يتيح التألق المناعي متعدد الإرسال تصنيفا متسلسلا لعلامات الأجسام المضادة المتعددة ضمن قسم نسيج واحد لدعم التحليل المكاني لبنية الأنسجة ومجموعات الخلايا. هنا، يتم تقديم سير عمل للكشف عن العلامات المرتبطة بالشيخوخة والبنيوية والمناعية في التعدد، بما في ذلك إعداد الشرائح يدويا وآليا، والتصوير التكراري، وتحليل الخلايا الأحادية باستخدام برامج علم الأمراض الرقمي.
مقالة منهجية
اختبار الفلورة المناعية متعددة القنوات لتقييم مكاني لعلامات الشيخوخة في الجسم الحي
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
يمثل التلوين التوهج المناعي متعدد الأبعاد (IF) تحولا في التعقيد مقارنة بالتصوير التقليدي بالتلوين الصيامية، مما يسمح بالكشف المتسلسل عن علامات الأجسام المضادة المتعددة داخل مقطع نسيج واحد. هذا يسهل تحليل نطاق أوسع من أنواع الخلايا وهياكل الأنسجة، بالإضافة إلى السماح بتقييم العلاقة المكانية بينها بطريقة غير ممكنة مع المقاطع المتسلسلة. لا يوجد مؤشر عالمي واحد للشيخوخة، ومن المعروف الآن أن توقيعات الشيخوخة تختلف حسب نوع الخلية، ومحفز الشيخوخة، والوقت منذ التحفيز. لذا، توفر الأساليب التوافقية التي تقدمها التركيبة متعددة القنوات أداة قوية لتمكين الكشف غير المتحيز عن الخلايا الشيخوخة داخل مقطع نسيج واحد.
هنا، تم استخدام مصفوفات نسيج دقيقة تحتوي على نوى من 34 نوعا من الأنسجة البشرية. تم تلوينها بمزيج من العلامات الحيوية الهيكلية والمناعية والشيخوخة في اختبار 10 أشراسي، مع التقاط صور باستخدام ماسح شرائح متعدد الأشكال. تسمح هذه الطريقة بتقييم وفرة وتوزيع الخلايا المتقدمة في العمر في الأنسجة. تم استخدام دورات التلوين المتتالية، والتصوير، وتعطيل الصبغة لإنشاء مجموعات بيانات متعددة الإصدارات، مع التقاط الصور باستخدام نظام مسح شرائح فلورية متعدد التعدد. تم وصف بروتوكولات التحضير اليدوي للشرائح والمعالجة الآلية باستخدام جهاز صبغ الشرائح، إلى جانب تقسيم الخلايا الفردية والتحليل المكاني باستخدام برامج علم الأمراض الرقمي. بشكل عام، توفر هذه الطرق دليلا شاملا للتلوين والتصوير والتحليل المكاني للمؤشرات الحيوية المرتبطة بالشيخوخة داخل عينات الأنسجة، بالإضافة إلى دليل أكثر عمومية للتصوير متعدد الصور.
المقدمة
الشيخوخة هي مصير خلوي نهائي معقد ثبت أنه يساهم في مجموعة واسعة من العمليات بما في ذلك الشيخوخت، والسرطان، ووظيفة المناعة، بالإضافة إلى توازن الأنسجةالطبيعي 1. ومع ذلك، لم يتم وصف أي مؤشر حيوي عالمي للشيخوخة، ويعتمد التعرف على تقييم مجموعة من العلامات المزعومة2. تم اقتصار تصوير المتقطع المتقطع للأنسجة على تقييم مؤشر أو علامتين حيويتين في قسم واحد، مما جعل تقييم تركيبات العلامات داخل نفس العينة تحديا3. تزداد هذه المشكلة سوءا بسبب ظهور صورة تباين الخلايا المتقدمة في السن عند مستوىالخلية المفردة 4، وقلة علامات الشيخوخة في الجسم الحي، مما يجعل اختيار لوحات الكشف الضيقة أمرا صعبا في سياقات جديدة أو مع عينات ثمينة 5,6.
يهدف التصوير المتعدد-الصيام المتقطعي إلى تجاوز هذا القيد من خلال تسهيل الكشف المتسلسل لعدة علامات حيوية داخل قسم نسيج واحد3. وهذا ممكن إما من خلال استخدام مراسلين أوليجونكليوتيدات مزينة بالفلورية أو باستخدام الأجسام المضادة الأولية الموسومة التي يتم تبريد إشارتها الفلورية من خلال عملية تعطيل الصبغة7. في كلتا الحالتين، يستخدم التصوير المتسلسل لبناء لوحة من العلامات الحيوية محلية، مما يوفر مزايا مقارنة بالتصوير المتقطع التقليدي لتلوين الأنسجة المتسلسل. من خلال توليد هذه الملفات المعقدة داخل عينة نسيجية واحدة، يمكن اكتشاف عدد أكبر من الأنماط الظاهرية وأنواع الخلايا وهياكل الأنسجة المتقدمة للعمر، مما يسمح بتقييم معقد لعلاقاتها المكانية وتوزيعها.
ومع ذلك، بينما تتجاوز تعقيد ملفات تصوير IF متعددة القنوات بشكل ملحوظ مقارنة ب IF التقليدية، فإن لوحات العلامات عادة ما تقتصر على <100 مؤشر حيوي بسبب القيود العملية3. تشمل هذه العوامل فقدان محتمل لمستضدات الحواتم البصرية، أو شدة الإشارات، أو سلامة الأنسجة مع كل جولة تالية، والتحدي المتمثل في تحسين تركيبات كبيرة من الأجسام المضادة التي يجب بالضرورة ألا تحتوي على تفاعل متقاطع 8,9. لذا، فإن تحديد التركيب الأمثل لكل جولة من الأجسام المضادة يعد أمرا مهما في تصميم لوحات التعدد. وبالتالي، فإن "بليكس" بشكل عام أقل من تلك التي تحققها تقنيات مثل النسخات المكانية. ومع ذلك، نظرا لأن ال IF متعدد الإرسال يحدد كمية البروتين بدلا من مستويات النسخ، يمكن اعتبار التقنيتين مكملتين ويمكن دمجهما في خطوط أنابيب "متعددة الأوميكس" واسعة النطاق10.
هنا، تم تصوير مصفوفات نسيج بشرية تحتوي على نوى من 34 نوعا من الأنسجة. تم صبغ هذه العينات بمزيج من المؤشرات الحيوية الهيكلية والمناعية والشيخوخة في اختبار 10 أرواح: بان-سيتوكراتين (PANCK)، CD31، أكتين العضلة الملساء ألفا (aSMA)، الكيراتين 15 (K15)، الفيمنتين، FOXP3، CD8، Ki67، p16 ولامين B1. تم توفير بروتوكولات مفصلة خطوة بخطوة لكل من التحضير اليدوي للشرائح، بالإضافة إلى تعديل لدمج الأتمتة عبر جهاز تلوين الشرائح الآلي. تظهر المقارنات التجريبية التمثيلية أن الأخيرة تحسن سلامة الأنسجة، وبالنسبة لغالبية المؤشرات، الإشارة الفلورية11. أخيرا، تم توفير دليل خطوة بخطوة لتحليل صور الأنسجة الميكروآرايفة متعددة القنوات عبر برنامج علم الأمراض الرقمي HALO، بما في ذلك تقسيم الخلايا الفردية والتحليل المكاني لتعبير المؤشرات الحيوية. تظهر النتائج التمثيلية الجدوى التقنية لاكتشاف وقياس الخلايا الشيخوخة بناء على لوحة المؤشرات الحيوية (على عكس التحقق البيولوجي الشامل لتصنيف الشيخوخة).
