يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة بحثية

ينظم محور NEAT1/miR-181a-5p/HMGB1 استقطاب البلاعم والالتهاب في نماذج الإنتان

278 مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/69802

⸱

يناير 16, 2026

 ,  , 
1Tianjin Medical University General Hospital, 2Department of Critical Care Medicine, Affiliated Hospital of Hebei University

في هذه المقالة

ملخص

يدمج هذا البروتوكول عينات سريرية، وبلاعم مزروعة، ونموذج فأر ربط وثقب العضلات (CLP) لدراسة كيفية تنظيم محور NEAT1/miR-181a-5p/HMGB1 لاستقطاب البلاعم والالتهاب في تعفن الدم، مما يوفر إرشادات خطوة بخطوة يمكن تكييفها مع مسارات مناعية أخرى بوساطة lncRNA.

الملخص

يتميز الإنتان باستجابة مناعية مضطربة في المضيف ولا يزال سببا رئيسيا للوفيات حول العالم. تم ربط NEAT1 الريبي غير المشفرة لفترة طويلة بالأمراض الالتهابية، لكن دوره المحدد في استقطاب البلاعم أثناء الإنتان لم يتم تحديده بالكامل. هنا، نفحص بشكل منهجي محور NEAT1/miR-181a-5p/HMGB1 عبر العينات السريرية، والبلاعم المزروعة، ونموذج فأر CLP. تستخدم اختبارات PCR الكمية، وتحليل الضربات الغربية، واختبارات تقرير اللوسيفيرازين المزدوجين، وتجارب سحب RNA لتأكيد التفاعل التنافسي بين NEAT1 وmiR-181a-5p وHMGB1. تطبق الفحوصات الوظيفية، بما في ذلك التألق المناعي، وهجرة عبر البئر، وتلوين نهاية الحافة الطرفية (TUNEL) لإزالة الدوكسي نيوكليوتيديل ترانسفيراز dUTP (TUNEL)، لتقييم استقطاب البلاعميات والهجرة والاستماتة المبرمجة. في الجسم الحي، يتحقق نموذج CLP مع ELISA وعلم الأنسجة المرضي من تأثير سقوط NEAT1 على ملفات السيتوكينات وإصابة الأعضاء. يتم رفع تنظيم NEAT1 وHMGB1، بينما يتم تقليل تنظيم miR-181a-5p في المرضى المصابين بالإنتان وفي البلعم التحفيزية بالدهنيات التحفيزية بالسكريات. إسكات NEAT1 يعزز استقطاب البلاعم M2، ويقلل من السيتوكينات الالتهابية، ويعيق هجرة البلاعميات، ويخفف من تلف الأنسجة في الفئران المدمجة عبر محور miR-181a-5p/HMGB1. حسب علمنا، هذا هو أول بروتوكول متكامل يصف دائرة تنظيم lncRNA-microRNA-HMGB1 في الإنتان باستخدام أساليب سريرية متناسقة، وفي المختبر، وفي الجسم الحي. يوفر إطارا منهجيا لاستهداف شبكات ceRNA المرتبطة ب NEAT1 كاستراتيجيات علاجية محتملة.

المقدمة

يعرف الإنتان بأنه خلل في وظائف الأعضاء المهدد للحياة ناتج عن استجابة غير منظمة للعوائل للعدوى1. على الرغم من التقدم في الإدارة السريرية، لا تزال وفياته مرتفعة، والآليات الجزيئية وراء اختلال التوازن المناعي غير مفهومة بالكامل 2,3. بين منظمات المناعة، ظهرت الحمض النووي الريبي غير المشفر الطويل (lncRNAs) كعوامل مهمة لإشارات الالتهاب ووظيفة البلاعم 4,5. NEAT1، وهو نسخ غني بالطاقة النووية، هو مكون هيكلي للبقع الباريسبكلز وقد ارتبط بالاستجابات المناعية وإصابات الأنسجة 6,7. ربطت الدراسات السابقة NEAT1 بالتهاب الأمعاء، وإصابة نقص التروية/إعادة التروية، ومتلازمة الضيق التنفسي الحاد 8,9,10.

في سياق الإنتان، تشير الأدلة المتراكمة إلى أن الحمض النووي الريبي اللاعددي ينظم استقطاب البلاعم والإشارات الالتهابية، مما يؤثر على تقدم المرض ونتائجه11,12. على سبيل المثال، تم الإبلاغ عن أن lncRNA KCNQ1OT1 وSNHG1 تعدل إصابة عضلة القلب الناتجة عن الإنتان من خلال المسارات التي تتتوسط بواسطة microRNA13,14. ومع ذلك، لم يتم تعريف ما إذا كان NEAT1 ينظم استقطاب البلاعم عبر محور miR-181a-5p/HMGB1 في تعفن الدم بشكل منهجي. لمعالجة هذه الفجوة، أنشأنا بروتوكولا يجمع بين عينات دم المرضى، وبلاعم RAW264.7 المحفزة بالدهون متعددة السكريات، ونموذج فأر الربط والثقب لفحص محور NEAT1/miR-181a-5p/HMGB115,16. باستخدام PCR الكمي، وتحليل الغرب، واختبارات تقرير اللوسيفيرازين المزدوجين، وسحب RNA، وقراءات وظيفية لاستقطاب البلاعم M1/M2، والهجرة، والموت المبرمج، يوفر هذا البروتوكول إطارا تجريبيا قابلا لإعادة الإنتاج لتعريف NEAT1 كمنظم لوظيفة البلاعم في تعفن الدم ولدعم تطوير استراتيجيات مستهدفة ل lncRNA17,18.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تمت الموافقة على جميع الإجراءات التي تشمل المشاركين البشريين من قبل مجلس مراجعة الأخلاقيات في المستشفى التابع لجامعة خبي (رقم الموافقة: HDFY-LL-2021-232). تم الحصول على موافقة مكتوبة ومستنيرة من جميع المشاركين أو، عند الاقتضاء، من وكلائهم القانونيين. أجريت جميع التجارب على وفقا للإرشادات المؤسسية واللوائح الوطنية، وتمت الموافقة عليها من نفس لجنة الأخلاقيات. حدد البروتوكول المعتمد تفاصيل عملية ربط وثقب العضلات (CLP)، وإعطاء الفيروسات الغدية، ونظام التخدير، والنقاط النهائية الإنسانية.

