مقالة منهجية

اختبار نايميخن للتواستاز: قياس فلوروجيني متزامن لتوليد الثرومبين والبلاسمين في بئر واحد

DOI:

10.3791/69701

⸱

فبراير 27, 2026

 ,  ,  ,  , 
1Department of Hematology, Radboud university medical center, 2Hemophilia Treatment Center Nijmegen-Eindhoven-Maastricht, 3Enzyre BV, Noviotech Campus, 4Department of Laboratory Medicine, Radboudumc Laboratory of Diagnostics, Radboud university medical center, 5Department of Laboratory Medicine, Laboratory of Hematology, Radboud university medical center

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول اختبار نيميغن لتحليل الدم (Nejmegen hemostasisis)، الذي يتيح قياسا متزامنا ودقيقا زمنيا لتوليد الثرومبين والبلاسمين لتوفير تقييم متكامل للتخثر والتحلل الليفي. يهدف الاختبار إلى تحسين توصيف توازن التوازن الدموي في الأبحاث والسرير، بما يتجاوز نطاق اختبارات الهيموستاتيك التقليدية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يلعب كل من الثرومبين والبلازمين دورا مركزيا في التعثر، حيث ينظمان التخثر وتحلل الفيبريني على التوالي. غالبا ما تركز اختبارات الهيموستاتيك التقليدية على المكونات المعزولة أو المراحل المحدودة من التعثر؛ على سبيل المثال، يقيم وقت الثرومبوبلاستين الجزئي المنشط وزمن البروثرومبين فقط بدء تكوين الفيبرين، بينما تقيم اختبارات نشاط العوامل وظيفة عوامل التخثر الفردية. على الرغم من قيمتها، تفتقر هذه الاختبارات إلى رؤية شاملة للعملية العامة للانفجار الدموي الثانوي والتحلل الليفي، الذي يتكشف ديناميكيا مع مرور الوقت. يعالج اختبار نيميجن للدموستاز (NHA) هذا القيد من خلال تمكين القياس المتزامن والدقيق الزمني لتوليد الثرومبين والبلاسمين في بئر واحد من الصفيحة الدقيقة. باستخدام ركائزين صناعيين مفلورين مع طيف إثارة وانبعاث مميزة وبدون تفاعل متبادل، يسمح الاختبار بقياس دقيق لكلا الإنزيمين بالتوازي. يبدأ التعقيم الدموي في بلازما فقيرة بالصفائح الدموية باستخدام عامل الأنسجة، والكالسيوم ومنشط البلازمينوجين من نوع الأنسجة، ويسجل التألق كل 30 ثانية على مدى 70 دقيقة عند 37 درجة مئوية. يتم توليد منحنيات نشاط الإنزيمات باستخدام معايير المعايرة، والتي تستمد منها معايير مثل زمن التأخير، جهد الثرومبين، وقت تحلل الفيبرين، وارتفاع ذروة البلازمين. يلتقط الاختبار بشكل موثوق توليدات الثرومبين والبلاسمين في نفس الوقت بدقة جيدة داخل الفحص وبين الاختبارات، ويكتشف تعديل التخثر والتحلل الليفي بواسطة مؤثرات مثل الهيبارين، والبروتين النشط C، وحمض إبسيلون-أمينوكابرويك. في العينات السريرية، لوحظ انخفاض كبير في إنتاج الثرومبين لدى المرضى الذين يعانون من نقص في عوامل التخثر، بينما أظهر المرضى الذين يعانون من اضطرابات تحلل الفيبراينولين مستويات أعلى من إنتاج البلازمين. من خلال دمج قياسات تولد الترومبين والبلازمين، يوفر تحليل NHA نظرة شاملة على توازن الدم النسوي يتجاوز الاختبارات التقليدية. يحمل هذا النهج المتكامل وعدا للأبحاث والتطبيقات السريرية، مثل توصيف الأنماط الظاهرية الدموية، وتقييم مخاطر النزيف والجلطة، ومراقبة التدخلات العلاجية المستهدفة. يحدد هذا البروتوكول إجراء NHA الذي يهدف إلى تعزيز فهم وتقييم توازن الهيموستاتاس.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

النزيف هو نتيجة توازن ديناميكي بين التخثر والتحلل الليفي. الثرومبين والبلازمين هما الإنزيمات الرئيسية التي تدير هذه العمليات: الثرومبين يحول الفيبرينوجين إلى فيبرين، بينما يقوم البلازمين بتحليل الفيبرين لإذابة الجلطات. اضطراب هذا التوازن قد يؤدي إلى نزيف أو أحداث تخثرية 1,2. ومع ذلك، تركز الاختبارات المخبرية المستخدمة لتقييم التعثر الدموي في الممارسة السريرية عادة على خطوات معزولة من التخثر أو التحلل الليفي، مما يوفر رؤية محدودة للتوازن الدموي العام. في المرضى الذين يشتبه في إعجابهم بالنزيف، تستخدم عادة اختبارات الفحص الروتينية مثل وقت البروثرومبين (PT) ووقت الجلطة الجزئي المنشط (aPTT) لفحص نقص عوامل التخثر. ومع ذلك، تقيس هذه الاختبارات الوقت حتى تكون الفيبرين الأولي ولا تلتقط توليد الثرومبين بعد بداية التجلط، حيث يحدث معظم نشاط الثرومبين الفسيولوجي 1,2,3. وبالتالي، قد تعطي نتائج طبيعية لدى المرضى الذين يعانون من نقص بسيط في عوامل التخثر 3,4,5,6,7,8. لتحديد هذه النواقص المحددة، تستخدم اختبارات نشاط عامل التخثر. على الرغم من أنها مفيدة للتشخيص، إلا أن هذه الاختبارات تقيم البروتينات الفردية بشكل منفصل ولا تعكس التوازن الدموي العام. نتيجة لذلك، في المرضى الذين يعانون من نقص طفيف، غالبا ما ترتبط مستويات العوامل بشكل سلبي بالنمط الظاهريللنزيف 9,10. يعقد هذا تقييم المخاطر السريرية وتحسين إدارة المرضى، بما في ذلك توقيت وجرعات العلاج، بالإضافة إلى التدخلات استجابة للأحداث النزفية التخثرية أو الشديدة. تسلط هذه القيود الضوء على الحاجة إلى اختبارات تقدم رؤية أكثر شمولا لعملية الهيموستاتيك مع مرور الوقت وقد تساعد في سد الفجوة بين نتائج المختبر والعرض السريري.