بشكل عام، تقدم هذه المنهجية كدليل لتقييم المتعدد الأبعاد لمؤشرات الشيخوخة الحيوية في الجسم الحي وكذلك كدليل أكثر عمومية للتصوير متعدد الإرسال (الشكل 1).
البروتوكول
بيان الأخلاقيات
كانت عينات الأنسجة المدرجة في هذا العمل فائضة عن متطلبات التشخيص من أرشيف بارتس هيلث NHS، حيث تم الحصول على عينات متوافقة مع جميع الإرشادات المؤسسية والتنظيمية ذات الصلة وتمت الموافقة عليها بموجب بروتوكولات الأخلاقيات 10/H0704/65 و05/QO605/140.
1. تحضير الشريحة، استرجاع المستضدات وحجب
ملاحظة: ما لم يذكر، تنفذ جميع الخطوات في درجة حرارة الغرفة (~20–25 درجة مئوية) تحت ظروف المختبر القياسية.
- تركيب العينات الأولي
- لضمان احتفاظ الأنسجة بشكل مثالي، قم بتركيب عينات الأنسجة المدمجة في الفورمالين المثبت (FFPE) على شرائح مجهرية عالية الجودة (مشحونة إيجابيا)، محضرة من عبوة جديدة لضمان أقل قدر من فقدان الشحنة.
- تأكد من أن الأجزاء لا تتجاوز 5 ميكرومتر بسماكة بحد أقصى 4 × 2 سممربع مركبة في الوسط لضمان الرؤية داخل نافذة عرض حامل الشرائح بدون غطاء منزلق.
- قم بتحضير العينات يدويا عبر غرفة إزالة التخفي أو بطريقة آلية عبر جهاز تلوين آلي.
- غرفة إزالة التخفي
- اخبز حتى 24 شريحة طوال الليل على حرارة 60 درجة مئوية مع النسيج المواجه للأعلى.
- إزالة الشمع وإعادة ترطيب العينات باستخدام حضانة متتالية مدتها 5 دقائق في الزيلين (تنفيذ الخطوة مرتين) وتقليل تركيزات الإيثانول (100٪، 100٪، 90٪، 70٪) عن طريق غمر الشرائح بالكامل في كل كاشف.
- اغسل الشرائح عن طريق الغمر في PBS لمدة 5 دقائق (قم بتنفيذ الخطوة مرتين).
- ينزلق النفط عن طريق الغمر في ترايتون × 100 بنسبة 0.3٪ مخفف في PBS لمدة 10 دقائق.
- اغسل الشرائح بالغمر في PBS لمدة 5 دقائق.
- جهز غرفة إزالة التمويه بإضافة الكواشف التالية لكل قسم من الأقسام المنفصلة:
- 500 مل DDH2O في الحجرة الرئيسية.
- 250 مل DDH2O في موضع الخزان المركزي على سلة الرف المعدني.
- محلول كشف المستضد رقم 1 (ARS1) بدرجة حموضة 6 بقدرة 250 مل (pH 6) في وضع الخزان الأيسر على سلة الرف المعدني.
- محلول كشف المستضد 1 برقم 1 بدرجة حموضة 9 بقدرة 250 مل (ARS2) في الموضع الأيمن للخزان على سلة الرف المعدنية (مخفف في DDH2O من مخزن 10x).
- اغمر العينات في محلول ARS1 ووضع شريط بخاري فوق جميع الخزانات الثلاثة.
- ضع الغطاء على غرفة إزالة الغطاء ولفه لقفل الوضع المغلق، مع التأكد من أن قيمة تحرير الضغط مستوية على ساق الضغط.
- اختر وابدأ بروتوكولا يرتفع إلى نقطة درجة حرارة مبرمجة مسبقا تبلغ 110 °م ويبقى لمدة 4 دقائق.
- خلال مرحلة التسخين، عندما تعرض لوحة مؤشر درجة الحرارة 70 درجة مئوية، ابدأ مؤقتا لمدة 20 دقيقة. سيصل النظام إلى درجة الحرارة، ويثبت ويبدأ في تقليل الضغط خلال هذه الفترة.
- قم بفك الضغط الكامل للنظام عن طريق إمالة صمام تحرير الضغط بعناية باستخدام ملقط وفتح الغطاء. تحقق من شريط الجدول للتأكد من الوصول إلى درجة الحرارة.
- انقل العينات من محلول ARS1 إلى محلول ARS2. أعد إغلاق غطاء الحجرة (لكن لا تقفل أو تعيد ضغطه) وابدأ مؤقتا لمدة 20 دقيقة.
- قم بإزالة سلة الخزان التي تحتوي على الشرائح إلى سطح الطاولة.
- اترك السلة على سطح الطاولة بدرجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.
- اغسل العينات بالغمر في PBS لمدة 5 دقائق (قم بتنفيذ هذه الخطوة أربع مرات).
- العينات الجماعية بالغمر في PBS يحتوي على 10٪ مصل حمار و0.3٪ BSA لمدة ساعة واحدة.
- اغسل العينات بالغمر في PBS لمدة 5 دقائق.
- عينات التلوين المضادة بالغمر في DAPI (1 ميكروغرام·مل-1) مخففة في PBS لمدة 15 دقيقة.
- اغسل العينات بالغمر في PBS لمدة 5 دقائق.
- ثبت الشرائح في حوامل منزلقات بدون غطاء منزلق.
- صبغة منزلقة أوتوماتيكية (مثل Bond RXm)
- ضع الغسيل، ومواد ER1 وER2 السائبة في الدرج السفلي.
- شغل النظام لتهيئة الجهاز.
- تأكد من أن حاويات النفايات فارغة، وأن جميع المواد الأخرى أعلى من الحد الأدنى.
- جهز ذراع الكواشف عن طريق ملء مواقع الأوعية بالمواد الكيميائية التالية عند الأحجام المطلوبة التي يشير إليها النظام لعدد الانزلاقات الكلي:
- أدخل وعاء فارغ مملوء ب PBS في ذراع الكاشف.
- أدخل وعاء كاشف يحتوي على 0.3٪ ترايتون X-100 مخفف في PBS إلى ذراع الكواشف.
- إدخال وعاء الكواشف الذي يحتوي على محلول حاجز – 10٪ مصل الحمار في 0.3٪ BSA في PBS إلى ذراع الكاشف.
- وعاء كاشف يحتوي على DAPI (1 ميكروغرام·مل-1) مخفف في PBS إلى ذراع كاشف.
- أدخل ذراع الكواشف بالكامل (مع أواني الحاوية المحضرة) في النظام.
- باتباع التعليمات الظاهرة على الشاشة، قم بإنشاء بروتوكول تلوينات آلي يتضمن الخطوات التالية التي يجب تشغيلها طوال الليل:
- اخبز على حرارة 60 درجة مئوية لمدة 10 ساعات.
