تصور أوراق وبراكتياليس القطن باستخدام المجهر الرقمي لتحسين دقة التقييم وحفظ البيانات

Summary

هنا، نوضح عمليات تدريجية لتنمذة الرحيق الورقية والشقاق في نباتات القطن باستخدام صور مولدة بالمجهر الرقمي. هذه طريقة فعالة لتقطيع رحيق الأوراق والبراكت من القطن، حيث يمكن جمع المعلومات وحفظها في شكل صور رقمية.

Abstract

الرحيق هو غدد مميزة تنتج الرحيق، وتوجد في العديد من أنواع النباتات. تظهر الرحيق هياكل ووظائف متنوعة. في القطن، يكون التقييم التقليدي للصفة الرحيقة عرضة للأخطاء وغير موثوق وله حدود، حيث أن الأنماط الظاهرية لهذه الصفة غالبا لا تكون مرئية بالعين المجردة. يتم التحكم في تعبيرات الصفات الشحولية بواسطة جينات Ne1 و/أو Ne2. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يتأثر التعبير عن السمات بالبيئة ومراحل النمو، مما يؤكد الحاجة إلى طرق تقييم دقيقة. على وجه الخصوص، يؤدي التقييم الظاهري بواسطة الصور الرقمية إلى طريقة تسجيل أكثر دقة للرحيق. تتغلب هذه الطريقة على قيود التوسيط التقليدي من خلال توليد صور عالية الدقة. علاوة على ذلك، يسهل تحديد وتمييز الفروق الدقيقة في تعبير الصفات الرحيقة مع الحفاظ على هذه الصور الرقمية للرجوع إليها مستقبلا. يمكن تكييف طريقة تقييم الأنماط الظاهرية الموضحة هنا بسهولة لتصحيح صفات نباتية أخرى مثل الغدد والشعر واللون. يمكن تخصيص طرق التقييم هذه لتناسب أنواع النباتات الأخرى. في هذا المقال، نشرح الإجراءات خطوة بخطوة لكيفية جمع العينات من الحقل أو الدفيئة، وتشريحها لمشاهدتها باستخدام المجهر الرقمي، وحفظ هذه الصور لتحليل التقييم المستقبلي. في هذه الطريقة، سنستخدم، على سبيل المثال، تصحيح عينات الأوراق والبراكتيل من نباتات القطن لتمييز وجود الرحيق (مكتمل النمو، المختزل والبقايا) وغياب الرحيق.

Introduction

النباتات لديها غدد متخصصة تسمى الرحيق التي تصنع وتنتج الرحيق في معظم النباتات الزهرية، وبعض السرخسيات، وبعض البذور^{الثانوية} 1,2,3,4. تصنف النكتورات إلى ثلاثة أنواع: الميزوفيلارية، والثلاثية النواة، والظهارية، بناء على أصل الخلايا التي تنتج الرحيق⁵. الرحيق في القطن هو ثغور معدل مكون من ثغور غددي تعرف باسم الحليمات ومصنفة^كنوع ثلاثي 5^،6. معظم أنواع جوسيبيوم تحتوي على رحيق؛ ومع ذلك، يختلف عدد النكتريات الموجودة في هذا الجنس من نوع لآخر من النوع⁷. الرقيق الزهري (FNs) أكثر شيوعا من النكتورات خارج الزهرة (EFNs) في النباتات⁸. يمكن أن توجد هذه الرحيق في أي مكان على النبات باستثناء الجذور ^1,2. على سبيل المثال، يظهر Gossypium hirsutum رحيقات زهرية وخارج الزهرة⁹. تظهر نباتات القطن المنزلية ثلاث نباتات زهرية إضافية وواحدة زهرية¹⁰. الثلاثة الرحيق الإضافي الزهري هي الرقيق، والبراكتي، والرحيق المحيطي¹¹. الرقيق الورقي نباتي وعادة ما يكون موجودا على الأوراق في الجانب السفلي من الضلع الأوسط، بينما الرشيق البريكتي والمحيط بالصخرة تتكاثر وتتطور عند قاعدة البراكيت وسطح الكأس الخلفية. يرتبط الرقيق الزهري بزهرة تتطور على السطح العلوي (المحوري) للكاسة. يتم التحكم في هذه الصفة الرحيقة بواسطة موقع جيني^{واحد هو 12}. حددت دراسات أجرتها مجموعتان بحثيتان مستقلتان أن صفة الرحيق تتحكم بها جين واحد، Ne1 من جينوم A أو Ne2 من الجينوم D، وتم تعيينه إلى الكروموسومات 12 و26، على التوالي^12,13. هذه الصفة تعبر فقط في حالة متنحية مزدوجة، مما يعني أن حالة متنحية متماثلة فقط هي التي تعبر عن السمة بلا رحيق.