تم تطوير اختبار نيميغن للاستياء الدموي (NHA) لمعالجة هذه القيود من خلال تمكين القياس المتزامن والزمني لتوليد الثرومبين والبلاسمين في بلازما 8,9 الفقيرة بالصفائح الدموية. يستخدم ركيزتين صناعيتين مفلورتين مع طيف إثارة وانبعاث مميزة لقياس كلا الإنزيمين في نفس بئر الصفيحة الدقيقة دون تفاعل متبادل. تسمح منحنيات توليد الإنزيمات باشتقاق معلمات كمية تعكس ديناميكيات التخثر الثانوي وتحلل الفيبرينوليس، بما في ذلك زمن التأخير، ارتفاع ذروة الثرومبين، زمن تحلل الفيبرين، وارتفاع ذروة البلازمين. يوفر NHA عدة مزايا مقارنة باختبارات توليد الثرومبين الحالية، مثل اختبار التثرومبوغرام الآلي المعاير (CAT)، وCeveron s100، وST Genesia، والتي توفر معلومات قيمة عن ديناميكيات الترومبين لكنها لا تقيم النشاط الليفي 10,11,12,13. تحاليل الجلطات تلتقط جوانب من التحلل الليفي لكنها تفتقر إلى معلومات عن جيل الثرومبينالرابع عشر. وهذا يحد من فائدتها في تقييم التفاعلات المعقدة التي تحدد التوازن الدموي العام. بينما تحتوي بعض الأساليب المطورة في المختبر على قياسات جمع بين توليدات الثرومبين والبلازمين، إلا أن هذه عادة تتطلب آبارا منفصلة أو اختبارات متوازية، مما يحد من المحاذاة الزمنية ومعدل الإنتاجية15. توفر الفحوصات العالمية مثل تصوير الجلطات المرنة (TEG) والقياس المرن للجلطات الدورانية (ROTEM) معلومات تكميلية من خلال التقاط التخثر الأولي، والتخثر الثانوي، والتحلل الليفي16,17. تمثل أنظمة غرف التدفق نهجا ناشئا وتجريبيا آخر لتقييم النزيف الكلي تحت ظروف التدفق18. بينما تقدم هذه الاختبارات العالمية سياقا فسيولوجيا أوسع، إلا أنها عادة أقل حساسية لاضطرابات النزيف الخفيفة 19,20,21. من خلال قياس توليد الثرومبين والبلازمين في نفس التفاعل في نفس بئر التفاعل في نفس المناسبة، يجمع تحليل الهواء الوطني حساسية الترومبين التقليدية مع الرؤية المتكاملة للاختبارات العالمية، مما يتيح التقييم المباشر للدموستاز الثانوي، والتحلل الليفي، وتفاعلاتهما.

أظهرت اختبارات توليد الثرومبين بالفعل وعدا كبيرا للتطبيقات الانتقالية، مثل التحليل الفردي لمخاطر النزيف والجلطات ومراقبة العلاج 22,23,24,25. في الأبحاث السريرية، أظهرت الجمعية الوطنية للبلازمين انخفاضا في توليد الثرومبين لدى مرضى الهيموفيليا أ، والهيموفيليا ب، ونقص في عوامل التخثر النادرة، بالإضافة إلى زيادة إنتاج البلازمين في الحالات المسببة لفرط تحلل الفيبرينية مثل نقص ألفا-2-أنتيبلازمين26،27،28،29. كما لوحظت اختلافات في كلا المسارين لدى مرضى نقص التليف الدموي، وهو اضطراب مرتبط بالنزيف وزيادة خطر الإصابة بالجلطة. في هذه الفئة، ارتبطت مستويات الفيبرينوجين المنخفضة بانخفاض إنتاج البلازمين، ويرجح أن ذلك يعود إلى نقص مواقع ارتباط البلازمينوجين، بينما أظهر المرضى الذين لديهم تاريخ من الجلطة زيادة في إنتاج الجلطات30. بالإضافة إلى ذلك، يكشف الاختبار عن تأثيرات العوامل العلاجية، بما في ذلك مضادات التخثر، ومسجلات التخثر، ومضادات التحلل الليفية. في دراسة سابقة، اقترحنا نهجا للتوحيد القياسي والتطبيع لتحسين قابلية التكرار وتمكين مقارنة النتائج عبر الجولات والمختبرات، وهي خطوة أساسية نحو التنفيذ السريري28. يحدد هذا البروتوكول الإجراءات الكاملة والنهج التحليلي للهيئة الوطنية للتاريخ للتنفيذ في البحث السريري أو البيئات الترجمية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم إجراء جميع الإجراءات التي تشمل عينات بلازما بشرية وفقا للإرشادات المؤسسية وتمت الموافقة عليها من قبل لجنة الأخلاقيات الطبية في أرنهيم-نايميخن. تم الحصول على موافقة مكتوبة مستنيرة من جميع المتبرعين قبل جمع العينات.