- حضن ب Triton X-100 بنسبة 0.3٪ مخفف في PBS (10 دقائق).
- اغسل باستخدام مادة الغسل بالجملة (روتين مبرمج مسبقا).
- حضن باستخدام كاشف الكتلة Epitope Retrieval 1 (ER1) (20 دقيقة، 100 درجة مئوية).
- اغسل باستخدام مادة الغسل بالجملة (روتين مبرمج مسبقا).
- حضن باستخدام كاشف الكتلة Epitope Retrieval 2 (ER2) (20 دقيقة، 100 درجة مئوية).
- اغسله ثلاث مرات باستخدام مادة الغسل السائبة (روتين مبرمج مسبقا).
- حضانة مع محلول الحماية - 10٪ مصل الحمار و0.3٪ BSA في PBS (ساعة واحدة).
- DAPI (1 ميكروغرام·مل-1 في PBS) أربع مرات لمدة 5 دقائق في كل مرة.
- غسل (روتين مبرمج مسبقا).
- تأكد من ضبط جميع أحجام الجمع على 150 ميكرولتر وأن خطوة التحضير مضبوطة على إزالة الشمع باستخدام القائمة المنسدلة.
- أضف تفاصيل تصل إلى 30 شريحة واطبع ملصقات الباركود.
- أزل صينية الشرائح وأدخل الشرائح وهي تواجه الأعلى. أضف بلاط غطاء فوق كل شريحة تواجه الأعلى. ضع ملصقات الباركود بحيث تقرأ من الأعلى إلى الأسفل على الشريحة.
- ضع صينية السحب مرة أخرى في جهاز التصبغ التلقائي وأغلق عبر زر الصينية الأمامية.
- اضغط زر البدء لكل ذراع منزلق محمل حاليا بشرائح التشغيل.
ملاحظة: يستغرق البروتوكول الكامل ~15 ساعة للتشغيل (بما في ذلك 10 ساعات للخبز). يمكن تأجيل وقت البدء لتوفير غسلات إعادة الترطيب. - قم بتركيب الشرائح في حوامل منزلقات بدون غطاء بعد الانتهاء من الدورة.
- تحميل حامل الانزلاق بدون غطاء
- ضع الشرائح في حامل الشرائح بدون غطاء منزلق، مع التأكد من محاذاة الحواف العلوية واليمنى مع الحواف المعدنية.
- اقفل السلايد في مكانه باستخدام الكاميرات البلاستيكية (باستخدام الاثنين معا) عن طريق الدوران إلى وضع القفل المغلق.
- تأكد من أن الشريحة مستوية تماما ولا تتأرجح داخل الحامل.
- ضع حجرة إدخال حامل الانزلاق بدون غطاء فوق السلايد، عن طريق قرص القضبان الجانبية بكلتا اليدين لتقليل الضغط ومنع الكسر.
- حمل حامل السلايد بدون غطاء عبر منفذ المدخل باستخدام وسائط تركيب بحجم 2 مل مكونة من 50٪ جليسرول في PBS.
- أضف ملصق باركود إلى الشريحة نفسها على الجانب الأيسر من الشريحة في أي من الاتجاهين.
- تابع إلى التصوير.
2. تصوير متعدد الأجزاء
- اختيار المنطقة والتصوير الذاتي التألقي
- افتح برنامج اكتساب التصوير متعدد القنوات (مثل سير عمل Mx (4.2.0.4)) وأنشئ بروتوكولا يحتوي على الجولات / العلامات الحيوية وأوقات التعريض المطلوبة باستخدام معالج ناشر البروتوكولات.
ملاحظة: حدد مسبقا تعيين كل جسم مضاد للقنوات المتاحة. تقييد العلامات الضعيفة (أي تلك التي تتطلب أوقات تعرض أعلى) إلى قنوات Cy5 و Cy7 التي لديها أقل تألق ذاتي. يمكن استخدام حد أقصى 4 أجسام مضادة في كل جولة في نظام التصوير الفلوري متعدد الطلقات. - إذا كانت هناك حاجة لصور H&E افتراضية، فتأكد من الحصول على قناة Cy3.
- أضف الشرائح إلى بروتوكول (باستخدام رقم الباركود) عبر أداة إنشاء الدفعات لإنشاء سير عمل تجريبي متعدد الإرسال.
- قم بتحميل الشريحة في المجهر عبر برنامج الاستحواذ (4.2.0.4) واتباع سير العمل برسم مناطق الاهتمام عبر خطوات التصوير 2x و10x لكل شريحة. عند اختيار المناطق، تأكد من أن لكل مجال رؤية جاران على الأقل لمنع مشاكل الخياطة.
- قلل من كمية الزجاج الفارغ المصورة لمنع مشاكل الغياطة وتقليل أوقات العمل بعدم اختيار الحقول الفارغة.
- قم بإجراء تصوير التألق الذاتي بمقدار 20x باستخدام أوقات التعريض المحددة في الخطوة 2.1.1 واتبع معالج مراقبة الجودة (QC). تأكد بصريا أنه لا توجد مناطق خارجة عن التركيز أو قطع أثرية. إذا تم تحديد هذه الموارد، فأفشل في اختبار الجودة وأعد التصوير.
ملاحظة: لا يوجد مقياس واحد لصرامة مراقبة الجودة المقبولة، وسيعتمد النجاح على القراءات التجريبية المطلوبة ومدى قيمة العينة. يجب أن يبدو النسيج البؤري مع كثافة الصبغ الكافية واضحا وواضحا من الناحية البصرية. غالبا ما تلاحظ مناطق صغيرة من انفصال أو تدهور الأنسجة، والتي لن تتحسن مع التصوير الإضافي ويمكن تحملها إذا تم تصوير بقية العينة بشكل جيد. إذا لوحظت تشوهات كبيرة ومضيئة (مثل الغبار)، فمن الأفضل إزالتها عن طريق تنظيف الشريحة وإعادة التصوير. - توليد صور خلفية سيتم طرحها من الإشارة النهائية للمؤشر الحيوي، في عملية تتكرر في كل جولة متعددة الإصدارات.
ملاحظة: سيتم محاذاة جميع جولات المجمع تلقائيا عبر برنامج الاستحواذ.
- افتح برنامج اكتساب التصوير متعدد القنوات (مثل سير عمل Mx (4.2.0.4)) وأنشئ بروتوكولا يحتوي على الجولات / العلامات الحيوية وأوقات التعريض المطلوبة باستخدام معالج ناشر البروتوكولات.
- استخدام معالج الألواح الروبوتي
- تأكد من إغلاق برنامج الاستحواذ.
- افتح برنامج دمج الروبوتات واضغط على ابدأ.
- ضع حامل الشريحة بدون غطاء مكدس في مكدس الإدخال.
- تأكد من أن مكدس الإخراج فارغ.
- افتح برنامج التحكم في متحكم اللوحة الروبوتية (مثل برنامج Harmony للروبوتات (3.2.0)) واتبع المعالج، مع التأكد من اختيار نوع اللوحة والرقم الصحيحين.
- انقر على بدء التشغيل وسيحمل معالج اللوحة المجهر، الذي سيعرف تلقائيا مرحلة سير العمل الصحيحة بسبب الباركود الشريحي.
