مقالة منهجية

إجراء خطوة بخطوة لإنتاج الكيميرا الجرثومية في الدجاج عبر زراعة الخلايا الجرثومية البدائية

DOI:

10.3791/69704

⸱

ديسمبر 5, 2025

 ,  , 
1Department of Agricultural Biotechnology and Research Institute of Agriculture and Life Sciences, Seoul National University, 2Department of International Agricultural Technology & Institute of Green Bioscience and Technology, Seoul National University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكيميرا الجرثومية في الطيور، التي تولد من زراعة الخلايا الجرثومية البدائية (PGCs) في الأجنة المستلمة، تتيح التطبيقات في التحويل الجوي، وتحرير الجينات، وحفظ الأنواع. يوضح هذا البروتوكول إجراءات عزل PGC، وتوسيع المختبر ، والحقن الدقيق، والتحقق من المتبرعين، مما يوفر منصة موثوقة لإنتاج الكيميرا الجرثومية وتطوير التكنولوجيا الحيوية للطيور.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوفر توليد الكيميرا الجرثومية في الدجاج عبر زراعة الخلايا الجرثومية البدائية (PGCs) منصة قوية وقابلة للتكاثر لعملية التحول الطيوري، وتحرير الجينوم، وحفظ الأنواع. الأساليب التقليدية التي تستخدم خلايا الأريمة الجلدية من أجنة المرحلة X في EGK محدودة بانخفاض كفاءة نقل الخط الجرثومي بسبب الانفصال المبكر في السلالات الخلوية. وعلى النقيض من ذلك، تستغل استراتيجيات PGC الكفاءة الجرثومية الجوهرية لهذه الخلايا وحيدة القدرة، مما يتيح دمجاها بشكل موثوق في الغدد التناسلية المستقبلة. هنا، نقدم بروتوكولا خطوة تدريجيا لعزل الخلايا البضيضة من الأجنة في المرحلة 26-28 من مرحلة HH، والحفاظ عليها وتوسيعها في المختبر، وزرعها في الشريان الأبهر الظهري للأجنة المستلمة من المرحلة 14-17 من HH. يتم مراقبة الزرع قصير الأمد باستخدام علامات فلورية مثل PKH26، بينما يتم تأكيد مساهمة الخط الجرثوتي طويل الأمد من خلال تحليل PCR للغدد التناسلية المتلقية. يضمن هذا النهج تولدا متسقا للكيميرا الجرثومية مع الحفاظ على قابلية وكفاءة الطيور الوظيفية لمخلوقات ال PGC المتبرعة. بالإضافة إلى ذلك، تتوافق الطريقة مع أدوات تحرير الجينوم مثل CRISPR/Cas9 وناقلات الانتقال الوراثي، مما يمكن من إنتاج نماذج طيور معدلة وجينيا. بعيدا عن البحث الأساسي، تدعم هذه الاستراتيجية جهود الحفظ من خلال نقل الخطوط الجرثومية بين الأنواع والحفاظ على الموارد الوراثية. بشكل عام، يوفر هذا البروتوكول إطارا شاملا وموثوقا للتلاعب بالخط الجرثومي للطيور، مما يوفر منصة متعددة الاستخدامات للدراسات الأساسية والتطبيقية في تكنولوجيا الدواجن الحيوية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

انتقال الخط الجرثومي عبر الخلايا الجرثومية البدائية (PGC) هو الطريقة الأكثر كفاءة لنقل المعلومات الجينية إلى الجيل التالي في الطيور 1,2,3. تسمح الكيميرا الجرثومية، التي تعرف بأنها أفراد يحملون خلايا جرثومية مشتقة من المتبرع والمضيف، بنقل المادة الوراثية المتبرعة إلى النسل، مما يدعم التطبيقات في التحول الوراثي، والجينوم الوظيفي، والحفاظ على الأنواع المهددةبالانقراض 4,5,6,7,8. على عكس الأساليب التي تعتمد على الخلايا الأريمية الجلدية، توفر استراتيجيات PGC كفاءة أعلى في انتقال الخط الجرثومي وقابلية التكرار، مما يجعلها مناسبة جدا للتلاعب الجيني الدقيق.

