مقالة بحثية
* These authors contributed equally
يتيح هذا البروتوكول دمج التسلسل من الجيل القادم والفلورية المناعية متعددة الألوان لتشكيل سرطان الغدة الرئية. يهدف إلى تحليل العلاقة بين التغاير الجيني وكثافة الخلايا المناعية المتسللة للأورم. يسهل هذا النهج متعدد الأبعاد تقييما شاملا للبيئة الدقيقة للورم لتقييم التنبؤ بعد العملية.
يتم تقييم توقع سرطان الغدة في الرئة (LUAD) تقليديا من خلال مرحلة انتقال العقد الورمية (TNM)، والتي لا تأخذ في الاعتبار حالة المريض المناعية. يدمج هذا البروتوكول التحليل الجينومي وتحليل البيئة الدقيقة المناعية لتسهيل تقييم تنبؤي أكثر شمولا بعد العملية. تتضمن الطريقة تحليلا استعاديا للأنسجة الورمية المدمجة في البارافين باستخدام تقنيتين رئيسيتين. أولا، يتم إجراء تسلسل الجيل التالي (NGS) باستخدام لوحة مخصصة مكونة من 37 جينا لتحديد الطفرات في جينات السائق والمتغيرات ذات الأهمية غير المؤكدة. ثانيا، يستخدم التألق المناعي متعدد القنوات (mIF) لاستهداف العلامات مثل HLA-DR، CD68، CD163، CD206، PD-L1، وPanCK. يتيح ذلك قياس التوزيع المكاني والكثافة لمجموعات فرعية محددة من الخلايا المناعية عبر مناطق الأورام المختلفة. يتيح هذا النهج المتكامل التقييم المتزامن لتباين الجينوم وخصائص الخلايا المناعية المتسللة للأورم. تحدد البيانات الناتجة تركيبات محددة من ملفات الطفرة—مثل حالة EGFR —وكثافات الخلايا المناعية. تمكن هذه التركيبات المتكاملة من دراسة تأثيرها الجماعي على بقاء المرضى، مما يوفر نهجا واعدا لتطوير نماذج مستقبلية لتنبؤ سرطان الرئة. يظهر هذا البروتوكول طريقة قوية لتوصيف الخصائص البيولوجية المعقدة للبيئة الدقيقة للورم في LUAD.
يعد LUAD النوع الفرعي الأكثر انتشارا من سرطان الرئة، ومع ذلك يظل متوسط معدل البقاء على قيد الحياة خلال 5 سنوات منخفضا عند حوالي 15٪1. يعتمد التقييم التنبؤي الحالي بشكل أساسي على نظام الترتيب TNM؛ ومع ذلك، غالبا ما تتجاهل هذه الطريقة الحالة المناعية العامة للمريض، مما قد يحد من دقته التنبؤية. تشير الأدلة إلى أن كل من التباين الجينومي والبيئة الدقيقة للورم (TME) يلعبان أدوارا حاسمة في تكوين الأورام في LUAD وتطور المرض 2,3.
في السنوات الأخيرة، أتاح الانتقال من تسلسل سانجر التقليدي إلى نظام NGS المستهدف التحليل عالي الحساسية والمتزامن لجينات المحركات المتعددة مثل EGFR وTP53 وKRAS 4,5. بينما يوفر NGS خريطة عالية الدقة للتغيرات الجينية، لا يمكن للبيانات الجينومية وحدها أن تلتقط التفاعلات الخلوية المعقدة والتنظيم المكاني داخل TME.
لمعالجة هذه التعقيدات، يقدم التحليل العضلي متعدد العضلات مزايا كبيرة مقارنة بطرق التحليل المناعي التقليدية. بينما تقتصر الكيمياء المناعية الفردية (IHC) على علامة واحدة لكل قسم، فإن mIF تتيح الكشف المتزامن لعدة علامات بروتين مع الحفاظ على البنية المكانية للنسيج. على عكس التحليل التسلسلي للنسيج الهوكي (IHC) الذي قد يسبب تحلل الأنسجة، أو التسلسل الخلوي المتدفق وتسلسل الحمض النووي الريبي الضخم، الذي يؤدي إلى فقدان الموقع المكاني ودقة الخليةالفردية 6,7,8، يسمح mIF مع شرح المنطقة المكانية بتوصيف متعدد المعاملات في الموقعلمشهد المناعة 9.
