اختبار MeRIP-qPCR للكشف عن مستويات تعديلm6A من الحمض النووي الريبي المحدد في خلايا الساركوما العظمية

Binghan Yan; Junli Chang; Suxia Guo; Peng Zhao; Fulai Zhao; Chujie Zhou; Junjie Tong; Xinyu Zhang; Yuping Hong; Mengchen Yin; Xingyuan Sun; Yanping Yang

doi:10.3791/69880

يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

اختبار MeRIP-qPCR للكشف عن مستويات تعديل^m6A من الحمض النووي الريبي المحدد في خلايا الساركوما العظمية

996 مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/69880

⸱

ديسمبر 30, 2025

Binghan Yan^*¹^,² , Junli Chang^*¹^,² , Suxia Guo¹^,² , Peng Zhao¹^,² , Fulai Zhao¹^,² , Chujie Zhou¹^,² , Junjie Tong¹^,² , Xinyu Zhang¹^,² , Yuping Hong¹^,² , Mengchen Yin¹^,² , Xingyuan Sun¹^,² , Yanping Yang¹^,²

¹Longhua Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, ²Key Laboratory of Theory and Therapy of Muscles and Bones, Ministry of Education

^* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

يوفر هذا البروتوكول نهجا مفصلا لتقييم مستويات تعديل m⁶A للحمض النووي الريبي المحدد باستخدام MeRIP-qPCR.

الملخص

يلعب تعديل الترجمة الريبية دورا حاسما في بدء وتطور أنواع مختلفة من السرطان، من بينهاN6-ميثيلادينوزين (m 6 A) هو التعديل الأكثر انتشارا وتنوعا وظيفيا. هنا، نقدم بروتوكولا مبسطا وقابلا للتكرار باستخدام MeRIP-qPCR لتقييم مستويات تعديل m⁶A لنسخ محددة في خلايا الساركوما العظمية. في هذا الاختبار، تم استخراج إجمالي RNA، تلاه الحضانة باستخدام جسم مضاد محدد مضاد^m-6Aلتعديل m6 A لالتقاط المناعة RNA بمعدل^{m 6}A. ثم تم تجزئة الحمض النووي الريبي، وتم تحقيق إثراء شظايا m⁶من الحمض النووي الريبي المعدلة ب A باستخدام حرز مغناطيسي من البروتين G. تم إطلاق الحمض النووي الريبي الغني عن طريق هضم البروتيناز K وتم نقاؤه بواسطة حبات مرتبطة بالحمض النووي الريبي. وأخيرا، تم تعريض الحمض النووي الريبي للنسخ العكسي وتفاعل بوليميراز المتسلسل الكمي (PCR) لتقييم مستويات^{m 6}A في الجينات المرشحة. أظهرت النتائج أن هذه الطريقة تميز بفعالية اختلافات المثيلة وتوفر أداة موثوقة لاستكشاف الآليات الوظيفية لتعديل m⁶A في خلايا الساركوما العظمية. في الختام، يقدم MeRIP-qPCR نهجا بسيطا ومحددا للغاية لدراسة تعديل m⁶A في خلايا الساركوما العظمية. يحمل هذا البروتوكول إمكانات كبيرة لتوضيح شبكات التنظيم^m6A وتحديد أهداف علاجية جديدة.

المقدمة

تكشف أحدث أبحاث الإبيترانسكريبتوم أن تعديل N 6-ميثيلادينوزين (m⁶A) من RNA، وهو مثيلة موضع^N6على الأدينوسين، هو أكثر التعديلات الكيميائية الجوهرية المعروفة لmRNA في الخلايا حقيقية النواة¹. يشارك m⁶A في مجموعة واسعة من العمليات البيولوجية، بما في ذلك استقرار mRNA، والربط، والتصدير النووي، وكفاءة الترجمة². ومن المهم أن تشير الأدلة المتراكمة إلى أن خلل تعديل^m6A يساهم في بدء وتطور أنواع مختلفة من السرطانات، بما في ذلك الساركوما العظمية، وهو ورم عظمي خبيث عدواني للغاية يصيب المراهقين والشباب بشكل رئيسي³.