مقالة منهجية

عزل الحمورات من نسيج قشرية الفأر باستخدام FACS لتسلسل الخلايا الأحادية

DOI:

10.3791/69749

⸱

يناير 30, 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Microcirculation, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, 2International Center of Microvascular Medicine, Chinese Academy of Medical Sciences, 3College of Acupuncture-Moxibustion and Tuina, Beijing University of Chinese Medicine

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

للحصول على الحضيضات القشرية في دماغ الفأر تلبي متطلبات scRNA-seq، نقدم بروتوكول FACS محسن بشكل حرج يعتمد على اختيار CD13⁺/CD31⁻. تحسيناتنا الرئيسية تعزز بشكل كبير قدرة الخلايا على البقاء وسلامة الحمض النووي الريبي، مما يتيح التوصيف النصي المعتمد.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تلعب الحضيضات، باعتبارها مكينا أساسيا في وحدة الأوعية الدموية العصبية، دورا حيويا في الحفاظ على سلامة الحاجز الدموي الدماغي وتنظيم التوازن الديناميكي الدموي الدماغي من خلال تعديل النغمة الميكروأوعية. تم ربط خلل في الحمورات بمجموعة متنوعة من الاضطرابات العصبية. للتحقيق في تباين الحوضيات وتوضيح آلياتها في أمراض الأوعية العصبية بدقة خلية واحدة، أنشأنا بروتوكولا محسنا وقابلا للتكرار لعزل بيرسيات دماغ الفئران المناسبة لتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية (scRNA-seq). تبني هذه الطريقة على استراتيجية الفرز المعتمدة في CD13+/CD31، لكنها تتضمن تحسينات رئيسية مصممة خصيصا لتطبيقات scRNA-seq. باختصار، تم جمع أدمغة من ثلاثة فئران بالغة من نوع C57BL/6. تم تفكيك أنسجة الدماغ ميكانيكيا وخضوعها لهضم إنزيمي للحصول على تعليق خلوي واحد. بعد الطرد المركزي المتسلسل، تم إعادة تعليق الحبيبة الأخيرة في محلول ألبومين مصل البقري بنسبة 20٪ (BSA)، وهي خطوة محورية قدمناها لتقليل الإجهاد والتجمع، وبالتالي تعظيم القدرة على البقاء وجودة الحمض النووي الريبي للتسلسل. يتيح هذا النهج المحسن القائم على FACS العزل القوي لبيرسيات دماغ الفئران القابلة للحياة التي تلبي المتطلبات الصارمة ل scRNA-seq، مما يوفر أداة قوية لتحليل تغاير الخلايا الحمورية وأدوارها المرضية في أمراض الأوعية العصبية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الحوضاء هي نوع مهم من الخلايا تقع على طول الأوعية الدقيقة، وعادة ما تكون مدمجة داخل الغشاء القاعدي الشعري وتغطي الخلايا البطانية1. في الدماغ، تشكل الحضيضات، مع الخلايا البطانية والخلايا النجمية وأنواع الخلايا الأخرى، وحدة الأوعية العصبية وهي جزء لا يتجزأ من بنية ووظيفة الحاجز الدموي الدماغي (BBB). تلعب الحمورات أدوارا أساسية في تنظيم تدفق الدم الدماغي، وإعادة تشكيل الأوعية الدموية، والحفاظ على التوازن الوعائي. تحافظ على سلامة BBB من خلال تفاعلات فيزيائية وثيقة وإشارات باراكرين مع الخلايا المجاورة2؛ ينظم ديناميكيا نقل الغابات عبر البطانة عبر الداخلية والتعبير عن بروتينات ناقلة محددة؛ وتساهم في استقرار الديناميكا الدموية الدماغية من خلال أنشطتها الانقباضية والمريحة3. خلل في وظائف الحمور، بالإضافة إلى التغيرات في تغطيتها أو كثافتها، يمكن أن يؤدي إلى خلل في تنظيم الأوعية الدموية ونقص عصبي، مما يؤدي في النهاية إلى تغيرات مرضية مرتبطة باضطرابات عصبيةمختلفة. ومع ذلك، فإن التغاير الفطري في الحوضيات يشكل تحديات كبيرة أمام الدراسات الميكانيكية المستقبلية.

مع تقدم تقنية تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية (scRNA-seq)، استخدمت عدد متزايد من الدراسات scRNA-seq لاستكشاف التباين الخلوي وتحديد الأهداف الرئيسية في التسبب وتقدم الأمراض. تشمل العلامات الشائعة المستخدمة في الحمورية مستقبلات عامل النمو المستخرج من الصفائح الدموية (PDGFR-β)5، والمستضد العصبي-الدبقي 2 (NG2)، وأكتين العضلة الملساء ألفا (α-SMA). ومع ذلك، فإن هذه العلامات ذات خصوصية ضعيفةنسبيا 6، حيث يمكنها في الوقت نفسه وضع علامات على خلايا وعائية أخرى، مثل خلايا العضلات الملساء، والخلايا العصبية السلفية مثل الخلايا السلفية للحلزون السابقة، مما يصعب التمييز بين البريوسيات وخلايا الدماغ الأخرى. بحثا عن بديل أكثر قوة، لجأنا إلى CD13 (أمينوببتيداز N، APN)، وهو مؤشر معروف على نطاق واسع لتعبيره القوي والمتسق في الحضيضات الدماغية في الدراساتالسابقة 7,8,9,10. في دراستنا، أجرينا تلوين فلوري مناعي على أقسام أنسجة الدماغ، وأكدت النتائج تعبير CD13 في الصماء المحيطة، مما أظهر فعاليته في التمييز بين الخلايا الحمورية والخلايا البطانية، حيث كانت إشارة CD13 مرتبطة حصريا بالخلايا المحيطة بالأوعية الدموية وغائبة عن خلايا البطانة CD31⁺. (الشكل 1A). ومع ذلك، من المهم ملاحظة أن تعبير CD13 ليس حصريا تماما على الحوض؛ كما تلاحظ مستويات يمكن اكتشافها في خلايا العضلات الملساء للشرايين والأوردة (الشكل 1B,C).