ينشئ هذا البروتوكول سير عمل مشترك يدمج التقييم المستهدف ل NGS، وmIF، وتقييم المنطقة المكانية (يشمل كامل الأنسجة، وحدود الورم، ونواة الورم). مثل هذا النهج متعدد الأبعاد ضروري للتحقيق في التفاعل بين التغيرات الجينومية وكثافة الخلايا المناعية—وهي علاقة غالبا ما تفشل الأساليب ذات النمط الواحد في التقاطها. من خلال تقييم هذه الخصائص المتكاملة، يوفر هذا البروتوكول استراتيجية تكميلية لتوصيف الخصائص البيولوجية ل LUAD ويوفر إطارا أكثر قوة للتدرج التنبؤي بعد العملية.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
تمت الموافقة على هذه الدراسة الاستعادية من قبل لجنة الأخلاقيات الطبية في مستشفى كونمينغ يانآن (رقم الموافقة 2021-140-01). تم الحصول على موافقة مستنيرة من جميع المشاركين.
تصميم الدراسة وجمع العينات
تم تسجيل مجموعة مكونة من 63 مريضا يعانون من LUAD مؤكد مرضيا أو نسيجيا وخضعوا لاستئصال جراحي بين عامي 2015 و2021. شملت معايير الاستبعاد تلقي العلاج الكيميائي المساعد الجديد، أو العلاج الإشعاعي، أو العلاج المناعي قبل الجراحة. بالإضافة إلى ذلك، تم استبعاد المرضى الذين لديهم أورام خبيثة متزامنة، أو أمراض مصاحبة شديدة، أو جودة نسيج ضعيفة، أو سجلات سريرية غير مكتملة من التحليل. تمت معالجة كتل الأورام المدمجة بالبارافين المثبتة في الصيغة الفورمالينية (FFPE) إلى أقسام بحجم 1 مم لإزالة البارافين. كما هو موضح في سير العمل (الشكل 1)، خضعت هذه العينات لتحليل متكامل باستخدام mIF ونظام NGS المستهدف. يتيح هذا النهج المشترك التقييم المتزامن للتغيرات الجينومية وخصائص البيئة الدقيقة المناعية، مما يوفر إطارا متعدد الأبعاد لتوصيف بيولوجيا الأورام.
متابعة
تم تتبع الأدوية المستهدفة للمريض، والعلاج المناعي، وتطور المرض أو وفاته عبر المتابعة الهاتفية، وتم الحصول على معلومات مفصلة حول حالة بقاء المرضى، وتطور المرض أو عودته، والعلاجات المساعدة التي تلقاها بعد الجراحة، وأي أمراض مصاحبة تم تشخيصها حديثا. انتهى وقت المتابعة في يوليو 2023، وكانت نقطة الملاحظة النهائية هي تقدم المرض أو الوفاة. تم تعريف البقاء على قيد الحياة بشكل عام بأنه الفترة من بداية الجراحة حتى وفاة المريض. لم يفقد أي مرضى أثناء المتابعة. كان الحد الأدنى لوقت المتابعة 21 شهرا.
تحضير وتسلسل مكتبة NGS
استخراج الحمض النووي من مقاطع نسيج FFPE
الحصول على مقاطع نسيج FFPE (بسماكة 3–10 ميكرومتر) من عينات مرضية. ضع مقاطع في أنابيب طرد مركزي دقيق معقمة. أضف الزيلين إلى كل أنبوب وحضن لمدة 5–10 دقائق في درجة حرارة الغرفة لإزالة البارافين. استخدم الطرد المركزي بقوة 12,000 × جرام لمدة 5 دقائق ثم تخلص من السوبرناتانت بعناية. كرر علاج الزيلين مرة واحدة لضمان إزالة البارافين الكاملة. اغسل الحبيبات بشكل متسلسل بإيثانول 100٪ مرتين لإزالة بقايا الزيلين. جفف الحبيبة بالهواء في درجة حرارة الغرفة حتى يتبخر الإيثانول المتبقي بالكامل. أضف محلول التحلل المناسب وبروتيناز K (المقدم في مجموعة استخراج الحمض النووي) وحضن النسيج عند حرارة 56 درجة مئوية لمدة 1–3 ساعات (أو طوال الليل إذا لزم الأمر) حتى يتم تحلل النسيج بالكامل. إجراء حضانة إضافية عند 90 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة لعكس الربط المتبادل للفورمالين. استخلاص الحمض النووي الجينومي باستخدام مجموعة استخراج الحمض النووي التجارية من FFPE (انظر جدول المواد) وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. غالبا ما تكون جودة الحمض النووي من عينات FFPE مجزأة؛ لذلك، يجب أن تفي جودة الحمض النووي بالحد الأدنى من حدود السلامة (مثل DIN ≥ 5) لضمان التحضير الناجح للمكتبة للمستهدفين المستهدفين.