1. تحضير المخازن، والكواشف، وعينات البلازما

  1. تحضير حلول المخزن المؤقت
    1. يزن 1.2 جرام تريس (p.a.) ويذوب في 180 مل من 0.9٪ NaCl.
    2. اضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.4 باستخدام HCl.
    3. ارفع الحجم النهائي إلى 200 مل مع 0.9٪ NaCl للحصول على 50 ملليمول من Tris-150 mM NaCl (TBS).
    4. قم بتقسيم ال TBS إلى أنبوبين بسعة 50 مل.
    5. استخدم ال 100 مل المتبقية من التيلاتين لتحضير المحلول المؤقت المحتوي على الكالسيوم. قم بإذابة 7.34 جرام CaCl2.2H 2O في 100 مل من TBS للحصول على عازل Tris-NaCl-CaCl2 (TBS-Ca، pH 7.4).
    6. قم بدمج TBS-Ca في أنبوبين بسعة 50 مل.
    7. خزن كلا المخازن على حرارة 4 درجات مئوية واستخدمها خلال أسبوع واحد.
  2. تحضير الركائز المفلورة
    1. قم بإذابة 53.2 ملغ من ركيزة الثرومبين (Bz-beta-Ala-Gly-Arg-AMC) في 4 مل من محلول Tris-NaCl.
      ملاحظة: يحتوي الصندوق على منشور يحتوي على شهادة تحليل. يعتمد حجم المخزن المؤقت المراد إضافته على التركيز المحدد ويجب تعديله بحيث ينتج 1 ميكرولتر من الثرومبين البشري المضاف في 120 ميكرولتر تركيزا نهائيا يبلغ 76 نانومول/لتر.
    2. أليكوت 100 ميكرولتر في أنابيب إبندورف وتخزينها عند −80 درجة مئوية.
    3. قم بإذابة كمية من الركيزة الفلوروجينية الخاصة بالثرومبين لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام. Vortex وأبق على الجليد أثناء التجربة.
    4. إذابة محتويات قارورة واحدة من ركيزة البلازمين (CBZ-L-Phe-Arg-rhodamine) في 1,955 ميكرولتر من DMSO.
      ملاحظة: يحتوي الصندوق على منشور يحتوي على شهادة تحليل. يعتمد حجم المخزن المؤقت المراد إضافته على التركيز المحدد ويجب تعديله بحيث يعطي 1 ميكرولتر من البلازمين البشري المضاف في مادة كاشفة 120 ميكرولتر تركيزا نهائيا قدره 200 نانومول/لتر.
    5. أليكوت 60 ميكرولتر في أنابيب إيبندورف ويتم تخزينها عند −80 درجة مئوية.
    6. قم بإذابة كمية من الركيزة الفلوروجينية الخاصة بالبلاسمين لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام. دوامة والحفاظ على درجة حرارة الغرفة أثناء التجربة.
      ملاحظة: هذه الركيزة تذوب في ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) ولا يجب تبريدها لتجنب الترطيب.
  3. جهز كواشف الزناد
    1. أعد تشكيل السيفالين المحمول بالليوفيل بإضافة 1 مل من الماء المقطر. دوامة تماما حتى تذوب تماما.
      ملاحظة: يعاد تكوين السيفالين لتوفير الفوسفوليبيدات، وهي ضرورية لتحفيز تفاعلات تخثر متعددة تمكن من التخثر الفسيولوجي المرتبط في الاختبار.
    2. أليكوت 60 ميكرولتر في أنابيب إبندورف (كافية ل 20 بئرا) وتخزن عند −20 درجة مئوية.
    3. قم بإذابة العليكوت قبل الاستخدام واحتفظ به على الثلج. دوامة قصيرة قبل أن تنفجر بالمشاة.
    4. إعادة تكوين محتويات قارورة واحدة من عامل الأنسجة البشرية المؤتلفة (TF) في 4 مل من الماء المقطر.
    5. أليكوت 60 ميكرولتر في أنابيب إيبندورف ويتم تخزينها عند −80 درجة مئوية.
    6. قم بإذابة جزء من TF وVortex لفترة وجيزة.
    7. جهز تخفيفا بنسبة 1:500 من TF بواسطة تخفيف متسلسل:
      1. أضف 6 ميكرولتر من TF إلى 54 ميكرولتر من TBS المخزن. دوامة.
      2. خذ 6 ميكرولتر من هذا التخفيف وأضف إلى 54 ميكرولتر من الدوامة التيبينية (TBS).
      3. خذ 20 ميكرولتر من هذا التخفيف الثاني وأضيف إلى 80 ميكرولتر من التيبراين لتصل إلى تركيز نهائي 0.28 بينومل. دوامة.
    8. إعادة تكوين محتويات قارورة واحدة (20 ملغ) من منشط البلازمينوجين النسجي (tPA) في 20 مل من الماء المقطر للحصول على تركيز نهائي يبلغ 580,000 وحدة دولية/مل (تحقق من تركيز الدفعة المحددة).
    9. أليكوت 50 ميكرولتر في أنابيب إبندورف وتخزينها عند −80 درجة مئوية.
    10. قم بإذابة مقتبس من tPA ودوامة لفترة وجيزة.
    11. تحضير تخفيف بنسبة 1:50 من tPA بإضافة 20 ميكرولتر من tPA إلى 980 ميكرولتر من مخزن Tris-NaCl، ليصل إلى تركيز نهائي يبلغ 11,600 وحدة دولية/مل. دوامة.
  4. تحضير عينات البلازما
    1. اجمع الدم الوريدي في أنابيب سترات بحجم 3 مل تحتوي على 3.2٪ سترات، مع ضمان جمع لا يقل عن 2.7 مل (90٪ ملء).
    2. لا تستخدم الأنبوب الأول بعد التبخير الوريدي؛ تخلص منه لتجنب التنشيط بواسطة عامل الأنسجة.
    3. اقلب الأنبوب على الأقل 10 مرات مباشرة بعد الجمع.
    4. الطرد المركزي خلال ساعتين على درجة حرارة الغرفة، أولا عند 2500 × جرام لمدة 5 دقائق، تليها 10000 × جرام لمدة 10 دقائق.
    5. استخدم ماصة ذات مرة واحدة لجمع البلازما فوق طبقة الخلية مباشرة.
    6. ادمج البلازما في الكريوفيات الموسومة، ثم تجميده السريع في النيتروجين السائل، وتخزينه عند −80 درجة مئوية.
      ملاحظة: تأكد من أن العينة خالية من الجلطات. استخدم فقط البلازما الطازجة أو التي تذوب مرة واحدة. أنبوب CTAD واحد يكفي لتحليل التكرار.