جمع عينات المرضى

تم استقطاب مرضى الإنتان بشكل مستقبلي في المستشفى التابع لجامعة خبي بين فبراير 2022 ويوليو 2024. استوفى ما مجموعه 50 مريضا معايير الإدراج، بما في ذلك 26 ذكرا و24 أنثى، تتراوح أعمارهم بين 24-69 سنة (المتوسط 52.4 ± 10.2 سنة). تم تشخيص الإنتان وفقا لمعايير الإنتان-3، مما يتطلب وجود عدوى مشتبه بها أو مؤكدة بالإضافة إلى زيادة في درجة تقييم فشل الأعضاء المتسلسل (SOFA) بمقدار ≥ نقطتين. لكل مريض، تم تسجيل مصدر العدوى الأساسي (مثل عدوى الرئة أو البطن أو المسالك البولية أو مجرى الدم) وشدة المرض (تعفن الدم أو الصدمة الإنتانية)، وتم تلخيص توزيع درجات SOFA لوصف عبء المرض. كمجموعة ضابطة، تم تسجيل 39 فردا سليما بدون دليل سريري على وجود عدوى أو مرض التهابي جهازي (20 ذكرا و19 أنثى، تتراوح أعمارهم بين 26 و70 سنة، بمتوسط 50.7 ± 11.0 سنة)، ولم تكن هناك فروق ذات دلالة إحصائية في العمر أو الجنس بين المجموعات.

تم جمع دم الأوردة الطرفية من مرضى الإنتان قبل بدء العلاج المختص بالإنتان كلما أمكن ذلك. تم سحب الدم (عادة 5-10 مل) إلى أنابيب مغطاة بحمض الإيثيلين ديامين رباعي الأسيتيك (EDTA) وقلبه بلطف عدة مرات لخلط مضاد التخثر. تمت معالجة العينات خلال حوالي ساعة من الجمع. تم الحصول على البلازما عن طريق الطرد المركزي عند 1,500 × جرام لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة، ثم تم نقلها إلى أنابيب دقيقة معنونة، وتخزينها عند -80 درجة مئوية لقياسات السيتوكين اللاحقة. لاستخلاص الحمض النووي الريبي والبروتين، تم عزل خلايا الدم أحادية النواة الطرفية (PBMCs) من جزء من نفس العينات باستخدام وسط فصل الكثافة والتدرج وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. ثم تم غسل الخلايا مرتين في PBS، وتم عدها، وتخزينها كحبيبات خلايا عند -80 درجة مئوية.

زراعة الخلايا والانتقال

تم الحفاظ على خلايا البلعم الفأرية RAW264.7 في وسط RPMI-1640 مدعوما ب 10٪ مصل أبقار جنيني غير نشط بالحرارة، و100 U/mL بنسلين، و100 ميكروغرام/مل ستربتوميسين في حاضنة رطبة عند 37 درجة مئوية مع 5٪CO2. تم تمرير الخلايا باستخدام مكشطة خلايا قبل الوصول إلى التقاء زائد للحفاظ على نمط ظاهري مستقر.

للنقل، تم زرع خلايا RAW264.7 عند 5 × 10إلى 5 خلايا لكل بئر في صفائح ذات 6 آبار في 2 مل من وسط كامل لمدة تقارب 24 ساعة قبل التعرض للكاشف. عندما وصلت المزارع إلى التقاء بنسبة 70-90٪، تم تركيب الأحماض النووية (مثل بلازميدات التعبير NEAT1 أو HMGB1، والبلازميدات ذات الدبوس القصير، والمقلدات أو المثبطات miR-181a-5p، والمواد الضابطة المقابلة) بمادة تحويل دهونية في وسط خال من المصل وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. عادة، كان يتم خلط 2-3 ميكروغرام من حمض نووي البلازميدي أو 50-100 ميكروغرام من حمض النووي الريبي الصغير مع الحجم الموصى به من الكاشف، ويسمح لتكوين مركبات في درجة حرارة الغرفة لمدة 10-15 دقيقة، ثم تضاف قطرة قطرية إلى الخلايا في وسط خال من المضادات الحيوية. بعد 4-6 ساعات، تم استبدال الوسط بوسط جديد كامل، وتم حضن الخلايا لمدة 24-48 ساعة إضافية قبل إجراء الفحوصات اللاحقة.

