مقالة منهجية

تحليل إمكانية الوصول للكروماتين في يرقات الكاينورهابديتس الكاملة . L4

DOI:

10.3791/69791

⸱

أبريل 17, 2026

 ,  , 
1Departamento de Biología Celular y Desarrollo, Instituto de Fisiología Celular (IFC), Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM)

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا، نقدم بروتوكول ATAC-seq سريع وبسيط ليتم تنفيذه في المرحلة L4 من Caenorhabditis elegans كاملة باستخدام 30 ميكرولتر فقط من حبيبات الدودة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يلعب الوصول إلى الكروماتين أدوارا أساسية في النسخ وإصلاح الحمض النووي وفصل الكروموسومات. المناطق ذات الوصول الفائق عادة ترتبط بمحفزات ومعززات نشطة، مما يسهل ربط عوامل النسخ والنشاط التنظيمي. يتيح الفحص الخاص بكروماتين المتاح للترانسبوزاز باستخدام التسلسل (ATAC-seq) من التحليل الجينومي الكامل لإمكانية الوصول إلى الكروماتين مع عدد قليل جدا من الخلايا. ومع ذلك، فإن تطبيقها في Caenorhabditis elegans محدود بسبب الجلد الكولاجين الغني للدودة الخيطية الذي يعقد تفكك الخلايا. هنا، نقدم بروتوكولا محسنا لأداء ATAC-seq في الديدان الكاملة في المرحلة الرابعة. يبدأ الإجراء بزراعة متزامنة ويشمل اضطراب الأظراف، والتفكك الإنزيمي، وتحضير التعليق الخلوي. ثم تخضع النوى المنفاذة لتحويل Tn5، تليها تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) وتنقية مكتبات الجيل التالي الجاهزة للتسلسل (NGS). يتطلب هذا البروتوكول 30 ميكرولتر من حبيبات الدودة، ويمكن إكمالها في يوم واحد، ويولد 5,000–9,000 ذروة وصول في السلالة المرجعية N2 لبريستول. يمكن تكييف هذا السير المبسط لمراحل تطور أخرى أو مجموعات الخلايا المنقاء بواسطة FACS. من خلال تقليل الحواجز التقنية أمام ATAC-seq في C. elegans، توسع هذه الطريقة فرص دراسة إمكانية الوصول إلى الكروماتين على مستوى الجينوم استجابة للاضطرابات الجينية والبيئية في سياق الكائن الحي.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الجينومات حقيقية النواة مكتظة بكثافة داخل نواة الخلية. للتعامل مع القيود المكانية، يلتف الحمض النووي بإحكام حول النوكليوسومات، وهي مركبات متعددة البروتينات تتكون من ثمانية هيستونات محفوظة بشكل كبير عبر شعب مختلفة1. تختلف أنماط الوصول إلى الكروماتين حسب الحالة الخلوية في النسيج، وأنماط جينيةمحددة 2،3،4. ترتبط إمكانية الوصول إلى النيوكليوسوم ارتباطا وثيقا بالنسخ النشط، خاصة في المحفزات والمناطق التنظيمية البعيدة مثل المعززات، والتي يمكن الوصول إليها لعوامل النسخ5. تلعب مناطق الكروماتين المفتوحة أيضا أدوارا مهمة في إصلاح الحمض النووي، والتكاثر، وفصل الكروموسومات3. على النقيض من ذلك، فإن انخفاض سهولة الوصول عادة ما يرتبط بالكروم الغامض الصامت والتسلسلات المتكررة 6,7.

كان رسم خريطة الوصول إلى الكروماتين نهجا قويا لفهم تنظيم الجينات. تم استخدام تقنيات مختلفة لفحص إمكانية الوصول إلى الكروماتين. من بين أقدم الطرق، تم استخدام هضم النيوكلياز الدقيق (MNase) وDNase I لرسم خريطة مواقع النيوكليوسوم وإمكانية الوصول إليها في مواقعمحددة 8,9. تم تطبيق هذه التقنيات لاحقا في الدراسات الجينومية العامة عند دمجها مع التسلسل من الجيل التالي (NGS)10,11. ومع ذلك، تتطلب هذه التقنيات معايرة دقيقة لتركيز الإنزيمات ووقت التفاعل، إلى جانب عدد كبير من الخلايا، لتنفيذ ناجح.

