مقالة منهجية
الكيميرا الجرثومية في الطيور، التي تولد من زراعة الخلايا الجرثومية البدائية (PGCs) في الأجنة المستلمة، تتيح التطبيقات في التحويل الجوي، وتحرير الجينات، وحفظ الأنواع. يوضح هذا البروتوكول إجراءات عزل PGC، وتوسيع المختبر ، والحقن الدقيق، والتحقق من المتبرعين، مما يوفر منصة موثوقة لإنتاج الكيميرا الجرثومية وتطوير التكنولوجيا الحيوية للطيور.
يوفر توليد الكيميرا الجرثومية في الدجاج عبر زراعة الخلايا الجرثومية البدائية (PGCs) منصة قوية وقابلة للتكاثر لعملية التحول الطيوري، وتحرير الجينوم، وحفظ الأنواع. الأساليب التقليدية التي تستخدم خلايا الأريمة الجلدية من أجنة المرحلة X في EGK محدودة بانخفاض كفاءة نقل الخط الجرثومي بسبب الانفصال المبكر في السلالات الخلوية. وعلى النقيض من ذلك، تستغل استراتيجيات PGC الكفاءة الجرثومية الجوهرية لهذه الخلايا وحيدة القدرة، مما يتيح دمجاها بشكل موثوق في الغدد التناسلية المستقبلة. هنا، نقدم بروتوكولا خطوة تدريجيا لعزل الخلايا البضيضة من الأجنة في المرحلة 26-28 من مرحلة HH، والحفاظ عليها وتوسيعها في المختبر، وزرعها في الشريان الأبهر الظهري للأجنة المستلمة من المرحلة 14-17 من HH. يتم مراقبة الزرع قصير الأمد باستخدام علامات فلورية مثل PKH26، بينما يتم تأكيد مساهمة الخط الجرثوتي طويل الأمد من خلال تحليل PCR للغدد التناسلية المتلقية. يضمن هذا النهج تولدا متسقا للكيميرا الجرثومية مع الحفاظ على قابلية وكفاءة الطيور الوظيفية لمخلوقات ال PGC المتبرعة. بالإضافة إلى ذلك، تتوافق الطريقة مع أدوات تحرير الجينوم مثل CRISPR/Cas9 وناقلات الانتقال الوراثي، مما يمكن من إنتاج نماذج طيور معدلة وجينيا. بعيدا عن البحث الأساسي، تدعم هذه الاستراتيجية جهود الحفظ من خلال نقل الخطوط الجرثومية بين الأنواع والحفاظ على الموارد الوراثية. بشكل عام، يوفر هذا البروتوكول إطارا شاملا وموثوقا للتلاعب بالخط الجرثومي للطيور، مما يوفر منصة متعددة الاستخدامات للدراسات الأساسية والتطبيقية في تكنولوجيا الدواجن الحيوية.
انتقال الخط الجرثومي عبر الخلايا الجرثومية البدائية (PGC) هو الطريقة الأكثر كفاءة لنقل المعلومات الجينية إلى الجيل التالي في الطيور 1,2,3. تسمح الكيميرا الجرثومية، التي تعرف بأنها أفراد يحملون خلايا جرثومية مشتقة من المتبرع والمضيف، بنقل المادة الوراثية المتبرعة إلى النسل، مما يدعم التطبيقات في التحول الوراثي، والجينوم الوظيفي، والحفاظ على الأنواع المهددةبالانقراض 4,5,6,7,8. على عك....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
تمت الموافقة على جميع الإجراءات المتعلقة بالدجاج من قبل معهد موارد المختبرية في جامعة سيول الوطنية، كوريا الجنوبية (رقم الموافقة من IACUC: SNU-250226-4). تم الحفاظ على في ظروف منظمة وصحية مع توفير مياه معقمة وعلف. بالإضافة إلى ذلك، تم التعامل مع جميع النفايات الكيميائية والبيولوجية الناتجة أثناء الإجراءات، بما في ذلك محاليل التربسين/EDTA، والخلايا الموسومة ب PKH26، والأنسجة الجنينية أو الغدد التناسلية، والتخلص منها وفقا لإرشادات السلامة البيولوجية المؤسسية وإدارة النفايات الخطرة في جامعة سيول الوطنية. جميع المواد والكواشف والمعدات المستخدمة في هذا البروتوكول مدرجة في جدول المواد. يجب أن تكون الوسائط والكواشف المستخدمة....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