ملاحظة: إذا كنت تستخدم المحمل الآلي لخطوات تصوير المؤشر البيولوجي أدناه، فمن الضروري إلغاء اختيار خيار "أوقات التعريض المعينة ديناميكيا" في البرنامج واستخدام أوقات تعريض محددة مسبقا.
- التلوين الحيوي التسلسلي، تعطيل الصبغة، والتصوير متعدد القنوات
- الأجسام المضادة للطرد المركزي بقوة 13,000 × جرام لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة للحد من الآثار الأثرية.
- حضر محلول الأجسام المضادة في PBS يحتوي على 0.3٪ BSA.
ملاحظة: التركيزات النهائية للأجسام المضادة تختلف، لكن تخفيف 1:200 هو نقطة انطلاق جيدة لتحسين الجسم المضاد الجديد. - أزل وسائط التثبيت عن طريق إزالة الأنابيب من منفذ حامل السلايد بدون غطاء وغسل بإضافة 2 مل PBS يحتوي على 0.01٪ Tween لمدة 5 دقائق (كرر هذه الخطوة ثلاث مرات).
- قم بإزالة PBS وإجراء صبغ الأجسام المضادة عن طريق حقن محلول الأجسام المضادة بسعة 350 ميكرولتر مخفف في PBS إلى المنفذ. تم تحسين هذا الحجم لضمان تغطية كاملة للعينات داخل غرفة التلوين.
- حضن لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة على سطح الطاولة.
- أزل محلول الأجسام المضادة عن طريق إزالة الماصات من منفذ حامل السلايد بدون غطاء وغسل بإضافة 2 مل PBS يحتوي على 0.01٪ Tween لمدة 5 دقائق (كرر هذه الخطوة ثلاث مرات).
- أزل PBS وأضف وسائط تركيب بحجم 2 مل.
- أدخل حامل منزلق بدون غطاء في المجهر لبدء خطوة تصوير تلقائية خاصة بالجولة.
- بعد اكتمال التقدم، تقدم سير العمل بتمرير خطوات مراقبة الجودة كما هو موجه على الشاشة.
- أزل وسائط التثبيت عن طريق إزالة الأنابيب من منفذ حامل السلايد بدون غطاء وغسل بإضافة 2 مل PBS يحتوي على 0.01٪ Tween لمدة 5 دقائق (كرر هذه الخطوة ثلاث مرات).
- جهز محلول تعطيل الصبغة حديثا الذي يحتوي على 7 مل ddH2O، 2 مل 0.5M NaHCO3 و1 مل 30٪ H2 O2. جهز هذا المحلول فورا قبل الاستخدام وطبقه على الشرائح دون تأخير.
تحذير: يجب التعامل مع بيروكسيد الهيدروجين باستخدام معدات الحماية الشخصية المخبرية المناسبة. - قم بإزالة PBS وإضافة 2 مل من تعطيل الصبغة لكل شريحة مباشرة بعد إضافة H2O2 إلى المحلول العامل.
- احتضن لمدة 15 دقيقة على سطح الطاولة في حامل المنزلق.
- أزل محلول تعطيل الصبغة عن طريق إزالة الأنابيب من منفذ حامل الشريحة بدون غطاء واغسله لمدة 5 دقائق في 2 مل PBS يحتوي على 0.01٪ Tween.
- أزل PBS وأضف وسائط تركيب بحجم 2 مل.
- أدخل حامل الشريحة بدون غطاء في المجهر لبدء تصوير تلقائي خاص بالفلورة الدائرية بمقدار 20x.
- بعد اكتمال التقدم، تقدم سير العمل بتمرير خطوات مراقبة الجودة كما هو موجه على الشاشة.
- كرر الخطوات من 2.3.1 إلى 2.3.17 للحصول على عدد من الجولات/العلامات المطلوبة. (تم التحقق من العملية من قبل الشركة المصنعة حتى 10 طلقات، رغم أن سلامة الأنسجة ستكون العامل الأساسي في هذا الحد).
3. تحليل HighPlex الآلي عبر برامج علم الأمراض الرقمية
- تحميل البيانات وتقسيم TMA
- قم بسحب وإفلات صور IF متعددة الإرسال إلى تبويب "الدراسات" في برنامج علم الأمراض الرقمي.
- يجب استيراد صور H&E الافتراضية بشكل منفصل.
- بالنسبة لعينات المصفوفة الدقيقة للأنسجة (TMA) استخدم "وحدة TMA". هذا يسمح بوضع العلامات على أساس كل نواة، مما يجعل تتبع بيانات البيانات أكثر وضوحا من التعامل مع الشريحة ككل.
- لإنشاء كتلة TMA، انتقل أولا إلى إجراءات الكتلة وأنشئ خريطة TMA جديدة.
- يمكن إدخال ذلك يدويا أو باستخدام جدول بيانات إكسل عبر معالج الاستيراد.
- قم بتقسيم TMA بالنقر بزر الفأرة الأيمن على العينة في تبويب الدراسات واختيار "تقسيم TMA".
- اختر حجم النوى واصطفها مع الخريطة عن طريق تحريك المربعات الحمراء. اضغط على الحفظ بمجرد الانتهاء.
- يمكن الآن إجراء التحليل وتصدير البيانات بطريقة مركزية.
ملاحظة: يمكن أيضا تشغيل خط الأنابيب التالي على أقسام الأنسجة الكاملة دون استخدام وحدة TMA.
- قم بسحب وإفلات صور IF متعددة الإرسال إلى تبويب "الدراسات" في برنامج علم الأمراض الرقمي.
- تقسيم الهدف الواحد
- انتقل إلى تبويب التحليل.
- في قائمة "الإعدادات الإجراءات" المنسدلة، اضغط على التحميل واختر وحدة تحليل الفلورة في HighPlex.
- لهذه النتائج تم استخدام الإصدار v5.2.2.
- في اختيار الصبغة، قم بتعبئة العلامات قيد التقييم يدويا أو عبر وظيفة "التعبئة التلقائية للصبغات".
- في الكشف النووي، اختر نوع تقسيم مناسب لنسخة HALO (هنا يوصف النسخة التقليدية غير الذكاء الاصطناعي).
- اضبط عتبة التباين النووي لالتقاط النوى (عادة في النطاق 0.4 – 0.6).
- اضبط الحد الأدنى لشدة النوى لالتقاط النوى (عادة لا تقل عن 0.05).
- خفض أقصى سطوع الصورة إلى حوالي 0.4 اعتمادا على شدة إشارة DAPI (انخفضت من 1 بسبب النطاق الديناميكي للصور ذات 16 بت).
- قم بضبط معايير إضافية مثل عدوانية التقسيم، وثقوب الملء، وفلاتر الحجم، حسب نوع الأنسجة.
- كرر هذه العملية للكشف عن الغشاء والسيتوبلازم.
- بالنسبة للكشف التقليدي عن السيتوبلازم، غالبا ما يكون نصف قطر الطوق بين 2 و5 نقطة انطلاق جيدة.
- اختيار العتبة الإيجابية للمؤشر البيولوجي
- سيتم قياس كل مؤشر حيوي يتم اختياره في مرحلة اختيار الصبغة لقيم الشدة الخام.