2. إعداد الأجهزة وإعداد البرمجيات

  1. جهز قارئ لوحة الفلورة
    1. شغل قارئ الألواح ودعه يتوازن إلى 37 درجة مئوية.
    2. اضبط المعايير الأساسية التالية:
      1. غرينر 96-بئر، مسطح القاع، أسود.
      2. الإعدادات العامة: تأخير التموضع: 0.1 ثانية؛ عدد النوافذ الحركية: 1.
      3. النافذة الحركية: عدد الدورات: 140؛ وقت بدء القياس: 0.0 ثانية؛ عدد الوميضات لكل بئر في كل دورة: 10؛ مدة الدورة: 30 ثانية.
      4. البصرية: البصرية العليا
      5. إعدادات الفلتر: عدد الصبغات أحادية اللون: 2. مرشح الإثارة: 355 نانومتر للثرومبين؛ 485 نانومتر للبلازمين. فلتر الانبعاث: 460 نانومتر للثرومبين، 520 نانومتر للبلازمين. التقدم: 600.
    3. حدد التخطيط بحيث يكون الحد الأقصى 20 بئرا لكل لوحة.
    4. انتقل إلى التركيزات/الأحجام/الاهتزاز وتأكد من الإعدادات التالية. المضخة 1 = 20 ميكرولتر؛ المضخة 2 = 0 ميكرولتر؛ السرعة = 420 ميكرولتر/ثانية.
  2. جهز نظام الحقن
    1. قم بإزالة وإبر الحقن واغسبها في وعاء مع حاجز.
    2. اضبط حجم الشطف على 2,500 ميكرولتر وشطف المضخات بمحلول Tris/NaCl بدرجة 37 °م.
    3. أعد ضبط حجم الشطف إلى 500 ميكرولتر.

3. إعداد الاختبار بصيغة الميكروبليت

  1. إعداد هزاز الميكروبليت
    1. اضبط جهاز هزاز الميكرولوح على 37 درجة مئوية وتحقق من درجة الحرارة قبل الاستخدام.
    2. اضبط شدة الاهتزاز على 1100 دورة في الدقيقة.
    3. استخدم هذا الهزاز في جميع خطوات الخلط في الاختبار لضمان توزيع الكواشف المتجانسة والنشاط الإنزيمي المتسق.
  2. أضف المواد الكيميائية إلى الآبار
    1. قم بإذابة بلازما المريض والبلازما المجمعة الطبيعية (NPP) في حمام ماء بدرجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة تصل إلى 10 دقائق.
    2. اخلط جيدا وتحقق من الذوبان الكامل (بدون تجميد التبريد).
    3. أضف 80 ميكرولتر من بلازما المريض أو NPP إلى الآبار المختارة مسبقا. استخدم رأس ماصة جديد لكل عينة.
      ملاحظة: أدرج عينة NPP في كل اختبار لأخذ في الاعتبار التباين بين الجولات (انظر المزيد في الخطوة 5.6).
    4. أضف 2 ميكرولتر من السيفالين.
    5. أضف 2 ميكرولتر من عامل الأنسجة (تخفيف 1:500). اخلط لفترة وجيزة باستخدام هزة الطبق.
    6. أضف 10 ميكرولتر من مخزن Tris-NaCl. اخلط لفترة وجيزة باستخدام هزة الطبق.
    7. أضف 4 ميكرولتر من ركيزة الثرومبين.
    8. أضف 2 ميكرولتر من ركيزة البلازمين. اخلط لفترة وجيزة باستخدام هزة الطبق.
  3. ما قبل الحضانة
    1. أدخل الميكروبلويت في قارئ اللوحة.
    2. اترك الطبق يتوازن عند 37 درجة مئوية لعدة دقائق.

4. تحضير وحقن مادة البداية

  1. جهز المادة الكيميائية للمضخة 1
    1. اجمع بين 672 ميكرولتر من مخزن Tris/NaCl، و192 ميكرولتر من مخزن Tris/NaCl/CaCl₂، و96 ميكرولتر من tPA (من الخطوة 1.2.5). فورتكس تماما.
    2. اثقب ثقبين في غطاء أنبوب الكواشف.
    3. أدخل أنبوب المضخة من خلال فتحة واحدة إلى أسفل الأنبوب.
  2. الفحص الأساسي وبدء الفحص
    1. استخدم البرنامج لتحضير المضخة ب 500 ميكرولتر من المادة الكيميائية.
    2. أعد إدخال إبر الحقن في أماكنها المحددة.
    3. ابدأ فورا بقياس الفلورة.
  3. بدء الفحص يدويا
    ملاحظة: يوفر هذا الإجراء اليدوي بديلا لسير عمل الحقن الآلي الموضح في الخطوات 2.2 و4.1 و4.2.
    1. جهز الكاشف الابتدائي كما هو موضح في 4.1.1 مباشرة قبل الاستخدام.
    2. قم بإزالة الميكرولوح من قارئ الألواح وأضف بسرعة 20 ميكرولتر من مادة البداية يدويا إلى كل بئر باستخدام ماصة معايرة أو ماصة متعددة القنوات لمعالجة أسرع.
    3. أعد اللوح فورا إلى القارئ وابدأ قياس الفلورة دون تأخير.
      ملاحظة: تقليل الوقت بين إضافة الكواشف وبدء القياس (<10 ثوان لكل صف) لتقليل التباين.
  4. قراءة الحركة
    1. سجل الفلورة كل 30 ثانية لمدة 70 دقيقة.
    2. حافظ على اللوحة عند 37 درجة مئوية أثناء القياس.

