يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

بناء عضويات الغدد اللعابية من غدد اللعاب الصغيرة البشرية

610 مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/69861

⸱

ديسمبر 19, 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Plastic and Reconstructive Surgery, Shanghai Ninth People's Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 2Department of Burns and Plastic Surgery, Affiliated Hospital of Jiangnan University

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

ينتج هذا البروتوكول عضويات غدد لعابية ثانوية بشرية من خلال التنظيم الذاتي لخلايا جذعية الغدد اللعابية الصغيرة البشرية (hMSG-SCs) والخلايا الجذعية المتوسطة للغدد اللعابية الصغيرة (hMSG-MSCs) داخل نظام ماتريجيل ثلاثي الأبعاد.

الملخص

تصف هذه الدراسة بروتوكولا لبناء عضويات الغدة اللعابية الثانوية البشرية (hMSG) لتأسيس نموذج قابل للتكرار لأبحاث تجديد الأنسجة. تم عزل الخلايا الجذعية/السلفية للغدد اللعابية (hMSG-SCs) والخلايا الجذعية الميزنشيمية (hMSG-MSCs) من أنسجة الغدد اللعابية الصغيرة للأطفال، وتم تمسيدها وزراعتها معا في نظام ثلاثي الأبعاد (ثلاثي الأبعاد) قائم على ماتريجيل. أدى التنظيم الذاتي إلى تكوين عضويات ذات هياكل شبيهة بالقنوات والأسينار، مما أعاد تباين الخلايا الأصلية بشكل أكثر فعالية من النماذج الظهارية فقط. يركز البروتوكول الحالي على تحسين ظروف الزراعة للحفاظ على الأنماط الظاهرية للخلايا والخطوات الموحدة للمرور، وخلط النسب، والتعامل مع الماتريجيل (مصفوفة القبو التجارية)، مما يعزز قابلية التكرار. ومن المهم أن وجود الخلايا الميزنشيمية يوفر بيئة دقيقة داعمة تعزز بقاء الظهارة وتكاثرها وتتكون الظهارة، متغلبة على قيود الكفاءة المنخفضة والبنية غير المكتملة. يتيح هذا النهج من التوليد المستمر لعضويات الغدد اللعابية ويقدم نموذجا قويا لدراسة التطور، والاستعادة الوظيفية، وآليات الأمراض، مع دعم التطبيقات الانتقالية المحتملة في العلاجات التجديدية.

المقدمة

الغدد اللعابية هي غدد خارجية أساسية في تجويف الفم، مسؤولة عن إفراز اللعاب للحفاظ على رطوبة الفم، ومساعدة الهضم، وتوفير الدفاع المضاد للميكروبات1. خلل هذه الغدد، مثل متلازمة شوغرن أو التلف بعد الإشعاع، يمكن أن يؤدي إلى مشاكل صحية فموية خطيرة، وتفتقر حاليا إلى العلاجات التجديدية الفعالة2. تقنية العضويات، وهي طريقة ناشئة لبناء بدائل خلايا تحاكي بنية ووظيفة الأنسجة والأعضاء في نظام زراعة ثلاثي الأبعاد (ثلاثي الأبعاد)، تقدم أداة واعدة لأبحاث تجديد الغدد اللعابية3.

في السنوات الأخيرة، تم تأسيس أنظمة زراعة الغدد العضوية للفئران والبشر بنجاح 4,5. تم استخدام أنواع مختلفة من الخلايا الجذعية، بما في ذلك الخلايا الجذعية/السلفية للغدد اللعابية 4,5، والخلايا الجذعية متعددة القدرات 6,7، والخلايا الجذعية المشتقة من الظهارة مثل الخلايا الجذعية لجريبات الأسنان8، لتوليد هذه العضويات. ومع ذلك، لا تزال هناك عدة تحديات تقنية. تظهر الخلايا الجذعية/السلفية للغدة اللعابية البشرية الأولية (hSG-epiS/PCs) تكاثرا محدودا وانخفاض البقاء في المختبر، مما يحد من كفاءة تكوين العضوية وقابليتها للتكاثر9. علاوة على ذلك، غالبا ما تفتقر الأعضاء المشتقة فقط من الخلايا الظهارية إلى التغاير الخلوي وتفشل في إعادة ملخص البنية المتفرعة والتنظيم الوظيفي للقنوات الحارة للغدد الأصلية10.