في عام 2013، أنشأ مختبر جرينليف اختبار الكروماتين المتاح للترانسبوزاز باستخدام التسلسل (ATAC-seq) لرسم خريطة سلاسة لوصول الكروماتين على مستوى الجينوم بأكمله باستخدام عدد قليل من الخلايا12. يستفيد ATAC-seq من إنزيم Tn5 التجاري المتوفر تجاريا لإدخال تسلسلات DNA قصيرة (أي الرموز الشريطية) بشكل تفضيلي في مناطق الكروماتين المفتوحة، عادة خالية من النيوكليوسومات، ويرتبط بمحفزات ومحسنات نشطة. يتطلب البروتوكول نفاذية الخلايا وعزل النوى، يليه هضم محدود باستخدام Tn5 لوضع الكروماتين عالي الوصول. لاحقا، يتم دمج المؤشرات التكميلية أثناء PCR، مما يسهل تعدد العينات قبل NGS13. أثبت ATAC-seq أنه بروتوكول قوي يتيح أيضا بصمة عامل النسخ السيليكو، وقد تم تنفيذه لدقة خلية واحدة 14,15,16,17. بالإضافة إلى الفئران والعينات البشرية، تم تطبيق ATAC-seq في أنظمة مختلفة، بما في ذلك سمك الزرد واللافقاريات مثل ذبابة الفاكهة والدودة الخيطية Caenorhabditis elegans 18,19,20.

على مدى عقود، كان C. elegans نظام نماذج قوي في مجالات مثل التطور، وعلم الأحياء الخلوي، وعلوم الأعصاب، مما أدى إلى اكتشافات رائدة منها تحديد الميكرو RNA وتداخل RNA (RNAi)21,22. يمتلك جينوم مضغوط بحجم 100 ميغابايت يحتوي على ~20,000 جين يرمز للبروتين،23. يحدث تنظيم الجينات من خلال نشاط المروجين وكذلك المعززات البعيدة، التي تم رسمها عبر ATAC-seq عبر أنسجة مختلفة، ومراحل تطور، ونقاط زمنية للشيخوخة24,18. لذا أصبح تحليل إمكانية الوصول إلى الكروماتين أداة قيمة لفهم تنظيم الجينات لدى C. elegans. وبالتالي، يحمل ATAC-seq وعدا خاصا لدراسة المناظر الطبيعية فوق الجينية عبر ظروف بيئية مختلفة أو معزولات برية لاكتشاف استجابات نسخية متنوعة. بالإضافة إلى ذلك، قد يوفر رؤى حول بنية الكروماتين في الديدان الخيطية الممرضة وغير الممرضة الأخرى.

أحد التحديات المنهجية الرئيسية لدى C. elegans هو وجود قشرة غنية بالكولاجين يجب تفكيكها للحصول على تعليق خلوي متجانس من الديدان25. لمواجهة هذا التحدي، قمنا بتجميع وتحسين بروتوكولات مختلفة لتفكيك الديدان الخيطية ثم تنفيذ تسلسل ATAC في C. elegans18,26. يفضل استخدام مرحلة يرقات L4 لأن الحيوانات في هذه المرحلة التطورية تمتلك خط جرثومي نشط نسخيا، والذي يترجم إلى كروماتين مفتوح، مما يوفر مصدرا ثابتا ومفيدا للوصول إلى الكروماتين في الخلايا الجسدية. هنا، نقدم بروتوكولا سريعا وفعالا لتفكك الديدان وتوليد تعليق الخلية، مما يمكن من ATAC-seq في C. elegans. طريقتنا محسنة لديدان المرحلة الرابعة وتتطلب ما يصل إلى 30 ميكرولتر من حبيبات الدودة، مع إمكانية التكيف مع مراحل تطور أخرى أو لعينات أصغر مثل الخلايا المنقاء ب FACS. يمكن تنفيذ هذا البروتوكول في سلالات وظروف مختلفة من C. elegans، مما يمكن من تحديد قمم وصول الكروماتين بين 5,000–9,000 في السلالة المرجعية لبريستول-N2، مما يمهد الأساس لتحليلات الوصول للكروماتين لاحقا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ينصح بارتداء القفازات في جميع الأوقات.