في أنواع الطيور، تنشأ PGCs من منطقة البيلوسيدا المركزية من الأديم الأرياني عند المرحلة X 9 من إيال-جيلادي وكوخاف (EGK) ثم تهاجر إلى الهلال الجرثومي بواسطة هامبورغر وهاميلتون (HH) المرحلة 410. بين المرحلتين 9 و12 من HH، تدور الخلايا المجردة عبر الأوعية الدموية الجنينية قبل أن تستقر في الحافة الغدبية التناسلية11، 12، 13. تمكن هذه الأنماط الهجرية المميزة من عزل الخلايا الساقية الجلدية في مراحل متعددة، بما في ذلك الهلال الجرثوي، والدم المتداول، والغدد التناسلية14. ومن الجدير بالذكر أن الخلايا الجزيئية المأخوذة من التناسل التناسلي في المرحلة 26-28 من HH وزرعت في أجنة المستلمين من المرحلة 14-17 من HH أظهرت كفاءة مثالية في الخط الجرثوي وكفاءة في الطعم، مما يوفر إطارا عمليا لتطبيق هذا البروتوكول بشكل موحد.

يمكن الحفاظ على PGCs وتوسيعها في المختبر مع الحفاظ على هوية الخط الجرثوي والقدرة على النقل، مما يمكن من استخدامها للتعديل الوراثي المستقر. تم استخدام إنتاج الكيميرا الجرثومية بوساطة PGC لإنتاج طيور معدلة وراثيا تعبر عن بروتينات مؤتلفة، وتتبع السلالة الجرثومية، وتعديل مسارات تحديد الجنس، وتعزيز مقاومة الأمراض المعدية 6,15,16,17,18,19. علاوة على ذلك، يسهل زرع PGC انتقال وحفظ الوراثة الوراثية للطيور المهددة بالانقراض بين الأنواع 7,8,20,21,22,23، كما يمكن حفظ PGC بالتبريد للحفاظ على الموارد الوراثية على المدى الطويل.

على الرغم من أن أنواع أخرى من الخلايا الجذعية، بما في ذلك الخلايا الجذعية الجنينية (ESCs)26,27,28,29، التي تم استكشاف الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة (iPSCs)30,31,32، والخلايا الجذعية المنوية (SSCs)33,34، قد تم استكشاف تعديل الخط الجرثومي في الطيور، إلا أن كفاءة انتقال الخط الجرثومي لديها لا تزال أقل من الأنظمة القائمة على PGC، والتي تعتبر حاليا الأكثر مصدر موثوق لخلايا ذات كفاءة في الخط الجرثوي.

في دراسات الكيميرا الجرثومية، يعد اختيار السلالة المتبرعة أمرا بالغ الأهمية لتمييز الخلايا الجرثومية المشتقة من المتبرع عن الخلايا المشتقة من المضيف. يمتلك دجاجة أوغي الكورية (KOC) الأليل المتنحي I/i المسؤول عن البشرة السوداء والريش، وهو أمر يمكن تمييزه بسهولة عن خط ليغورن الأبيض الذي يحمل الأليل السائد I/I 35,36. يسمح هذا الاختلاف الظاهر بالتعرف الواضح على النسل المستخرج من المتبرعين أثناء تحليل انتقال الخط الجرثوي، كما يدعم الحفاظ على التنوع البيولوجي بسبب القيمة الجينية المحلية ل KOC.