في ظل هذا السياق، تهدف هذه الدراسة إلى تأسيس طريقة موحدة لبناء عضويات الغدد اللعابية الصغيرة البشرية. أولا، عزلنا الخلايا الجذعية (hMSG-SCs) والخلايا الجذعية الميزنكيمية (hMSG-MSCs) من أنسجة الغدد اللعابية الدقيقةالبشرية 11,12,13. تم بدء العضويات لاحقا عبر آلية تجميع ذاتي عن طريق زرع hMSG-SCs و hMSG-MSCs في ماتريجيل. توفر هذه الطريقة منصة قابلة للتكرار لزراعة عضويات الغدد اللعابية وتضع أساسا مهما للأبحاث المستقبلية في تجديد الغدد اللعابية ونمذجة الأمراض.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تم الحصول على عينات من الغدة اللعابية الصغرى البشرية (hMSG) من مرضى خضعوا لجراحة الشفاه في قسم جراحة التجميل والترميم، مستشفى شنغهاي التاسع للشعب، كلية الطب بجامعة جياو تونغ في شنغهاي. كان عمر المرضى (رقم > 10) بين 3 أشهر و10 سنوات، دون تاريخ من اضطرابات الغدد أو أمراض المناعة الذاتية. تم الحصول على جميع الأنسجة من غدد لعابية ثانوية زائدة وطبيعية نسيجيا تم استئصالها أثناء إصلاح الشفة المشقوقة، مما يوفر مصدرا معتمدا أخلاقيا وأمثل للأنسجة الحية لعزل الخلايا الجذعية/الخلايا السلفية. تم الحصول على موافقة مستنيرة قبل العملية، وتمت الموافقة على الدراسة من قبل لجنة الأخلاقيات الطبية في مستشفى شنغهاي التاسع للشعب (الموافقة رقم 2018-56). المواد المستخدمة والمواد المستخدمة مدرجة في جدول المواد.

1. جمع أنسجة الغدد اللعابية الصغيرة البشرية

  1. مباشرة بعد الاستئصال، يغمر أنسجة الغدد اللعابية في وسط النسر المعدل (DMEM) من دولبيكو مع مضادات حيوية ويحافظ على درجة الحرارة عند 4 درجات مئوية حتى المعالجة الإضافية (خلال 6 ساعات).