- حدد تصنيفات عتبة ثنائية (موجبة مقابل سالبة) أو متعددة (عالية، متوسطة، منخفضة، سالبة) لكل علامة، وضبط القيم باستخدام الشرائح في الحجرات النووية أو السيتوبلازمية أو الغشائية حسب نمط التلوين.
- لتحديد عتبة ثنائية، قم بضبط المنزلق السفلي فقط لتحديد قيمة القطع.
- قيم الأداء باستخدام نافذة الضبط في الوقت الحقيقي في قائمة "التحليل" وعن طريق تشغيل وإيقاف قناع التحليل للمقارنة مع مستويات الصبغ الخام.
- أنشئ مجموعات من العلامات باستخدام دالة "الأنماط الظاهرية".
- يشمل التوزيعات المنطقية AND/OR موجب/سالبة لجميع العلامات، مما يسمح ببناء مصفوفة غير محدودة عبر جميع الصبغات.
- اضبط بيانات الكائنات المخزنة على الحقيقة إذا كانت هناك حاجة لبيانات هدف واحد (وهي مطلوبة للتحليل المكاني).
- احفظ البروتوكول وفي تبويب الدراسات قم بتحديد جميع الشرائح للتحليل، ثم انقر بزر الفأرة الأيمن وتحليل البروتوكول المطلوب.
4. مراجعة النتائج
- التقييم المكاني في برامج علم الأمراض الرقمية
- عرض جميع النتائج في تبويب "النتائج" في برنامج علم الأمراض الرقمي.
- جدول الملخص في الأعلى سيكون متوسطات جميع الميزات عبر الصورة الحالية.
- سيكون هذا لنواة واحدة إذا تم فتحها بشكل منفصل.
- الجدول السفلي سيعرض بيانات الهدف الواحد لكل ميزة.
- استفسر نقاط البيانات الفردية باختيار من الجدول أو النقر على الصورة.
- أنماط المرشح، أو عتبات إيجابية المؤشر أو شدة المرشحات في الأعمدة المناسبة. يمكن بعد ذلك رسم هذه الخطوط من خلال التنقل إلى: "فعل الجسم" > "رسم بياني" > "مخطط مكاني".
- بمجرد إجراء ذلك لعدة مجموعات مختلفة، يمكن إجراء التحليل المكاني.
- اختيار زر "التحليل المكاني" واختيار الخيارات حسب الحاجة:
- أقرب جار: سيحدد المسافة إلى أقرب ملاحظة لنوع خلية محدد من نوع آخر.
- تحليل القرب: يقيس في نطاقات حول نوع خلية محدد ويقيس عدد ومسافة أي نوع آخر من الخلية.
- تحليل التسرب: يقيس بالنطاقات المسافة إلى طبقة تعليق محددة (يتم تمييزها على الصورة عبر أداة التعليقات) حيث تم العثور على نوع خلية معين.
- خريطة الحرارة الكثافة: ستولد تصورا لتوزيع نوع الخلية في جميع أنحاء الصورة.
- يمكن تشغيل التحليل المكاني عبر جميع أنوية TMA عبر زر "تحديد النتيجة" تحت إجراءات الانزلاق وقائمة "إجراءات النتائج" المنسدلة.
- تصدير النتائج من برنامج علم الأمراض الرقمي
- يمكن تصدير النتائج من تبويب TMA عن طريق التنقل إلى "إجراءات الانزلاق" > "تصدير".
- يمكن تصدير بيانات ملخصة فقط أو تحليل هدف واحد كامل عبر التبويب المتقدم.
- توليد البيانات كملفات .csv يمكن تحليلها بعد ذلك باستخدام برامج مثل R لتوليد تحليل على مستوى السكان لشدة المؤشرات الحيوية عبر جميع الخلايا. تشمل ميزات الكائن الواحد: معرف العينة، معرف الكائن الفريد (لكل خلية)، قيم الشدة الخام لكل علامة، تصنيفات النمط الظاهري والإحداثيات المكانية.
النتائج
10-plex IF وH&Virtual المزدوج تم توليد صور E ل 136 نواة نسيج ميكروآراي تغطي 34 نوعا من الأنسجة البشرية عبر شريحتين تم إعدادهما بمنهجيات مختلفة (الشكل 2). تظهر هذه الصور التمثيلية نجاحا في التلوين المتعدد مع الحفاظ على شكل الأنسجة واكتشاف واضح لعدة علامات حيوية عبر أنوية الميكروآراي الأنسجة. استخدم أحد الشرائح جهاز تلوين الشرائح الآلي، والآخر عملية تحضير الشرائح يدويا. لوحظ حدوث تشوهات أنسجة أكبر مع الطريقة اليدوية المعتمدة على غرفة إزالة التخفي بما في ذلك انفصال الأنسجة، بالإضافة إلى فقدان أو انزلاق النوى (الشكل 3). تقلل هذه الشوائب من منطقة الأنسجة القابلة للتحليل لكل عينة أو نواة، مما يؤثر على تحليل الصور المتعددة في المراحل النهائية. تؤكد هذه الملاحظات أن البروتوكول يتيح تلوينا وتصويرا موثوقا عبر أنواع الأنسجة المتنوعة.
يشير نجاح التصوير المتعدد إلى الحفاظ على شكل الأنسجة، ومحاذاة متسقة عبر طلقات التلوين، واكتشاف واضح ومحدد للإشارات البيولوجية. على النقيض من ذلك، تتميز النتائج غير المثالية بانفصال الأنسجة، فقدان الإشارة، أو تشوهات تصويرية تقلل من المناطق القابلة للتحليل وتؤثر على التحليل اللاحق.
بعد ذلك، تمت مقارنة ملف التلوين لعلامات مثل PANCK (النسيج الطلائي)، CD31 (النسيج البطاني)، aSMA (النسيج البترومي)، الكيراتين 15 (K15؛ الظهارة الأساسية)، الفيمنتين (الخلايا الميزنشيمية)، Ki67 (علامة التكاثر)، CD8 (الخلايا التائية السامة للخلايا) وFOXP3 (TREGs)، عبر كلتا تقنيتي تحضير الشريحة، مع ملاحظة انخفاض طفيف في الإشارة نوعيا (بصريا) باستخدام الطريقة اليدوية (الشكل 4A). باستخدام عتبات تصنيف المؤشرات الحيوية في برنامج علم الأمراض الرقمي، تم تصنيف العينات إلى مجموعات إيجابية وسالبة لكل خلية من ~630 ألف خلية في مجموعة البيانات (الشكل 4B). تم إجراء التقييم الكمي لإشارة العلامة باستخدام قياسات الشدة المستمدة من سير عمل تحليل الأمراض الرقمي. أظهرت تقديرات كثافة السكان (حيث تمثل المساحة تحت المنحنى 100٪ من السكان) وقيم الشدة الوسيطة زيادات طفيفة في العلامات الحيوية 5/8 ضمن السكان الإيجابيين عند استخدام جهاز التلوين الآلي مقارنة بالعملية اليدوية (الشكل 4C).