استقطاب البلاعم

لتحفيز استقطاب البلاعم الالتهابي، سمح لخلايا RAW264.7 بالالتصاق في صفائح ذات 6 آبار لمدة لا تقل عن 4 ساعات في وسط كامل. ثم تم استبدال الوسط ب DMEM يحتوي على 100 نانوغرام/مل من الدهون البوليسكاريدية (LPS)، وتم حضن الخلايا لمدة 6 ساعات عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. بعد التحفيز، كانت الخلايا تعالج فورا لاستخراج الحمض النووي الريبي والبروتين، أو التلوين الفلوري المناعي، أو اختبارات الهجرة، أو تحليل الاستماتة المبرمجة، حسب تصميم التجربة.

تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي (qRT-PCR)

تم استخراج الحمض النووي الريبي الكلي من الخلايا المزروعة أو PBMCs أو أنسجة الفئران باستخدام كاشف أحادي الطور قائم على الفينول الجوانيدينيوم وفقا للإجراءات القياسية. باختصار، تم تحلل العينات في 1 مل من المادة الكيميائية لكل 10خلايا أو 50-100 ملغ من الأنسجة، وحضنتها لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة، ثم خلطت بقوة مع الكلوروفورم (0.2 مل لكل 1 مل من الكاشف). بعد الحضانة لمدة 2-3 دقائق، تم طرد الليزاتات بحرارة 12,000 × جرام لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية لفصل الأطوار. تم نقل الطور المائي إلى أنبوب جديد، وترسيب الحمض النووي الريبي بحجم متساو من الأيزوبروبانول. ثم تم حضانة الخليط لمدة تقارب 10 دقائق ثم تم طرد مركزه مرة أخرى عند 12,000 جرام × لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. تم غسل الحبيبة الناتجة بنسبة 75٪ إيثانول، وطرد مركزها بحرارة 7,500 × جرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية، وتجفيفها بالهواء لفترة وجيزة، وذابتها في ماء خال من RNase. تم تقييم تركيز ونقاء الحمض النووي الريبي باستخدام مطيافية الأشعة فوق البنفسجية، واستخدمت عينات بنسبة A260/A 280 تقريبا 1.8-2.0 للتحليلات اللاحقة. عند الضرورة، تم التحقق من السلامة بواسطة الرحلان الكهربائي الهلام بالأغاروز.

تم تصنيع الحمض النووي التكميلي (cDNA) من إجمالي الحمض النووي الريبي باستخدام مجموعة نسخ عكسي متوفرة تجاريا، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. بالنسبة ل miR-181a-5p، تم استخدام بادئات خاصة بالجين أو الحلقة الجذعية كما هو موصى به. تم إجراء PCR الكمي في الوقت الحقيقي باستخدام نظام PCR في الوقت الحقيقي ومزيج رئيسي مناسب (مثل الكيمياء الخضراء أو الكيمياء المعتمدة على المسبار) في حجم تفاعل إجمالي يبلغ 20 ميكرولتر يحتوي على قالب cDNA و0.2-0.4 ميكرومولار من كل بادئ. شملت ظروف الدورة النموذجية إزالة الطبيعة الأولية عند 95 درجة مئوية لمدة 3 دقائق، تليها 40 دورة من 95 درجة مئوية لمدة 10 ثوان و60 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، مع تحليل منحنى الصهر عند الاقتضاء لتأكيد خصوصية الأمبليكون. تم تطبيع مستويات تعبير NEAT1 وHMGB1 إلى GAPDH، وتم تطبيع تعبير miR-181a-5p إلى RNA نووي صغير من U6. تم حساب التعبير النسبي باستخدام طريقة 2-ΔΔCt وعبر عنه كتغيير الطية مقارنة بالمجموعات الضابطة. تم تجميع تسلسلات المقدمات وأحجام المضخمات في جدول بيانات منفصل لتقديمه كجدول تكميلي 1.

البلوط الغربي

في التنظيف الغربي، تم غسل الخلايا مرتين باستخدام PBS البارد جدا وتم تحللها في محلول مناسب لاختبار التقرب المناعي الإشعاعي (RIPA) مع مكمل مثبطات للبروتيياز. تم حضن الليزيات على الثلج لمدة 15-30 دقيقة مع خلط لطيف بين الحين والآخر، ثم تم طرد مركزها على حرارة 12,000 × جرام لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية لإزالة الحطام الخلوي. تم جمع المواد الفائقة، وتم تحديد تركيزات البروتين باستخدام اختبار حمض البيسينكونينيك (BCA).