2. عزل الخلايا من أنسجة الغدد اللعابية الدقيقة البشرية

  1. ضمان ظروف معقمة من خلال تجهيز مجموعة جراحية معقمة وإجراء جميع الإجراءات داخل خزانة السلامة البيولوجية (الفئة الثانية BSC).
  2. انقل النسيج المستخرج إلى طبق مزرعة يحتوي على محلول ملحي مخزن بالفوسفات من Dulbecco (PBS) واغسله جيدا. أثناء عملية الغسيل، استخدم الملقط لإزالة أي نسيج ضام ودم متبقي بعناية، لضمان تنظيف نسيج الغدة اللعابية بالكامل.
  3. أضف 1 مل من وسط خال من المصل لمنع جفاف الأنسجة. قم بتقطيع النسيج إلى قطع لا تزيد حجمها عن 0.5مم 3 باستخدام مقص عيون معقم.
  4. باستخدام ملقط معقم، وزع قطع الأنسجة بشكل متساو على قاع قارورة زراعة T-25.
  5. أضف 10 مل من وسط الزراعة إلى قارورة الزرعة.
    ملاحظة: لزراعة الخلايا الجذعية الظهارية (hMSG-SCs)، الوسط الأساسي المستخدم هو وسط الكيراتينوسايتا (KM)، الذي يحتوي على ألبومين مصل البقر 5 ميكروغرام/مل، ومستخلص الغدة النخامية البقري 50 ميكروغرام/مل، 5 ميكروغرام/مل ترانسفريرين، 3.75 ميكروغرام/مل أنسولين، عامل نمو للأرمية الليفية 2 نانوغرام/مل، عامل نمو البشرة 1 نانوغرام/مل، 500 نانوغرام/مل إبينفرين، 0.5 ميكروغرام/مل هيدروكورتيزون، 10-8 ميغاوات بروستاجلاندين E2، و30 نانوماليت T3. بالنسبة لزراعة الخلايا الجذعية الميزنشيمية (hMSG-MSCs)، يتكون وسط الزراعة الأساسي من DMEM/F12 مدعوما ب 10٪ مصل الأبقار الجنيني (FBS)، و1٪ بنسلين-ستريبتوميسين (5,000 وحدة حرارية/مل) و1٪ مكمل جلوتاماكس.
  6. ضع قارورة T-25 عموديا في حاضنة بدرجة حرارة 37 درجة مئوية و5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 4-5 ساعات. في الوضع الرأسي، لا يلامس الوسط الأنسجة المفرومة، مما يسمح للنباتات الخارجية بالاستقرار والالتصاق بقوة على السطح السفلي.
  7. بعد 4-5 ساعات، حول القارورة إلى وضع أفقي بحيث يغطي وسط الزراعة بالكامل قطع الأنسجة المتصلة ويدعم نمو الخلايا.
  8. استبدل نصف الوسط في اليوم الرابع ثم استبدل الوسط كل 3 أيام حتى تظهر مستعمرات الخلايا. عند ملاحظة تثبيط نمو الخلايا، استمر في المرور.

3. مرور الخلايا

  1. خلايا المرور عندما تظهر مستعمرات الخلايا الأولية تثبيط النمو أو عندما يصل التقاء الخلايا إلى 80٪-90٪.
  2. استنشق وسط الزراعة واغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام PBS.
  3. أضف 1 مل من 0.25٪ تريبسين-إيدتا وحضن على حرارة 37°م، 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 4 دقائق لخلايا الظهارة و1.5 دقيقة لخلايا الميزنكيميا على التوالي.
  4. قم بتحييد التربسين بإضافة 5 مل من وسط DMEM المسخن مسبقا مع مكمل 10٪ FBS. قم بعمل ماصة برفق على الخلايا لضمان التفكك الصحيح، ثم انقل تعليق الخلية إلى أنبوب الطرد المركزي وجهاز الطرد المركزي عند 300 × جرام لمدة 5 دقائق.
  5. تخلص من المادة الفائقة وأعد تعليق hMSG-SCs في وسط KM، ثم أعد تعليق hMSG-MSCs في وسط الخلايا الجذعية الميزنشيمية (MSCM).
  6. زرع الخلايا المعلقة في قوارير زراعة T-25 بنسبة 1:3، ثم حضن عند 37 درجة مئوية، 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لاستمرار التمدد.