بعد إكمال اللوحة، تم إقران العلامات الموصوفة أعلاه مع مؤشرات حيوية إضافية ل لامين B1 (الغشاء النووي) وp16 (مثبط كيناز معتمد على السيكلين)، مما يسمح برؤية وفرة الأنسجة النسبية وتوزيع جميع العلامات العشرة عبر عينة واحدة (الشكل 5). تعد القدرة على تحليل عدد كبير من العلامات الحيوية ذات فائدة خاصة في مجال الشيخوخة، الذي يعتمد على تقييم علامات متعامدة متعددة لضمان تصنيف صحيح2. هنا، تمكنا من تحليل التغيرات في شدة لامين B1 ضمن مجموعات p16 العالية والمنخفضة. ومن المهم أن هذه كانت عينة متعددة التركيبات، فقد تم وضع هذه الخلايا في سياق مكاني، من خلال مقارنتها بتوزيع أنواع الخلايا الأخرى داخل نفس النسيج (الشكل 6A). من خلال عتبة تصنيف برنامج علم الأمراض الرقمي، تم قياس هذا التلوين لإثبات أن الخلايا الموجبة p16 مرتبطة بمستويات أقل من لامين B1 مقارنة بنظيراتها السلبية (الشكل 6B)، وهو ملف يتوافق مع أنماط العلامات المرتبطة بالشيخوخة الموصوفةسابقا 12. كما لاحظنا أن خلايا لامين B1 سالبة لديها مستويات أعلى من p16 (الشكل 6C). باستخدام وظيفة الأنماط الظاهرية في برنامج علم الأمراض الرقمي (الذي يصنف الخلايا بناء على تقسيم الخلية الفردية والعتبة لمؤشرات متعددة)، تم استخدام دمج هذه العلامات لتعريف مجموعة من الخلايا على أنها متقدمة في السن، أي تلك التي تكون موجبة p16 وسلبية في لامين B1. ثم تم قياس نسبة هذه الخلايا عبر جميع النوى حسب نوع الأنسجة، مع كل علامة من العلامات العشرة بشكل فردي (الشكل 6D). يتيح هذا الناتج المقارنة الكمية لمجموعات الخلايا المعرفة بالمؤشرات الحيوية عبر أنواع أنسجة متعددة ضمن مجموعة بيانات التعدد. على الرغم من أن خط أنابيب التحليل يعمل على مستوى الخلية الواحدة، إلا أن مجموعة البيانات الحالية تعرض بشكل أساسي باستخدام توزيعات على مستوى السكان. قد يحد الوفرة المنخفضة نسبيا لخلايا p16 الموجبة في هذه المجموعة من القدرة الإحصائية على تحليل الارتباط القوي بين p16 ولامين B1، ولذلك يجب تفسير هذه العلاقات بحذر.
الشكل 1: مخطط يوضح سير عمل الفلورة المناعية المتعددية الكاملة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2: نظرة عامة على تصوير المتبادلات: (A-B): Virtual H& صور E تم توليدها من تلوين DAPI وتوهج Cy3 الذاتي للجولة الأولى لعرض سلامة الأنسجة للشرائح المحضرة باستخدام عملية تلوينات الشرائح الآلية أو التحضير اليدوي للشرائح. (C-D): تلوين IF متعدد الأبعاد لجميع العلامات الحيوية. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 3: أمثلة على أنواع القطع الأثرية: أمثلة تمثيلية لأنواع مختلفة من القطع الأثرية التي يمكن توليدها بشكل أساسي أثناء تحضير الشريحة. يمكن ملاحظة انفصال جزئي للأنسجة كمناطق خارج التركيز وقد يسبب مشاكل في محاذاة الأنسجة في الجولات اللاحقة. فقدان النوى يقلل من قوة التجربة وغالبا ما يحدث بشكل غير متناسب في أنواع الأنسجة الحساسة. تحدث الانزلاق أو التداخل بين النوى عندما تنفصل النواة عن موقعها على TMA لكنها تلتصق بمنطقة أخرى، مما يزيد من فقدان العينة ويجعل النواة المخفية صعبة التحليل. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 4: مقارنة بين الطلاء الذاتي BOND وإشارة الفلورة اليدوية لتحضير الشريحة: (A): تلوين IF تمثيلي لعلامات الهيكل بان سيتوكيراتين (PANCK)، CD31، وأكتين العضلة الملساء ألفا (aSMA). يظهر دمج هذه الصور الثلاث في العمود الأول. (B): أقنعة تحليل التصنيف الثنائي من برنامج علم الأمراض الرقمي، تشير إلى اكتشاف المؤشرات الإيجابية عبر أنواع الخلايا المختلفة: CD31 (أحمر)، FOXP3 (فيروزي)، Ki67 (أصفر)، CD8 (أبيض)، PANCK (أخضر). المربع الأبيض يشير إلى منطقة التكبير الرقمي في اللوحات السفلية. (C): قياس شدة المؤشر الحيوي في مجموعات الخلايا المجمعة حسب طريقة تحضير الأنسجة (جهاز تلوين منزلق آلي = أحمر، يدوي = أزرق) وإيجابية العلامة (داكن = سالب، فاتح = إيجابي). تمثل المساحة تحت كل مخطط كثافة 100٪ من مجموعة الخلايا المحللة. AF = التألق الذاتي. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 5: لوحة متعددة كاملة: صور ممثلة من نسيج الزائدة تظهر A-B: لوحة IF كاملة من 10 أرقام C: PANCK (أخضر)، D: CD31 (أحمر)، E:aSMA (أصفر)، F: K15 (وردي)، G: فيمنتين (أبيض)، H: Lamin B1 (تركواز)، I:p16 (ذهبي)، J: Ki67 (أصفر ساطع)، K: CD8 (أخضر ساطع) و L: FOXP3 (بنفسجي). المربع الأبيض = التكبير الرقمي (الدمج، CD31، aSMA، K15، Vim، LB1، p16)، المربع المتقطع = التكبير الرقمي (Ki67، CD8، FOXP3). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 6: اكتشاف علامة الشيخوخة: (A): IF ممثل من صور أنسجة البنكرياس تظهر أنماط تلوين متباينة بين لامين B1 (الفيروزي) وp16 (الذهبي) مع علاقة مكانية مع علامات أخرى مثل PANCK (الأخضر)، CD31 (الأحمر) وفيمنتين (الأبيض). (B): قياس كثافة نواة لامين B1 (LB1) في مجموعات الخلايا الموجبة والسالبة p16. (C): قياس كثافة الخلايا p16 في مجموعات الخلايا الموجبة والسالبة من Lamin B1 (LB1). تمثل مساحة مخطط الكثافة تحت المنحنى 100٪ من السكان. (D): خريطة الحرارة الموحدة بدرجة Z لمتوسط نسبة إيجابية النواة لكل مؤشر حيوي أو نمط ظاهري للشيخوخة (p16+/LB1-ve) عبر أنواع الأنسجة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
المناقشة
يسهل التصوير المتقطع المتقطع المتعدد، عبر منصات آلية، توليد ملفات تعريف دقيقة للوحة كبيرة من المؤشرات الحيوية داخل أقسام نسيج واحدة13. عند دمجها مع برامج علم الأمراض الرقمي مثل HALO، يسمح ذلك بفحص كل من وفرة وعلاقات الأماكن لأنواع الخلايا، بالنسبة لبعضها البعض وكذلك توزيعها عبر هياكل الأنسجة المختلفة3. وهذا لديه القدرة على إضفاء قيمة كبيرة على مجال الشيخوخة، الذي يعتمد على تركيبات السمات المميزة لتصنيف قوي للخلايا الشيخوخة، والتي بدورها تثبت أنها تمتلك تغايرا كبيرا وبالتالي تتطلب تنميطا للخلايا المستهدفة واحدة لا يمكن تحقيقه مع أقسام الأنسجة14 المتسلسلة. علاوة على ذلك، يختلف عبء الخلايا المتقدمة في السن عبر الأنسجة، وقد يتراكم بمعدلات مختلفة مع التقدم في العمر، وهناك ندرة واضحة لمؤشرات الشيخوختة في الجسم الحي، مما يجعل القدرة على استخدام لوحة أكبر من العلامات الحيوية مرغوبة في سياقات جديدة حيث قد تتطلب مرونة أكبر 5,15,16. ومن المهم أن الدراسات السابقة أظهرت أن تراكم وديناميكيات الخلايا الزمنية للشيخوخة تعتمد بشكل كبير على الأنسجة، مع تفاوت كبير في الوفرة والبداية عبر أنظمة الأعضاء، مما يبرز أن الشيخوخة لا تحدث بشكل متزامن عبر الأنسجة. يمكن لتقنيات التحليل المكاني البديلة، مثل النسخات المكانية أو تصوير القياس الخلوي الكتلي، أن توفر معلومات جزيئية مكملة؛ ومع ذلك، يقيس التألق المناعي متعدد القنوات تعبير البروتين مباشرة ويتيح تحليلا مكانيا عالي الدقة لأنماط الخلايا داخل أقسام الأنسجة السليمة. الطبيعة المتسلسلة لنمط التفاعل المتعدد في البناء السريع تتيح أيضا خط أنابيب اكتشاف تكراري.