بالإضافة إلى هذه الجينات، تلعب الظروف البيئية ومراحل النمو دورا في التحكم في درجة التعبير. لذلك، يجب أن يكون هناك طريقة دقيقة لتقييم هذه الصفة. تركز الدراسة الحالية على التنمذة الظاهرية للرحيق الورقي والبراكتيل في القطن. النباتات التي تحتوي على رحيق منتج للرحيق تظهر تسجل على أنها موصولة، بينما النباتات التي تفتقر لهذه الصفة تسجل كنباتات خالية من الرحيق 1,2,3,4. الهدف الرئيسي من هذا المقال هو تقديم طرق تقييم دقيقة لصفة الرحيق باستخدام تقنية المجهر الرقمي. لا يمكن للتقييم التقليدي بالملاحظة البصرية المباشرة بسهولة اكتشاف الفروق في تغير تعبير صفة الرحيق في الموقع بالعين المجردة. يمكن تصور هذه الفروق الدقيقة في تعبيرات الصفات الرحيقة باستخدام المجهر الرقمي. للتوضيح، في رحيق أوراق القطن، يتبع معيار التقييم مقياسا قياسيا من 1-4 حيث 1 يمثل عدم وجود رحيق، 2 يمثل نتوءا على نمط الوريد، 3 يمثل الوسادات أو الحواف غير المتطورة بدون رحيق، و4 يمثل الرحيق الكامل والمتكامل مع وسادات وحواف^{شفافة 13}. تم إنشاء هذا التصنيف الظاهري باستخدام صور رقمية لرحقات الأوراق [باستخدام صور رقمية للجانب السفلي (السفلي) من منتصف الورقة]. بشكل عام، يتم تسجيل غياب الرحيق ب 0، ولكن بالنسبة للدلالة الإحصائية، لا يمكن استخدام القيمة 0 واستبدالها بالقيمة 1. لذا، تم تعديل نطاق تقييم النمط الظاهري إلى 1-4 من التصنيف المعياري 0-4¹³. تتبع معايير التقييم للأزهار نمط تسجيل مشابه من 1 إلى 4 حيث 1 تمثل بدون رحيق بدون غدد بارزة بدون وسادات أو نتوءات، 2 للغدد المشوشة التي تحتوي الرحيق عليها علامات وسادات خفيفة فقط ولا يوجد رحيق، 3 للغدد السيئة التكوين مع نتوءات و/أو وسادات باهتة أو غائبة، و4 للرحيق الكامل التكوين مع الرحيق. يظهر نمط التقييم هذا 4 للأنماط الظاهرية ذات الرحيق (متماثل الزيجوت/غير متماثل الزيغوت السائد لأحد الجينات)، 3، 2 للتعبير التفاضلي للصفة الرحيقة كما في الجينات غير المتغاير الزيجوت، و1 للصفات غير المتجانسة (متجانسة متنحية لكلا الجينين).

وبالمثل، يتم جمع الزهور وتشريحها خطوة بخطوة كما هو موضح في هذا المقال لجمع الصور الرقمية لتصحيح رحيق البراكتيا. يمكن تصور هذا النمط الظاهري بالمجهر لتحديد نقاط دقيقة يمكن تخزينها على شكل صور رقمية. في القطن، لا تجذب الصفات الرقيقة الملقحات فقط، بل تجذب أيضا الآفات التي تسبب فقدان المحصول¹⁴. لحل هذه المشكلة، اختار المربون نباتات خالية من الصفات الخالية من الرحيق كبديل للسيطرة على الآفات بشكل طبيعي دون استخدام المبيدات الكيميائية^9,15. تم إدخال صفة بلا رحيق في الأصل من Gossypium tomentosum إلى Gossypium hirsutum (قطن أبلاند المزروع)⁸. تعد طريقة التقييم هذه مفيدة بشكل خاص لتحديد الفصل الخالي من الرحيق بين المجموعات التي يتم توليدها عن طريق تهجين الوالدين المرحقين مع الوالدين غير الرحيق. نتيجة لهذه التهجينات بين والدين متنوعين، F₂ (الجيل الثاني للبناء) يظهر أنماطا جينية مختلفة من الرحيق المتماثل الزيجوت، والرحيق المتغاير الزيجوت، والمتماثل الزيجوت بدون رحيق. هناك جين سائد واحد فقط ضروري للتعبير عن صفات الرحيق، والذي يتبع نسبة الفصل 15:1 (9:3:3:1). لذا، 1 من كل 16 يعبر عن صفة الخصيق بدون رحيق في حالة متنحية متجانسة مع النمط الجيني ne1ne1ne2ne2. ومع ذلك، لاحظ الباحثون في برامج التربية عددا أكبر من الخطوط الخالية من الرحيق مقارنة بالنسبة المتوقعة وهي 1 إلى 16. هذا يعني أن الصفة الرحيقة تعبر عنها عندما تعبر الجينات كالتالي Ne1Ne1Ne2Ne2, Ne1ne1Ne2ne2, ne1ne1Ne2Ne2, ne1ne1Ne2ne2, Ne1ne1ne2ne2, and ne1ne1ne2Ne2. النمط المتنوع لتعبير صفات الرحيق في مثل هذه التجمعات من الرحيق المتماثل الزيجوت (Ne1Ne1Ne2Ne2), رحيقي متغاير الزيجوت (Ne1ne1Ne2ne2)، ومتماثل الزيجوت بدون رحيق (ne1ne1ne2ne2) يمكن تسجيل النباتات بدقة من خلال اكتشاف التغيرات المعروضة في الصور الرقمية^12,13. نظرا لأن النباتات غير المتغاير ذات الرحيق المنخفض قد لا تظهر سمة الرحيق بصريا وقد تشبه صفة الرقيق بدون رحيق، فإن التنمذج البصري يشكل تحديات في اختيار هذه الصفة بشكل موثوق. تزداد هذه المشاكل في أواخر موسم النمو، حيث لا توجد الرحقات في بعض أصناف القطن. يمكن اكتشاف الفروق بين النباتات غير المتغاير الزيجوت والنباتات غير الرحيقية المتماثلة بسهولة من خلال التصوير الرقمي، حيث قد تظهر النباتات المتغايرة الزيغوت رحيق صغير أو مقلل، بينما النباتات المتماثلة الزيجوت تفتقر تماما إلى هذه الصيفة. من الناحية الظاهرية، يصنف وجود الرحيق على أنه رحيق (متماثل الزيجوت/متغاير الزيجوت مع جين سائد واحد على الأقل)، ووجود رحيقات صغيرة أو متجانسة كغير متغاير الزيجوت، وغياب الرحيق كنباتات متجانسة الزيجوت بدون رحيق. أدى تقييم الصور الرقمية إلى تقليل التقييم غير الدقيق للنباتات غير المتغاير كنباتات بلا رحيق. وبالمثل، يفضل مرحلة منتصف الإزهار عندما يكون هناك أقصى تعبير للصفات. لذا، تم جمع عينات من الأوراق والأزهار في هذه المرحلة لإجراء تجارب تقييم النمط الظاهري هذه لتحقيق تقييم دقيق وموثوق للصفات الرحيقة. علاوة على ذلك، فإن تصور الصفات الرحيقة باستخدام المجهر الرقمي يمنع/يقلل من الإيجابيات الكاذبة للمجموعات التي لا تحتوي على صفات رحيقية. يستخدم هذا التقييم الظاهري للصفة الرحيقة أيضا في دراسات رسم الخرائط لتحديد علامات الحمض النووي المرتبطة بالصفة بلا رحيق والتي يمكن للمربين استخدامها في الانتقاء بمساعدة العلامة (MAS) للصفة بلا رحيق¹³. يمكن توسيع هذه التقنية لتشمل أنواع النباتات الأخرى بالإضافة إلى دراسة صفات أخرى مثل الغدد والشعر واللون. بشكل عام، لا يحل تقييم الصور الرقمية مشكلة التقييم غير الدقيق للصفات الشحولية فحسب من خلال توفير صور عالية الدقة، بل يحدد أيضا تغيرات التعبير الدقيقة ويخزن الصور الرقمية للاستخدام المستقبلي. القطن الذي يحتوي على صفة خالية من الرحيق قد يستخدم للمكافحة الحيوية للآفات، بالإضافة إلى الإجابة على أسئلة بحثية حول كيفية تشجيع هذه الصفة على تفاعلات الحشرات المفيدة.