قياس الحمض النووي وتطبيره
قم بقياس الحمض النووي باستخدام طريقة فلورومتري لضمان قياس تركيز دقيق. تطبيع عينات الحمض النووي إلى تركيز نهائي يقارب 5–10 نانوغرام/ميكرولتر باستخدام مخزن Tris-HCl (pH 8.5). قم بتنفيذ خطوات التخفيف تدريجيا إذا لزم الأمر لضمان دقة وثبات تركيز الحمض النووي.
تحضير المكتبة وهدف الإثراء
تحضير مكتبات تسلسل باستخدام NGS مستهدف يعتمد على الالتقاط الهجين على الحمض النووي المستخرج من نسيج FFPE10. إجراء إثراء الهدف باستخدام لوحة مسبار مخصصة تغطي المناطق الخارجية من الجينات المختارة المرتبطة بتطور الأورام. تقييم جودة المكتبة وتوزيع حجم الشظايا باستخدام الطرق القياسية (مثل الأنظمة القائمة على الرحلان الكهربائي)، إذا لزم الأمر.
تجميع المكتبات وتسلسل الكتب
قم بقياس كل مكتبة باستخدام اختبار فلوروميري. مكتبات المسابح بتركيزات متساوية المضمار وفقا لمتطلبات مجموعة التسلسل. قم بتحميل المكتبات المجمعة على منصة التسلسل Illumina وتنفيذ التسلسل باستخدام نمط تسلسل مزدوج النهايات بسرعة 150 بيتاب.
معالجة البيانات واكتشاف المتغيرات
تمت معالجة قراءات التسلسل الخام باستخدام خطوط أنابيب المعلوماتية الحيوية القياسية، بما في ذلك تقليم المحولات، وتصفية الجودة، والمحاذاة مع الجينوم المرجعي البشري (GRCh37/hg19). كانت مؤشرات مراقبة الجودة كما يلي: > الربع 20 85٪، متوسط عمق التسلسل > 2500x، معدل تحقيق الهدف > 65٪، وعقوبة الأساس للطي 80 ≤ 2. مراقبة الجودة والمحاذاة: خضعت بيانات FASTQ الخام لمراقبة الجودة باستخدام FastQC وTrim Galore (أو Trimmomatic) لإزالة تلوث المحولات وتسلسلات منخفضة الجودة. تم محاذاة القراءات النظيفة مع الجينوم المرجعي البشري GRCh37 (hg19) باستخدام جهاز Burrows-Wheeler Aligner (BWA). معالجة ما بعد المحاذاة: تم إجراء الفرز، وتحديد التكرار، وإعادة معايرة نقاط الجودة الأساسية (BQSR) باستخدام بيكار وأداة تحليل الجينوم (GATK) لتقليل النداءات الإيجابية الكاذبة. النداء المتغير: تم اكتشاف تعدد أشكال النيوكليوتيد الأحادي في الخط الجرثوي (SNPs) وInDels باستخدام BWA MEM (0.7.16a - r1181). تم تحديد SNVs وInDels الجسدية من خلال نهج توافقي باستخدام Mutect2 و VarScan2. تم تقييم الطفرات منخفضة التردد بشكل إضافي باستخدام نموذج فريبايز الإحصائي (v 1.3.2). التعليق والتصفية: تم توضيح المتغيرات باستخدام ANNOVAR، مع دمج بيانات من gnomAD وClinVar وCOSMIC. تم تمييز متغيرات الخط الجرثومي عن الطفرات الجسدية من خلال تصفية SNPs عالية التردد للسكان وتقييم ترددات الأليلات المتغيرة (VAF). عتبات VAF: تم استخدام حد أقصى ل VAF بنسبة ≥5٪ للأحداث المستنسخة (مثل ROS1 وALK)، بينما تم تطبيق عتبة 1٪ على الطفرات الجينية (مثل EGFR) لضمان اكتشاف التغيرات منخفضة التردد، وهو ما أصبح ممكنا بفضل متوسط عمق التسلسل العالي البالغ >500x. تم تمييز الطفرات الجراثيمية عن الطفرات الجسدية باستخدام بيانات مشروع 1000 جينوم (1000G) وقاعدة بيانات محلية للأفراد الهان الصينيين الأصحاء التي أنشئت في مختبرنا. تم إجراء تقييم الممرضية للمتغيرات الجسدية المكتشفة وفقا لإطار العمل رقم11 ل AMP/ASCO/CAP، الذي يحسن تقييم الأدلة للمتغيرات الجسدية من خلال نهج متعدد