4. التنظيم الذاتي ل hMSG-MSCs و hMSG-SCs لبناء الأعضاء

  1. ثواب ماتريجيل على الجليد لمدة 3-4 ساعات.
  2. قم بتسخين لوح يحتوي على 24 بئر عند 37 درجة مئوية في الحاضنة وأطراف الماصة المبردة مسبقا عند 4 درجات مئوية لمعالجة دقيقة.
  3. أضف 450 ميكرولتر من PBS المعقمة المبردة مسبقا إلى 1 مل من ماتريجيل المذابة بالكامل.
  4. اخلط بلطف باستخدام رؤوس الماصة المبردة مسبقا ووزع 350 ميكرولتر من المادة المخففة في كل بئر في لوحة 24 بئر المسخنة مسبقا، مع التأكد من عدم تكون فقاعات.
  5. ميل اللوحة برفق لضمان تغطية متساوية لمادة الماتريجيل.
  6. ضع اللوحة في حاضنة بدرجة حرارة 37 درجة مئوية و5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 20-30 دقيقة للسماح للمادة بالتصلب الكهربائي. تجنب تجفيف الماتريجيل بشكل مفرط.
  7. زراعة hMSG-MSCs و hMSG-SCs في المقاطعات 3-5 بشكل منفصل حتى تصل إلى 80٪-90٪ تلاقية. هضم الخلايا التي تحتوي على 0.25٪ من تريبسين-EDTA، وتحديد الخلايا باستخدام وسط كامل، وعدد أعداد الخلايا باستخدام عداد الخلايا الآلي أو مقياس الدم الخلوي.
  8. الطرد المركزي عند 300 × جرام لمدة 5 دقائق، تخلص من السوبرناتان، وأعد تعليقه في وسط زراعة طازج.
  9. امزج hMSG-MSCs و hMSG-SCs بنسبة 1:1.
  10. زرع الخلايا في ألواح مغطاة بماتريغيل ب 24 بئر بتركيز خلوي إجمالي 2 × 105 خلايا لكل بئر.
  11. أضف 1 مل من وسط زراعة العضوية (MSCM:KM = 1:1) إلى كل بئر.
  12. حضانه عند 37 درجة مئوية، 5٪ ثاني أكسيد الكربون2، وغير الوسط كل 3 أيام.
  13. يتم زراعة الأعضاء الفرعية كل 7 أيام بنسبة 1:2 إلى 1:4، وتعاد تعليقها في وسط تجميد الخلايا للتخزين عند -80 درجة مئوية.

5. الإحصاء وقابلية التكرار

  1. تحليل جميع البيانات باستخدام برامج الإحصاء والرسوم البيانية وتقديم الانحراف المعياري ± المتوسط (SD). تم استخدام اختبارات t للطلاب غير المزدوجة ذات الذيلين للمقارنات بين مجموعتين. تم اعتبار P < 0.05 ذات دلالة إحصائية.
    ملاحظة: تم تكرار جميع التجارب بشكل مستقل على الأقل ثلاث مرات بنتائج متشابهة، واستندت جميع التحليلات الإحصائية إلى ثلاث تجارب أو عينات مستقلة على الأقل.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

أظهرت نسج الغدد اللعابية الصغيرة البشرية التي تم زرعها في قوارير T25 نمويا خلايا واضحا حول كتل الأنسجة بعد حوالي 5 أيام. في وسط زراعة الخلايا الجذعية الغني بالمصل، أظهرت الخلايا شكلا على شكل المغزل مميزا لمركبات hMSG-MSC (الشكل 1A,B). كشف تحليل التدفق الخلوي أن هذه الخلايا عبرت عن مستويات عالية من علامات الخلايا الجذعية الميزنشيمية، بما في ذلك CD29، CD90، CD105، وCD166 (الشكل 1C). على النقيض من ذلك، عند زراعتها في وسط KM، ظهرت مستعمرات شبيهة بال...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يتيح هذا البروتوكول البناء الناجح لعضويات الغدد اللعابية الصغيرة البشرية من خلال عزل وزراعة hMSG-SCs وhMSG-MSCs. يعتمد تكوين الأعضاء على التحضير الدقيق لبذور الأنسجة، والحفاظ على ظروف زراعة مميزة للخلايا الظهارية والميزنشيمية، وزراعة دقيقة لكلا النوعين من الخلايا على ماترجيل. تعد نسب الخلايا المناسبة وكثافات البذور ضرورية لدعم التنظيم الذاتي وتكوين الهياكل الشبيهة بالقنوات والأسينار.

خلال الإجراء، قد تظهر تحديات مثل ضعف نمو الخلايا الظهارية، أو تكوين غير متساو...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

المؤلفون لا يفرضون أي تضارب مصالح.