figure-introduction-1
الشكل 1: يظهر التلوين المناعي الفلوري تعبيرا CD13 في الحضيضات الوعائية الدماغية وخلايا العضلات الملساء، دون وجود إشارة قابلة للكشف في الخلايا البطانية. (أ) تصوير فلوري مناعي تمثيلي لمنطقة الانتقال بين الشريان والأوعية الدموية في الأوعية الدموية الدقيقة للدماغ. تظهر الصورة المدمجة المحلول المحيطي CD13⁺ (الأخضر) وهو يغمد خلايا البطانة CD31⁺ (الأحمر). خلايا العضلة الملساء α-SMA+ (السماوي) متمركزة في المنطقة الشريانية وغائبة عن الشعيرات الدموية. (ب) مقطع عرضي للشريان. تظهر الصور وجود توازي واضح بين خلايا العضلات الملساء CD13⁺ (الأخضر) وخلايا العضلة الملساء α-SMA+ (السماوي) في طبقة العضلات الملساء المحيطة، مما يؤكد تعبير CD13 في خلايا العضلات الملساء الشريانية. (ج) مقطع عرضي للوريد. وبالمثل، يمكن اكتشاف CD13 (الأخضر) في خلايا العضلات الملساء ذات α-SMA (رؤوس الأسهم) في جدار الوريد. شريط السلم: 20 ميكرومتر (A-C). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

للحصول على الخلايا الوعوية الدموية القشرية للفئران التي تلبي متطلبات scRNA-seq، أجرينا فرز الخلايا المنشطة بالفلورة (FACS) باستخدام وسم الأجسام المضادة CD13⁺/CD31⁻ لعزل الحوضاء11. في البداية، تم استخدام علامات CD45 وCD41 لاستبعاد الخلايا المسببة للدموية من تعليق أنسجة الدماغ12. لاحقا، تم إثراء الحموريات باختيار خلايا CD13+ ، وتم استبعاد الخلايا البطانية أكثر من ذلك عن طريق البوابة لتجمعات CD31، مما أدى إلى عزل مجموعة الحوضاء المستهدفة13.

نعترف بأن خطوة الانتقاء الإيجابية ل CD13 تلتقط في الوقت نفسه خلايا العضلات الملساء التي تعبر عن CD13 من كل من الشرايين والأوردة. لتلبية المتطلبات الحرجة ل scRNA-seq وتعظيم احتفاظ الصوت، اخترنا هذا التركيبة الاستراتيجية لإعطاء الأولوية لإنتاج الصخور في مرحلة الفرز. على الرغم من أن هذا النهج يؤدي إلى العزل المشترك لمجموعة صغيرة من خلايا العضلات الملساء، إلا أنه يعظم فعليا استعادة جميع الحضيضات المحتملة خلال مرحلة التخصيب الأولية. تقلل هذه الاستراتيجية التدريجية بشكل كبير فقدان الخلايا الأولي. بالإضافة إلى ذلك، لتعظيم قدرة البيريسيتس على البقاء والإنتاجية، استخدمنا أيضا حل BSA بنسبة 20٪ لإعادة تعليق وترشيح الخلايا بعد التفكك، مما أدى إلى إزالة الحطام بفعالية مع الحفاظ على صلاحية ونقاء الخلايا المصنفة14.

باستخدام هذه الطريقة، نجحنا في تمييز الحضيضات الوعائية الدماغية عن أنواع الخلايا الأخرى، محققين تحضيرات للبيرسيات عالية النقاء والحيوية التي تلبي المتطلبات الصارمة ل scRNA-seq. توفر هذه التقنية أساسا قويا لتحقيقات متعمقة لاحقة في أدوار الحموريات في سياقات الأمراض المختلفة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذه الدراسة، استخدمنا ثلاثة فئران بالغة من نوع C57BL/6J (عمرها 3 أشهر، وزنها 20-25 جرام). تم إيواء جميع الفئران تحت دورة ضوء/ظلام لمدة 12 ساعة مع تحكم صارم في درجة الحرارة والرطوبة، مع إمكانية الوصول إلى الطعام والماء قبل التجارب. تمت الموافقة على جميع الإجراءات التجريبية التي تشمل المختبر من قبل لجنة رعاية وأخلاقيات المختبرية التابعة لمعهد الدورة الدموية الدقيقة، والأكاديمية الصينية للعلوم الطبية، وكلية بكين الطبية يونيون، وأجريت وفقا لإرشادات رفاهية ذات الصلة.