ملاحظة: اليوم الأول: تحضير مجموعة الديدان المتزامنة. تمت زراعة جميع الديدان على صفائح NGM مزروعة ب E. coli OP50. الأشياء المطلوبة قبل البدء: (لكل عينة أو سلالة)، لوح دودة بالغ بقطر 90 مم أو اثنان من الديدان بقطر 60 مم، لوح واحد بحجم 90 مم أو لوحين بحجم 60 مم مع الطعام، مخزن M9 معقم27 (3 جرام KH2PO4، 6 جرام Na2HPO4، 5 جرام NaCl، 1 مل 1 M MgSO4، H2 O إلى 1 لتر. تعقيم عن طريق التعقيم التعميمي)

1. جمع الديدان

  1. خذ صفيحة بحجم 90 مم (أو اثنتين بحجم 30 مم) مع عدد الدودة البالغة.
  2. استرجع الديدان باستخدام مخزن M9 وانقلها إلى أنبوب طرد مركزي بسعة 15 مل.
  3. كرر الخطوة السابقة لاستعادة جميع الديدان من اللوحة أو الصفائح.
  4. دع الديدان تستقر في أنبوب 15 مل لمدة دقيقة ثم أزل المخزن M9 بحذر.
  5. تأكد من وجود ~1 مل من الديدان.

2. التبييض

  1. أضف 5 مل من محلول M9 + 650 ميكرولتر من NaOH 5M + 1,300 ميكرولتر من مبيض المنزل (محلول 5٪ من NaClO).
  2. دوامة بأقصى سرعة لمدة دقيقة إلى دقيقتين (لا تزيد عن 2.5 دقيقة).
  3. جهاز الطرد المركزي عند 1000 × g لمدة دقيقة واحدة عند RT (درجة حرارة الغرفة).
  4. أزل المادة الفائقة وأضف 9 مل من مخزن M9.
  5. كرر القسمين 2.3 و2.4 خمس مرات أخرى.
  6. أعد تعليق الأجنة في 7 مل من محلول M9.
    ملاحظة: قد يختلف بروتوكول التبييض في الكفاءة حسب درجة الحرارة ونوع المبيض التجاري28.

3. الفقس السائل للبيض خلال الليل

  1. تأكد من أن أنبوب الجمع الذي يحتوي على البيض المبيض مغلق بشكل صحيح.
  2. ضع الأنبوب في حركة بطيئة عند 20 درجة مئوية (مثلا، في هزاز داخل غرفة عند 20 درجة مئوية).
  3. تفقس الديدان خلال الليل وتتوقف في L1.
    ملاحظة: لا تترك الأنبوب لأكثر من 12 ساعة.

4. اليوم الثاني: نمو الديدان: تعافي الديدان من المستوى الأول .

  1. خذ الأنبوب من الهزاز وأكد تحت المجهر وجود ديدان L1 .
  2. دع الأنبوب يستقر عموديا لمدة ساعة تقريبا عند المراقبة.
  3. أزل الفائق وانقل الديدان ~300 L1 إلى لوح واحد بحجم 90 مم أو لوحين بحجم 30 مم مع الطعام.
  4. ضعها في حاضنة بدرجة حرارة 20 درجة مئوية ودعها تنمو لمدة 26 ساعة حتى تصل إلى المرحلة الرابعة.

5. اليوم الثالث: تحضير حلول المخزون: يجب تجهيز الحلول التالية لصنع حلول جديدة في اليوم الرابع

ملاحظة: يمكن القيام بذلك في اليوم الثاني أو الثالث.

  1. 1 مل من 10٪ SDS.
  2. 50 مل من 1M HEPES pH 8 (معقم مغذي).
  3. 250 مل من 20٪ سوكروز (معقم الجسم).
  4. 100 مل من 2M NaCl: جهز (معقم).
  5. 50 مل من 2M KCl (جهاز تعقيم معقم).
  6. 10 مل من 1M CaCl2 (معقم).
  7. 10 مل من 1M MgCl2 (معقيم).
  8. 100 مل من 1M Tris، درجة الحموضة 7.4.
  9. 5 مل من 5M NaCl (معقم).
  10. 500 ميكرولتر من 10٪ Tween-20.
  11. 500 ميكرولتر من 10٪ Nonidet P40/IGEPAL.
  12. 100 ميكرولتر من 5٪ ديجيتونين (يجب تسخينه إلى 65 درجة مئوية للذوبان).
  13. 500 ميكرولتر من 10٪ BSA (فلتر بحجم 0.22 ميكرومتر) مخزن عند 4 درجات مئوية.
    اليوم الرابع: ديدان المرحلة L4 ل ATAC
    ملاحظة: قبل البدء، تأكد من وجود حاضنة عند 25 درجة مئوية، وجهاز طرد مركزي بحرارة 4 درجة مئوية جاهز، وتسخين ديجيتونين إلى 65 درجة مئوية (لتحضير المخزن المؤقت الجديد)، ووجود مخزن M9 معقم، ومرشحات H2O معقمة، و20 ميكرومتر.