يمكن إجراء تصوير متعدد الوسائط في سير عمل عالي الإنتاجية من خلال التكامل مع جهاز تلوين شرائح آلي. بالإضافة إلى توفير مزايا كبيرة من حيث التوحيد القياسي، يبدو أن تحضير الشريحة الآلي يؤدي أيضا إلى عدد أقل من القطع الأثرية مقارنة باستخدام نهج يدوي قائم على غرفة إزالة التخفيه، حيث لوحظ انفصال الأنسجة وفقدان اللبنة. ومع ذلك، تستند هذه الملاحظات إلى مقارنة نوعية، وسيكون هناك حاجة إلى تقييم كمي إضافي لتحديد الفروق رسميا في تلف الأنسجة الناتج عن المعالجة. وهذا أمر يثير القلق بشكل خاص في أنواع الأنسجة الدهنية مثل الجلد والثدي. علاوة على ذلك، يسمح نظام حامل الانزلاق بدون غطاء بالدمج مع مناولات الألواح الروبوتية، مما يتيح إنتاجية أعلى ويقلل من وقت المشغل من خلال تسهيل تحسينات سير العمل مثل عمليات التصوير الليلية. بينما من المتوقع أن تحسن الأتمتة من معدل الإنتاجية والتوحيد القياسي، لم يتم تقييم المقارنة الكمية لهذه التحسينات رسميا في هذه الدراسة ويجب تفسيرها كملاحظة عملية بدلا من كونها نتيجة مقاسة. مع تحضير عينات كمصفوفات أنسجة دقيقة، يصبح من الممكن إجراء هذه التحليلات الشاملة لمئات عينات المرضى عبر عدد قليل نسبيا من الشرائح، مما قد يسهل دراسات مستقبلية لتحقيق الخلايا المتقدمة في السن في عينات الأنسجة السريرية 5,11.
بينما لوحظت زيادات طفيفة في شدة العلامات باستخدام صبغة الشريحة الآلية مقارنة بعملية تحضير الشريحة اليدوية، فإن هذه الميزة في الواقع طفيفة، حيث يمكن عادة التغلب على انخفاض الإشارة إما باستخدام أوقات تعريض أطول أو تعديلات على عتبات التحليل. تؤثر عدة خطوات رئيسية بشكل حاسم على نجاح الاختبار، بما في ذلك تحسين الأجسام المضادة، وتصميم لوحات التعدد، واختيار معلمات التصوير. التحقق الدقيق من توافق الأجسام المضادة، وشدة الإشارة، ومقاومة دورات التلوين المتكررة أمر ضروري لضمان بيانات متعددة القنوات قابلة للتكرار وعالية الجودة. الأهم بكثير هو التحسين الدائري واختيار القنوات للمؤشرات الحيوية. يتم تقييم هذه العينات على عينات الاختبار بشكل فردي ومجتمع، لضمان عدم وجود تفاعل متبادل بين الأجسام المضادة، وكذلك لإثبات أن تعطيل الصبغة واكتشاف الحواتم ممكنة في الجولات المطلوبة. يوصى باستخدام علامات ضعيفة أو أقل وفرة في قناتي Cy5 و Cy7 التي عادة ما تظهر تألق ذاتي أقل. يتم اختبار اللوح النهائي في نوع الأنسجة المعنية، حيث أن بعض أنسجة التحسين المستخدمة على نطاق واسع (مثل اللوزتين) غالبا ما تتطلب تركيزات وأوقات تعرض أقل من البيئات التجريبية، والتي قد تختلف أيضا في خصائصها مثل التألق الذاتي. ومع ذلك، يمكن أن تكون هذه الأنسجة الإيجابية مفيدة عندما يكون وجود نوع الخلية غير مؤكد في الأنسجة التجريبية، حيث لا يمكن تمييز نقص الإشارة بسهولة عن غياب الخلايا المستهدفة. يعد الاجتهاد في هذه التحسينات اللوحية ضمن نوع الأنسجة المستهدفة الخطوة التجريبية الأكثر أهمية لضمان نجاح الاختبار، لتقليل فقدان المؤشرات الحيوية من التجارب النهائية. تنشأ غالبية المشاكل بسبب تفاعل الأجسام المضادة، أو ضعف الإشارة بسبب انخفاض تركيزات الأجسام المضادة، أو انخفاض الإشارة إلى الضوضاء في قنوات FITC/Cy3. بالإضافة إلى ذلك، فإن حفظ المستضدات تحت خطوات تعطيل الصبغة المتكررة يعتمد على الأجسام المضادة والأنسجة، مما يستلزم استخدام خطوات تحسين شاملة لضمان اختيار تركيبات الألواح/الدوائر المناسبة للعينات التجريبية. أحد القيود الرئيسية في سير عمل التألق المناعي متعدد القنوات هو الاعتماد على الأجسام المضادة عالية الجودة، إلى جانب استقرار الحواتم عبر دورات التلوين المتكررة وتعطيل الصبغة.
بشكل عام، يمثل التصوير متعدد الإرسال مع منصات الأتمتة تغييرا في التعقيد لتقييم القيم الداخلي لعينات الأنسجة الحية داخل الجسم ، مما يسهل التحليل المكاني الشامل لألواح معقدة من العلامات الحيوية على مستوى الخلية الواحدة. تشمل التطبيقات المستقبلية لهذا سير العمل التحليل الواسع النطاق للمؤشرات الحيوية المرتبطة بالشيخوخة عبر أنواع الأنسجة المتنوعة والتكامل مع مناهج الأوميكس المكانية الناشئة لمعالجة التباين الخلوي داخل بيئات الأنسجة المعقدة.