شكر وتقدير

وقد دعمت هذه الدراسة المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (المنحة رقم  81801946، رقم 81871576)، مشروع بنك حيوي (رقم المنحة. YBK202502) من مستشفى شنغهاي التاسع للشعب، كلية الطب بجامعة شنغهاي جياو تونغ، وخطة المواهب لبحيرة ووشي تايهو، دعم المواهب الرائدة في مهنة الطب والصحة (رقم المنحة 453210902THDJ).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
دولبيكو' النسر المتوسط المعدل (DMEM)جيبكوC11885500BT
0.25٪ تريبسين-إيدتاجيبكو25200056
دولبيكو' s النسر المعدل المتوسط (DMEM)/F12جيبكوC11330500BT
مصل البقر الجنيني (FBS)جيبكو10270106
جلوتاماكسجيبكو35050061
وسط الكيراتينوسيتساينس ل2101
ماتريجيلBD356230
وسط الخلايا الجذعية الميزنشيمية (MSCM)Sciencell 7501
البنسلين/ستريبتومايسين جيبكو15140122
محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)جيبكوC20012500BT

المراجع

  1. Chibly, A. M., Aure, M. H., Patel, V. N., Hoffman, M. P. Salivary gland function, development, and regeneration. Physiol Rev. 102 (3), 1495-1552 (2022).
  2. Ramos-Casals, M., Tzioufas, A. G., Stone, J. H., Siso, A., Bosch, X. Treatment of primary sjogren syndrome: A systematic review. JAMA. 304 (4), 452-460 (2010).
  3. Wu, Y., et al. Organoids in the oral and maxillofacial region: Present and future. Int J Oral Sci. 16 (1), 61(2024).
  4. Maimets, M., et al. Long-term in vitro expansion of salivary gland stem cells driven by Wnt signals. Stem Cell Reports. 6 (1), 150-162 (2016).
  5. Pringle, S., et al. Human salivary gland stem cells functionally restore radiation damaged salivary glands. Stem Cells. 34 (3), 640-652 (2016).
  6. Tanaka, J., et al. Generation of orthotopically functional salivary gland from embryonic stem cells. Nat Commun. 9 (1), 4216(2018).
  7. Tanaka, J., et al. Human induced pluripotent stem cell-derived salivary gland organoids model SARS-CoV-2 infection and replication. Nat Cell Biol. 24 (11), 1595-1605 (2022).
  8. Adine, C., Ng, K. K., Rungarunlert, S., Souza, G. R., Ferreira, J. N. Engineering innervated secretory epithelial organoids by magnetic three-dimensional bioprinting for stimulating epithelial growth in salivary glands. Biomaterials. 180, 52-66 (2018).
  9. Sui, Y., et al. Generation of functional salivary gland tissue from human submandibular gland stem/progenitor cells. Stem Cell Res Ther. 11 (1), 127(2020).
  10. Verstegen, M. M. A., et al. Clinical applications of human organoids. Nat Med. 31 (2), 409-421 (2025).
  11. Zhang, C., et al. Therapeutic potential of human minor salivary gland epithelial progenitor cells in liver regeneration. Sci Rep. 7 (1), 12707(2017).
  12. Kang, B. K., et al. Maintenance of adult stem cells from human minor salivary glands via the Wnt signaling pathway. Stem Cell Res Ther. 14 (1), 220(2023).
  13. Lu, L., et al. Characterization of a self-renewing and multi-potent cell population isolated from human minor salivary glands. Sci Rep. 5, 10106(2015).
  14. Hosseini, Z. F., et al. Fgf2-dependent mesenchyme and laminin-111 are niche factors in salivary gland organoids. J Cell Sci. 131 (4), 208728(2018).
  15. Kim, D., Yoon, Y. J., Choi, D., Kim, J., Lim, J. Y. 3d organoid culture from adult salivary gland tissues as an ex vivo modeling of salivary gland morphogenesis. Front Cell Dev Biol. 9, 698292(2021).
  16. Hajiabbas, M., et al. Bioengineering in salivary gland regeneration. J Biomed Sci. 29 (1), 35(2022).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

بناء العضوانياتتجديد الأنسجةالخلايا الجذعية الميزنكيميةالخلايا السليفة الجذعيةالزرع ثلاثي الأبعادنظام الماتريجيل (Matrigel)التخلق الشكلي الظهاريالحفاظ على النمط الظاهري للخلايا

تم نشر هذه المقالة

الفيديو قريباً

تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.