور بليد.76247-652
حل حجب IgG من ReadyProbes بالفأرة على الفأرة (30x)ثيرمو فيشر العلميR37621المجموعة: 3226230
تركيب SlowFade Diamond Antifade (وسائط تركيب)ثيرمو فيشر العلميS36972
نظام تلوين شرائح StainTray 10سسيمبريت ساينتيفكM918-2
المجهر الستيريو 0.8x-5xنيكونSMZ645
Sucrose سيغما-ألدريتشS9378-1KG
مضخمات السطح X-100 (ترايتون X)ثيرمو فيشر العلمي28314
TMEM16A (ANO1: تخفيف 1:400)أبكامAB53212 المجموعة: GP3295656-1 RRID: AB_883075
مضرب النقلفالكون357575
TUBB3 (تخفيف 1:400)تقنية الإشارات الخلوية4466المجموعة: 5 RRID: AB_1904176
زيلينيس فيشر ساينتيفكX3P-1GAL206238

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chaudhry, S. R., Liman, M. N. P., Omole, A. E., Peterson, D. C. Anatomy, abdomen and pelvis: Stomach. , StatPearls. (2025).
  2. Sanders, K. M., Drumm, B. T., Cobine, C. A., Baker, S. A. Ca(2+) dynamics in interstitial cells: Foundational mechanisms for the motor patterns in the gastrointestinal tract. Physiol Rev. 104 (1), 329-398 (2024).
  3. Moolenbeek, C., Ruitenberg, E. J. The "Swiss roll": A simple technique for histological studies of the rodent intestine. Lab Anim. 15 (1), 57-59 (1981).
  4. Li, S., You, S., Mao, K. Protocol for multiplex immunofluorescence imaging of mouse intestinal tumors. STAR Protoc. 6 (2), 103776(2025).
  5. Bialkowska, A. B., Ghaleb, A. M., Nandan, M. O., Yang, V. W. Improved Swiss-rolling technique for intestinal tissue preparation for immunohistochemical and immunofluorescent analyses. J Vis Exp. (113), e54161(2016).
  6. Dooley, S. A., et al. Optimized protocol for intestinal Swiss rolls and immunofluorescent staining of paraffin-embedded tissue. J Vis Exp. (209), e66977(2024).
  7. Hayashi, Y., et al. Platelet-derived growth factor receptor-alpha regulates proliferation of gastrointestinal stromal tumor cells with mutations in KIT by stabilizing ETV1. Gastroenterology. 149 (2), 420-432.e16 (2015).
  8. Hayashi, Y., et al. TRP53-mediated cell cycle arrest of precursors underlies interstitial cell of Cajal depletion during aging. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 11 (1), 117-145 (2021).
  9. Rothenberg, M. E., et al. Identification of a cKit(+) colonic crypt base secretory cell that supports Lgr5(+) stem cells in mice. Gastroenterology. 142 (5), 1195-1205 (2012).
  10. Gomez-Pinilla, P. J., et al. Ano1 is a selective marker of interstitial cells of Cajal in the human and mouse gastrointestinal tract. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 296 (6), G1370-G1381 (2009).
  11. Lee, B., et al. Anoctamin 1/TMEM16A controls intestinal Cl(-) secretion induced by carbachol and cholera toxin. Exp Mol Med. 51 (8), 1-14 (2019).
  12. Uhlen, M., et al. Tissue-based map of the human proteome. Science. 347 (6220), 1260419(2015).
  13. Uhlen, M., et al. A human protein atlas for normal and cancer tissues based on antibody proteomics. Mol Cell Proteomics. 4 (12), 1920-1932 (2005).
  14. San Roman, A. K., Jayewickreme, C. D., Murtaugh, L. C., Shivdasani, R. A. Wnt secretion from epithelial cells and subepithelial myofibroblasts is not required in the mouse intestinal stem cell niche in vivo. Stem Cell Reports. 2 (2), 127-134 (2014).
  15. Drokhlyansky, E., et al. The human and mouse enteric nervous system at single-cell resolution. Cell. 182 (6), 1606-1622.e23 (2020).
  16. Jiang, Y., et al. Mapping and tracing Grem1(+) stromal cells in an Apc (Min/+) mouse utilizing cryopreserved intestinal sections prepared via modified Swiss-roll technique. iScience. 27 (11), 111173(2024).
  17. Izbeki, F., et al. Loss of Kitlow progenitors, reduced stem cell factor and high oxidative stress underlie gastric dysfunction in progeric mice. J Physiol. 588 (Pt 16), 3101-3117 (2010).
  18. Hayashi, Y., et al. Hyperglycemia increases interstitial cells of Cajal via MAPK1 and MAPK3 signaling to ETV1 and KIT, leading to rapid gastric emptying. Gastroenterology. 153 (2), 521-535.e20 (2017).
  19. Gao, F., et al. Hypoxia-inducible factor 1alpha stabilization restores epigenetic control of nitric oxide synthase 1 expression and reverses gastroparesis in female diabetic mice. Gastroenterology. 165 (6), 1458-1474 (2023).
  20. Kuro-o, M., et al. Mutation of the mouse klotho gene leads to a syndrome resembling ageing. Nature. 390 (6655), 45-51 (1997).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Swiss Roll TechniqueGastric Muscle LayersSpatial OmicsImmunofluorescence StainingMouse StomachTissue OrientationCryosection EmbeddingGastric RegionsInterstitial CellsSmooth Muscle Cells

Related Articles