5. تحليل البيانات

  1. جهز البيانات للتحليل
    1. تصدير بيانات الفلورة الحركية من قارئ الألواح كجدول يحتوي على نقاط زمنية وقيم فلورية لكل بئر.
    2. تحويل بيانات التألق الخام إلى منحنيات توليد الإنزيمات عن طريق حساب المشتقة الأولى باستخدام Excel أو برنامج آخر.
    3. رسم منحنيات توليد الإنزيمات لكل بئر لرؤية التفاعل الإنزيمي.
      ملاحظة: تمثل هذه المنحنيات معدل توليد الثرومبين أو البلازمين مع مرور الوقت وتتوافق مع الناتج الرسومي الموضح في الصور.
  2. تحليل منحنيات توليد الثرومبين
    1. حدد المعلمات التالية من منحنى توليد الثرومبين (انظر الشكل 1):
      1. وقت التأخير: النقطة الزمنية التي يرتفع فيها منحنى توليد الثرومبين باستمرار ويصل إلى 8٪ من ارتفاع ذروة الثرومبين.
      2. ارتفاع ذروة الثرومبين: أقصى قيمة إشارة على المحور y (أي أقصى معدل توليد للثرومبين).
      3. وقت ذروة الثرومبين: الفترة من بداية الاختبار حتى ارتفاع ذروة الثرومبين.
      4. جهد الثرومبين (المساحة تحت منحنى توليد الثرومبين): المساحة تحت المنحنى من زمن التأخير حتى عودة إشارة الثرومبين إلى الوضع الأساسي.
        ملاحظة: يعكس جهد الثرومبين القدرة الإجمالية لتوليد الثرومبين للعينة تحت ظروف الاختبار.
  3. تحليل منحنيات توليد البلازمين
    1. حدد المعلمات التالية من منحنى توليد البلازمين (انظر الشكل 2):
      1. زمن تحلل الفيبرين: هو الوقت من بداية توليد البلازمين (أي النقطة الزمنية التي يرتفع فيها منحنى توليد البلازمين باستمرار ويصل إلى 8٪ من ارتفاع ذروة البلازمين) حتى النقطة التي يصل عندها إلى ذروة البلازمين.
      2. ارتفاع ذروة البلازمين: الحد الأقصى المميز الأول في المنحنى، الذي يتوافق مع الانفجار الأولي في توليد البلازمين، يحدد عند النقطة التي يصل فيها المشتق الثاني لمنحنى توليد البلازمين (بناء على متوسط متحرك مدته ثلاث دقائق) إلى الصفر بعد بدء توليد البلازمين.
      3. جهد البلازمين (المساحة تحت منحنى توليد البلازمين): المساحة تحت المنحنى من بداية توليد البلازمين وحتى وقت ذروة البلازمين.
        ملاحظة: تحدث تقلبات الإشارة بعد ذروة البلازمين الأولية، ولا تدرج في تحليل معلمات توليد البلازمين.
  4. استخراج المعلمات يدويا أو باستخدام برامج مخصصة
    1. استخدم Microsoft Excel أو GraphPad Prism أو سكريبت مخصص (مثل بايثون أو R) لاستخراج المعلمات الحركية.
    2. احفظ البيانات الخام، والمنحنيات المرسومة، والمعاملات المحسوبة بصيغة منظمة للأرشفة والرجوع إليها مستقبلا.
      ملاحظة: إذا كنت تستخدم الماكروز، تحقق من صحة جميع المعلمات بصريا ويدويا قبل الاعتماد على الإخراج الآلي. الماكرو الخاص بنا لتحويل البيانات متاح عند الطلب.
  5. التوحيد والتطبيع
    1. إنشاء مرجع فسيولوجي بقياس 40 عينة فردية من متبرعين أصحاء بالتوازي مع عينة NPP المستخدمة للتطبيع. قم بهذه الخطوة مرة واحدة لكل دفعة من ال NPP.
    2. احسب متوسط قيم معلمات توليد الثرومبين والبلاسمين للمتبرعين الأصحاء، وحدد نسبتها إلى قيم NPP المقابلة التي تم الحصول عليها في نفس التشغيل.
    3. لكل عينة مريض في تجربة معينة، أولا قم بتطبيع معامل توليد الثرومبين أو البلاسمين إلى قيمة NPP المقاسة في نفس التشغيل.
    4. اقسم هذه النتيجة على نسبة المتبرع إلى التيار الوطني الحيوي السليمة التي تم تحديدها سابقا لنفس دفعة الخطة (انظر الخطوة 5.6.2). هذا يعطي قيمة نسبية موحدة للفرد السليم المتوسط، مع توحيد التغيرات بين الجولات باستخدام NPP.
    5. تعبير عن قيم المعلمات كنسب مئوية بالنسبة لمتوسط قيمة الأفراد الأصحاء (المعرفة بأنها 100٪). قدم نتائج عينة المرضى وفقا لذلك.
      ملاحظة: يتم حساب قيم المعلمات النسبية لكل عينة فردية من المرضى باستخدام الصيغة التالية، حيث تشير الجولة a إلى قياس عينة المريض، والجولة b تشير إلى الجولة المرجعية التي تم فيها قياس عينات المتبرعين الأصحاء بالتوازي مع نفس دفعة NPP. ملف Excel الخاص بنا الذي يحتوي على حسابات تطبيع البيانات متاح عند الطلب.
      figure-protocol-1