بشكل عام، يوفر إنتاج الكيميرا الجرثومية بوساطة PGC منصة قوية لتقنية الطيور الحيوية (الشكل 1). من خلال تحديد مرحلتي المتبرع الأمثل (HH26-28) والمستلم (HH14-17) ودمج خطوات محددة للزراعة والتحقق، يمكن هذا البروتوكول نقل الخطوط الجرثومية بكفاءة ويوفر إطارا عمليا لتوليد الطيور المعدلة وراثيا والجينوم، بالإضافة إلى الحفاظ على الموارد الوراثية الطيورية القيمة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت الموافقة على جميع الإجراءات المتعلقة بالدجاج من قبل معهد موارد المختبرية في جامعة سيول الوطنية، كوريا الجنوبية (رقم الموافقة من IACUC: SNU-250226-4). تم الحفاظ على في ظروف منظمة وصحية مع توفير مياه معقمة وعلف. بالإضافة إلى ذلك، تم التعامل مع جميع النفايات الكيميائية والبيولوجية الناتجة أثناء الإجراءات، بما في ذلك محاليل التربسين/EDTA، والخلايا الموسومة ب PKH26، والأنسجة الجنينية أو الغدد التناسلية، والتخلص منها وفقا لإرشادات السلامة البيولوجية المؤسسية وإدارة النفايات الخطرة في جامعة سيول الوطنية. جميع المواد والكواشف والمعدات المستخدمة في هذا البروتوكول مدرجة في جدول المواد. يجب أن تكون الوسائط والكواشف المستخدمة في أخذ عينات الغدد التناسلية وزراعة الخلايا من أجنة المتبرعين عقيمة.

1. عزل كائنات PGC للدجاج

  1. حضن بيض الدجاج المخصب الطازج في المرحلة X من إيال-جيلادي وكوخاف (EGK) عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 5.5 أيام حتى تصل الأجنة إلى مراحل HH 26-28.
    ملاحظة: حافظ على رطوبة بين 60٪-65٪ لضمان تطور جنين طبيعي.
  2. عزل الأجنة بعناية من البويضات في مراحل HH 26-28 باستخدام ملقط معقم.
  3. اغسل الأجنة ب 1× PBS، ثم ضع الجنين على لوحة فحم وتثبيته بدبابيس حشرات. باستخدام المجهر المجسم، قم بتشريح التناسل التناسلي الجنيني المزدوج بعناية باستخدام ملقط حاد.
    ملاحظة: تعامل مع الأنسجة بلطف لمنع التلف وضمان عزل دقيق للغدد التناسلية. نظرا لقربها من الكلية المتوسطة في المراحل 26-28 من الكلية المتوسطة، قد يتم جمع كمية صغيرة من نسيج الكلى عن غير قصد؛ ومع ذلك، يضمن التشريح الدقيق تحت المجهر المجسم وظروف الزراعة الانتقائية أن تتكاثر الحبوب البيضاء فقط مع الحفاظ على النقاء.
  4. انقل الغدد التناسلية المجمعة من ثلاثة أجنة إلى أنبوب بسعة 1.5 مل يحتوي على 500 ميكرولتر من 0.05٪ تريبسين/EDTA وحضن عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق لتفكيك الخلايا.
  5. أضف 50 ميكرولتر من FBS لتعطيل التريبسين.
  6. الطرد المركزي عند 200 × جرام لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (حوالي 20-25 درجة مئوية). أزل الفائق بحذر دون إزعاج حبيبات الخلية.
  7. أعد تعليق الخلايا الغدية التناسلية المفككة في 1 مل من 1× PBS.

2 . التكاثر الصناعي لمركبات الدجاج المبكرة

  1. حضر وسط زراعة PGC (KO-DMEM مدعوم ب 20٪ FBS، 2٪ سيروم دجاج، نيوكليوسيدات، جلوتا ماكس، أحماض أمينية غير ضرورية MEM، 2-ميركابتوإيثانول، 10 ملليمول بيروفات الصوديوم، مضاد حيوي مضاد للفطريات، 10 نانوغرام/ملتر bFGF) وسخن الوسط إلى 37 درجة مئوية.
  2. أضف خلايا الغدد التناسلية المفككة التي جمعت من ثلاثة أجنة في مراحل HH 26-28 (حوالي 100-150 PGC لكل جنين37,38) إلى 1 مل من وسط الزراعة المسخن مسبقا في كل بئر وطبقت الخلايا على صفيحة زراعة مكونة من 12 بئر.
  3. اهز الصفيحة بلطف لضمان توزيع الخلايا بشكل منتظم.
  4. حافظ على حرارة PGCs عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO₂، ومراقبة الشكل وكثافة الخلايا يوميا. تبقى الخلايا الجسدية المستديرة والقابلة للانكسار وعادة ما تطفو، بينما الخلايا الجسدية ملتصقة (الشكل 2A).
    ملاحظة: تدعم ظروف الزراعة بشكل انتقائي تكاثر الخلايا الجسدية، مما يسمح لها بالتوسع بينما يتم القضاء تدريجيا على الخلايا الجسدية.
  5. يتم الحفاظ على ال PGCs المزروعة في صفيحة مكونة من 12 بئر عن طريق تغيير وسط الزراعة كل 3-4 أيام لدعم التكاثر الأمثل والقابلية للبقاء (الشكل 2B).
  6. اختياريا، استخدم علامات خاصة ب PGC (مثل CVH، DAZL، NANOG، وPOUV) للتحقق من النقاء وتحديد الجنس باستخدام PCR (الجدول 1).
    1. تحضير عينات PGC لاستخراج RNA باستخدام نظام RNA Miniprep وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
    2. قم بإجراء RT-PCR (مثل CVH، DAZL، NANOG، وPOUV) أو التلوين المناعي باستخدام علامات خاصة ب PGC (SSEA1 و DAZL) وفقا للبروتوكولات القياسية39 (الشكل 2C,D).
    3. قم بإجراء تحليل PCR حسب البروتوكولات القياسية40 (الشكل 2E).