المستويات قائم على الأدلة. يتم الاحتفاظ بالمتحورات الممرضة/المحتملة الممرضة (P/LP)، وتصنيفها يستند إلى معايير المستوى I/II التي تتطلب أدلة A/B (موافقة إدارة الغذاء والدواء، التجارب السريرية) أو C/D (الدراسات قبل السريرية/دراسات الحالة) للتقييم. المستوى الثالث (VUS) يفتقر إلى الأدلة الحاسمة، بينما يشير المستوى الرابع إلى متغيرات حميدة من خلال تكرار السكان (مثل gnomAD) أو الدراسات الوظيفية؛ تم استبعاد هذه الطفرات من التحليلات اللاحقة. تم إجراء تقييم المنشأة المرضية لمتغيرات الخط الجرثومي المكتشفة وفقا لإرشادات ACMG/AMPرقم 12. تم تسجيل متغيرات من الممرضات (P)، والمحتملة الممرضة (LP)، والدلالة غير المؤكدة (VUS) في هذه الدراسة. تم تضمين فقط المتغيرات عالية الثقة التي اجتازت معايير مراقبة الجودة في التحليلات اللاحقة (QUAL ≥1؛ عمق التغطية >10 للطفرات في الخط الجرثومي وعمق التغطية >500x للطفرات الجسدية)
تحضير عينة من نسيج FFPE
تحضير مقاطع البارافين
قم بقطع كتل نسيج FFPE إلى أقسام بسماكة 3 ميكرومتر باستخدام ميكروتوم. قم بعمل أقسام عائمة على حمام ماء بدرجة حرارة 40–45 درجة مئوية لتسطيح الأنسجة. قم بتركيب الأقسام على شرائح مجهر لاصقة وجففها في درجة حرارة الغرفة. ضع السلايدات في فرن تجفيف بدرجة حرارة 65 درجة مئوية لمدة ساعة لضمان التصاق النسيج بشرائح الشرائح وإذابة البارافين الزائد.
إزالة البارافينية وإعادة الترطيب
ضع شرائح السحب في رف تلوين واغمرها في محلول تنظيف لمدة 5 دقائق. الشرائح الناقلة بالتتابع إلى محلول التنظيف II ومحلول التنظيف III، كل منهما 5 دقائق، لإذابة البارافين بالكامل. انقل السلايد إلى 100٪ إيثانول لمدة 3 دقائق لإزالة مادة التنظيف المتبقية. أعد ترطيب أقسام الأنسجة من خلال سلسلة إيثانول متدرجة: 95٪ إيثانول لمدة 3 دقائق و80٪ إيثانول لمدة 3 دقائق. أغسل السحب مرتين في الماء المقطر، مع السماح بثلاث دقائق بين الغسلات. تم التعامل مع الزيلين والإيثانول المستخدم أثناء إزالة البارافينية في غطاء أبخرة كيميائي بسبب تقلبهما وسمتهما. تم جمع جميع محاليل النفايات التي تحتوي على مذيبات عضوية بشكل منفصل والتخلص منها وفقا لإرشادات التخلص من النفايات الخطرة المؤسسية.
حاجز التلوين HE
صبغة الهيماتوكسيلين والإيوسين
اغمر شرائح بعد إزالة البارافين وإعادة الترطيب في محلول الهيماتوكسيلين لمدة 5–10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. اشطف السلايدات تحت ماء الصنبور الجاري لمدة 5 دقائق. تميز الشرائح في كحول حمض الهيدروكلوريك بنسبة 1٪ لبضع ثوان (3–10 ثوان). اشطف فورا بماء الصنبور الجاري. النوى الزرقاء عن طريق غمر شرائح في ماء الصنبور أو محلول البلوغ لمدة 5 دقائق. اغمر شرائح في محلول الإيوزين لمدة 1–3 دقائق في درجة حرارة الغرفة. اشطف لفترة وجيزة بالماء المقطر إذا لزم الأمر.
الجفاف والتنظيف
انزلاق التجفيف عبر الإيثانول المصنف: 80٪ إيثانول لمدة دقيقة واحدة؛ 95٪ إيثانول لمدة دقيقة واحدة، و100٪ إيثانول مرتين لمدة دقيقة واحدة. شرائح شفافة من الزيلين I إلى II، كل منها من 2 إلى 5 دقائق.
التركيب
ضع قطرة من البلسم المحايد. ضع غطاء الغطاء بعناية لتجنب فقاعات الهواء. اترك الشرائح لتجف في درجة حرارة الغرفة قبل التصوير.