Protocol

1. أخذ عينات الأوراق من الزجاج أو الحقول (الشكل 1)

1. جهز أكياس زيب-لوك عينات مع عينات معرفية. خزن أكياس العينات في درجة حرارة الغرفة حتى الاستخدام.
2. ضع المبرد في الثلاجة قبل يوم من جمع العينات. ضع كيس ثلج من الفريزر في قاع المبرد. ضع صينية بلاستيكية على كيس الثلج في المبرد.
   ملاحظة: يمكن استخدام أي مبرد محمول لهذا الغرض. ضع كيس الثلج في المبرد يليه صينية بلاستيكية (هذا الفصل يمنع تلف التجمد الناتج عن ملامسة العينة مباشرة للثلج) قبل نقل المبرد إلى موقع جمع العينات.
3. انقل أكياس المبرد والأكياس المزينة بالبلاستيك إلى الدفيئة/الحقل لجمع العينات. تم جدولة رش منتظم للنباتات الحقلية لجمع عينات خالية من الآفات. وبالمثل، بالنسبة للنباتات الدفيئة، تم اتباع جداول الرش والأسمدة المنتظمة للنباتات الصحية.
4. اجمع الأنسجة الورقية الصغيرة من نباتات دفيئة أو قطنية مزروعة في الحقول تتراوح أعمارها بين 8 إلى 12 أسبوعا في أكياس العينات الموسومة.
   1. اختر مرحلة منتصف الإزهار لاختيار العينة بسبب أعلى تعبير عن صفة الرحيق في هذه المرحلة. اختر الأوراق الصغيرة من جميع النباتات في هذه المرحلة التطورية. بالإضافة إلى التأثير الجيني والبيئي، تتأثر الصفة الرحيقة أيضا بمرحلة التطور.
   2. للحفاظ على ثبات مرحلة التطور للمقارنة بين الأنماط الجينية المختلفة ضمن مجموعة_F2 ، اجمع عينات الأوراق بشكل موحد في مرحلة واحدة لتقييد المقارنة بهذه المرحلة. استخدم حجم الأوراق من 5 إلى 7 سم كعمدة قياس، لكن يمكن جمع نفس حجم الأوراق الصغيرة من جميع العينات. تظهر الأوراق القديمة تعبيرا عن صفات الرحيق، لكن في بعض الخطوط، لا يتم التعبير عن صفة الرحيق في مراحل لاحقة من التطور. لتجنب هذا التفاوت وتحسين اتساق جمع البيانات، اتبع هذه التعليمات أثناء جمع العينات.
5. اجمع نسيج ورقة العينة وضعه في كيس العينة المعني. اجمع على الأقل ورقتين لكل عينة نباتية.
6. بالنسبة لأنسجة الورقة، اختر أوراقا صحية بطول 5 إلى 7 سم عبر شفرة الورقة من الفرع العلوي للنبات.
   ملاحظة: الأوراق الصغيرة الموجودة على الفروع العلوية مفضلة لجميع العينات. هذا النوع من جمع العينات لا يقتصر فقط على أخذ العينات في مرحلة تطور محددة، بل يقلل أيضا من الأخطاء في التصنيف الظاهري من خلال الحفاظ على ثبات نوع العينة. تشمل المعايير الأخرى سهولة الوصول وصحة الأوراق. سيتم إجراء مقارنة بيانات متسقة عند جمع عدة أوراق نباتية من نفس مرحلة التطور لتحديد الفروق الظاهرية القائمة على النمط الجيني في التجمعات.
7. ضع كل كيس عينة مغلق مع نسيج الورقة في المبرد. انقل المبرد إلى المختبر.
8. نقل العينات الفردية إلى الثلاجة للحفاظ على ظروف تبريد تبلغ 4 درجات مئوية. خزن العينات في الثلاجة حتى يتم تصوير الرحيق رقميا. يمكن تخزين الأوراق لمدة تصل إلى يومين للتصوير الرقمي، لكن يفضل التقاط الصور في نفس اليوم أو اليوم التالي.
9. لفحص عدد كبير من عينات الأوراق، اجمع عينات على دفعات لإنهاء التصوير في الوقت المحدد ليوم واحد بعد حصادها. اجمع عينات على دفعات من 10 إلى 20 أو استخدم عدة مبردات لمنع تلف الأنسجة أو طي الأنسجة. يجب توخي الحذر عند جمع العينات للحصول على صور رقمية جيدة.