تم خلط كميات متساوية من البروتين (عادة 40 ميكروغرام لكل مسار) مع مخزن التحميل، وغليها على حرارة 95 درجة مئوية لمدة 5-10 دقائق لتفكيك البروتينات، وفصلها على جل كبريتات الصوديوم الدوديسيل (SDS)-بولي أكريلاميد بتركيز مناسب من الأكريلاميد (على سبيل المثال، 10-12٪ ل HMGB1). تم نقل البروتينات إلى أغشية فلورايد البوليفينيليدين (PVDF) باستخدام نظام نقل رطب أو شبه جاف تحت ظروف موصى بها لنطاق الوزن الجزيئي المطلوب. تم حجب الأغشية بحليب غير دهني بنسبة 5٪ أو ألبومين مصل البقري (BSA) في محلول ملحي مخزن بتريس-مع 0.1٪ Tween-20 (TBST) لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة، ثم حضنت طوال الليل عند 4 درجات مئوية مع أجسام مضادة أولية ضد HMGB1 (مثل تخفيف 1:500) وGAPDH (على سبيل المثال، تخفيف بنسبة 1:1,000) مخففة في محلول حاجز. بعد ثلاث غسلات في TBST، تم حضن الأغشية بأجسام مضادة ثانوية مناسبة مع بيروكسيداز الفجل الحار لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. بعد غسلات إضافية، تم تصور أشرطة البروتين باستخدام ركيزة لمعان كيميائي معززة وتم التقاطها باستخدام نظام تصوير رقمي. تم قياس شدة النطاق باستخدام برامج تحليل الصور، وتم تطبيع إشارات HMGB1 إلى GAPDH، وتمت مقارنة التعبير النسبي عبر المجموعات.

اختبار مراسل لوسيفراز مزدوج

تم استنساخ شظايا البرية والطفرة من NEAT1 ومنطقة HMGB1 3′-غير مترجمة (3′-UTR) التي تحتوي على مواقع الارتباط المتوقعة miR-181a-5p إلى متجه تقرير لوسيفيراز19. تم التحقق من جميع البنى بواسطة تسلسل سانجر لتأكيد مواقع الإدخال والطفرات20. تم زرع خلايا RAW264.7 في صفائح بسعة 24 بئرا وسمح لها بالالتصاق طوال الليل. ثم تم نقل الخلايا معا مع بلازميدات المراسلة وإما مثبطات miR-181a-5p أو محاكاة أو عناصر تحكم سلبية مقابلة باستخدام كاشف نقل يعتمد على الدهون، كما هو موصوف في إجراء النقل العام.

بعد حوالي 24-48 ساعة من الحضانة، تم غسل الخلايا باستخدام PBS، وتحللها في مخزن تحلل سلبي مناسب (على سبيل المثال، 20 ميكرولتر لكل بئر)، وتحريك بلطف لضمان التحلل الكامل. تم قياس نشاط لوسيفراز باستخدام مجموعة اختبار مزدوجة اللوسيفيراز ومقياس ضوء متوافق مع تعليمات الشركة المصنعة. تم تطبيع نشاط لوسيفيراز اليراعي إلى نشاط رينيلا لوسيفيراز للتحكم في كفاءة النقل، وتمت مقارنة النشاط النسبي لكل مجموعة مع المجموعة الضابطة المقابلة.

اختبار الهجرة عبر البئر

تم تقييم هجرة البلاعم باستخدام غرف عبر البئر مغطاة مسبقا بهلام مصفوفة خارج الخلية مناسب لاختبارات غزو الخلايا. تم تخفيف الجل بنسبة 1:6 في وسط خال من المصل على الثلج، وأضيف 50 ميكرولتر من المحلول المخفف إلى السطح العلوي لكل إدخال. تم حضن الصفيحة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة تقارب 4 ساعات للسماح للجل بالتصلب. تم استخراج خلايا RAW264.7 المنقولة أو المعالجة، وأعيد تعليقها في وسط خال من المصل بمعدل 1 ×10 6 خلايا/مل، وأضيف 100 ميكرولتر من تعليق الخلية (1 ×10 5 خلايا) إلى الحجرة العلوية. تم ملء الحجرة السفلية ب 600 ميكرولتر من وسط كامل يحتوي على 10٪ مصل أبقار جنيني كجاذب كيميائي.

تم حضن الخلايا عند حرارة 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 24 ساعة. في نهاية الحضانة، كانت الخلايا غير المهاجرة المتبقية على السطح العلوي للغشاء تتم إزالتها بلطف باستخدام مسحة قطنية. تم تثبيت الخلايا المهاجرة الملتصقة بسطح الغشاء السفلي ب 95٪ إيثانول لمدة حوالي 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، ثم صبغت بمحلول بنفسجي بلوري 0.5٪ لمدة 10-15 دقيقة. تمت إزالة الصبغة الزائدة عن طريق الغسل باستخدام PBS، وتجفيف الأغشية بالهواء. تم فحص الخلايا المهاجرة تحت المجهر الضوئي، وتم عد الخلايا في عدة حقول عشوائية لكل إدخال بطريقة عمياء لقياس القدرة على الهجرة.

اختبار الاستماتة المبرمج TUNEL

لاكتشاف الاستماتة المبرمجة، تم زراعة خلايا RAW264.7 على أغطية زجاجية وخضعت للعلاجات أو التحويلات الموصى بها. تم تثبيت الخلايا ب 4٪ بارافورمالديهايد لمدة 30-60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة وشطفها ب PBS. تم حجب نشاط البيروكسيداز الداخلي عن طريق الحضانة في بيروكسيد الهيدروجين بنسبة 0.3٪ لمدة 20 دقيقة، تلاها غسلات PBS. تم استخدام مجموعة اختبار TUNEL، وتم تطبيق خليط الوسم لتغطية الخلايا. تم حضن العينات عند 37 درجة مئوية لمدة تقارب 60 دقيقة في غرفة رطبة، وتم إيقاف التفاعل وفقا لتعليمات المجموعة. بعد الحضانة باستخدام ستريبتافيدين-HRP أو كاشف كشف مكافئ لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية، تم رؤية النوى باستخدام ركيزة كروموجينية مثل 3,3′-ديامينوبينزيدين (DAB) حتى تظهر نوى أبوتتوكية ملونة باللون البني. تم صبغ الشرائح بالهيماتوكسيلين، وتجفيفها عبر الإيثانول المتدرج، وتنظيف الزيلين، وركبتها بوسط دائم. تمت ملاحظة الخلايا المبوتة والنوى الكلية تحت المجهر الضوئي، وتم حساب مؤشر الاستماتة كنسبة الخلايا الموجبة ل TUNEL.