صبغة الفلورية المناعية متعددة الأجزاء لأقسام أنسجة FFPE
تم إجراء تلوين متسلسلي بالتلوين المناعي الفلوري لاكتشاف عدة علامات مناعية وأورام على نفس قسم النسيج. يتيح هذا النهج التصور الميداني لمجموعات الخلايا المختلفة مع الحفاظ على السياق المكاني13. استرجاع المستضدات: املأ جرة التلوين بحاجز استرجاع المستضدات. ضع البرطمان في فرن ميكروويف وسخنه على طاقة عالية لمدة 3-5 دقائق حتى يبدأ المحلول بالغلي. انقل الشرائح بعناية بعد إزالة البارافين وإعادة الترطيب إلى مخزن السحب الساخن، لضمان غمر أجزاء الأنسجة بالكامل. تنزلق الحرارة عند طاقة منخفضة في الميكروويف لمدة 15 دقيقة للسماح بكشف المستضدات بكفاءة. بعد التسخين، اترك الشرائح تبرد طبيعيا في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. انقل السلايدات إلى ماء مثلج لمدة 5 دقائق لإيقاف عملية استرجاع المستضدات.
الغسيل وتحضير الحواجز الكارهة للماء
أغسل السلايد مرة واحدة بالماء المقطر لإزالة بقايا السحب المتبقية. استخدم قلم حاجز كاره للماء لرسم دائرة حول كل جزء من الأنسجة. ينزلق الشطف مرة أخرى لفترة وجيزة بالماء المقطر. اغسل السلايدات مرتين باستخدام مخزن TBST. بعد كل غسل، ضع الشرائح أفقيا لمدة 3 دقائق لضمان إزالة المخزن بشكل كامل.
الحجب
ضع حاجز حاجز لتغطية قسم الأنسجة بالكامل (~100 ميكرولتر لكل شريحة فقط). حضانة الانزلاق في غرفة رطبة بدرجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
حضانة الأجسام المضادة الأولية
أزل المخزن الحاجز عن طريق النقر بلطف على حافة الشريحة على ورق ماص. تم تطبيق الأجسام المضادة الأولية ضد HLA-DR، CD68، CD163، CD206، PD-L1، وPanCK في تخفيفات عاملة محسنة تتراوح بين 1:100 إلى 1:400. ضع ~100 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الأولية المخفف على كل قسم من الأنسجة. حضانة الانزلاق في غرفة رطبة: 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة، أو 4 درجات مئوية طوال الليل لزيادة الحساسية.
الغسيل
اغسل شرائح الغسل 3 مرات باستخدام مخزن TBST، 3 دقائق لكل غسلة. ضع الزلاجات أفقيا بعد كل غسيل للسماح بتصريف المخزن المؤقت (buffer drain).
حضانة الأجسام المضادة الثانوية
جهز محلول الأجسام المضادة الثانوي عن طريق تخفيف بنسبة 1:3 في مخزن TBST. ضع حوالي 100 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الثانوية على كل شريحة من المحلول. تنزلق عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق في غرفة رطبة. اغسل السلايدات ثلاث مرات مع TBST، وكل غسول لمدة 3 دقائق.
تضخيم الإشارة الفلورية
تخفيف مادة التضخيم الفلورية بنسبة 1:100 في مخزن التضخيم. ضع 100 ميكرولتر من المادة المخففة على كل شريحة. حضانة الشرائح في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق في الظلام لمنع التبييض الضوئي. اغسل السلايدات ثلاث مرات مع TBST، وكل غسول لمدة 3 دقائق.
استرجاع المستضدات بين العلامات
قم باسترجاع المستضدات بالميكروويف كما هو موضح. بعد التسخين، قم بالتبريد بالتتابع: 5 دقائق في ماء دافئ و5 دقائق في ماء مثلج.
التلوين المتسلسل للعلامات الإضافية
كرر خطوات حضانة الأجسام المضادة الأولية والثانوية لكل علامة أجسام مضادة إضافية. تأكد من إجراء استرجاع المستضدات بعد صبغ كل مؤشر قبل الانتقال إلى الجسم المضاد التالي.
التلوين النووي المضاد
غسل السلايدات مرة واحدة باستخدام مخزن TBST. طبق صبغة نووية من DAPI. حضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق في الظلام. غسل السلايدات ثلاث مرات بالماء المقطر. تحديد نقطة النهاية: يجب أن تظهر النوى مصبوغة بوضوح تحت المجهر الفلوري.