2. أخذ عينات من الزهور من الدفيئة أو الحقول (الشكل 1)

1. اتبع الخطوات من 1.1 إلى 1.6. اجمع الزهور من نبات زجاجي عمره 8 إلى 12 أسبوعا أو نبات قطن مزروع في الحقل. اجمع على الأقل زهرتين لكل عينة نباتية.
   1. اجمع الزهور عادة من الفروع العلوية عندما تكون النباتات في منتصف مرحلة الإزهار. تظهر صفة الرحيق أعلى تعبير في مرحلة منتصف الإزهار.
2. قطف أزهارا صحية. ضع كل كيس عينة مغلق يحتوي على زهرتين على الأقل في المبرد. انقل المبرد إلى المختبر.
3. نقل العينات الفردية إلى الثلاجة للحفاظ على ظروف تبريد تبلغ 4 درجات مئوية. تخزين العينات في الثلاجة حتى يتم تصوير القطع العصبية رقميا.
   1. معالجة العينات في نفس اليوم أو اليوم التالي بعد الجمع. اجمع عينات الأزهار، ويخزنها عند 4 درجات مئوية، ويعالج الرحيق البراكسي في نفس اليوم. اجمع الزهور التي تنتج في وقت لاحق من اليوم التالي أو في وقت لاحق من الأسبوع وقم بإجراء تصوير رقمي لرحيق البراكتيل في نفس اليوم.

3. إعداد المجهر الرقمي الأولي (الشكل التكميلي 1)

ملاحظة: يمكن استخدام مجاهر مماثلة أخرى لالتقاط الصور وتخزينها رقميا.

1. شغل المجهر (VHX 600) وأكمل الخطوات الأولية. ضع ورقة بيضاء نصف مطوية بحجم A4 تتناسب مع حجم مرحلة المجهر.
2. اضبط الضوء على منصة/مسرح المجهر باستخدام مقابض الإضاءة الصغيرة الموجودة في وحدة التحكم في الكونسول.
3. قم بتدوير مفتاح الإضاءة (المقبض الصغير في الكونسول) إلى أقصى حد للحصول على أقصى إضاءة ومفتاح سطوع (مقبض كبير في الكونسول) إلى متوسط عالي عن طريق تدوير المقبض على الكونسول 3/4 الطريق.
4. برنامج VHX 600 المدمج يظهر خيارات لضبط العدسة على شاشة الكمبيوتر. قم بضبط العدسة لتكبير 10 أضعاف عن طريق اختيار خيار العدسة 10x على الشاشة. قم بتشغيل مفتاح تشغيل الشاشة في الشاشة الأمامية للكمبيوتر، وستظهر القائمة الرئيسية التي تعرض خيارات العدسة وخيارات تسجيل الصور.
5. خذ عددا قليلا من العينات (3 إلى 5) من الثلاجة إلى المبرد للتصوير الرقمي. ضع المبرد مع العينات بجانب المجهر.
6. احتفظ بلوح التقطيع والشفرة المعقمة على الطاولة بالقرب من المجهر. اختر عينة واحدة من المبرد وأخرج الأنسجة العينة للبدء في التصوير الرقمي (الشكل 1).