6. توليد منحنيات المعايرة

  1. جهز منحنى معايرة الثرومبين
    1. أعد تشكيل α الترومبين البشري المسبب لليوفيلية كما هو موضح في ورقة بيانات الشركة المصنعة.
      ملاحظة: على سبيل المثال، إذا حددت ورقة البيانات إعادة التكوين في ماء بسعة 100 ميكرولتر لإنتاج 3.34 ملغ/مل، فإن هذا يعادل 0.334 ملغ في 100 ميكرولتر.
    2. قم بتخفيف الثرومبين المعاد تشكيله بنسبة 1:10 في مخزن Tris/NaCl.
      ملاحظة: ينتج عن ذلك تركيز مخزون يقارب 9.1 نانومول/مل (0.0091 نانومول/ميكرولتر)، بناء على وزن جزيئي يبلغ 36,700 جرام/مول.
    3. جهز سلسلة تخفيف في مخزن تريس/NaCl لتحقيق تركيزات نهائية للثرومبين في الاختبار تتراوح من 0 إلى 152 نانومول/لتر.
    4. ثرومبين البيبيت في آبار مختارة تحتوي بالفعل على المخزن المؤقت ليصل إلى حجم إجمالي يبلغ 100 ميكرولتر لكل بئر.
    5. تحضير محلول الركيزة للمضخة 1 بخلط 300 ميكرولتر من مخزن Tris/NaCl مع 200 ميكرولتر من ركيزة الثرومبين من الخطوة 1.2.2.
    6. يمكن تخفيف هذا المحلول أكثر بدمج 400 ميكرولتر من الخليط مع 360 ميكرولتر من مخزن Tris/NaCl.
    7. أضف 20 ميكرولتر من هذا الخليط إلى كل بئر معايرة، ليصل إجمالي حجم الاختبار إلى 120 ميكرولتر.
    8. اخلط اللوحة بلطف وأدخلها في قارئ اللوحة. شغل الاختبار الحركي لمدة 25 دورة باستخدام نفس إعدادات الفلورة الموضحة في القسم 2.
    9. تصدير بيانات الفلورة الخام وتحديد الميل الأولي (معدل زيادة الفلورة لكل دورة) لكل تركيز من الثرومبين باستخدام برنامج GraphPad Prism أو برنامج مكافئ.
    10. قم بإنشاء منحنى قياسي عن طريق رسم الميل الابتدائي مقابل تركيز الثرومبين.
      ملاحظة: تأكد من أن جميع المخازن المدمنة تسخن مسبقا إلى 37 درجة مئوية وتعامل مع الإنزيمات على الثلج. حضر دائما مخففات طازجة وامزج جيدا. يستخدم المنحنى القياسي الناتج لحساب النشاط النسبي للثرومبين في عينات غير معروفة باستخدام الماكرو الموضح في القسم 5.
  2. إعداد منحنى معايرة البلازمين
    1. إعادة تكوين البلازمين المحمية بالليوفيل في الماء المقطر (مثلا 0.543 مل) وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
      ملاحظة: وزن البلازمين الجزيئي 75,400 جم/مول. تركيز المخزون الناتج هو حوالي 24.3 نانومول/مل (0.024 نانومول/ميكرولتر)، بافتراض 1 ملغ في 0.543 مل.
    2. جهز سلسلة تخفيف في مخزن تريس/NaCl لتحقيق تركيزات نهائية للبلازمين في الاختبار تتراوح بين 66 إلى 532 نانومول/لتر.
    3. يتم تحويل البلازمين إلى آبار تحتوي على مخزن Tris/NaCl للوصول إلى حجم نهائي يبلغ 100 ميكرولتر لكل بئر.
    4. تحضير محلول الركيزة للمضخة 1 عن طريق خلط 680 ميكرولتر من محلول تريس/NaCl مع 80 ميكرولتر من ركيزة البلازمين/الرودامين (مخففة مسبقا بنسبة 1:1 إذا لزم الأمر) من الخطوة 1.2.5.
    5. أضف 20 ميكرولتر من محلول الركيزة هذا إلى كل بئر معايرة، ليصبح الحجم الكلي 120 ميكرولتر.
    6. اخلط اللوحة بلطف وأدخلها في قارئ اللوحة. شغل الاختبار الحركي لمدة 25 دورة باستخدام نفس إعدادات الفلورة الموضحة في القسم 2.
    7. تصدير بيانات الفلورة الخام وتحديد الميل الأولي لزيادة الفلورة لكل تركيز بلازمين عن طريق تطبيق الانحدار الخطي على الطور الخطي للمنحنى الحركي باستخدام منشور GraphPad أو برنامج مكافئ.
    8. توليد منحنى قياسي عن طريق رسم الميل الابتدائي مقابل تركيز البلازمين.
      ملاحظة: بسبب التفاوت في نشاط البلازمين من دفعة إلى أخرى، يجب تكرار المعايرة مع كل دفعة جديدة. إذا لوحظ نشاط مرتفع بشكل غير متوقع، يوصى بتخفيف المخزون بنسبة 1:2 قبل تحضير سلسلة المعايرة.
  3. استخدم منحنى المعايرة للقياس التكميمي
    1. استخدم منحنيات المعايرة المولدة في القسم 6 لتحويل قيم ميل الفلورة إلى نشاط إنزيمي نسبي.
    2. استخدم فقط الجزء الخطي من منحنى المعايرة لاستيفاء العينات المجهولة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تظهر منحنيات تولد الثرومبين والبلاسمين التمثيلية التي تم الحصول عليها باستخدام اختبار نيميجن للدم (NHA) في الشكل 3. يتم التعبير عن شدة الإشارة في كل منحنى كنسبة مئوية بالنسبة للعينة الطبيعية المقاسة في نفس الوقت للبلازما المجمعة (NPP). يتم تضمين عينة تحتوي على NPP في كل جولة كأداة تحكم داخلية للتحقق من صحة التحليل وضمان قابلية المقارنة بين الجولات.

يعرض الشكل 3A,B نتائج من ثلاثة عناصر...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

اختبار نيميجن للاستياء الدموي (NHA) هو اختبار فلوروجيني مزدوج الإنزيم يتيح القياس المتزامن والزمني لتوليد الثرومبين والبلاسمين في بلازما فقيرة بالصفائح الدموية. من خلال التقاط العمليتين في بئر واحد، تسهل الطريقة التحليل الحركي عالي الدقة للانفجار الدموي الثانوي والتحلل الليفي. يقدم هذا القراءة المزدوجة مزايا منهجية واضحة مقارنة بالاختبارات التقليدية، وقد تم تطبيقه بنجاح في دراسة نقص عوامل التخثر، وحالات فرط التحلل الليفي، واضطرابات أخرى في توازن الدم.