6. تحضير المحلول

  1. تحضير حلول جديدة (انظر الجدول 1). دائما تعامل مع L-15 10٪ FBS وبيض العزل في الظروف المعقمة واحتفظ بها باردة.

الجدول 1: المخزون لتحضير المحلول الطازج. وصفات لتحضير المرق لتفكك الديدان وبروتوكول تعليق الخلايا (القسمان 6 و7). يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.

7. تفكك الديدان الخيطية وبروتوكول تعليق الخلايا

ملاحظة: سيكون هناك حاجة إلى لوحة واحدة بقطر 90 مم أو لوحين بحجم 30 مم مع مجموعة دودة متزامنة من المستوى الرابع.

  1. بعد 26 ساعة في الحاضنة التي تبلغ 20 درجة مئوية، تؤكد تحت المجهر أن غالبية الديدان في المرحلة الرابعة.
  2. استرجع جميع الديدان من الألواح باستخدام مخزن M9 وضعها في أنبوب طرد مركزي بسعة 1.5 مل.
  3. اغسله خمس مرات ب 1 مل من الهيدروجينالمعقم 2الأكسجين عن طريق ترك الديدان تستقر بالجاذبية.
  4. انقل الأنبوب مع الديدان إلى حاضنة بدرجة حرارة 25 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة للتخلص من بقايا الطعام المعوي.
  5. خذ 50 ميكرولتر من حبيبة الدودة وضعها في أنبوب جديد.
  6. أضف 200 ميكرولتر من مخزن SDS-DTT الجديد وامزج مع دوار الأنابيب لمدة 5 دقائق بالضبط (وليس أكثر).
  7. أضف 1 مل من محلول البيض البارد وأعط دورة على البيكوفوج لإزالة السوبرناتانت. كرر ذلك 6 مرات.
  8. أضف 80 ميكرولتر من برونازي طازج (15 ملغ/مل).
  9. باستخدام ماصة بسعة 200 ميكرولتر (مع أطراف مفلترة)، اخلط 70 مرة خليط الديدان والبرونازي واحتضن لمدة 15 دقيقة عند RT.
  10. أضف 800 ميكرولتر من L-15 10٪ FBS وجهاز طرد مركزي لمدة 5 دقائق عند 500 × جرام عند 4 درجات مئوية.
  11. أضف 1 مل من L-15 10٪ من وسائط FBS وكرر الطرد المركزي.
  12. كرر الخطوة السابقة مرتين إضافيتين.
  13. قم بإزالة المادة الفائقة وأعد تعليقها في 900 ميكرولتر من وسط L-15 بنسبة 10٪ FBS.
  14. فلتر بفلتر 20 ميكرومتر.

8. عزل النوى وتصنيف الكروماتين

ملاحظة: استخدم أطراف الماصات المفلترة. قبل البدء: أخرج مخزن Tn5، ودعه يذوب، اضبط كتلة حرارية على 37 درجة مئوية، أخرج مجموعة تنقية منتجات PCR (جدول المواد)، ضع مخزن EB عند 37 °م، ويجب إجراء الطرد المركزي للأعمدة عند RT.