1. تحضير المواد التفاعلية

  1. محلول جلوكوز 30٪ (وزن/حجم): إذابة 15 جرام جلوكوز في 50 مل من محلول UltraPure DNase/RNase الخالي من dH2O. لضمان الذوبان الكامل، أضف أولا الجلوكوز إلى 20 مل من dH2O الخالي من UltraPure DNase/RNase وامزج جيدا. ثم أضف dH2O من UltraPure DNase/RNase الخالي من ال RNase إلى حجم نهائي يبلغ 50 مل. فلتر المحلول وخزن عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر.
  2. DNase I (10 ملغ/مل): ذيب 50 ملغ DNase I في 5 مل من DDH2O. يمكن تخزين محلول المخزون عند -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهرين.
    ملاحظة: يجب تجنب تكرار دورات التجميد والذوبان بشكل صارم لمنع فقدان النشاط الإنزيمي. لتقليل تأثيرات التجميد والذوبان، يتم جمع 150 ميكرولتر من المحلول في أنابيب طرد مركزي دقيق معقمة قبل التجميد الأولي، وقم بإذابة الكميات الفردية حسب الحاجة للتجارب.
  3. 2٪ (حجم/حجم) مصل البقر الجنيني (FBS) في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS): جهز 1× PBS عن طريق خلط 5 مل من 10× PBS مع 45 مل من UltraPure DNase/RNase الخالي من dH2O. أضف 1 مل من FBS إلى 49 مل من 1× PBS وامزجه جيدا.
    ملاحظة: جهز هذا الحل حديثا خلال الخطوة 2.1.2. خصص 15 مل لكل عينة نسيجية.
  4. محلول الكولاجيناز ومخزون إنزيم الديسباس (CD): ذيب 100 ملغ من ديسباز و100 ملغ من الكولاجيناز بشكل منفصل في 1 مل من ديزايز فائق النقي/ديسبايز الخالي من الريثانdH 2O لكل منهما. ادمج المحاليل للحصول على حجم نهائي 2 مل (تركيز إنزيم 100 ملغ/مل).
    ملاحظة: أليكوت 500 ميكرولتر في أنابيب الطرد المركزي الدقيق المعقمة وتخزينها عند -20 درجة مئوية. دوامة قبل الاستخدام لتجنب فقدان النشاط الناتج عن دورات التجمد والذوبان. من المهم ملاحظة أن شكل البودرة يمكن أن يسبب تهيج شديد في الجلد والعين وضيق في التنفس. دائما استخدم غطاء بخار كيميائي مع ارتداء قفازات نيتريل وقناع N95. في حال التعرض، قم بري المنطقة المصابة فورا بماء وفير واطلب الرعاية الطبية.
  5. محلول يعمل إنزيم CD: اخلط 1.5 مل من محلول مخزون إنزيم CD مع 43.5 مل من 2٪ (حجم/حجم) FBS في PBS (من الخطوة 1.3) عن طريق انقلاب لطيف.
    ملاحظة: استعد مباشرة قبل تفكك الأنسجة (الخطوة 2.3.4). هذا الحجم محسن لثلاثة فئران؛ عدل بشكل متناسب حسب الحاجة.
  6. محلول بيركول بنسبة 22٪ (حجم/حجم): اجمع بين 11 مل من بيركول، 5 مل من 10× PBS، و34 مل من محلول UltraPure DNase/RNase الخالي من dH2O لتحضير محلول بسعة 50 مل.
    ملاحظة: قم بالتعقيم بالفلتر عبر غشاء PES بحجم 0.22 ميكرومتر. يمكن تخزينه عند 4 درجات مئوية لمدة شهر دون فقدان كبير للاستقرار.
  7. مخزن التفكك الميكانيكي: أضف 1 مل من DNase I (10 ملغ/مل) إلى 10 مل من 2٪ (حجم/حجم) FBS في PBS (من الخطوة 1.3). امزج عن طريق استخدام الماصات.
  8. حلول BSA: جهز حلول BSA بنسبة 1٪، 20٪، و35٪ (وزن/تضخم) بشكل منفصل كما يلي:
    1. 1٪ (وزن/حجم) BSA: تذيب 0.15 جرام من BSA في 15 مل من محلول Dulbecco الملحي الفوسفوري المخزن (DPBS).
    2. 20٪ (وزن/تكبير) BSA: إذابة 3 جرام من BSA في 15 مل من DPBS.
    3. 35٪ (وزن/تطوع) BSA: تذيب 0.7 جرام من BSA في 2 مل من DPBS.
      ملاحظة: قم بتصفية جميع المحاليل عبر غشاء PES بحجم 0.22 ميكرومتر قبل الاستخدام.
  9. محلول الملح المتوازن لهانكس (HBSS)/BSA/مخزن الجلوكوز: أضف 167 ميكرولتر من 30٪ (وزن/حجم) من الجلوكوز (من الخطوة 1.1) و1.4 مل من 35٪ (وزن/حجم) BSA (من الخطوة 1.8) إلى 50 مل من HBSS، وامزجه بلطف.
    ملاحظة: حضر هذا المحلول حديثا تحت ظروف معقمة خلال الخطوة 2.1.2. خزن عند 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.
  10. مخزن جمع الأنسجة: مكمل 12 مل من HBSS/BSA/محلول الجلوكوز (من الخطوة 1.9) مع 800 ميكرولتر من DNase I (10 ملغ/مل). استخدامه لتخزين الأنسجة المؤقت وغسل الماصات.
    ملاحظة: حضر هذا المحلول حديثا تحت ظروف معقمة خلال الخطوة 2.1.2.
  11. محلول 1.25٪ (w/v) تريبروموإيثانول: ذاب 1.25 جرام من 2,2,2-تريبروموإيثانول في 2.5 مل من 2-ميثيل-2-بوتانول، ثم أضف هذا الخليط إلى 97.5 مل من محلول ddH2O المعقم أو محلول ملحي فسيولوجي للحصول على محلول شفاف بنسبة 1.25٪ تريبروموإيثانول.
    ملاحظة: حضر المحلول طازجا قبل كل استخدام. خزنها محمية من الضوء في درجة حرارة الغرفة واستخدمها بسرعة.