التألق المناعي

لتركيب الفلورة المناعية، تم إزالة شمع أقسام الأنسجة المدمجة بالبارافين في الزيلين وإعادة ترطيبها عبر سلسلة إيثانول متدرجة إلى الماء. تم استرجاع المستضدات باستخدام حاجز مناسب (مثل عازل السيترات، رقم الهيدروجينية 6.0) واسترجاع الحواتم الناتج عن الحرارة بواسطة الميكروويف أو قدر الضغط، وفقا لتوصيات الأجسام المضادة. بعد التبريد والشطف، تم حجب الأقسام بمصل طبيعي بنسبة 5٪ في PBS لمدة ساعة واحدة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لتقليل الارتباط غير النوعي. ثم تم حضن الأنسجة خلال الليل عند درجة حرارة 4 درجات مئوية مع أجسام مضادة أولية ضد مؤشرات استقطاب البلاعم والسيتوكينات الالتهابية، بما في ذلك CD206، TNF-α، IL-1β، IL-6، إنزيم أكسيد النيتريك المحفز (iNOS)، IL-4، IL-10، وArg-1 (عادة عند تخفيف 1:500)، مخففة في محلول حاجب.

في اليوم التالي، تم غسل الأقسام في PBS وحضنتها بأجسام مضادة ثانوية متقاربة بالفلوروفور لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية في الظلام. تم صبغ النوى بمادة 4′,6-دياميدينو-2-فينيليندول (DAPI) لمدة 5 دقائق. بعد الغسلات النهائية، تم تركيب الأقسام بوسط تثبيت مضاد للتلاشي وفحصها تحت مجهر فلوري باستخدام مجموعات مرشحات مناسبة. تم التقاط الصور بإعدادات تعريض متسقة عبر المجموعات، وتم الإشارة إلى أشرطة مقياس (مثل 20 ميكرومتر) والتكبيرات في جميع لوحات الأشكال والرموز التوضيحية.

نموذج الفأر المتعفن الناتج عن CLP

تم التكيف مع الفئران الذكور C57BL/6 (24-32 جم) لمدة لا تقل عن أسبوع قبل الجراحة ثم تم توزيعها عشوائيا إلى مجموعات الشام، CLP، CLP بالإضافة إلى دبوس الشعر القصير السلبي الضابط، أو مجموعات CLP مع NEAT1 (n = 6 لكل مجموعة). تم تخدير الفئران عن طريق استنشاق الإيثر في غرفة مغلقة لمدة تقارب 1-3 دقائق حتى فقدان الإيثر المنعكس التصحيحي أو مخدر آخر معتمد من مؤسسة بجرعة ومدة تعرض تسبب فقدان منعكس التقويم مع الحفاظ على وظيفة تنفسية كافية. تم حلق شعر البطن، وتعقيم الجلد بمحلول مطهر مناسب. تم إجراء عملية بطن منتصف المسار بطول حوالي 1-2 سم لكشف الأساقال مع أمعاؤه المجاورة.

بالنسبة لالتهاب الجلد الربطي المزمن، تم إخراج السيمور بلطف وربطه بخبزة معقمة على حوالي ثلثي طوله، مع الحرص على عدم انسداد الصمام اللفائفي أو التأثير على تدفق الدم المسريقيق. تم ثقب السيكوم المربوط مرتين بإبرة معقمة من القياس المحدد في البروتوكول المعتمد (على سبيل المثال، 21 ج)، وتم بثها بلطف كمية صغيرة من المادة البرازية لضمان ثبات مواقع الثقب. ثم أعيد اللحم إلى التجويف البريتوني، وتم إغلاق جدار البطن والجلد بطبقات بالغرز. خضعت الفئران التي أجريت بعملية الصيد الصناعي لنفس عملية البطن والتعرض للسيكوم دون الحاجة إلى ربط أو ثقب.

لتحقيق تقليل العدوى في الجسم الحي ، تم تحضير ناقل فيروس أدينوفيروس يشفر shNEAT1 وناقل تحكم سلبي مقابل عند عيار محدد (على سبيل المثال، 1 × 109 وحدات تكوين لويحات/مل). تم إعطاء حجم ثابت من تعليق الفيروس (مثل 100 ميكرولتر لكل فأر) عبر الوريد الذيلي في وقت محدد بالنسبة ل CLP (على سبيل المثال، ساعة واحدة بعد الجراحة)، كما هو موصوف في التصميم التجريبي ومعتمد من لجنة الأخلاقيات. بعد الجراحة، تلقت الفئران رعاية قياسية بعد العملية، بما في ذلك إنعاش السوائل تحت الجلد إذا دعت الحاجة، وتمت مراقبتها للكشف عن علامات الإنتان والضيق السريري. في النقطة الزمنية المحددة مسبقا، تم القضاء على بطريقة إنسانية عن طريق استنشاق الإيثر بجرعة زائدة في غرفة مغلقة، باستخدام حوالي 5-10 مل من الإيثر لضمان توقف التنفس السريع، تليها تأكيد الوفاة، وجمع الدم لتحليل السيتوكينات، وجمع الأعضاء لإجراء علم الأمراض النسيجي، والفلورية المناعية، والاختبارات الجزيئية.