4. التصوير الرقمي والتسوية بورقة الرقيق (الشكل 2)

1. اتبع الخطوتين 1 و3. افتح كيس الزيبلوك العيني وضع عينة الأوراق على لوح التقطيع. اقطع عنفقة الورقة باستخدام شفرة معقمة.
   ملاحظة: للاستخدام الآمن للشفرات، ارتد قفازات وابق حواف الشفرة الحادة موجهة بعيدا عن أصابعك، بحيث يكون النسيج بين الأصابع أثناء إجراء الشقوق.
2. انقل نسيج الورقة إلى الورقة البيضاء المقطوعة مسبقا الموضوعة على المسرح. اقلب نسيج الورقة في وسط مرحلة المجهر بحيث يكون الجانب البديني مواجها للأعلى.
3. ركز على منتصف الورقة عن طريق تدوير التعديلات الخشنة والدقيقة لمقابض المجهر برفق. استمر في التعديل حتى لا يظهر أي ضبابية في الصورة.
4. وبما أن الرحيق موجود في الطرف السفلي من الضلع الأوسط، حافظ عليه في المركز حيث لوحظت الأوردة الوسطى والأوردة المتفرعة لاحقا. حافظ على تركيز الورقة في المنتصف على المسرح.
   ملاحظة: يلاحظ رحيق ورقة واحد فقط في القطن المنزلي، بينما تظهر الأنواع البرية ثلاث رحيق، واحدة على العرق الأوسط وواحدة على كل وريد جانبي على جانبي الضلع الأوسط (إجمالي الرحيق :3).
5. ضبط التعديلات الخشنة والدقيقة للمجهر لتحسين وضوح الصورة الرقمية. قم بجميع تعديلات الصورة لالتقاط وحفظ صورة الرحيق للورقة.
   1. لتجنب انعكاس الضوء على الصورة الرقمية، أطفئ جميع الأضواء وسجل الصورة على شاشة الكمبيوتر. أطفئ جميع الأضواء في الغرفة واستخدم مصباح طاولة لمعالجة كل عينة. بعد تنفيذ جميع الخطوات، أطفئ المصباح واترك ضوء المجهر فقط مضاءا وسجل الصورة.
6. احفظ الصورة بمجرد أن يطلب البرنامج نافذة تظهر عدة خيارات للحفظ. احفظ الصورة (عن طريق وضع علامة على كل صورة) برقم معرف العينة. قم بتقييم الصورة الرقمية لرحيقة الأوراق على أنها 1، 2، 3 و4 بناء على النمط الظاهري للرحيق. قم بتحديث ورقة التقييم لكل معرف عينة.

5. التصوير الرقمي وتحديد الرقيق البراكتيالي (الشكل 3)

1. اتبع الخطوتين 2 و3. انقل عددا قليلا من عينات الزهور (2-3) للتصوير. أخرج عينة الزهور من كيس الزيبلوك.
2. أزل البراكتات من الزهرة باستخدام الملقط أو يدويا. ضع الزهرة على لوح التقطيع النظيف. استخدم شفرة معقمة لقطع ساق الزهرة. استخدم شفرة معقمة لعمل شق مستقيم على حافة القطع التي أزيلت.
3. ضع النسيج مقلوبا (مع وضع السويقة للأعلى) على الورقة البيضاء المقطوعة مسبقا موضوعة على مرحلة المجهر.
4. استخدم تعديلات خشنة ودقيقة لتحسين وضوح الصورة المعروضة على الشاشة. قم بجميع تعديلات الصورة واضغط على زر التسجيل في وحدة التحكم لالتقاط صورة الورقة.
   1. قم بضبط الصورة عن طريق ضبط المقبض الصغير/مفتاح الضوء على الحد الأقصى، وزر السطوع الكبير/السطوع على متوسط عالي (عن طريق تدوير المقبض إلى 3/^4). ثم تحسين دقة الصورة عن طريق تدوير التعديلات الخشنة والدقيقة للمجهر. حافظ على هذه التعديلات ثابتة وبدل العينات حتى يتم تسجيل الصور لمجموعة العينات بأكملها. لتجنب انعكاس الضوء على الصورة الرقمية، أطفئ جميع الأضواء وسجل الصورة على الكمبيوتر.
5. بعد ذلك، يطلب البرنامج نافذة تعرض جميع مواقع الكمبيوتر لحفظ الصورة. احفظ الصورة الرقمية في الكمبيوتر مع رقم معرف العينة.
6. قم بتقييم رحيق البراكتيل (الشكل التكميلي 2) ب 1، 2، 3، و4 بناء على النمط الظاهري الذي لوحظ في الصور الرقمية المكتسبة. قم بتحديث ورقة التقييم مع معرف العينة والدرجة المناسبة للتحليل المستقبلي