التلوين النهائي فقط على العلامة
ضع محلول البيوتين مخففا بنسبة 1:200 في مخزن تضخيم، ثم حضن لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. اغسل الشرائح ثلاث مرات باستخدام مخزن TBST. قم بسحب المستضدات كما هو موصوف. اغسل الشرائح ثلاث مرات باستخدام مخزن TBST. ضع مادة حاجب البيوتين الداخلي المنشأ، واحتضن 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. ضع صبغة صبغة بدرجة 1:100 في TBST واحتضن لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. اغسل السلايدات مرة واحدة باستخدام TBST واتركها لتصرف 3 دقائق.
التركيب
أضف قطرة من وسط تركيب مضاد التدرج على قسم المناسلة. ضع غطاء غطاء فوق الزلاجة بعناية. اترك الشرائح لتجف قبل التصوير.
التقاط الصور لأقسام H&E وmIF
تم التقاط صور كاملة للشرائح (WSI) لمقاطع أنسجة مصبوغة ب H&E وmIF باستخدام ماسح شرائح. تم إجراء مسح الحقل المضيء لمقاطع H&E، بينما استخدم المسح الفلوري لمقاطع mIF. الهدف: تكبير 20x للمسح الشامل؛ تكبير 40x للتصوير الإقليمي عالي الدقة. إعدادات الإثارة والانبعاث: محسنة لكل فلوروفور وفقا لمواصفات الشركة المصنعة. زمن التعريض والكسب: يتم تعديله تلقائيا بواسطة برامج التصوير لضمان كثافة الإشارة الكافية دون التشبع.
التحكم في جودة mIF وقابلية تقييم الصورة
لضمان موثوقية نتائج mIF، تم تنفيذ بروتوكول مراقبة دقيق صارم قبل تصنيف الأنسجة وقياس الخلايا باستخدام نظام HALO الرقمي لعلم الأمراض. إزالة القطع الأثرية وتعريف المنطقة بتقدير: تمت مراجعة صور الشرائح الكاملة (WSIs) بدقة لاستبعاد المناطق التي تحتوي على طيات الأنسجة، وشوائب التلوين، والإشارات الخلفية غير المحددة يدويا. كانت هذه الخطوة ضرورية لمنع الإشارات الإيجابية الكاذبة وضمان دقة التحليل المكاني. بعد هذا الفحص، تم تصنيف متوسط 80٪ (النطاق: 50٪–95٪) من مساحة الأنسجة عبر جميع العينات كمنطقة mIF المقيمة. التحقق المرضي والتقسيم: لتحديد أقسام الأورام والعضلات بدقة، تم مقارنة مقاطع الالتهاب العضلي مع مقاطع متسلسلة متجاورة مصبوغة ب H&E. تمت مراجعة التعليقات بشكل مستقل من قبل اثنين من أخصائيي علم الأمراض ذوي الخبرة، مع حل أي اختلافات بالإجماع. تم استبعاد العينات التي تحتوي على مساحة نسيج ورمي أقل من 30٪ من الدراسة للحفاظ على صرامة التحليل. التحقق بعد التكميم: بعد التنمذة الظاهرية والقياس الآلي للخلايا، أعيد تقييم أنماط التوزيع المكاني والتعبير لمجموعات الخلايا المناعية من قبل علماء الأمراض. ضمنت هذه المراجعة أن البيانات الكمية الرقمية كانت متوافقة مع الخصائص النسيجية المرجعية الأساسية، مما ضمن موثوقية ودقة النتائج.
تحليل الأمراض الرقمية وشرح المناطق
تم استيراد الصور الممسوحة بانوراما إلى منصة تحليل الصور الرقمية للأمراض لمعالجتها. تم استخدام إضافة HALO AI Nuclei Seg-Plugin لتقسيم وتحديد الخلايا. باستخدام صبغة H&E كمرجع، تم توضيح المناطق ذات الاهتمام (ROIs) التالية يدويا: منطقة الورم الكاملة (WSIT)؛ حدود الورم (TB)؛ نواة الورم (TC). تم تحديد اكتشاف الإشارة الإيجابية بناء على عتبات شدة الفلورة والموقع المتوقع تحت الخلوي لكل علامة. تم تطبيق هذا النهج الخاص بكل قسم لتقليل التداخل الخلفي وتحسين دقة تحديد الخلايا المناعية. تم قياس كثافة الخلايا المناعية بعدد الخلايا الموجبة للعلامة لكل منطقة ورم مختارة. محاذاة صور mIF مع تعليقات مشتقة من H&E بناء على شكل الأنسجة. تم تقسيم المرضى إلى مجموعات عالية الكثافة ومنخفضة الكثافة وفقا للقيمة المتوسطة لكثافة الخلايا المناعية لكل مؤشر.