التحليل الإحصائي

تم إجراء التحليل الإحصائي باستخدام SPSS الإصدار 23.0 أو حزمة برامج إحصائية مكافئة. تعرض البيانات كمتوسط ± انحراف معياري (SD) ما لم يذكر خلاف ذلك. للمقارنات بين مجموعتين، تم استخدام اختبار t لطالب غير مقترن عندما كانت البيانات موزعة بشكل طبيعي مع تباينات متجانسة. للمقارنات بين ثلاث مجموعات أو أكثر، تم تطبيق تحليل التباين أحادي الاتجاه (ANOVA)، تلاه اختبارات لاحقة مناسبة للمقارنات المتعددة عند اكتشاف تأثير عام ذو دلالة. تم اعتبار قيمة p ثنائية الجانب < 0.05 ذات دلالة إحصائية. تم تعريف معنى الرموز الإحصائية (على سبيل المثال، p < 0.05، *p < 0.01) في أساطير الأشكال، ويتم الإشارة إلى عدد النسخ البيولوجية في النص أو الأساطير المقابلة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

اكتشاف تعبير وتفاعلات NEAT1/miR-181a-5p/HMGB1 في الإنتان

في المصل لدى مرضى الإنتان، كانت مستويات NEAT1 وHMGB1 أعلى بشكل ملحوظ مقارنة بالأشخاص السليمين في الضابطين، في حين انخفضت مستويات miR-181a-5p بشكل ملحوظ. لوحظت أنماط تعبير مماثلة في PBMCs وفي بلاعم RAW264.7 التي تحفز بالدهون البوليسكاريد، مما يشير إلى أن هذا المحور يتغير باستمرار في حالات الإنتان والالتهابات الشبيهة بالإنتان (الشكل 1A-C). خفض معدل NEAT1 في خلايا RAW264.7 أدى ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يتميز الإنتان باضطراب مناعي عميق وغالبا طويل الأمد، حيث تتعايش مراحل فرط الالتهاب وقمع المناعة معا وتساهم معا في فشل الأعضاء والنتائج السيئة21,22. تشير الأدلة المتراكمة إلى أن الحمض النووي الريبي غير المشفر الطويل (lncRNAs) يشارك في هذه العمليات من خلال تعديل الإشارات الالتهابية واستقطاب البلاعم23,24. على سبيل المثال، تم الإبلاغ عن أن lncRNA-MAAMT يعزز تجنيد البلاعم وتنشي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يعلن المؤلفون عدم وجود مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

يشكر المؤلفون الطاقم السريري والمختبري في مستشفى جامعة خبي التابع على مساعدتهم في استقطاب المرضى، ومعالجة العينات، ورعاية. وقد دعم هذا العمل لجنة الصحة في مقاطعة خبي (المنحة رقم 20220640).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
ناقل الفيروسات الأدينوفاروسية (shNEAT1)10692-V5فيجين للعلوم الحيويةفيروس الأدينوفيروس المستخدم لتقليل تعبير NEAT1 في الجسم الحي وفي المختبر.
مجموعة اختبار بروتين BCA23227ثيرمو فيشركانت مجموعة تستخدم لقياس تركيز البروتين في محللات الخلايا.
مجموعة اختبار المراسلين المزدوجة لوسيفرازE1910بروميغامجموعة تستخدم لاختبارات المراسل المزدوج لوسيفيراز لقياس تفاعل miR-181a-5p.
مجموعات إليسا (السيتوكينات)لا يوجدR& دي سيستمزمجموعات تستخدم لقياس مستويات السيتوكين في عينات المصل والأنسجة.
مصل الأبقار الجنيني (FBS)16000-044جيبكومكمل يستخدم في وسائط الزراعة لنمو الخلايا.
الأجسام المضادة GAPDH2118Sتقنية الإشارة الخلويةالجسم المضاد الأساسي ضد GAPDH يستخدم كوسيلة تحكم في التحميل في ويسترن بلوت.
مجموعة تلوين الهيماتوكسيلين وإيوسينلا يوجدثيرمو فيشرمجموعة تستخدم للتلوين النسيجي لمقاطع الأنسجة للتحليل المرضي.
الأجسام المضادة للفلورية المناعية (CD206)14693-1-APبروتين تكالأجسام المضادة المستخدمة للكشف عن علامة البلعم M2 CD206 في مقاطع الأنسجة.
ليبوبوليسكاريد (LPS)L2630سيغما-ألدرتشLPS المستخدم لتحفيز استقطاب البلاعم الالتهابي في خلايا RAW264.7.
miR-181a-5p Mimicلا يوجدلا يوجديستخدم مقلد miR-181a-5p الصناعي لتعديل مستويات miR-181a-5p.
بلازميد تعبير NEAT1لا يوجدلا يوجديستخدم البلازميد في التعبير الزائد عن NEAT1 في بلاعم RAW264.7.
خلايا البلاعم RAW264.7TIB-71ATCCخط خلايا البلاعم في الموران المستخدم في تجارب المختبر.
مخزن تحليل RIPA89901ثيرمو فيشرالمخزن المستخدم لتحلل الخلايا لاستخراج البروتين الكلي.
RPMI-1640 متوسط11875-093جيبكووسط الزراعة لبلاعم RAW264.7.
مزيج SYBR Green Master4385612ثيرمو فيشرالكاشف المستخدم في تحليل PCR الكمي في الوقت الحقيقي.
غرف اختبار الهجرة في ترانسويل3422كورنينغغرف تستخدم لاختبارات هجرة عبر البئر لتقييم هجرة البلاعميات.
مجموعة اختبار TUNEL للاستماتةAB66110أبكاممجموعة تستخدم لاكتشاف موت المبرمج في خلايا RAW264.7 عن طريق تلوين TUNEL.
الأجسام المضادة الغربية للنطخ (HMGB1)ab18256أبكامالجسم المضاد الأساسي ضد HMGB1 المستخدم في البلتينغ الغربي.