Results

تم اختيار نباتات القطن التي تزرع في الحقل لمدة 8 إلى 12 أسبوعا لهذه الدراسة. تم جمع نسختين تقنيتين على الأقل لكل نبتة لكل نوع نسيج. يتم جمع عينات صحية من الأوراق الصغيرة من الأغصان العلوية بشفرات أوراق طولها من 5 إلى 7 سم. يتم جمع عينات زهور صحية من الزهور المفتوحة أو براعم الزهور التي ستفتح في نفس اليوم. تم جمع عينات أوراق وزهور من الحقل من خطوط نباتية مختلفة، وتم توليد صور رقمية لكلا نوعي الأنسجة في المختبر باستخدام المجهر (الشكل 1). تم اتباع جميع الخطوات كما هو موضح أعلاه في الإجراء من جمع العينات إلى التصوير (كما هو موضح في الشكل 2 والشكل 3). تظهر النتائج التمثيلية لكل من الرحيق الورقي والبراكتيل عادة غياب الرحيق (1)، ووجود الرحيق ذو الأنماط الظاهرية المتوسطة (2، 3)، ووجود رحيق مكتمل النمو ينتج الرحيق (4). البيانات التي تم إنشاؤها في الشكل 4 هي الصور الرقمية التي تم الحصول عليها من مصنعين قطنيين مختلفين (مملح وبدون رحيق). أظهرت نتائج تقييم الصورة الرقمية لسطح الورقة المحوري (على الجانب السفلي من الضلع الأوسط) نمطين ظاهريين بدرجات 1 (بدون رحيق على الضلع الأوسط) و4 (مع رحيق متطور بالكامل مع الرحيق؛ الشكل 4A,B). وبالمثل، عند تحليل عينات الأزهار بحثا عن رحيق البراكتيال، أظهرت نمطا ظاهريا من 1 (بدون رحيق) و4 (رحيق مكتمل الشكل ينتج رحيق؛ الشكل 4C,D). من الناحية المثالية، يجب أن تتبع الأوراق والأزهار التي جمعت من نفس النبات نفس النمط، مما يعني أن الورقة والزهرة بلا رحيق يجب أن تنتميان إلى نبات واحد، بينما يجب أن تنتمي الورقة والزهرة المروحية إلى نفس النبات. يتم إنتاج الشكل 5 من خلال جمع صور رقمية لكل من الرحيق الورقي والبراكتيل للنباتات المروحية بحجم 10 أضعاف، 20، و40 مرة لرؤية الصفات الرحيقة بوضوح. علاوة على ذلك، لفهم كيفية إعطاء هذا التقييم عند_{فصل مجموعات} F2 من آباء القطن المرحقين والعديمي الرحيق، تم جمع أنسجة الأوراق من إحدى هذه المجموعات، وتم إنتاج صور رقمية لكل عينة من رحيق الأوراق. تم تمييز الصور الرقمية المختارة على شكل أوراق تتوافق مع التوزيع القياسي للتنسيق 1، 2، 3، و4 في الشكل 6¹³. النمط الشائع والسهل التعرف عليه هو غياب الرحيق ووجود الرحيق. يمنح غياب الرحيق أدنى درجة، بينما يحصل الرحيق المتطور بالكامل على أعلى درجة وهي 4. نطاق الدرجات بين 1 و4، وهي 2 و3، غير متطور وأصغر من الرحيق العادي. يمكن ملاحظة هذا النمط في الرحيق المتماثل الزيجوت، وهو حالة 1 (غائبة)، وحالة متغاير الزيجوت كما في الدرجات 2 و3 (الرحيق المختزل)، و4 (الرحيق الكامل النمو). بالإضافة إلى ذلك، يمكن زراعة خطوط الوالدين المروحية والخالية من الرحيق مع مجموعات سكانية لمقارنة وفهم هذه الفروقات.