3. التحقق من كفاءة الخلايا الجرثومية لبطولة PGC المزروعة باستخدام وسم PKH26

  1. احصد الخلايا الساقية المبكرة عندما تصل إلى مرحلة نمو الأخشاب، عادة بكثافة تقارب 1-5 × 10إلى 5 خلايا في كل بئر في صفيحة مكونة من 12 بئرا.
  2. قم بتسخين الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 200 × جرام لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (حوالي 20-25 درجة مئوية)، ثم أعد تعليقها في 1× PBS، وقيم الجدوى باستخدام تريبان بلو.
  3. جهز مخفف C من مجموعة PKH26 الحمراء لربط الخلايا الفلورية للوسم العام على غشاء الخلية ووازنه إلى درجة حرارة الغرفة (حوالي 20-25 درجة مئوية).
  4. إعادة تشكيل صبغة PKH26 وتحضير محلول عمل في مخفف C بتركيز نهائي يقارب 1-2 ميكرومول.
  5. أعد تعليق حبيبات PGC في محلول مخفف بسعة 1 مل C. أضف بسرعة محلول PKH26 بسعة 1 مل (بنسبة 1:1)، وامزجه بلطف، وحضن لمدة 2-5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (حوالي 20-25 درجة مئوية).
  6. أضف بسرعة محلول عمل 1 مل PKH26 إلى تعليق الخلية (بنسبة 1:1)، وامزجه بلطف عن طريق التوصيل بالماصات، واحتضن في درجة حرارة الغرفة (حوالي 20-25 درجة مئوية) لمدة 2-5 دقائق.
    ملاحظة: لا تتجاوز الوقت الموصى به للحضانة.
  7. أوقف التلوين بإضافة 2-4 أضعاف حجم FBS أو 1٪-5٪ BSA في PBS.
  8. الطرد المركزي عند 200 × جم، 5 دقائق عند درجة حرارة الغرفة (حوالي 20-25 درجة مئوية)؛ اغسل ثلاث مرات بمتوسط زراعة PGC أو 1× PBS + 0.1٪ BSA.
  9. أعد تعليق الخلايا في مخزن الحقن (وسط زراعة PGC أو 1× PBS + 0.1٪ BSA) بتركيز 1-5 × 10إلى 1 ×10 5 خلايا/ميكرولتر. احتفظ بها على التجميد لفترة وجيزة للحفاظ على البقاء.
  10. تحقق من وضع العلامات تحت مجهر الفلورة قبل الحقن (الشكل 3A).
  11. حقن أكثر من 3,000 جبن PGC قابل للوسم معين، مع احتساب باستخدام الأزرق التريباني، في الأجنة في مرحلة HH 14-17 وحضن حتى اليوم السادس (الشكل 3B).
  12. تأكيد استعمار الغدد التناسلية المستقبلة بحلول اليوم السادس (الشكل 3C).