التحليل الإحصائي
تم استخدام برنامج SPSS 17.0 للتحليل. تم التعبير عن البيانات الموزعة بشكل طبيعي كمتوسط ± انحراف معياري، وكانت البيانات الكمية غير الموزعة بشكل طبيعي تعبر عنها كمتوسط (نطاق الكمي 25٪-75٪). تم تحليل العلاقة بين كل نوع من طفرات الجينات، وكثافة خلايا المناعة، والخصائص السريرية بواسطة نموذج الانحدار النسبي للمخاطر كوكس باستخدام نموذج خطوط الحياة بايثون. اعتمادا على حجم العينة وما إذا كانت البيانات تتوافق مع التوزيع الطبيعي، تم استخدام اختبار الطالب أو اختبار مان-ويتني U للمقارنة بين المتغيرات المستمرة. تم استخدام اختبار الرتبة الموقعة بنظام ويلكوكسون لمقارنة متغيرات الرتبة. تم اختيار اختبار كاي تربيع أو اختبار فيشر الدقيق لتحليل المتغيرات الفئوية غير المرتبة وفقا لحجم العينة والتردد النظري. تم استخدام اختبار سبيرمان أو اختبار بيرسون لتحليل الارتباط. تم الحصول على معدل البقاء الإجمالي للمرضى باستخدام طريقة كابلان-ماير، واستخدم اختبار التصنيف اللوغاريتمي للاختبار. تم رسم منحنيات البقاء باستخدام لغة R المبنية على برنامج RStudio. تم اعتبار قيمة P <0.10 ذات دلالة إحصائية.
التطبيق العملي والقيود
لتنفيذ هذا السير المتكامل بشكل موثوق، يجب أن تفي كتل الأنسجة ب FFPE بمعايير جودة صارمة، بما في ذلك خلوية الورم المثالية بنسبة ≥30٪ وعدم وجود نخر واسع النطاق أو تشوهات أنسجة كبيرة. يعتمد النجاح التقني لتقنية mIF بشكل كبير على حفظ الأنسجة؛ عوامل مثل الإفراط في التثبيت، الضرر المفرط، أو ارتفاع التألق الذاتي في الخلفية يمكن أن تؤدي إلى ضعف اختراق الأجسام المضادة وشدة إشارة دون المستوى الأمثل. علاوة على ذلك، يجب النظر في عدة قيود جوهرية لهذه الدراسة. أولا، يعتمد التحليل على مجموعة مركزية واحدة بأثر رجعي مكون من 63 مريضا، مما قد يحد من القوة الإحصائية وقابلية التعميم الواسعة للنتائج على مجموعات سكانية أخرى. ثانيا، نطاق التقييم يقتصر على لوحة NGS ثابتة مكونة من 37 جينا ومجموعة محددة من العلامات المناعية (HLA-DR، CD68، CD163، CD206، PD-L1، وPanCK؛ الجدول التكميلي 1). كما ورد في المصادر، بينما يوفر هذا النهج المشترك إطارا أكثر قوة للتدرج التنبؤي، فإن الدراسات المستقبلية الأكبر متعددة المراكز ضرورية لتعزيز صحة هذه الارتباطات وتحسين الفائدة التنبؤية للمؤشرات الحيوية المحددة.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الخصائص السريرية للمرضى المصابين بسرطان الغدة في الرئة
تم جمع ما مجموعه 63 مريضا تم تشخيصهم بمرض LUAD وخضعوا للعلاج الجراحيفي مستشفانا من 2015 إلى 2021 واستوفيوا معايير الإدراج في هذه الدراسة. تظهر الخصائص السريرية للمرضى المشمولين في الجدول 1. بين المرضى المسجلين، كان متوسط العمر 60 سنة (47-73 سنة)، بما في ذلك 30/63 مريضا ذكوريا (46.2٪) و33 من أصل 63 مريضة (53.8٪). كان هناك 23 من أصل 63 مريضا لديهم تاريخ من التدخين (35.4٪). النوع المرضي لجمي...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
التنميط المناعي المتكامل الجينومي والمحلي لتحليل LUAD
تظهر هذه الدراسة سير عمل متكامل يجمع بين NGS المستهدف وmIF لتوصيف المشهد متعدد الأبعاد ل LUAD. تتوافق نتائجنا الجينومية مع الأدبيات السابقة، خاصة فيما يتعلق بالاختلافات العرقية في تكرار الطفرات. معدل الطفرات المرصود في EGFR (حوالي 40٪-60٪) يتوافق مع التكرارات المبلغ عنها في السكان الآسيويين، والتي هي أعلى بكثير من تلك الموجودة في المجموعات الغربية (15-20٪)15،
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
يصرح المؤلفون بعدم وجود علاقات تجارية أو مالية يمكن تفسيرها على أنها تضارب محتمل في المصالح.