الشكل 1: نظرة عامة على خطوات تصور الرحيق الأوراق والبراكتيال بدءا من أخذ العينات إلى المجهر الرقمي. (أ) اختيار نباتات القطن في منتصف مرحلة الإزهار لجمع عينات الأوراق والأزهار معا. (ب) جمع عينات أوراق من الحقل لرصد الصفات الرحيقة على الورقة. (ج) قلب الورقة بحيث يواجه الجانب السفلي من الورقة للأعلى وراقب صفة الرحيق في منطقة الصندوق الأسود المميزة. (د) وضع الورقة على مرحلة المجهر، والحفاظ على التركيز في منطقة الصندوق الأسود المميزة لتسجيل الصور الرقمية لرحيق الأوراق. (ه) جمع الزهور في مرحلة منتصف الإزهار من الحقل (أ). (و) عمل شق بوضع الزهرة على لوح تقطيع وشق في خط مستقيم في منطقة الصندوق الأبيض باتجاه السهم، مفصلا قاعدة الزهرة. (ز) وضع المقطع المحفور على مرحلة المجهر للتصوير الرقمي لرحيق البراكتيال. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 2: إجراء تدريجي للتصوير الرقمي وتقطيع رحيقات الأوراق في القطن. 1. جمع مواد الأوراق من الحقل في أكياس عينات معنونة ووضعها في مبرد 2. انقل المبرد مع العينات إلى المختبر 3. أخرج عينات فردية من المبرد 4. افتح كيس العينات الفردية وأخرج ورقة 5. اقطع سوقة الورقة يدويا أو استخدم شفرة. 6. ضع الورقة على مرحلة المجهر المضبوطة مسبقا بحيث يكون الجانب السفلي (الخلفي) مواجها للأعلى 7. اضبط التكبير إلى 10x في شاشة الكمبيوتر VHX 600. قم بضبط التعديلات الخشنة والدقيقة للميكروسكوب للحصول على أفضل دقة للصورة. 8. انظر إلى شاشة الكمبيوتر لأي تعديلات على الصورة التي تلاحظها على شاشة الكمبيوتر (ضبط الضوء والسطوع الذي يتم التحكم فيه بواسطة مقابض صغيرة وكبيرة عن طريق تدوير هذه المقابض، استخدام الأزرار الدقيقة والخشنة على المجهر لأفضل دقة صورة، وإيقاف الأضواء الأخرى لإزالة الانعكاس، إلخ) في ورقة الرقيق 9. احفظ الصورة الرقمية للتوسيق. دائرة القطع حول الرحيق في الورقة تبرز منطقة رحيق الأوراق في الصورتين 8 و9. راقب رحيق الأوراق تحت المجهر بتكبير 10 أضعاف (100 ميكرومتر). يلاحظ رحيق ورقة واحد فقط في القطن المنزلي (كما هو موضح في هذه الصورة). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 3: إجراء خطوة تدريجي للتصوير الرقمي وتقطيع رحيق البراكتيل في القطن. 1. جمع عينات الزهور من الحقل في أكياس العينات المعنونة واحتفظ بها في المبرد 2. أخرج عينة واحدة من المبرد 3. أخرج زهرة واحدة 4. أزل البراكت يدويا عن طريق قطعها بعيدا عن الزهرة 5. قم بعمل شق باستخدام شفرة معقمة عن طريق قطع حافة البراكتيل في خط مستقيم (المربع الأبيض موضح في الشكل 1 قبل الانتقال إلى التصوير الرقمي لرحيق البراكتيال) 6. اقلب القسم 7 المنقوش. ضع القسم المحفور بحيث يكون جانب السويقة مواجها للأعلى على مرحلة المجهر المرحلة 8. قم بضبط الضوء باستخدام مفاتيح الضوء والسطوع في وحدة التحكم المتصلة بالمجهر. استخدم تعديلات خشنة ودقيقة على المجهر لجمع الصور بدقة جيدة. تلاحظ جميع الصور تحت المجهر بتكبير 10 أضعاف (100 ميكرومتر). اجمع الصور الرقمية لتصحيح الخصلات البريكتية. تسلط الدوائر في الصور الرقمية لرحيق البراكتيل الضوء على وجود الرحيق، وهناك 3 نكتاريات بركتيل في القطن المنزلي. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 4: صور رقمية لرحيق أوراق القطن ورحيق البراكتيال. (أ) ورقة مع رحيق؛ (ب) ورقة بدون رحيق؛ (ج) زهرة تظهر 3 رحيق براكتي، و(د) زهرة لا تظهر أي رحيق براكتي. راقب كل من رحيقات الأوراق والزهور تحت المجهر بتكبير 10 أضعاف (100 ميكرومتر). تظهر دوائر الداش وجود وغياب الرحيق في رحيق الأوراق ورحيق البراكتي. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 5: تم تكبير رحيقات الأوراق والبراكتيل بمقدار 10x و20x و40x لتحديد الرحيق بوضوح في الصور الرقمية. (أ) جمع عينات من الأوراق لملاحظة صفة الرحيق على الضلع الأوسط. (ب) مراقبة رحيق الأوراق على الضلع الأوسط تحت المجهر بتكبير 10 أضعاف. (ج) مراقبة رحيق الأوراق على الضلع الأوسط تحت المجهر بتكبير 20 مرة. (د) مراقبة رحيق الأوراق على الضلع الأوسط تحت المجهر بتكبير 40x. (ه) شق قسم زهور للرحيق البراكتيلي. (و) مراقبة الرقيق البراكتي تحت المجهر بتكبير 10 أضعاف. (G) مراقبة الرقيق البراكتيالي تحت المجهر بتكبير 20x. (ح) مراقبة الرقيق البراكتي تحت المجهر بتكبير 40 مرة. تمثل أشرطة التدرج في كل صورة التكبير الذي تم به التقاط صور رحيق الأوراق أو الرحيق الشققي (كما هو موضح هنا ب 10x، 20x، و40x). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 6: نمط النقاط القياسي لرحيق الأوراق باتباع أنماط 1، 2، 3، و4. (أ) عينة أوراق بدون رحيق كما هو مميز في الدوائر المتقطعة (الدرجة 1 لعدم وجود رحيق). (ب) يظهر الرحيق الصغير للأوراق نمطا لأحد الحالات غير المتغاير (صورة دائرة متقطعة للرحيق مصنفة 2). (ج) رحيق الأوراق بدرجة 3، نمط آخر من الهيتروزيجوت. (د) الرحيق الكامل بدرجة 4. المقياس 10x يمثل التكبير الذي تم التقاط الصور به. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 7: رحيق الأوراق ورحيقات البراكتيال دون استخدام المجهر. يصور الشكل كيف تظهر النكتريات مع التوزيع التقليدي. تم تعديل هذا الرقم من¹³. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 8: الأنماط الجينية المحتملة للسكان يظهر الشكل الأنماط الجينية لمجموعات_F2 الناتجة عن تهجين آباء متنوعين، متولين بالرحيق وبدون رحيق. تم تعديل هذا الجدول من^{العدد 13}. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل الإضافي 1: إعداد المجهر الرقمي. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الشكل الإضافي 2: عدد مختلف من الرقيق البراكتيالي الذي تم ملاحظته. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