تعد هناك...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

دبليو. إل. فان هيردي هو مؤسس وموظف في شركة إنزاير بي في وشريك في مالك شركة فان هيرد هولدينغ بي في، وهي مساهم في إنزاير. حصلت إنزاير على تمويل للأبحاث التعاقدية من تاكيدا ونوفو نورديسك. كما تلقى دبليو. إل فان هيردي دعما لمنح السفر من SOBI وCAF-DCF. المؤلفون الباقون يعلنون عدم وجود مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أجريت هذه الدراسة وفقا لأهداف يوروببلودنت.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
<قوي>مواد
كلوريديديهيدرات الكالسيوم (CaCl2.2H2O)ميرك1.02382
سيفالين (مجموعة كاشف C.K. Prest 5 APTT)ستاجو00847مستقرة لمدة 6 أشهر عند -20 درجة مئوية  
الماء المقطرسجل تاريخ الافتتاح. استخدمها خلال يوم واحد بعد الفتح الأول.
ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO)ميرك1.02950.0500
ألفا-ثرومبين بشريمختبرات أبحاث الإنزيماتHT 1002aيحتوي الصندوق على منشور يحتوي على شهادة تحليل. حجم المخزن المراد إضافته يعتمد على التركيز المحدد ويجب تعديله بحيث 1 وميكرو؛ L من زيادة الثرومبين البشري بمقدار 120 وميكرو؛ ينتج كاشف L تركيزا نهائيا قدره 76 نانومول/لتر.
البلازمين البشريمختبرات أبحاث الإنزيماتHPlasيحتوي الصندوق على منشور يحتوي على شهادة تحليل. حجم المخزن المراد إضافته يعتمد على التركيز المحدد ويجب تعديله بحيث 1 وميكرو؛ لتر من إضافة بلازمين بشري بحجم 120 وميكرو؛ ينتج عن مادة L تركيزا نهائيا قدره 200 نانومول/لتر.
البلازما المجمعة العاديةالتحضير الداخليغير قابل للتطبيقثابت لمدة 3 ساعات بعد الذوبان إذا بقي في الثلج.
بلازما المريضغير قابل للتطبيقغير قابل للتطبيق
ركيزة البلازمين (CBZ-L-فينيل ألانيل-إل-أرجينين أميد)-رودامين-مورفولينو يورياسيميرسمستقر لمدة 6 أشهر عند -80 درجة مئوية  
عامل الأنسجة البشرية المؤتلف: Innovinداد بيرينغB4212مستقر لمدة 6 أشهر عند -80 درجة مئوية  
منشط البلازمينوجين من نوع الأنسجة المؤتلفة (tPA): ألتيبلاز/أكتيليزبويرغر إنغلهايممستقر لمدة 12 شهرا عند -80 درجة مئوية  
تريس(هيدروكسيل ميثيل)أمينوميثان (H2NC(CH2OH)3)ميرك1.08382.2500
مخزن Tris-NaCl، الرقم الهيدروجيني 7,4 (TBS)التحضير الداخليغير قابل للتطبيق
تريس-ناكل-كاكل2 الخازن، الرقم الهيدروجيني 7,4 (TBS-Ca)التحضير الداخليغير قابل للتطبيق
ركيزة الثرومبين Bz-beta-Ala-Gly-Arg-7-amino-4-methylcoumarinسيميرسمستقر لمدة 6 أشهر عند -80 درجة مئوية  
<قوي>معدات
فلوريمتر Fluostar Optima / قارئ الميكروبليت مع التحكم في درجة الحرارة وحقن الكواشفبي إم جي لاب تك
صفيحة ميكروتيتر بسعة 96 بئر، بوليسترين، سطح اتصال متوسط القاع المسطح، الأسود (ما يعادل الميكرولون)غراينر بيو-ون655076
التوازن التحليلي (توازن التحميل العلوي)
رؤوس الماصة الزرقاء (ل 100-1000 وميكرو؛ L)
أنابيب جمع الدم من السترات 3 مل (3.2٪ سترات)بي دي فاكوتينر
دلو الثلج
آلة الثلج
الحاضنة / هز الألواح الصغيرة
التحريك المغناطيسي
رف أنابيب الطرد المركزي الدقيق
أنابيب الطرد المركزي الدقيق القابلة للإغلاق
مقياس الرقم الهيدروجيني
أطراف بيبيت 0.1-10 وميكرو؛ L، غير عقيم
البيبتات (2، 10، 20، 100، و1000 وميكرو؛ L)
مفك البراغي (يستخدم كمسبار)
خلاط الأنابيب
حمام مائي
رؤوس الماصة الصفراء (ل20-200 وميكرو؛ L)