  1. قم بجهاز الطرد المركزي بتعليق الخلية المفلتر لمدة 5 دقائق عند 500 × جرام عند 4 درجات مئوية.
  2. أزل السوبرناتان، مع ترك ~50 ميكرولتر.
  3. أضف 45 ميكرولتر من محلول التحليل (جاهز حديثا) وأعد تعليقه بحذر.
  4. أضف بحذر 50 ميكرولتر من محلول الغسيل (لا تخلط).
  5. الطرد المركزي لمدة 5 دقائق على 500 × جرام عند 4 درجات مئوية. أزل السوبرناتان. احتفظ بها في الجليد.
  6. أثناء الدوران، حضر لكل تفاعل (Rx) خليط Tn5 التالي لكل عينة: 25 ميكرولتر Tn5 Buffer29، 24.8 ميكرولتر H2O، 0.2 ميكرولتر Tn5 إنزيم. جهز خليط رئيسي لعدة عينات.
  7. بعد الطرد المركزي، أزل السوبرناتانت. حافظ على النوى في التجمد. أضف 50 ميكرولتر من خليط Tn5 إلى حبيبات النوى واستخدم الماصة ببطء سبع مرات. حضن على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على كتلة حرارية. تأكد من إعطاء نقرات صغيرة لكل أنبوب كل 10 دقائق.
    ملاحظة: قم بإزالة مجموعة تنقية PCR وضع مخزن EB في حاضنة بدرجة حرارة 37 درجة مئوية. الخطوات الخمس التالية ستستخدم مخازن هذه المجموعة.
  8. بعد حضانة Tn5، أضف 300 ميكرولتر من مخزن PB (الأصفر) من المجموعة وامزج في دوامة بأقصى سرعة لمدة 25 ثانية.
  9. خذ كل حجم الأنبوب وانقله إلى عمود الدوران (بنفسجي، مخزن عند 4 درجات مئوية) وجهاز الطرد المركزي لمدة دقيقة واحدة عند أقصى سرعة عند RT.
    ملاحظة: العمود سيحمل الحمض النووي، بحيث يمكن التخلص من الفائق بثقة.
  10. أضف 750 ميكرولتر من مخزن الطاقة الكهرومغناطيسية إلى عمود الدوران وجهاز الطرد المركزي دقيقة واحدة عند أقصى سرعة عند RT.
  11. تخلص من المادة الفوقية مع أنبوب الجمع. ضع العمود في أنبوب جديد بسعة 1.5 مل وكرر عملية الطرد المركزي؛ تخلص من أنبوب 1.5 مل.
  12. ضع العمود في أنبوب جديد بسعة 1.5 مل وأضف 10 ميكرولتر من مخزن EB عند 37 درجة مئوية إلى مركز العمود. تأكد من عدم لمس العمود. اتركها عند RT لمدة دقيقة واحدة.
  13. جهاز الطرد المركزي لمدة دقيقة واحدة عند أقصى سرعة عند RT؛ لم تكن درجة الحرارة أبدا عند 4 درجات مئوية.
  14. كرر آخر خطوتين ليصبح المجموع 20 ميكرولتر في مخزن EB.
    ملاحظة: توقف اختياري: إذا توقفت، يمكن تخزين العينات عند -20 درجة مئوية. هنا، الكروماتين الموسوم في حجم 20 ميكرولتر.

9. تضخيم المكتبة

  1. لتضخيم مكتبة ATAC، يجب إجراء PCR في الوقت الحقيقي لتقدير رقم تضخيم الدورة المناسب (انظر الجدول 2). قم بذلك على لوحة PCR.
  2. لتقدير أرقام الدورة للتضخيم النهائي، يجب أخذ رقم الدورة الذي يتوافق مع الثلث الأول من منحنى التضخيم. من المثالي ألا يتجاوز رقم الدورة 15. يجب تقدير عدد الدورة لكل عينة.
    ملاحظة: بعد qPCR، يكون الحمض النووي الموسوم في حجم 18 ميكرولتر. توقف اختياري: إذا أردت التوقف، يمكن تخزين العينات عند -20 درجة مئوية.
  3. التضخيم النهائي لمكتبة ATAC:
    1. يجب أن يكون لكل عينة تمهيد RV مختلف (دون ملاحظات).
    2. يجب تضخيم كل عينة ليكون رقم الدورة (N) المقدر لكل واحدة.
    3. قم بإجراء هذا التحليل التفاعلي في أنابيب بسعة 200 ميكرولتر (انظر الجدول 3).
    4. هنا، هناك 8 ميكرولتر من الحمض النووي الموسوم و50 ميكرولتر من مكتبات ATAC المضخمة
    5. توقف اختياري: إذا رغبت في التوقف، يمكن تخزين العينة عند -20 درجة مئوية.

الجدول 2: تعليمات التضخيم الأول للمكتبة. برنامج وصفة وPCR لأول تضخيم مكتبة (القسم 9). يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.

الجدول 3: تعليمات التضخيم النهائي لمكتبة ATAC. برنامج وصفة وPCR لتضخيم المكتبة النهائي (القسم 9). يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.