4. زرع خلايا PGC المتبرعة في الأوعية الدموية الجنينية للمستلم

  1. حضن البيض المستلم إلى مرحلة HH 14-17 (37 درجة مئوية، رطوبة 60-70٪، وتتأرجح بسرعة 45° كل ساعة).
  2. جهز ميكروبايبت زجاجية شعيرات شعرية باستخدام أنبوب زجاجي بوروسيليكات (قطر خارجي 1.0 مم، قطر داخلي 0.5-0.75 مم). اسحب الشعيرات الدموية باستخدام جهاز سحب الميكروبايبت وتلميع الطرف حتى يصل قطر داخلي يقارب 10-20 ميكرومتر.
  3. إنشاء نافذة صغيرة (حوالي 0.5 سم × 0.5 سم) في الطرف المدبب للبويضة للسماح بالوصول إلى الحقن الدقيق مع تقليل الاضطراب للجنين.
    ملاحظة: قم بتعقيم سطح قشر البيض بنسبة 70٪ إيثانول قبل فتح النافذة لمنع التلوث.
  4. حقن 2 ميكرولتر من تعليق يحتوي على أكثر من 3000 PGC في 1× PBS أو HBSS في الشريان الأبهر الظهري تحت ميكروسكوب مجسم.
    ملاحظة: قم بإجراء الحقن تحت المجهر المجسم لتجنب إتلاف الجنين أو الأوعية الدموية، وقم بتحريك إبرة الحقن الدقيق بعناية لمنع الإصابة.
  5. أغلق نافذة البيض بطبقة من البارافين؛ ضع طرف البيضة المدببة للأسفل وحضن حتى الفقس عند 37.5 درجة مئوية، مع رطوبة 60-70٪، مع تأرجح بمعدل 45° كل ساعة.
    ملاحظة: حافظ على درجة الحرارة والرطوبة المناسبة لضمان بقاء الجنين وتطوره الناجح.