وقد دعم هذا العمل مشروع خطة العلوم والتكنولوجيا الطبية والصحية لمقاطعة تشجيانغ (2022KY1237)؛ مشروع صندوق البحث العلمي التابع لإدارة التعليم في يونان (2025Y0387)؛ برنامج البحث والتطوير الرئيسي في يونان (202403AC100002).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| مجموعة AlphaTSA Multiplex IHC | شركة alphaxbio Technology Co., Ltd. | AXT36025011 | التلوين المضاق المناعي متعدد القنوات |
| وسيط تركيب مضاد التدرج | شركة ليجين للتكنولوجيا، المحدودة. | IH0252، المجموعة0525A17 | التلوين المضاق المناعي متعدد القنوات |
| CD163 | شركة بكين تشونغشان للجسر الذهبي للتكنولوجيا الحيوية المحدودة | ZM0428 | RRID:AB_3714707; التلوين المضاق المناعي متعدد القنوات |
| CD206 | شركة أبكام، إنك | Cat# 5307-1 | RRID:AB_10896526; التلوين المضاق المناعي متعدد القنوات |
| CD68 | شركة بكين تشونغشان للجسر الذهبي للتكنولوجيا الحيوية المحدودة | ZM0060 | RRID:AB_2904190; التلوين المضاق المناعي متعدد القنوات |
| لوحة جينات السرطان المخصصة | شركة تويست المحدودة | إعداد مكتبة NGS | |
| إزالة البارافينية بوف | شركة كياجين المحدودة. | 19093 | استخراج الحمض النووي تلوين HE؛ التلوين المضاق المناعي متعدد القنوات من أقسام أنسجة FFPE |
| Dynabead M-270 streptavidin | شركة ثيرمو المحدودة | 65602 | إعداد مكتبة NGS |
| الفلورومتر | شركة ثيرموفيشر العلمية المحدودة. | الكيوبت 4.0 | إعداد مكتبة NGS |
| منصة تحليل الصور الرقمية لعلم الأمراض HALO | إنديكا لابز، ألبوكيركي | الإصدار 3.6.4134 | تحليل التلوين الفلوري المناعي HE وتحليل التلوين الفلوري المناعي متعدد الأبعاد |
| مجموعة تلوين الهيماتوكسيلين-إيوسين | شركة ووهان للعلوم التقنية المحدودة. | E-IR-R117 | التلوين |
| مجموعة الحمض النووي HiPure FFPE | شركة قوانغتشو ماجن للتكنولوجيا الحيوية المحدودة. | D6323 | استخراج الحمض النووي من مقاطع أنسجة FFPE |
| HLA-DR | شركة هوابيو المحدودة. | ET1610-66 | RRID:AB_3069950; التلوين المضاق المناعي متعدد القنوات |
| متسلسل الحمض النووي إلومينا | إلومينا، شركة | 550DX | التسلسل |
| البلسم المحايد | بكين سولاربيو للعلوم والطاقة الشمسية شركة تكنولوجي المحدودة | G8590 | التلوين |
| بانك | شركة بكين تشونغشان للجسر الذهبي للتكنولوجيا الحيوية المحدودة | ZM0069 | RRID:AB_2941997; التلوين المضاق المناعي متعدد القنوات |
| PD-L1 | أنظمة البحث والتطوير | الكتالوج # AF1019 | RRID:AB_354540; التلوين المضاق المناعي متعدد القنوات |
| مخزن TBST | شركة أبكلونلا للتكنولوجيا، المحدودة. | RM00013 | التلوين بتقنية HE والتلوين المناعي الفلوري متعدد الأبعاد |
| UN-Blocker | شركة هومجن المحدودة. | إعداد مكتبة NGS | |
| خرز VAHTS DNA نظيف | شركة فازيمي المحدودة | N411 | إعداد مكتبة NGS |
| مجموعة تحضير مكتبة الحمض النووي الموحدة ل VAHTS ل Illumina | شركة فازيمي المحدودة | ND610 | إعداد مكتبة NGS |
| نظام التصوير الكامل للشرائح | شركة زايس المحدودة. | ZEISS AXIOSCAN 7 إصدار 3.3 | تحليل التلوين الفلوري المناعي HE وتحليل التلوين الفلوري المناعي متعدد الأبعاد |
| مجموعة الهجين والغسل xGen | شركة IDT المحدودة. | 1080577 | إعداد مكتبة NGS |
طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه
طلب إذن