2. إجراء تجريبي (باستخدام ثلاثة فئران كمثال)

  1. التحضير قبل التجربة (التوقيت: 30 دقيقة)
    1. تطلب الأوتوكلاف مواد استهلاكية وتعقيم الأدوات الجراحية ب 75٪ (فول/فول) إيثانول.
    2. تحضير الحلول العاملة: 1× PBS (من الخطوة 1.3)، 2٪ (حجم/حجم) FBS في PBS (من الخطوة 1.3)، محلول HBSS/BSA/الجلوكوز (من الخطوة 1.9)، ومخزن جمع الأنسجة (من الخطوة 1.10).
    3. صب 10 مل من 1× PBS في طبق خلية بحجم 10 سم وابقها على الثلج.
    4. حضر ثلاث أمبولات، أضف 3 مل من حاجز جمع الأنسجة لكل واحدة، واحتفظ بها على الثلج.
    5. جهز ثلاثة أنابيب طرد مركزي بسعة 15 مل، أضف 10 مل من أنابيب الطرد المركزي 2٪ (حجم/حجم) في PBS لكل منها، واحتفظ بها على الثلج.
  2. حصاد دماغ الفأر (التوقيت: 30 دقيقة)
    1. تم تخدير الفئران بعمق عن طريق حقن ثلاثي بروموإيثانول داخل الصفاق (من الخطوة 1.11) بجرعة 0.2 مل لكل 10 جرامات من وزن الجسم. بعد فقدان ردود الفعل اليدوية، تم تنفيذ القتل الرحيم عن طريق خلع عنق الرحم.
      ملاحظة: إذا لم يصل الفأر إلى مستوى جراحي من التخدير (تم تقييمه بغياب رد فعل انسحاب الدواسات) خلال 5-10 دقائق بعد الحقن، يتم إعطاء جرعة إضافية داخل الصفاق من التريبروموإيثانول، تعادل ثلث الجرعة الأولية.
    2. رش منطقة الرأس/الرقبة بنسبة 75٪ إيثانول. قم بعمل شق منتصف فروة الرأس من المناطق القذالي إلى الجبهية لكشف الجمجمة. قم بإجراء شق عرضي أمام المدارات الثنائية، يليه شقوق جانبية على الحواف السفلية للمخيخ لفصل قاعدة الجمجمة. وأخيرا، شق الفرج طوليا على طول الغرز السهمي من الخلف إلى الأمامي. ارفع الغطاء الجحفي لكشف الدماغ المحاط بالجافة. ارفع الدماغ بلطف مع قطع الأعصاب البصرية والاتصال بين النخاع المستطيل والحبل الشوكي باستخدام المقص الجراحي15. ضع الدماغ السليم في طبق بحجم 10 سم يحتوي على 10 مل من 1× PBS البارد جدا.
      ملاحظة: تعامل مع الأنسجة بلطف لتجنب التلف.
    3. انقل الدماغ إلى ورق الألمنيوم. باستخدام الملقط، ارفع الدورا ماتر من الهوامش واقطعها على طول منتصف العضلات. بعد إزالة الغفرة الكاملة للجافة، كشف الفضاء تحت العنكبوتية. اشطف الفراغ تحت العنكبوتية بمحلول HBSS، ثم قم بتشريح الأوعية باستخدام إبرة غير حادة وإزالة ال piamater 16 بعناية. قسم الدماغ إلى شرائح بسماكة 2-3 مم باستخدام شفرة حلاقة. تخلص من البصلة الشمية والأقسام الذيلية الأكبر. عزل القشرة الدماغية على طول الجسم الثفني وانقل الأنسجة القشرية إلى أمبولات تحتوي على 3 مل من حاجز جمع الأنسجة الباردةجدا.
    4. يستهدف عزل الحمورية في هذا البروتوكول بشكل خاص القشرة الدماغية. لمناطق أخرى ذات اهتمام: ضع مقاطع الإكليل في شريحة ذات بئرين مع قطرة واحدة من 2٪ (حجم/حجم) FBS في PBS. تحديد المناطق المستهدفة تحت مجهر التشريح، وعزلها يدويا، والمضي قدما في خطوات معالجة متطابقة لاحقة.
  3. تفكك الأنسجة (التوقيت: 3-3.5 ساعات)
    1. يتم تقطيع الأنسجة في الأمبولات باستخدام المشرط الجراحي إلى شظايا بحجم يقارب 1 مم × 1 مم.
      ملاحظة: قم بالتقطيع الكامل خلال 5 دقائق للحفاظ على نضارة الأنسجة.
    2. شطف أطراف الماصة مسبقا باستخدام حاجز جمع الأنسجة. قم بسحب شظايا مفروم ببطء نحو قمة الطرف مع الحفاظ على الاتجاه الرأسي (الرأس للأسفل). قم بطرد الشظايا بلطف في أنابيب طرد مركزي مبردة مسبقا بسعة 15 مل (تم إعدادها في الخطوة 2.1.5).
      ملاحظة: تجنب شفط الشظايا إلى السبطانة العلوية لمنع التصاقها بجدار الماصة.
    3. غسل الأمبولات التي تحتوي على شظايا (من الخطوة 2.3.1) مع 2٪ (حجم/حجم) FBS في PBS وانقل الغسيل إلى أنابيب الطرد المركزي. الطرد المركزي عند 300 × g عند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق.
    4. تخلص من السوبرناتات بعد الطرد المركزي. أعد تعليق الحبيبات في 3 مل من محلول إنزيم CD العامل (من الخطوة 1.5) لكل أنبوب. قم بتقسيم كل نظام تعليق بالتساوي إلى ثلاثة أنابيب (إجمالي 9 أنابيب، 1 مل/أنبوب)، ثم أضف 4 مل من محلول إنزيم CD العامل (الحجم النهائي: 5 مل/أنبوب).
    5. حضن الأنابيب في فرن هجين بدرجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 100 دقيقة مع اهتزاز مداري عند 100 × g14.
    6. تحضير محلول تفكك الأنسجة أثناء الحضانة بإضافة 1 مل من محلول DNase I إلى 10 مل من 2٪ (حجم/حجم) FBS في PBS (من الخطوة 1.10).
    7. أنهي الهضم بالطرد المركزي عند حرارة 300 × جرام عند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق.