10. تطهير المكتبة

ملاحظة: قبل البدء، أخرج خرز اختيار الحجم (AMPure، SPRIselect، أو خرز معاير منزليا) من الثلاجة لتسمح لها بالضبط على درجة حرارة الغرفة. اخلط الخرزات بقوة باستخدام الدوامة في كل مرة قبل الاستخدام.

  1. حضر 1 مل من 80٪ إيثانول (درجة جزيئية).
  2. أضف 25 ميكرولتر (0.5 فوليوم) من الخرزات إلى أنبوب العينة (حيث يوجد 50 ميكرولتر) وامزج مع الماصة.
  3. حضانة في RT لمدة 10 دقائق.
  4. ضع الأنابيب في الرف المغناطيسي لمدة 5 دقائق.
  5. انقل المادة الفائقة (70 ميكرولتر) إلى أنبوب نظيف جديد بسعة 200 ميكرولتر.
    ملاحظة: في هذه الخطوة، يتم التخلص من شظايا الحمض النووي التي تبلغ <200 قطعة مضطنة.
  6. أضف 65 ميكرولتر (1.3 فوليوم) من الخرزات وامزج 10 مرات.
  7. حضانة في RT لمدة 10 دقائق.
  8. ضع الأنابيب في الرف المغناطيسي لمدة 5 دقائق.
  9. تخلص من السوبرناتينت (دون أخذ الأنبوب من الرف المغناطيسي).
    ملاحظة: في هذه المرحلة، تحمل الخرزات شظايا DNA بحجم >200 نقطة أساس و<1000 نقطة حراسة.
  10. مع استمرار الأنبوب على الرف المغناطيسي، أضف 200 ميكرولتر من الإيثانول الطازج المحضر بنسبة 80٪ مباشرة فوق الخرزات واغسل الأنبوب عدة مرات لغسلها.
  11. أزل الإيثانول وكرر الغسيل ب 200 ميكرولتر من الإيثانول.
  12. تخلص من الإيثانول، ثم دع الخرزات تجف والغطاء مفتوح لمدة ~2–5 دقائق (لا تجف كثيرا).
  13. أخرج العينة/العينات/العينات/العينات) من الرف المغناطيسي. أعد تعليقها في 50 ميكرولتر من الماء المعقم2O. تأكد من غسل جميع الخرزات من جدران الأنبوب.
  14. وأخيرا، حضن الأنبوب/الأنابيب/الأنابيب) في الرف المغناطيسي لمدة 5 دقائق.
  15. انقل المادة الفائقة إلى أنبوب نظيف جديد. هنا، تخزن مكتبات ATAC المضخمة والمنقية.
    ملاحظة: يمكن تخزين المكتبات عند -20 درجة مئوية لفترة قصيرة (حتى أربعة أسابيع) أو لفترات أطول عند -80 درجة مئوية.

11. توزيع حجم الشظايا

  1. بمجرد الانتهاء من التضخيم النهائي، ينصح بتمرير جزء من العينة عبر الرحلان الكهربائي الشعري لرؤية نمط توزيع حجم الشظايا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يضمن مراقبة الجودة بعد وضع الوسم إعداد المكتبة بدقة
خلال البروتوكول، من المهم إيلاء اهتمام خاص لاختبار qPCR الذي يتم بعد وسم الكروماتين (القسم 9)، لأنه خطوة حيوية لتقييم جودة الحمض النووي وأداء التجربة. يوضح الشكل 1A منحنيين للتضخيم؛ اليسار (أقل من 15 دورة) يمثل مادة ذات جودة جيدة تظهر أن كل شيء كان ناجحا حتى هذه اللحظة، لذا لا بأس بالاستمرار. المنحنى على اليمين (الشكل 1A) يظهر مواد ذات جودة منخفضة، لذا لا ينبغي الاستمرار في استخدام هذه العين...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا نصف بروتوكولا محسنا لتحديد وصول الكروماتين على مستوى الجينوم بواسطة ATAC-seq في ديدان Caenorhabditis elegans الكاملة في المرحلة L4. يؤثر الوصول إلى الكروماتين بشكل مباشر على التعبير الجني، وإصلاح الحمض النووي، والتكاثر، وإعادة التركيب، وبينما أصبح ATAC-seq نهجا قياسيا لعينات الخلايا والأنسجة، فإن تطبيقه على الكائنات الحية السليمة يطرح تحديات تقنية فريدة، خاصة في الدودة الخيطية ذات الجلد غير النفاذ والغني بالكولاجين. وفي الوقت نفسه، يوفر تقييم اختبارات الكائن الحي الكامل فرصة...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون أنهم لا يواجهون تضارب مصالح. لم يستخدم أي ذكاء اصطناعي توليدي في كتابة أو تحليل أو إعداد هذه المخطوطة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