الإفصاحات
عملت CLB كمستشارة لشركات مثل Senisca، StarkAge، وAKLRD. حصل مختبر CLB على تمويل من ValiRx.
مساهمة المؤلف:
طور RW LG وCLB المفهوم الأولي. أنهت شركات RW وFM وMGC وLG وCLB المفهوم، وطورت وصممت التجارب. أجرت جميع التجارب، RW وFM وMGC وLG. كتب RW وCLB المسودة الأولية للمخطوط مع مساهمة جميع المؤلفين في مراجعات المخطوطة قبل التقديم. جميع المؤلفين قرأوا ووافقوا على المخطوطة النهائية.
شكر وتقدير
تعترف CLB بتمويل FM وMGC من BBSRC (BB/T008709/1 و BB/W510427/1 على التوالي) ولشراء Cell DIVE من مؤسسة ويلكوم (223803/Z/21/Z).
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 30% Hydrogen Peroxide (H2O2) | Merck | H1009 | |
| Antigen unmasking solution 1 (H3300) (ARS1) | Vector Labs. | H-3300 | Prepare with 12.5 ml Antigen Unmasking Solution + 237.5 ml ddH2O |
| Antigen unmasking solution 2 (ARS2) | Sigma | T6066 / E5134 | Prepare 10x stock (12.9 g Trizma base, 3.7 g EDTA, 5 mL Tween 20, 995 mL ddH20). |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Merck | A2153 | |
| Bulk Dewaxing Solution | Leica | AR9222 | |
| Bulk Epitope Retrieval 1 (ER1) | Leica | AR9961 | |
| Bulk Epitope Retrieval (ER2) | Leica | AR9640 | |
| Bulk Wash Solution | Leica | AR9590 | |
| DAPI | Merck | D3571 | |
| Doubled distilled water (ddH20) | N/A | N/A | |
| DMSO | Merck | 472301 | |
| Donkey Serum | Merck | D9663 | |
| EDTA | Merck | E5134 | |
| Glycerol | Merck | G5516 | |
| NaHCO3 | Merck | S5761 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Merck | BP399 | |
| Propyl Gallate | Merck | P3130 | |
| Sodium Bicarbonate | Merck | S5761 | |
| Triton X 100 | Merck | H5141 | |
| Trizma Base | Merck | T6066 | |
| Tween20 | Merck | P1379 | |
| Other consumables or Equipment | |||
| Decloaking chamber | BioCare | DC2012 | |
| Steam strips | BioCare | 613QC | |
| Bond RXm Auto Slide Stainer | Leica | HIS2330 | Referred to as automated slide stainer |
| Cell DIVE | Leica | 29429159 | Referred to as multiplex fluorescence imaging system |
| Click Well slide holders | Leica | 29463259 | Referred to as Well Coverslipless Slide Holder |
| Antibody List | |||
| CD31 (Pecam-1) | Cell Signalling | 61255 | Clone: 89C2 Fluorophore: AF555 Dilution: 1 in 50 |
| CD8a | BioLegend | 372906 | Clone: C8/144B Fluorophore: Alexa 647 Dilution: 1 in 100 |
| CDKN2A/p16 | Santa Cruz | sc-56330 AF647 | Clone: jc8 Fluorophore: Alexa 647 Dilution: 1 in 200 |
| FOXP3 | BioLegend | 320114 | Clone: 206D Fluorophore: Alexa 647 Dilution: 1 in 50 |
| Keratin 15 | Abcam | ab194065 | Clone: EPR1614Y Fluorophore: AF_488 Dilution: 1 in 200 |
| Ki67 | Abcam | ab215226 | Clone: EPR3610 Fluorophore: AF555 Dilution: 1 in 50 |
| Lamin B1 | Abcam | ab194106 | Clone: EPR8985(B) Fluorophore: AF_488 Dilution: 1 in 100 |
| PanCK_AE1/AE3 | Thermofisher | 53-9003-82 | Clone: AE1/AE3 Fluorophore: AF_488 Dilution: 1 in 100 |
| SMA | R&D systems | IC1420S | Clone: 1A4 Fluorophore: Alexa 750 Dilution: 1 in 100 |
| Vimentin | Cell Signalling | 69227 | Clone: D21H3 Fluorophore: Alexa 750 Dilution: 1 in 100 |
المراجع
- Gorgoulis, V., et al. Cellular senescence: Defining a Path Forward. Cell. 179 (4), 813-827 (2019).
- Hernandez-Segura, A., Nehme, J., Demaria, M. Hallmarks of cellular senescence. Trends Cell Biol. 28 (6), 436-453 (2018).
- De Souza, N., Zhao, S., Bodenmiller, B. Multiplex protein imaging in tumour biology. Nat Rev Cancer. 24 (3), 171-191 (2024).
- Teo, Y. V., et al. Notch signaling mediates secondary senescence. Cell Rep. 27 (3), 997-1007 (2019).
- Ogrodnik, M., et al. Guidelines for minimal information on cellular senescence experimentation in vivo. Cell. 187 (16), 4150-4175 (2024).
- Sharpless, N. E., Sherr, C. J. Forging a signature of in vivo senescence. Nat Rev Cancer. 15 (7), 397-408 (2015).
- Schürch, C. M., et al. Coordinated cellular neighborhoods orchestrate antitumoral immunity at the colorectal cancer invasive front. Cell. 182 (5), 1341-1359.e19 (2020).
- Lin, J. R., et al. Highly multiplexed immunofluorescence imaging of human tissues and tumors using t-CyCIF and conventional optical microscopes. eLife. 7, e31657(2018).
- Tomimatsu, K., et al. Precise immunofluorescence cancelling for highly multiplexed imaging to capture specific cell states. Nat Commun. 15, 3657(2024).
- Kiessling, P., Kuppe, C. Spatial multi-omics: novel tools to study the complexity of cardiovascular diseases. Genome Med. 16 (1), 14(2024).
- Chaib, S., Tchkonia, T., Kirkland, J. L. Cellular senescence and senolytics: the path to the clinic. Nat Med. 28, 1556(2022).
- Freund, A., Laberge, R. M., Demaria, M., Campisi, J. Lamin B1 loss is a senescence-associated biomarker. Mol Biol Cell. 23 (11), 2066-2075 (2012).
- Eng, J., et al. A framework for multiplex imaging optimization and reproducible analysis. Commun Biol. 5 (1), 1-11 (2022).
- Wallis, R., et al. Senescence-associated morphological profiles (SAMPs): an image-based phenotypic profiling method for evaluating inter- and intra-model heterogeneity of senescence. Aging (Albany NY). 14, 1-27 (2022).
- González-Gualda, E., Baker, A. G., Fruk, L., Muñoz-Espín, D. A guide to assessing cellular senescence in vitro and in vivo. FEBS J. 288 (1), 56-80 (2021).
- O’Sullivan, E. A., Wallis, R., Mossa, F., Bishop, C. L. The paradox of senescent-marker positive cancer cells: challenges and opportunities. NPJ Aging. 10 (1), 1-11 (2024).
إعادة الطباعة والأذونات