      ملاحظة: قيم كفاءة الهضم مجهريا باستخدام محلول 10-20 ميكرولتر أليكوت. النهاية المثالية تظهر كقطع وعائية تشبه الخرز؛ تشير الأجزاء الوعائية الممدودة إلى سوء الهضم، بينما تشير الخلايا المفردة السائدة إلى فرط الهضم.
    8. أعد تعليق الحبيبات في 1 مل من محلول تفكك الأنسجة لكل أنبوب. انفصل ميكانيكيا عن الواقع عن طريق التوصيل بالماصة100 مرة 11.
      ملاحظة: تجنب الشفط الكامل لحجم الماصة لتقليل تكوين الفقاعات والحفاظ على حيوية الخلية.
    9. اجمع جميع المعلقات (من إجمالي 9 أنابيب هضم تمثل أنسجة دماغ 3 فئران) في أنبوب طرد مركزي بسعة 50 مل. اشطف كل أنبوب هضم بمحلول 2 مل من 2٪ (حجم/حجم) FBS في PBS وامزج غسولات. الطرد المركزي عند 300 × g عند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق.
    10. بعد الطرد المركزي، تظهر طبقات مميزة. تخلص بعناية من الطبقة العليا (التي تحتوي على شوائب وحطام خلوي صغير)، مع الاحتفاظ بالطبقة الوسطى (التي تتكون من خلايا أو مجموعات خلايا ذات كثافة أقل) والطبقة السفلية (الخلايا السليمة وقطع الأنسجة غير المهضومة جزئيا). أضف 12.5 مل من محلول BSA بنسبة 20٪ واقلب الأنبوب بلطف لإعادة تعليق الحبيبات. جهاز طرد مركزي مرة أخرى عند 1000 × جرام عند 4 درجات مئوية لمدة 20 دقيقة.
    11. اجمع الحبيبات السفلية (الغنية بخلايا سليمة ذات نقاوة أعلى) وانقل المادة الفائقة (التي تحتوي أساسا على بقايا المايلين، والدهون، وعدد قليل من الخلايا) إلى أنبوب طرد مركزي جديد بسعة 50 مل. أعد تعليقها عن طريق العكس اللطيف وتكرار الطرد المركزي عند 1000 × g عند 4 درجات مئوية لمدة 20 دقيقة.
    12. أعد تعليق كل حبيبة تم الحصول عليها من خطوتي الطرد المركزي (الخطوة 2.3.10 والخطوة 2.3.11) في 2 مل من 2٪ (حجم/حجم) FBS بكل PBS (الحجم النهائي المجمع: 4 مل).
      ملاحظة: تجنب لمس جدران الأنبوب أثناء إعادة التعليق لتقليل التلوث بالحطام.
    13. اجمع بين التعليقين المعلقين من الخطوة السابقة في أنبوب طرد مركزي بسعة 15 مل. الطرد المركزي عند 300 × جرام، 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق. تخلص من المادة الفائقة (النفايات التي تحتوي على BSA، وحطام الخلايا، وربما كميات ضئيلة من الدهون الميالينية المتبقية). أعد تعليق الحبيبة (الخلايا المستهدفة النهائية المنقاة والمغسولة عالية النقاء السليمة) في 2 مل من محلول PBS يحتوي على 2٪ FBS.
      ملاحظة: هذه الخطوة هي نقل الخلايا إلى مخزن تعليق نظيف ومناسب للتطبيقات اللاحقة.
    14. جهز أربعة أنابيب طرد مركزي بسعة 15 مل، كل منها يحتوي على 4 مل من محلول بيركول بنسبة 22٪. قم بطبقة بلطف 0.5 مل من التعليق المعاد تعليقها على تدرج بيركول (أربعة أليكوات إجمالا) لتعظيم عائد الخلية. الطرد المركزي عند 560 × g عند 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق.
      ملاحظة: اضبط جهاز الطرد المركزي على "بدون فرامل" لتجنب الاضطراب الناتج عن الدوامة لتدرج الكثافة، لضمان بقاء حطام المايلين مستقرا في السوبرناتانت.
    15. استنشق الزائفات بعناية. أعد تعليق الحبيبات في 1 مل من مخزن HBSS/BSA/محلول جلوكوز لكل أنبوب. تعليق المسبح في أنبوب جديد بسعة 15 مل. اشطف أنابيب بيركول بسعة 2 مل من محلول HBSS/BSA/محلول الجلوكوز وامزج الغسولات. جهاز طرد مركزي عند 300 × g عند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق).
  4. التحضير والاكتساب لفرز التدفق الخلوي (التوقيت: 50 دقيقة)
    1. استنشق السوبرناتانت بحذر. أعد تعليق حبيبات الخلية في 1 مل من محلول HBSS/BSA/محلول جلوكوز.
    2. أضف 5 ميكرولتر من كاشف الحظر لمستقبلات Fc (FcR) إلى تعليق الخلية وحضن عند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق.
    3. أضف الأجسام المضادة المتقاربة فلورية التالية إلى تعليق الخلية عند الأحجام المشار إليها (كافية للأنسجة المشتقة من 3 فئران): 5 ميكرولتر من CD45-PE؛ 5 ميكرولتر من CD41-PE؛ 20 ميكرولتر من CD31-APC؛ 15 ميكرولتر من CD13-FITC.
    4. حضن الخلايا على الثلج لمدة 20 دقيقة في الظلام.
      ملاحظة: الحماية من الضوء. تجنب التحريك.
    5. أضف 6 مل من محلول HBSS/BSA/محلول الجلوكوز لغسل الخلايا. الطرد المركزي عند 300 × g عند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق.