5. التحقق من صحة الكيميرا الجرثومية

  1. اجمع الخصية أو المبيض من فرخ G0 بعد الفقس.
  2. استخراج الحمض النووي الجيني من أنسجة الغدد التناسلية المجمعة لتأكيد تكوين الكيميرا في الخط الجرثوي. قم باستخراج الحمض النووي الجيني من أنسجة الغدد التناسلية المجمعة كما يلي:
    1. اجمع نسيج الخصية أو المبيض، وقم بتجانسها في 300 ميكرولتر من محلول التحلل (2 ملم تريس-HCl (درجة الحموضة 8.0)، 10 ملليمول EDTA، 1٪ SDS) يحتوي على 1.5 ميكرولتر من البروتيناز K، وحضنه عند 60 درجة مئوية لضمان التحلل الكامل.
    2. أضف 100 ميكرولتر من محلول ترسيب البروتين (7 مليون أسيتات أمونيوم)، وامزجه جيدا، واستخدم الطرد المركزي عند 12,000 × جرام لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    3. نقل الطور المائي (الفائق) إلى أنبوب جديد، وإضافة 500 ميكرولتر من الأيزوبروبانول لترسيب الحمض النووي، والطرد المركزي عند 12,000 × جرام لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    4. تخلص من السوبرناتانت، أضف 1 مل من الإيثانول بنسبة 70٪، واستخدم الطرد المركزي عند 12,000 × جرام لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    5. أزل الإيثانول، جفف حبيبات الحمض النووي في الهواء على درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.
    6. اشرب الحمض النووي ب 50 ميكرولتر من الماء الخالي من RNase وقس تركيز ونقاء الحمض النووي باستخدام مقياس طيفي (A 260/A 280 ≈ 1.8).
    7. اضبط الحمض النووي إلى 10-5 نانوغرام لكل تفاعل PCR.
  3. قم بتضخيم PCR باستخدام بادئات خاصة بأنواع معينة تم تصميمها (الجدول 1) تحت الشروط التالية: 94 °م لمدة 3 دقائق تليها 35 دورة من 94 °م لمدة 30 ثانية، 68 °م لمدة 30 ثانية، و72 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، بالإضافة إلى تمديد نهائي عند 72 درجة مئوية لمدة 5 دقائق (الشكل 4A).
  4. جمع السائل المنوي من الذكور الناضجين جنسيا من G0، واستخراج الحمض النووي للحيوانات المنوية باستخدام نفس البروتوكول، وإجراء PCR باستخدام بادئات خاصة بالنوع (الشكل 4B).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التكاثر والتوصيف لدجاجات PGC في المختبر
تم عزل الخلايا الغددية الكاملة التي تحتوي على PGC من الأجنة في مراحل HH 26-28 وزرعتها تحت ظروف زراعة محددة لل PGC. مع مرور الوقت، التصقت خلايا الغدد التناسلية إما بسطح الزراعة أو تعرضت للتحلل، بينما بقيت الخلايا البديلة في حالة تعليق وبدأت في التكاثر النشط (الشكل 2A). بعد حوالي أسبوعين من الزراعة، توسع عدد PGCs ليشمل أكثر من 1 × 105 خلايا، مما أظهر تكاثرا قويا وإثراء انتقائيا لخلايا PGC تحت هذه ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوفر زرع الخلايا الجرثومية البدائية المزروعة (PGCs) في الأجنة المستلمة طريقة موثوقة لإنتاج الكيميرا الجرثومية في الدجاج. يستفيد هذا البروتوكول من الإمكانات الجرثومية الجوهرية في الخلايا الجرثومية ويحسن الاتساق التجريبي مقارنة بالأنظمة التقليدية القائمة على الأديمة الأريمية، والتي تميل إلى الفسيفساء والتغيرات التطورية. ميزة حاسمة لهذه الطريقة هي التوسع الانتقائي في المختبر لجرثات PGC تحت ظروف زراعة محددة، مما يحافظ على هويتها في الخط الجرثوي. خلال فترة الزراعة، تحتفظ الخلايا الجل...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد دعم هذا العمل من خلال منحة من المؤسسة الوطنية للبحوث الكورية (NRF) الممولة من الحكومة الكورية (MSIT) [RS-2024-00418297] وبرنامج البحث التعاوني لتطوير علوم وتكنولوجيا الزراعة [RS-2025-02213489] من إدارة التنمية الريفية الكورية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
مرة واحدة على PBS هايكلونSH30256
2-ميركابتوإيثانولجيبكو21985023
محلول مضاد للفطريات بالمضاد الحيوي (100X)جيبكو15240062
الأجسام المضادة المضادة لتقنية DAZLأبكامAB215718
مصل الدجاج المعقمروكلاندD102-00-0500
ديوكسي ريبونوكلياز I من البنكرياس البقريسيغما ألدريتش9003-98-9
ميكروكاب دروموند ميكروبيبس القابلة للاستخدام الواحد  شركة دروموند العلمية1-000-0500
نيوكليوسيدات إمبريوماكس (100X)ميركES-008-D
FBS (توصيف اللحم البقري الجنيني، مصدره في الولايات المتحدة، 500 مل)هايكلونSH30919
مكمل جلوتاماكسجيبكو35050061
نوك آوت DMEMجيبكو10829018
محلول الأحماض الأمينية غير الأساسية MEMجيبكو11140050
فيلم مختبر بارافلام إمأمكورPM996 
مجموعة PKH26 لربط الخلايا الفلورية الحمراء لوضع العلامات العامة على أغشية الخلاياسيغما ألدريتشPKH26GL-1KT
الجسم المضاد المناعي المنقى لمضاد الفئران/الإنسان CD15 (SSEA-1)الأسطورة الحيوية125602
FGF البشري المؤتلف: أساسي/FGF2/bFGF (146 aa) بروتين R& أنظمة D  233-FB
أنظمة Miniprep RNA ReliaPrepبروميغاZ6011
بيروفيات الصوديوم (100 ملم متر)جيبكو11360070
محلول تريبان الأزرقسيغماT8154-100ML
تريبسين-إيدتا (0.5٪)، بدون فينول ريدGibco & trade;15400054