التكاثر والتوصيف لدجاجات PGC في المختبر
تم عزل الخلايا الغددية الكاملة التي تحتوي على PGC من الأجنة في مراحل HH 26-28 وزرعتها تحت ظروف زراعة محددة لل PGC. مع مرور الوقت، التصقت خلايا الغدد التناسلية إما بسطح الزراعة أو تعرضت للتحلل، بينما بقيت الخلايا البديلة في حالة تعليق وبدأت في التكاثر النشط (الشكل 2A). بعد حوالي أسبوعين من الزراعة، توسع عدد PGCs ليشمل أكثر من 1 × 105 خلايا، مما أظهر تكاثرا قويا وإثراء انتقائيا لخلايا PGC تحت هذه .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
يوفر زرع الخلايا الجرثومية البدائية المزروعة (PGCs) في الأجنة المستلمة طريقة موثوقة لإنتاج الكيميرا الجرثومية في الدجاج. يستفيد هذا البروتوكول من الإمكانات الجرثومية الجوهرية في الخلايا الجرثومية ويحسن الاتساق التجريبي مقارنة بالأنظمة التقليدية القائمة على الأديمة الأريمية، والتي تميل إلى الفسيفساء والتغيرات التطورية. ميزة حاسمة لهذه الطريقة هي التوسع الانتقائي في المختبر لجرثات PGC تحت ظروف زراعة محددة، مما يحافظ على هويتها في الخط الجرثوي. خلال فترة الزراعة، تحتفظ الخلايا الجل.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.
وقد دعم هذا العمل من خلال منحة من المؤسسة الوطنية للبحوث الكورية (NRF) الممولة من الحكومة الكورية (MSIT) [RS-2024-00418297] وبرنامج البحث التعاوني لتطوير علوم وتكنولوجيا الزراعة [RS-2025-02213489] من إدارة التنمية الريفية الكورية.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| مرة واحدة على PBS | هايكلون | SH30256 | |
| 2-ميركابتوإيثانول | جيبكو | 21985023 | |
| محلول مضاد للفطريات بالمضاد الحيوي (100X) | جيبكو | 15240062 | |
| الأجسام المضادة المضادة لتقنية DAZL | أبكام | AB215718 | |
| مصل الدجاج المعقم | روكلاند | D102-00-0500 | |
| ديوكسي ريبونوكلياز I من البنكرياس البقري | سيغما ألدريتش | 9003-98-9 | |
| ميكروكاب دروموند ميكروبيبس القابلة للاستخدام الواحد | شركة دروموند العلمية | 1-000-0500 | |
| نيوكليوسيدات إمبريوماكس (100X) | ميرك | ES-008-D | |
| FBS (توصيف اللحم البقري الجنيني، مصدره في الولايات المتحدة، 500 مل) | هايكلون | SH30919 | |
| مكمل جلوتاماكس | جيبكو | 35050061 | |
| نوك آوت DMEM | جيبكو | 10829018 | |
| محلول الأحماض الأمينية غير الأساسية MEM | جيبكو | 11140050 | |
| فيلم مختبر بارافلام إم | أمكور | PM996 | |
| مجموعة PKH26 لربط الخلايا الفلورية الحمراء لوضع العلامات العامة على أغشية الخلايا | سيغما ألدريتش | PKH26GL-1KT | |
| الجسم المضاد المناعي المنقى لمضاد الفئران/الإنسان CD15 (SSEA-1) | الأسطورة الحيوية | 125602 | |
| FGF البشري المؤتلف: أساسي/FGF2/bFGF (146 aa) بروتين | R& أنظمة D | 233-FB | |
| أنظمة Miniprep RNA ReliaPrep | بروميغا | Z6011 | |
| بيروفيات الصوديوم (100 ملم متر) | جيبكو | 11360070 | |
| محلول تريبان الأزرق | سيغما | T8154-100ML | |
| تريبسين-إيدتا (0.5٪)، بدون فينول ريد | Gibco & trade; | 15400054 |
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه
طلب إذن