المراجع

  1. Singer, M., et al. The third international consensus definitions for sepsis and septic shock (Sepsis-3). JAMA. 315 (8), 801-810 (2016).
  2. Girardis, M., et al. Understanding, assessing and treating immune, endothelial and haemostasis dysfunctions in bacterial sepsis. Intensive Care Med. 50 (10), 1580-1592 (2024).
  3. Rudd, K. E., et al. regional, and national sepsis incidence and mortality, 1990-2017: analysis for the Global Burden of Disease Study. Lancet. 395 (10219), 200-211 (2020).
  4. Chen, L. L., Kim, V. N. Small and long non-coding RNAs: past, present, and future. Cell. 187 (23), 6451-6485 (2024).
  5. Mattick, J. S., et al. Long non-coding RNAs: definitions, functions, challenges and recommendations. Nat Rev Mol Cell Biol. 24 (6), 430-447 (2023).
  6. Ashrafizadeh, M., et al. Non-coding RNA-based regulation of inflammation. Semin Immunol. 59, 101606(2022).
  7. Zhang, L., Liu, B., Han, J., Wang, T., Han, L. Competing endogenous RNA network analysis for screening inflammation-related long non-coding RNAs for acute ischemic stroke. Mol Med Rep. 22 (4), 3081-3094 (2020).
  8. Pan, S., et al. LncRNA NEAT1 mediates intestinal inflammation by regulating TNFRSF1B. Ann Transl Med. 9 (9), 773(2021).
  9. Wang, L., Qu, P., Yin, W., Sun, J. Lnc-NEAT1 induces cell apoptosis and inflammation but inhibits proliferation in a cellular model of hepatic ischemia/reperfusion injury. J Int Med Res. 49 (3), 300060519887251(2021).
  10. Yamazaki, T., et al. Functional domains of NEAT1 architectural lncRNA induce paraspeckle assembly through phase separation. Mol Cell. 70 (6), 1038-1053.e7 (2018).
  11. Isobe, M., et al. Forced isoform switching of Neat1_1 to Neat1_2 leads to the loss of Neat1_1 and the hyperformation of paraspeckles but does not affect the development and growth of mice. RNA. 26 (3), 251-264 (2020).
  12. Zhang, R. X., et al. Mechanism of action of lncRNA-NEAT1 in immune diseases. Front Genet. 16, 1501115(2025).
  13. Liu, J., et al. LIN28A-dependent lncRNA NEAT1 aggravates sepsis-induced acute respiratory distress syndrome through destabilizing ACE2 mRNA by RNA methylation. J Transl Med. 23 (1), 15(2025).
  14. Zhou, Y., et al. Downregulation of lncRNA NEAT1 alleviates sepsis-induced acute kidney injury. Cent Eur J Immunol. 47 (1), 8-19 (2022).
  15. Hashemian, S. M., et al. Non-coding RNAs and exosomes: their role in the pathogenesis of sepsis. Mol Ther Nucleic Acids. 21, 51-74 (2020).
  16. Liu, B., Ren, H., Chen, J. LncRNA NEAT1 correlates with Th1 and Th17 and could serve as an assistant biomarker in sepsis. Biomark Med. 15 (13), 1177-1186 (2021).
  17. Sun, F., et al. LncRNA KCNQ1OT1 attenuates sepsis-induced myocardial injury via regulating miR-192-5p/XIAP axis. Exp Biol Med. 245 (7), 620-630 (2020).
  18. Luo, S., et al. Long non-coding RNA small nucleolar RNA host gene 1 alleviates sepsis-associated myocardial injury by modulating the miR-181a-5p/XIAP axis in vitro. Ann Clin Lab Sci. 51 (2), 231-240 (2021).
  19. Pan, W., et al. miRNA-204-5p acts as a tumor suppressor in gastric cancer by inhibiting cell migration, invasion, and glycolysis via the RAB22A/PI3K/AKT axis. Sci Rep. 15 (1), 204-205 (2025).
  20. Qi, R., et al. PRMT2-mediated upregulation of miR-323-3p in sensory neurons promotes trigeminal neuropathic pain by targeting Kv2. 1 channels. Cell Rep. 44 (8), 116028(2025).
  21. Cao, M., Wang, G., Xie, J. Immune dysregulation in sepsis: experiences, lessons and perspectives. Cell Death Discov. 9, 465(2023).
  22. Zeng, X., et al. Screening of key genes of sepsis and septic shock using bioinformatics analysis. J Inflamm Res. 14, 829-841 (2021).
  23. Zhao, Q., et al. Long non-coding RNAs regulate the inflammatory responses of macrophages. Cells. 11 (1), 5(2021).
  24. Yarani, R., Mirza, A. H., Kaur, S., Pociot, F. The emerging role of lncRNAs in inflammatory bowel disease. Exp Mol Med. 50 (12), 1-14 (2018).