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. van de Lavoir, M. C., et al. Germline transmission of genetically modified primordial germ cells. Nature. 441 (7094), 766-769 (2006).
  2. Macdonald, J., Glover, J. D., Taylor, L., Sang, H. M., McGrew, M. J. Characterisation and germline transmission of cultured avian primordial germ cells. PLoS One. 5 (11), e15518(2010).
  3. Choi, J. W., et al. Basic fibroblast growth factor activates MEK/ERK cell signaling pathway and stimulates the proliferation of chicken primordial germ cells. PLoS One. 5 (9), e12968(2010).
  4. Macdonald, J., et al. Efficient genetic modification and germline transmission of primordial germ cells using piggyBac and Tol2 transposons. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (23), E1466-E1472 (2012).
  5. Park, T. S., Han, J. Y. PiggyBac transposition into primordial germ cells is an efficient tool for transgenesis in chickens. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (24), 9337-9341 (2012).
  6. Lee, H. J., et al. DMRT1 gene disruption alone induces incomplete gonad feminization in chicken. FASEB J. 35 (9), e21876(2021).
  7. Kang, S. J., et al. Reproduction of wild birds via interspecies germ cell transplantation. Biol Reprod. 79 (5), 931-937 (2008).
  8. Wernery, U., et al. Primordial germ cell-mediated chimera technology produces viable pure-line Houbara bustard offspring: potential for repopulating an endangered species. PLoS One. 5 (12), e15824(2010).
  9. Eyal-Giladi, H., Kochav, S. From cleavage to primitive streak formation: A complementary normal table and a new look at the first stages of the development of the chick. I. General morphology. Dev Biol. 49 (2), 321-337 (1976).
  10. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. J Morphol. 88 (1), 49-92 (1951).
  11. Ukeshima, A., Yoshinaga, K., Fujimoto, T. Scanning and transmission electron microscopic observations of chick primordial germ cells with special reference to the extravasation in their migration course. J Electron Microsc (Tokyo). 40 (2), 124-128 (1991).
  12. Fujimoto, T., Ukeshima, A., Kiyofuji, R. The origin, migration and morphology of the primordial germ cells in the chick embryo. Anat Rec. 185 (2), 139-145 (1976).
  13. Meyer, D. B. The migration of primordial germ cells in the chick embryo. Dev Biol. 10, 154-190 (1964).
  14. Kim, Y. M., Han, J. Y. The early development of germ cells in chicken. Int J Dev Biol. 62 (1-2-3), 145-152 (2018).
  15. Park, T. S., et al. Deposition of bioactive human epidermal growth factor in the egg white of transgenic hens using an oviduct-specific minisynthetic promoter. FASEB J. 29 (6), 2386-2396 (2015).
  16. Kim, Y. M., et al. The transgenic chicken derived anti-CD20 monoclonal antibodies exhibits greater anti-cancer therapeutic potential with enhanced Fc effector functions. Biomaterials. 167, 58-68 (2018).
  17. Rengaraj, D., et al. Dissecting chicken germ cell dynamics by combining a germ cell tracing transgenic chicken model with single-cell RNA sequencing. Comput Struct Biotechnol J. 20, 1654-1669 (2022).
  18. Park, J. S., et al. Production of recombinant human IgG1 Fc with beneficial N-glycosylation pattern for anti-inflammatory activity using genome-edited chickens. Commun Biol. 6 (1), 589(2023).
  19. Idoko-Akoh, A., et al. Creating resistance to avian influenza infection through genome editing of the ANP32 gene family. Nat Commun. 14 (1), 6136(2023).
  20. Ono, T., Yokoi, R., Aoyama, H. Transfer of male or female primordial germ cells of quail into chick embryonic gonads. Exp Anim. 45 (4), 347-352 (1996).
  21. Reynaud, G. The transfer of turkey primordial germ cells to chick embryos by intravascular injection. J Embryol Exp Morphol. 21 (3), 485-507 (1969).
  22. Liu, C., et al. Production of chicken progeny (Gallus gallus domesticus) from interspecies germline chimeric duck (Anas domesticus) by primordial germ cell transfer. Biol Reprod. 86 (4), 101(2012).