Discussion

الرحيق هي ترايكومات غددية متخصصة تنتج الرحيق في النباتات لتحقيق التلقيح المتقاطع الناجح. توجد الرحيق النباتي والتكاثري في النباتات. جنس Gossypium (القطن) يحتوي على أكثر من 50 نوعا، ومعظمها يحتوي على رحيق أوراق¹⁶. ومع ذلك، فإن هذه الصفة في القطن تجذب أيضا الآفات، مما يؤدي^{إلى خسائر} إضافية في الإنتاجية. اختار المربون صفات طبيعية خالية من الرحيق (غياب الرحيق) التي اكتشفت أولا في G. tomentosum لحل هذه المشكلة. لهذا السبب، أدخلوا هذه الصفة بلا رحيق إلى القطن المزروع في الأراضي المرتفعة¹⁷. في النهاية، تم توليد عدة مجموعات سكانية عن طريق اختيار سلالات رحيقة وخالية من الرحيق كآباء. نظرا لأن مجموعات النباتات المتجانسة الخالية من الرحيق وغير المتغاير الزيجوت لا تظهر أي اختلافات عند ملاحظتها بالعين المجردة، فهناك حاجة إلى أداة خاصة لتمييز هذه النباتات. لذلك، فإن طريقة التصحيح هذه باستخدام المجهر الرقمي، على عكس التصحيح التقليدي (كما هو موضح في الشكل 7)، لا تصور فقط الرحيق المختزل، بل تمنع أيضا التقييم غير الدقيق للنباتات غير المتغاير الزيجوت بدون رحيق كنباتات عديمة الرحيق متجانسة الزيجوت.

يعتمد التقييم الظاهري باستخدام الصور الرقمية على عدة عوامل رئيسية، مثل النقطة الزمنية المحددة لجمع العينة، اختيار العينة، استخدام مقياس قياسي للنقاط الورقي والبراكتيالية، النمط الجيني المحتمل، وكيفية تفسير بيانات التقييم للتطبيقات اللاحقة. أولا، من المهم جمع الأوراق والزهور خلال موسم النمو عندما يكون إفراز الرحيق في أعلى مستوياته، عادة في مرحلة منتصف الإزهار في يوليو. ثانيا، يلعب اختيار الأوراق أو الزهور بالحجم والمرحلة المناسبين دورا حاسما في تحديد النمط الظاهري. بالنسبة للأوراق، كانت الفروع العلوية ذات شفرات الأوراق التي يبلغ طولها 5 إلى 7 سم مفضلة لقطع رحيق الأوراق. وبالمثل، لإزالة رحيق البراكتيا، تم اختيار أزهار صحية من الأغصان العلوية. اختيار العينة في مراحل تطور محددة سيساعد حتى عند مقارنة جميع النباتات ضمن مجموعة سكانية من خلال استبعاد تعبيرات الصفات المعتمدة على مراحل النمو (كما هو موضح في الشكل 8). للتحقق مما إذا كان التصحيح قابلا للتكرار، تم توليد صور رقمية لعينتين على الأقل لكل نسيج لكل نبات. جمع عدة نسخ من نفس النبات يساعد في جمع البيانات بشكل متسق.

القيود المحتملة للطريقة هي الحفاظ على النباتات الخالية من الآفات حتى يتم جمع العينات. يمكن التعرف على مناطق الإصابة بالآفات من خلال بقع الأنسجة أو البيض الموضوعة في الأنسجة أو التلف في مناطق الرحيق التي تحتوي على مناطق سوداء لا تظهر فيها الرحيق بسبب استهلاكها من قبل المن أو الحشرات الأخرى. وقد لوحظ ذلك خلال فحص مئات العينات. في مثل هذه الحالات، تم جمع الأوراق والزهور الصحية مرة أخرى وتحليلها للحصول على بيانات متسقة من تلك العينات. يمكن حل ذلك من خلال الحفاظ على جداول منتظمة لمكافحة الآفات وإضافة الأسمدة للحصول على نباتات صحية. اتباع جميع الخطوات الحرجة كما هو موضح سيساعد في استكشاف أخطاء تقييم الأنماط الظاهرية.

لهذه التقنية عدة تطبيقات، مثل رسم الخرائط لتحديد علامات الحمض النووي التي تساعد المربين في تحديد الأنماط الجينية للاختيار بمساعدة المؤشر. يتطلب هذا التقييم الظاهري تأكيدا من علامات الحمض النووي بسبب التأثيرات البيئية ومرحلة التطور، بالإضافة إلى الجينات التي تتحكم في هذه الصدة. لذا، فإن تصنيف هذه الصفة باستخدام المجهر الرقمي سيكون نقطة انطلاق لتضييق عدد كبير من النباتات من عدة مجموعات إلى عدد قليل من الخطوط المشتبه بها بلا رحيق. باستخدام علامات الحمض النووي، يتم التحقق من صحة هذه الخطوط لاستخدامها في برامج التربية لتطوير مقاومة الأمراض بدون رحيقة وصفات في الأصناف الجديدة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة أيضا الباحثين على فهم دور صفة الرحيق في النباتات والتفاعلات المفيدة مع الحشرات.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
المجهر الرقمي	كاينس VHX	VHX 600	يمكن استخدام مجاهر أخرى
لوح التقطيع الفاربروير	فاربروير	رقم الطراز 78892-10	14'' L × 11'' عرض × 0.5''Th، يمكن استخدام أي علامة ماركة، وهذا متوفر بسعر amazon.com
مبرد صغير بسعة 9 كوارت في Igloos Laguna	إيغلو	رقم الجزء 00043567	يمكن استخدام أي علامة تجارية أو أي حجم حسب احتياجات المشروع
أكياس بلاستيكية (400 قطعة)، 3 × 4 إنش	علامة أوبيكو	NA	4''L ×3''W × 0.01''H، يمكن استخدام أي علامة ماركة، المفضلة هي البلاستيكية الشفافة اللون.
Single  شفرات الحلاقة الحافة، حزمة 100	ويوب	NA	يمكن استخدام أي علامة تجارية، وهذه متوفرة على amazon.com