  25. Gan, T., et al. LncRNA MAAMT facilitates macrophage recruitment and pro-inflammatory activation and exacerbates autoimmune myocarditis through the SRSF1/NF-κB axis. Int J Biol Macromol. 278 (Pt 1), 134193(2024).
  26. Munteanu, M. C., et al. Long non-coding RNA FENDRR regulates IFNγ-induced M1 phenotype in macrophages. Sci Rep. 10 (1), 13672(2020).
  27. Chen, R., Kang, R., Tang, D. The mechanism of HMGB1 secretion and release. Exp Mol Med. 54 (2), 91-102 (2022).
  28. Zhang, R., Feng, J. The diagnostic value of plasma high mobility group box 1 for sepsis following severe trauma. J Surg Res. 314, 79-84 (2025).
  29. Li, X., Jing, G., Guo, Z., Guo, Z. High-mobility group box 1 in acute kidney injury. Front Pharmacol. 16, 1618971(2025).
  30. Fan, H., et al. Inhibiting HMGB1-RAGE axis prevents pro-inflammatory macrophages/microglia polarization and affords neuroprotection after spinal cord injury. J Neuroinflammation. 17 (1), 295(2020).
  31. Hollis, R., Tenet, M., Aziz, M., Wang, P. Anti-DAMP therapies for acute inflammation. Front Immunol. 16, 1579954(2025).
  32. Roh, J. S., Sohn, D. H. Damage-associated molecular patterns in inflammatory diseases. Immune Netw. 18 (4), e27(2018).
  33. Murao, A., Aziz, M., Wang, H., Brenner, M., Wang, P. Release mechanisms of major DAMPs. Apoptosis. 26 (3-4), 152-162 (2021).
  34. Cheng, Y., et al. Identification of circRNA-lncRNA-miRNA-mRNA competitive endogenous RNA network as novel prognostic markers for acute myeloid leukemia. Genes. 11 (8), 868(2020).
  35. Shahpari, M., et al. The functional roles of competitive endogenous RNA (ceRNA) networks in apoptosis in human cancers: the circRNA/miRNA/mRNA regulatory axis and cell signaling pathways. Heliyon. 10 (21), e37089(2024).
  36. Huang, L., Wu, C., Xu, D., Cui, Y., Tang, J. Screening of important factors in the early sepsis stage based on the evaluation of ssGSEA algorithm and ceRNA regulatory network. Evol Bioinform Online. 17, 11769343211058463(2021).
  37. Liu, Z., et al. Uncovering the ceRNA network related to the prognosis of stomach adenocarcinoma among 898 patient samples. Biochem Genet. 62 (6), 4770-4790 (2024).
  38. Zhu, J., et al. lncRNA/circRNA-miRNA-mRNA ceRNA network in lumbar intervertebral disc degeneration. Mol Med Rep. 20 (4), 3160-3174 (2019).
  39. Chang, Z., et al. The construction and analysis of ceRNA network and patterns of immune infiltration in colon adenocarcinoma metastasis. Front Cell Dev Biol. 8, 688(2020).
  40. Hume, D. A., Irvine, K. M., Pridans, C. The mononuclear phagocyte system: the relationship between monocytes and macrophages. Trends Immunol. 40 (2), 98-112 (2019).
  41. Smigiel, K. S., Parks, W. C. Macrophages, wound healing, and fibrosis: recent insights. Curr Rheumatol Rep. 20 (4), 17(2018).
  42. Shapouri-Moghaddam, A., et al. Macrophage plasticity, polarization, and function in health and disease. J Cell Physiol. 233 (9), 6425-6440 (2018).
  43. Arts, R. J. W., Netea, M. G. Adaptive characteristics of innate immune responses in macrophages. Microbiol Spectr. 4 (4), (2016).
  44. Sweet, M. J., Ramnath, D., Singhal, A., Kapetanovic, R. Inducible antibacterial responses in macrophages. Nat Rev Immunol. 25 (2), 92-107 (2025).
  45. Rasheed, A., Rayner, K. J. Macrophage responses to environmental stimuli during homeostasis and disease. Endocr Rev. 42 (4), 407-435 (2021).
  46. Lee, H. C., et al. LPS-induced systemic inflammation is suppressed by the PDZ motif peptide of ZO-1 via regulation of macrophage M1/M2 polarization. eLife. 13, RP95285(2024).
  47. Qiu, P., Liu, Y., Zhang, J. Review: the role and mechanisms of macrophage autophagy in sepsis. Inflammation. 42 (1), 6-19 (2019).
  48. Patoli, D., et al. Inhibition of mitophagy drives macrophage activation and antibacterial defense during sepsis. J Clin Invest. 130 (11), 5858-5874 (2020).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

NEAT1 HMGB1
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.