حصل ي. هيرش-غونزاليس على منحة دكتوراه من المجلس الوطني للبشرية، العلوم والتكنولوجيا في كوناهسيت (التي تعرف الآن باسم سكرتاريا دي سيينسيا، هيومانيدادس، تكنولوجيا إي إنوفاسيون، سيسيهيتي) (#CVU 846476). حصل جي هيرش-غونزاليس على دعم منحة دراسية من CONAHCYT (التي أصبحت الآن SECIHTI) (788519). وقد تم دعم هذا المشروع من IN217824 منحة PAPIIT-UNAM ومنحة SECIHTI CBF-2025-I-2275 إلى VJV. في IFC، نشكر UBM: لورا أونغاي-لاريوس، غوادالوبي كوديز هويرتا، ومينيرفا مورا كابريرا؛ وجامعة بوسطن في الهند: أوغوستو سيزار بوت-هيرنانديز وكارلوس بيرالتا ألفاريز؛ وجامعة كومبوتو، إيميجينولوجيا، تالير، وبيبليوتيكا. نشكر مركز التهاب الوراثة القرني (CGC) بكل امتنان لتوفيره السلالات المستخدمة في هذا العمل. يتم تمويل مركز CGC من قبل مكتب برامج البنية التحتية البحثية في المعهد الوطني للصحة (P40 OD010440).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
250 mL, 0.22 µm PESUltra Curzsc-200253
AgarBD214010
Agencourt AMPURE XPNalgeneA63886
Bovine Serum AlbuminMaplica200100
Calcium ChlorideSigmaC5670-100G
CellTrics 20 µmSysmex04-0042-2315
CholesterolSigmaC8503-25G
DigitoninSigmaD141-500 mg
Disposable glovesMicroflex94-243
DL-DithiothreitolsigmaD0632-10Gضارة
Ethyl alcohol, pureSigma1003661421
Fetal Bovine SerumbiowestS181S-500
HEPESSigmaH3375-250 G
Illumina Tagment DNA Enzyme and Buffer (large Kit)Illumina20034211
Kapa Syber 50 mLSigmaKK4618
L-15 Medium (Leivobitz)sigmaL4386-10L
Magnesium Chloride anhydrousSigmaM8266-100G
Magnesium Sulfate HeptahydrateSigmaM1880-500G
Magnesium Sulfate HeptahydrateSigmaM1880-500G
MinElute PCR Purification Kit (50 preps)Qiagen28004
NEBNext® High-Fidelity 2X PCR Master MixNEBM0541S
Nonidet P40 SubstituteSigma74835-1L
Pen StrepGibco15140-122
PeptoneBD211677
Petri dish 60 mmTritechT3308
Petri dish 90 mmInterluxC9015-2C
Pipet tips 10 µL, filterCellpro800108
Pipet tips 20 µL, filterCellpro800708
Pipet tips 200 µL, filterCellpro800608
Potassium ChlorideSigmaP9541 -500G
Potassium Phosphate Dibasic PowderJ.T. Baker3252-01
Potassium Phosphate Monobasic, CrystalJ.T. Baker3246-01 500G
Sodium ChlorideJT Baker3624-01
Sodium dodecyl sulfatesigmaL4509-100G
Sodium HydroxideMacron7708-10
Sodium HypochloriteCloralex544394479
Sodium Phosphate Dibasic 7-Hydrated CrystalJ.T. Baker3824-01
SPRIselectBeckmanB23318
SucroseSigmaS0389-500G
Syringe Filter PVDF 0.22 µmUltra CurzSc-358812
Trizma baseSigmaT1503 1KG
Tween 20SigmaP9416-50ML