  23. van de Lavoir, M. C., et al. Interspecific germline transmission of cultured primordial germ cells. PLoS One. 7 (5), e35664(2012).
  24. Naito, M., Tajima, A., Tagami, T., Yasuda, Y., Kuwana, T. Preservation of chick primordial germ cells in liquid nitrogen and subsequent production of viable offspring. J Reprod Fertil. 102 (2), 321-325 (1994).
  25. Tajima, A., Naito, M., Yasuda, Y., Kuwana, T. Production of germline chimeras by transfer of cryopreserved gonadal primordial germ cells (gPGCs) in chicken. J Exp Zool. 280 (3), 265-267 (1998).
  26. Carsience, R. S., Clark, M. E., Verrinder Gibbins, A. M., Etches, R. J. Germline chimeric chickens from dispersed donor blastodermal cells and compromised recipient embryos. Development. 117 (2), 669-675 (1993).
  27. Petitte, J. N., Liu, G., Yang, Z. Avian pluripotent stem cells. Mech Dev. 121 (9), 1159-1168 (2004).
  28. Petitte, J. N., Clark, M. E., Liu, G., Verrinder Gibbins, A. M., Etches, R. J. Production of somatic and germline chimeras in the chicken by transfer of early blastodermal cells. Development. 108 (1), 185-189 (1990).
  29. Pain, B., et al. Long-term in vitro culture and characterisation of avian embryonic stem cells with multiple morphogenetic potentialities. Development. 122 (8), 2339-2348 (1996).
  30. Rossello, R. A., et al. Mammalian genes induce partially reprogrammed pluripotent stem cells in non-mammalian vertebrate and invertebrate species. Elife. 2, e00036(2013).
  31. Lu, Y., et al. Avian-induced pluripotent stem cells derived using human reprogramming factors. Stem Cells Dev. 21 (3), 394-403 (2012).
  32. Kim, Y. M., Park, Y. H., Lim, J. M., Jung, H., Han, J. Y. Technical note: Induction of pluripotent stem cell-like cells from chicken feather follicle cells. J Anim Sci. 95 (8), 3479-3486 (2017).
  33. Han, J. Y., et al. Production of quail (Coturnix japonica) germline chimeras by transfer of Ficoll-enriched spermatogonial stem cells. Theriogenology. 154, 223-231 (2020).
  34. Pramod, R. K., et al. Isolation, characterization, and in vitro culturing of spermatogonial stem cells in Japanese Quail (Coturnix japonica). Stem Cells Dev. 26 (1), 60-70 (2017).
  35. Park, T. S., et al. Improved germline transmission in chicken chimeras produced by transplantation of gonadal primordial germ cells into recipient embryos. Biol Reprod. 68 (5), 1657-1662 (2003).
  36. Chang, I. K., et al. Production of germline chimeric chickens by transfer of cultured primordial germ cells. Cell Biol Int. 21 (8), 495-499 (1997).
  37. Nakamura, Y., et al. Migration and proliferation of primordial germ cells in the early chicken embryo. Poult Sci. 86 (10), 2182-2193 (2007).
  38. Kuwana, T. Migration of Avian Primordial Germ Cells toward the Gonadal Anlage: (avian/PGC/migration/presumptive gonad/chimera). Dev Growth Differ. 35 (3), 237-243 (1993).
  39. Jung, K. M., Kim, Y. M., Ono, T., Han, J. Y. Size-dependent isolation of primordial germ cells from avian species. Mol Reprod Dev. 84 (6), 508-516 (2017).
  40. Ogawa, A., et al. Molecular characterization and cytological mapping of a non-repetitive DNA sequence region from the W chromosome of chicken and its use as a universal probe for sexing carinatae birds. Chromosome Res. 5 (2), 93-101 (1997).
  41. Park, K. J., et al. Gamma-irradiation depletes endogenous germ cells and increases donor cell distribution in chimeric chickens. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 46 (10), 828-833 (2010).
  42. Nakamura, Y., et al. Germline replacement by transfer of primordial germ cells into partially sterilized embryos in the chicken. Biol Reprod. 83 (1), 130-137 (2010).
  43. Song, Y., D'Costa, S., Pardue, S. L., Petitte, J. N. Production of germline chimeric chickens following the administration of a busulfan emulsion. Mol Reprod Dev. 70 (4), 438-444 (2005).
  44. Lee, H., et al. Compensatory proliferation of endogenous chicken primordial germ cells after elimination by busulfan treatment. Stem Cell Res Ther. 4 (6), 136(2013).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

CRISPR Cas9 PCR

مقالات ذات صلة