    6. استنشق السوبرناتان. أعد تعليق حبيبات الخلية في 1 مل من محلول HBSS/BSA/محلول جلوكوز. أضف 200 ميكرولتر من محلول 7-أمينوأكتينوميسين D (7-AAD) (لاستبعاد الخلايا الميتة) وحضن على الثلج لمدة 10 دقائق. بعد ذلك، قم بضبط الحجم إلى 2 مل باستخدام HBSS/BSA/مخزن الجلوكوز.
      ملاحظة: الحماية من الضوء.
    7. أضف محلول BSA بنسبة 1٪ إلى أنابيب الجمع (أنابيب مخروطية بحجم 15 مل)، ثم حركه بلطف لشطف الأسطح الداخلية. استنشق محلول زائد، تاركا بالضبط 1 مل من محلول BSA بنسبة 1٪ في كل أنبوب لاستقبال الخلايا المفترضة. تخزين التخزين مؤقتا على الثلج.
    8. تعليق الخلية المصبوغ بالفلتر عبر مصفاة بقطر 40 ميكرومتر مباشرة قبل الفرز.
    9. إنشاء بوابة أولية تعتمد على معلمات التشتت الأمامي (FSC-A) والتشتت الجانبي (SSC-A) لاستبعاد الحطام الخلوي الذي يظهر إشارات منخفضة في FSC-A/SSC-A.
    10. تم تحقيق استنزاف الخلايا السلالية المكونة للدم من خلال البوابة السلبية المزدوجة ل CD45 وCD41، مما أدى فعليا إلى القضاء على التلوث من كريات الدم البيضاء والخلايا المناعية والصفائح الدموية.
    11. التقاط الحوضيات المفترضة عن طريق الانتقاء الإيجابي ل CD13 من خلايا جدار الأوعية الدموية.
    12. تقييم سلامة الغشاء عبر الفحص الفلوري 7-AAD؛ استبعاد الخلايا الاستماتية بواسطة بوابة 7-AAD⁻.
      ملاحظة: اجمع بيريسيتات عالية النقاء من CD31⁻/CD13⁺ من خلال الانتقاء السلبي CD31. اجمع الحوضيات المفترزة مباشرة في أنابيب تحتوي على 1٪ BSA (من الخطوة 2.4.7) وضعها على الثلج. جهز فورا التعليق أحادي الخلية للعد. ثم قم بتحميل العينات مباشرة للتسلسل دون أي خطوات زراعة وسيطة.
  5. تسلسل وتحليل الحمض النووي الريبي (التوقيف: 3-4 أيام)
    1. تم إعداد تعليق خلية واحدة للبيرسيات المفترضة وفقا لبروتوكول 10x Genomics "دليل المستخدم لمجموعات كواشف GEM-X العالمية 3' للتعبير الجيني v4 4-plex" (CG000731)17,18. كان لتعليق الخلية المحضر للتحميل صلاحية > 90٪ وتم تخفيفه إلى تركيز ضمن النطاق الموصى به من 300-2000 خلية/ميكرولتر.
    2. اجمع بين التعليق أحادي الخلية مع خرزات هلام مشفرة شريطيا وإنزيمات، ثم انقسمه إلى حبات هلام في مستحلب (GEMs) عبر تغليف قطرات ميكروفلويدية19. قم بتحليل الخلايا في الموقع ، والنسخ العكسي، وربط الباركود ب cDNA.
    3. اكسر GEMs لاستعادة المنتجات. تضخيم cDNA بواسطة PCR باستخدام البروتوكول التالي: إزالة الطبيعة الأولية عند 9 °م لمدة 4 ثوان؛ تليها دورة (13 دورة ل <500 خلية هدف، 12 دورة ل501-6000 خلية مستهدفة) التي تتضمن إزالة الطبيعة عند 9 درجات مئوية لمدة 2 ثانية، والتلدين عند 9 درجات مئوية لمدة 3 ثوان، والتمديد عند 7 درجات مئوية لمدة 6 ثوان في كل دورة؛ وتمديد أخير عند 72 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة يليه توقف عند 4 درجات مئوية. تحقق من صحة المنتجات المضخمة لحجم الشظية (200-300 قطعة حرارة) والعائدة.
      ملاحظة: يمكن تخزين منتجات التضخيم عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 72 ساعة أو عند -2 درجة مئوية لمدة أسبوع، أو يمكن معالجتها مباشرة في الخطوة التالية.
    4. بالنسبة ل cDNA مؤهل: Fragment، قم بإصلاح نهائي، ربط محول P7، وتضخيم باستخدام بادئات مؤشرة. اختيار أجزاء بالحجم لبناء مكتبات التسلسل.
    5. مكتبات التسلسل على منصة Illumina NovaSeq بعد التحقق من جودة الجودة.
    6. بيانات تسلسل الديمولبلكس لاستخراج الباركودات الخلوية، والمعرفات الجزيئية الفريدة (UMIs)، وتسلسلات RNA. يقرأ Align إلى الجينوم المرجعي.
    7. قم بقياس عدد وحدات UMI، وتقدير أعداد الخلايا الصالحة، وإنشاء مصفوفة تعبير جين-باركود20.
    8. إزالة الدوبلت باستخدام حزمة DoubletFinder (v2.0.6) في R. التنبؤ بناء على تحديد الجيران الأقرب الاصطناعي لضمان جودة البيانات.
    9. إجراء تحليل المكونات الرئيسية (PCA) وتقليل أبعاد التقريب والإسقاط المنتظم للمشعب (UMAP) باستخدام Seurat (الإصدار 5.0). تحديد تجمعات الخلايا وتصور جينات العلامات الخاصة بالصخور للتحقق من الهوية الخلوية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لتحقيق عزل دقيق لخلايا الدماغ البحرية، تم صبغ الخلايا المنفصلة عن أنسجة الدماغ ب PE Texas الأحمر المقترافق مضاد للفأر CD41/CD45، ومضاد الفأر CD13 المرتبط بFITC، وCD31 مضاد للفأر متصل ب APC، مما أسس استراتيجية فرز متعددة الخطوات تدمج علامات السطح واكتشاف القدرة على البقاء (الشكل 2). استبعد البوابات الأولية القائمة على معاملات التشتت الأمامي (FSC-A) والتشتت الجانبي (SSC-A) الحطام الخلوي فعليا (الشكل 2، الربع العلوي الأيسر). أزال ا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تصف هذه الدراسة استراتيجية FACS محسنة ومعتمدة بشكل منهجي تعتمد على تصنيف CD13⁺/CD31⁻ متعدد الألوان لعزل الحضيضات الوعائية الوعائية في دماغ الفأر24 بكفاءة. أكدت تحليلات التدفق الخلوي والتحليل اللاحق ل scRNA-seq أن الطريقة تميز بدقة بين البيريسيات والخلايا البطانية وتنتج خلايا تلبي باستمرار جميع معايير التحكم الحرجة في الجودة ل scRNA-seq، بما في ذلك البقاء، ومعدل التجمع، وتركيز الخلايا الحية، ونسبة الخلايا النوية. توفر هذه المنهجية الراسخة أساسا تقنيا قويا للتحقيق ا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون عدم وجود تضارب مصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد دعم هذا العمل مؤسسة بكين للعلوم الطبيعية (المنحة رقم 7242222)، ومشروع خطة العلوم والتكنولوجيا الإقليمية لمقاطعة خبي (المنحة رقم 203777110D)، ومعهد أبحاث الدورة الدموية الدقيقة التابع لكلية بكين الطبية الاتحادية، والأكاديمية الصينية للعلوم الطبية (المنحة رقم CAMS-IM-2023-02).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
مصل البقر الجنيني (FBS)GibicolA5669701قم بتوزيعه وتخزينه في -20 درجة مئوية؛ يمكن تخزينه في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد بعد ذوبانه
محلول فوسفات عازل (10×PBS، pH 7.4)Life Technologies70011-044يتم التخفيف قبل الاستخدام لغسل الخلايا
D-(+)-GlucoseSigma-AldrichG7021-1KGلتحضير مخزن طاقة الخلايا
البومين المصل البقري (BSA)Sigma-AldrichA1933-25gيحمي الخلايا ويمنع الالتصاق
محلول فوسفات عازل من Dulbecco (DPBS،1×)Gibco14190-144
محلول الملح المتوازن من Hanks (HBSS،1×)Life Technologies14175-095لغسل الخلايا وإعادة تعليقها
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled WaterLife Technologies10977-015لتحضير أنظمة التفاعل الخالية من النوويز
Collagenase/DispaseSigma-Aldrich11097113001-100mgلهضم الأنسجة وفصل الخلايا؛ قم بتوزيعه وتخزينه في -20 درجة مئوية
DNaseI(RNase-Free)TIANGENRT411-1500Uيمنع تجمع الحمض النووي؛ قم بتوزيعه وتخزينه في -20 درجة مئوية
PercollSigma-AldrichP1644-100MLلفرز الخلايا؛ قم بتخزينه في 4 درجات مئوية
FITC Rat Anti-Mouse CD13BD Biosciences558744مركّب فلوريسنت؛ قم بتخزينه محميًا من الضوء في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى شهر
APC Rat Anti-Mouse CD31BD Biosciences551262قم بتخزينه محميًا من الضوء في 4 درجات مئوية لعدة أشهر
PE Rat Anti-Mouse CD41BD Biosciences558040قم بتخزينه محميًا من الضوء في 4 درجات مئوية لعدة أشهر
PE Rat Anti-Mouse CD45BD Biosciences553081قم بتخزينه محميًا من الضوء في 4 درجات مئوية لعدة أشهر
FITC Rat IgG1, κ Isotype ControlBD Biosciences552916مراقبة تدفق؛ قم بتخزينه محميًا من الضوء في 4 درجات مئوية
APC Rat IgG2a, κ Isotype ControlBD Biosciences553932قم بتخزينه محميًا من الضوء في 4 درجات مئوية لعدة أشهر
PE Rat IgG2b, κ Isotype ControlBD Biosciences553989قم بتخزينه محميًا من الضوء في 4 درجات مئوية لعدة أشهر
RNase AWAY Decontamination ReagentAmbion10328011لإزالة تلوث RNase
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block)BD Pharmingen553141لمنع ارتباط الأجسام المضادة غير المحدد
7-Aminoactinomycin D (7-AAD)BD Pharmingen559925لإستبعاد الخلايا الميتة.
2,2,2-TribromoethanolSigma-AldrichT48402-25gلتحضير محلول 1.25٪ (وزن/حجم) من Tribromoethanol
2-Methyl-2-butanolPsaitongM20008-500mLلتحضير محلول 1.25٪ (وزن/حجم) من Tribromoethanol
فأر C57BL/6Jiangsu Huachuang Xinnuo Pharmaceutical Technology Co., Ltd.SYXK (Su) 2020-0041
أنبوب طرد مركزي 50 ملCorning430291
أنبوب طرد مركزي 15 ملCorning430791
طبق زراعة الخلايا 100mm×20mmCorning430167
Cell Ranger3.1.0/4.0.0برنامج تحليل بيانات التسلسل الخلوي الفردي
Loupe Cell Browser4.1متصفح الخلايا
STAR2.5.1bمحاذاة الحمض النووي الريبي
irlbpy-تحليل المكون الرئيسي
tsne0.15تحليل Barnes-Hut t-SNE (الجار الشبكي المشتت المبني على التوزيع t)
k-means0.17التكتل باستخدام k-means
التكتل القائم على الرسم البياني0.17التكتل القائم على الرسم البياني
FastQCv0.11.2مراقبة جودة البيانات (QC)

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Payne, L. B., et al. The pericyte microenvironment during vascular development. Microcirculation. 26 (8), e12554(2019).
  2. Ma, Q., et al. Blood-brain barrier-associated pericytes internalize and clear aggregated amyloid-β42 by LRP1-dependent apolipoprotein E isoform-specific mechanism. Mol Neurodegener. 13 (1), 57(2018).
  3. Mäe, M. A., et al. Single-cell analysis of blood-brain barrier response to pericyte loss. Circ Res. 128 (4), e46-e62 (2021).
  4. Li, P., Fan, H. Pericyte loss in diseases. Cells. 12 (15), 1931(2023).
  5. Oliveira, F., et al. Cultured brain pericytes adopt an immature phenotype and require endothelial cells for expression of canonical markers and ECM genes. Front Cell Neurosci. 17, 1165887(2023).
  6. Yao, Y. Challenges in pericyte research:pericyte-specific and subtype-specific markers. Transl Stroke Res. 13 (6), 863-865 (2022).
  7. Vanlandewijck, M., et al. A molecular atlas of cell types and zonation in the brain vasculature. Nature. 554 (7693), 475-480 (2018).
  8. Alliot, F., et al. Pericytes and periendothelial cells of brain parenchyma vessels co-express aminopeptidase N, aminopeptidase A, and nestin. J Neurosci Res. 58 (3), 367-378 (1999).
  9. Huang, Y., et al. Isolation, culture, and characterization of primary endothelial cells and pericytes from mouse sciatic nerve. J Neurosci Methods. 416, 110366(2025).
  10. Armulik, A., et al. Pericytes regulate the blood-brain barrier. Nature. 468 (7323), 557-561 (2010).
  11. Crouch, E. E., Doetsch, F. FACS isolation of endothelial cells and pericytes from mouse brain microregions. Nat Protoc. 13 (4), 738-751 (2018).
  12. Eichhorn, T., et al. Expression of tissue factor and platelet/leukocyte markers on extracellular vesicles reflect platelet-leukocyte interaction in severe COVID-19. Int J Mol Sci. 24 (23), 16886(2023).
  13. Smyth, L. C. D., et al. Markers for human brain pericytes and smooth muscle cells. J Chem Neuroanat. 92, 48-60 (2018).
  14. Wu, Q., et al. Epitranscriptomic mechanisms of N6-methyladenosine methylation regulating mammalian hypertension development by determined spontaneously hypertensive rats pericytes. Epigenomics. 11 (12), 1359-1370 (2019).
  15. Mirzadeh, Z., et al. The subventricular zone en-face:wholemount staining and ependymal flow. J. Vis. Exp. (39), e1938(2010).
  16. Zappaterra, M. W., et al. Isolation of cerebrospinal fluid from rodent embryos for use with dissected cerebral cortical explants. J. Vis. Exp. (73), e50333(2013).
  17. Zou, Z., et al. A single-cell transcriptomic atlas of human skin aging. Dev Cell. 56 (3), 383-397.e8 (2021).
  18. Bahl, E., et al. Using deep learning to quantify neuronal activation from single-cell and spatial transcriptomic data. Nat Commun. 15 (1), 779(2024).
  19. Klein, A. M., et al. Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells. Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).
  20. Zheng, G. X. Y., et al. Massively parallel digital transcriptional profiling of single cells. Nat Commun. 8 (1), 14049(2017).
  21. Song, H. W., et al. Transcriptomic comparison of human and mouse brain microvessels. Sci Rep. 10 (1), 12358(2020).
  22. He, L., et al. Analysis of the brain mural cell transcriptome. Sci Rep. 6, 35108(2016).
  23. Stebbins, M. J., et al. Human pluripotent stem cell-derived brain pericyte-like cells induce blood-brain barrier properties. Sci Adv. 5 (3), eaau7375(2019).
  24. Crouch, E. E., et al. Regional and stage-specific effects of prospectively purified vascular cells on the adult V-SVZ neural stem cell lineage. J Neurosci. 35 (11), 4528-4539 (2015).
  25. Ruan, J., et al. Screening and identification of muscle pericyte selective markers. Sci Rep. 15 (1), 28874(2025).
  26. Dias, D. O., et al. Pericyte-derived fibrotic scarring is conserved across diverse central nervous system lesions. Nat Commun. 12 (1), 5501(2021).
  27. Thalgott, J. H., et al. Non-invasive characterization of pericyte dysfunction in mouse brain using functional ultrasound localization microscopy. Nat Biomed Eng. , (2025).
  28. Grant, R. I., et al. Organizational hierarchy and structural diversity of microvascular pericytes in adult mouse cortex. J Cereb Blood Flow Metab. 39 (3), 411-425 (2019).
  29. O'flanagan, C. H., et al. Dissociation of solid tumor tissues with cold active protease for single-cell RNA-seq minimizes conserved collagenase-associated stress responses. Genome Biol. 20 (1), 210(2019).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

FACS CD13 CD31

مقالات ذات صلة