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Poulet, A., et al. Identification and characterization of histones in Physarum polycephalum evidence a phylogenetic vicinity of mycetozoans to the animal kingdom. NAR Genom. Bioinform. 3 (4), lqab107(2021).
  2. Meléndez-Ramírez, C., et al. Dynamic landscape of chromatin accessibility and transcriptomic changes during differentiation of human embryonic stem cells into dopaminergic neurons. Sci. Rep. 11 (1), 16977(2021).
  3. Mansisidor, A. R., Risca, V. I. Chromatin accessibility: methods, mechanisms, and biological insights. Nucleus. 13 (1), 236-276 (2022).
  4. Koyanagi, K. O. Inferring chromatin accessibility during murine hematopoiesis through phylogenetic analysis. BMC Res. Notes. 16 (1), 222(2023).
  5. Gómora-García, J. C., Furlan-Magaril, M. Pioneer factors outline chromatin architecture. Curr. Opin. Cell Biol. 93, 102480(2025).
  6. Boivin, A., Dura, J. M. In vivo chromatin accessibility correlates with gene silencing in Drosophila. Genetics. 150 (4), 1539-1549 (1998).
  7. Penagos-Puig, A., Furlan-Magaril, M. Heterochromatin as an important driver of genome organization. Front. Cell Dev. Biol. 8, 579137(2020).
  8. Escamilla-Del-Arenal, M., Recillas-Targa, F. G. GATA-1 modulates the chromatin structure and activity of the chicken alpha-globin 3′ enhancer. Mol. Cell. Biol. 28 (2), 575-586 (2008).
  9. Zhong, J., et al. Mapping nucleosome positions using DNase-seq. Genome Res. 26 (3), 351-364 (2016).
  10. Johnson, S. M., et al. Flexibility and constraint in the nucleosome core landscape of Caenorhabditis elegans chromatin. Genome Res. 16 (12), 1505-1516 (2006).
  11. Boyle, A. P., et al. High-resolution mapping and characterization of open chromatin across the genome. Cell. 132 (2), 311-322 (2008).
  12. Buenrostro, J. D., et al. Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins, and nucleosome position. Nat. Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).
  13. Buenrostro, J. D., et al. ATAC-seq: A method for assaying chromatin accessibility genome-wide. Curr. Protoc. Mol. Biol. 109, 21.29.1-21.29.9 (2015).
  14. Corces, M. R., et al. The chromatin accessibility landscape of primary human cancers. Science. 362 (6413), eaav1898(2018).
  15. Shema, E., Bernstein, B. E., Buenrostro, J. D. Single-cell and single-molecule epigenomics to uncover genome regulation at unprecedented resolution. Nat. Genet. 51 (1), 19-25 (2019).
  16. Cao, J., et al. A human cell atlas of fetal gene expression. Science. 370 (6518), eaba7721(2020).
  17. Ma, S., et al. Chromatin potential identified by shared single-cell profiling of RNA and chromatin. Cell. 183 (4), 1103-1116.e20 (2020).
  18. Jänes, J., et al. Chromatin accessibility dynamics across C. elegans development and ageing. eLife. 7, e37344(2018).
  19. Dhillon-Richardson, R. M., et al. Fishing for developmental regulatory regions: Zebrafish tissue-specific ATAC-seq. Methods Mol. Biol. 2599, 271-282 (2023).
  20. Huynh, K., et al. Genetic variation in chromatin state across multiple tissues in Drosophila melanogaster. PLoS Genet. 19 (5), e1010439(2023).
  21. Lee, R. C., Feinbaum, R. L., Ambros, V. The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14. Cell. 75 (5), 843-854 (1993).
  22. Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
  23. Hillier, L. W., et al. Genomics in C. elegans: so many genes, such a little worm. Genome Res. 15 (12), 1651-1660 (2005).
  24. Daugherty, A. C., et al. Chromatin accessibility dynamics reveal novel functional enhancers in C. elegans. Genome Res. 27 (12), 2096-2107 (2017).
  25. Johnstone, I. L. The cuticle of the nematode Caenorhabditis elegans: a complex collagen structure. Bioessays. 16 (3), 171-178 (1994).
  26. Zhang, S., Banerjee, D., Kuhn, J. R. Isolation and culture of larval cells from C. elegans. PLoS One. 6 (4), e19505(2011).
  27. Stiernagle, T. Maintenance of Caenorhabditis elegans. WormBook. , The C. elegans. Research Community. (2006).
  28. Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. JoVE. (64), e4019(2012).
  29. Corces, M. R., et al. An improved ATAC-seq protocol reduces background and enables interrogation of frozen tissues. Nat. Methods. 14 (10), 959-962 (2017).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

ATAC Seq Tn5

مقالات ذات صلة