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chapin, J. C., Hajjar, K. A. Fibrinolysis and the control of blood coagulation. Blood Rev. 29 (1), 17-24 (2015).
  2. Furie, B. Pathogenesis of thrombosis. Hematology. 2009 (1), 255-258 (2009).
  3. Teruya, J., et al. A normal aPTT does not guarantee adequate coagulation factor levels. Anesthesiology. 94 (3), 542(2001).
  4. Puetz, J., Hugge, C., Moser, K. Normal aPTT in children with mild factor XI deficiency. Pediatr Blood Cancer. 65 (4), pbc.26910(2018).
  5. Toulon, P., et al. In vitro sensitivity of different activated partial thromboplastin time reagents to mild clotting factor deficiencies. Int J Lab Hematol. 38 (4), 389-396 (2016).
  6. Massignon, D., et al. Prothrombin time sensitivity and specificity to mild clotting factor deficiencies of the extrinsic pathway:evaluation of eight commercial thromboplastins. Thromb Haemost. 75 (4), 590-594 (1996).
  7. Burns, E. R., et al. Paradoxic effect of multiple mild coagulation factor deficiencies on the prothrombin time and activated partial thromboplastin time. Am J Clin Pathol. 100 (2), 94-98 (1993).
  8. van Geffen, M., et al. A novel hemostasis assay for the simultaneous measurement of coagulation and fibrinolysis. Hematology. 16 (6), 327-336 (2011).
  9. van Geffen, M., et al. Pharmacodynamics of recombinant activated factor VII and plasma-derived factor VII in a cohort of severe FVII deficient patients. Thromb Res. 132 (1), 116-122 (2013).
  10. Hemker, H. C., et al. The calibrated automated thrombogram (CAT):a universal routine test for hyper- and hypocoagulability. Pathophysiol Haemost Thromb. 32 (5-6), 249-253 (2002).
  11. Kristensen, S. R., et al. Thrombin generation measured on ST Genesia, a new platform in the coagulation routine lab:assessment of analytical and between-subject variation. Res Pract Thromb Haemost. 6 (1), e12654(2022).
  12. Hemker, H. C., Béguin, S. Phenotyping the clotting system. Thromb Haemost. 84 (5), 747-751 (2000).
  13. Tripodi, A. Thrombin generation assay and its application in the clinical laboratory. Clin Chem. 62 (5), 699-707 (2016).
  14. Valke, L., et al. Fibrinolytic assays in bleeding of unknown cause:improvement in diagnostic yield. Res Pract Thromb Haemost. 6 (2), e12681(2022).
  15. van Geffen, M., van Heerde, W. L. Global haemostasis assays, from bench to bedside. Thromb Res. 129 (6), 681-687 (2012).
  16. Luddington, R. J. Thrombelastography/thromboelastometry. Clin Lab Haematol. 27 (2), 81-90 (2005).
  17. Hartmann, J., et al. Viscoelastic testing:an illustrated review of technology and clinical applications. Res Pract Thromb Haemost. 7 (1), 100031(2023).
  18. Schoeman, R. M., et al. Flow chamber and microfluidic approaches for measuring thrombus formation in genetic bleeding disorders. Platelets. 28 (5), 463-471 (2017).
  19. Bavinck, A. P., et al. Viscoelastic testing in patients with very rare bleeding disorders of secondary hemostasis:a scoping review. Thromb Res. 2025, 109449(2025).
  20. Mansouritorghabeh, H., et al. The utility of total thrombus-formation analysis system (T-TAS) in the thrombosis and hemostasis field:a scoping review. Int J Lab Hematol. 47 (2), 201-211 (2025).
  21. Lecchi, A., et al. Flow-chamber device (T-TAS) to diagnose patients suspected of platelet function defects. Blood Transfus. 22 (1), 55-64 (2024).
  22. Zekavat, O. R., et al. Comparison of thrombin generation assay with conventional coagulation tests in evaluation of bleeding risk in patients with rare bleeding disorders. Clin Appl Thromb Hemost. 20 (6), 637-644 (2014).
  23. Brummel-Ziedins, K. E., et al. Thrombin generation and bleeding in haemophilia A. Haemophilia. 15 (5), 1118-1125 (2009).
  24. Al Dieri, R., et al. Thrombin generation:what have we learned. Blood Rev. 26 (5), 197-203 (2012).
  25. Binder, N. B., et al. Clinical use of thrombin generation assays. J Thromb Haemost. 19 (12), 2918-2929 (2021).
  26. Verhagen, M. J. A., et al. In patients with hemophilia, a decreased thrombin generation profile is associated with a severe bleeding phenotype. Res Pract Thromb Haemost. 7 (2), 100062(2023).
  27. Haisma, B., et al. Enhanced thrombin and plasmin generation profiles in alpha-2-antiplasmin-deficient patients:data from the Rare Bleeding Disorders in the Netherlands study. Res Pract Thromb Haemost. 8 (7), 102604(2024).
  28. Haisma, B., et al. Comparative analysis of thrombin generation platforms for patients with coagulation factor deficiencies:a comprehensive assessment. Thromb Res. 240, 109045(2024).
  29. van Geffen, M., et al. Retrospective evaluation of bleeding tendency and simultaneous thrombin and plasmin generation in patients with rare bleeding disorders. Haemophilia. 18 (4), 630-638 (2012).
  30. Haisma, B., et al. genotype, and laboratory assessment of congenital fibrinogen disorders:data from the Rare Bleeding Disorders in the Netherlands study. Thromb Res. 249, 109317(2025).
  31. Bouma, B. N., Meijers, J. C. Thrombin-activatable fibrinolysis inhibitor (TAFI, plasma procarboxypeptidase B, procarboxypeptidase R, procarboxypeptidase U). J Thromb Haemost. 1 (7), 1566-1574 (2003).
  32. Marx, P. F. Thrombin-activatable fibrinolysis inhibitor. Curr Med Chem. 11 (17), 2335-2348 (2004).
  33. Rijken, D. C., Lijnen, H. R. New insights into the molecular mechanisms of the fibrinolytic system. J Thromb Haemost. 7 (1), 4-13 (2009).
  34. Depasse, F., et al. Thrombin generation assays are versatile tools in blood coagulation analysis:a review of technical features, and applications from research to laboratory routine. J Thromb Haemost. 19 (12), 2907-2916 (2021).
  35. Subcommittee on Control of Anticoagulation of the SSC of the ISTH. Towards a recommendation for the standardization of the measurement of platelet-dependent thrombin generation. J Thromb Haemost. 9 (9), 1859-1861 (2011).
  36. Duarte, R. C. F., et al. Standardization and evaluation of the performance of the thrombin generation test under hypo- and hypercoagulability conditions. Hematol Transfus Cell Ther. 41 (3), 244-252 (2019).
  37. Dargaud, Y., et al. Effect of standardization and normalization on imprecision of calibrated automated thrombography:an international multicentre study. Br J Haematol. 139 (2), 303-309 (2007).
  38. Ninivaggi, M., et al. Recommendations for the measurement of thrombin generation:communication from the ISTH SSC Subcommittee on Lupus Anticoagulant/Antiphospholipid Antibodies. J Thromb Haemost. 19 (5), 1372-1378 (2021).
  39. Duchemin, J., et al. Influence of coagulation factors and tissue factor concentration on the thrombin generation test in plasma. Thromb Haemost. 99 (4), 767-773 (2008).
  40. Miszta, A., et al. A high-fat diet delays plasmin generation in a thrombomodulin-dependent manner in mice. Blood. 135 (19), 1704-1717 (2020).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة