يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

اختبار MeRIP-qPCR للكشف عن مستويات تعديلm6A من الحمض النووي الريبي المحدد في خلايا الساركوما العظمية

847 مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/69880

⸱

ديسمبر 30, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Longhua Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 2Key Laboratory of Theory and Therapy of Muscles and Bones, Ministry of Education

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

يوفر هذا البروتوكول نهجا مفصلا لتقييم مستويات تعديل m6A للحمض النووي الريبي المحدد باستخدام MeRIP-qPCR.

الملخص

يلعب تعديل الترجمة الريبية دورا حاسما في بدء وتطور أنواع مختلفة من السرطان، من بينهاN6-ميثيلادينوزين (m 6 A) هو التعديل الأكثر انتشارا وتنوعا وظيفيا. هنا، نقدم بروتوكولا مبسطا وقابلا للتكرار باستخدام MeRIP-qPCR لتقييم مستويات تعديل m6A لنسخ محددة في خلايا الساركوما العظمية. في هذا الاختبار، تم استخراج إجمالي RNA، تلاه الحضانة باستخدام جسم مضاد محدد مضادm-6Aلتعديل m6 A لالتقاط المناعة RNA بمعدلm 6A. ثم تم تجزئة الحمض النووي الريبي، وتم تحقيق إثراء شظايا m6من الحمض النووي الريبي المعدلة ب A باستخدام حرز مغناطيسي من البروتين G. تم إطلاق الحمض النووي الريبي الغني عن طريق هضم البروتيناز K وتم نقاؤه بواسطة حبات مرتبطة بالحمض النووي الريبي. وأخيرا، تم تعريض الحمض النووي الريبي للنسخ العكسي وتفاعل بوليميراز المتسلسل الكمي (PCR) لتقييم مستوياتm 6A في الجينات المرشحة. أظهرت النتائج أن هذه الطريقة تميز بفعالية اختلافات المثيلة وتوفر أداة موثوقة لاستكشاف الآليات الوظيفية لتعديل m6A في خلايا الساركوما العظمية. في الختام، يقدم MeRIP-qPCR نهجا بسيطا ومحددا للغاية لدراسة تعديل m6A في خلايا الساركوما العظمية. يحمل هذا البروتوكول إمكانات كبيرة لتوضيح شبكات التنظيمm6A وتحديد أهداف علاجية جديدة.

المقدمة

تكشف أحدث أبحاث الإبيترانسكريبتوم أن تعديل N 6-ميثيلادينوزين (m6A) من RNA، وهو مثيلة موضعN6 على الأدينوسين، هو أكثر التعديلات الكيميائية الجوهرية المعروفة لmRNA في الخلايا حقيقية النواة1. يشارك m6A في مجموعة واسعة من العمليات البيولوجية، بما في ذلك استقرار mRNA، والربط، والتصدير النووي، وكفاءة الترجمة2. ومن المهم أن تشير الأدلة المتراكمة إلى أن خلل تعديلm6A يساهم في بدء وتطور أنواع مختلفة من السرطانات، بما في ذلك الساركوما العظمية، وهو ورم عظمي خبيث عدواني للغاية يصيب المراهقين والشباب بشكل رئيسي3.

دراسة تعديلm 6A تتطلب منهجيات قوية وموثوقة. تم تطوير عدة طرق للكشف عن مستويات تعديل m6A، بما في ذلك نقطة m6A، m6AELISA، وMeRIP-seq. اختبار النقطةm6Aبسيط وفعال من حيث التكلفة، لكنه يعاني من حساسية محدودة وضعف في القياس. يوفر مستوى تعديل m6AللRNA الكلي، بدلا من مستوى تعديل m6AلRNA4 محدد. m6A يوفر ELISA اكتشافا مريحا نسبيا وعالي الإنتاجية؛ ومع ذلك، لا تزال التفاعلية المتبادلة والدقة المنخفضة تمثل مخاوف رئيسية، كما أنها تفتقر إلى القدرة على كشف التعديلات الخاصة بالنص أو الموقع5. يتيح MeRIP-seq رسم الخرائط على مستوى النسخ المكتوب ل m6A؛ ومع ذلك، فإن متطلباته لمدخلات RNA كبيرة، ودقة منخفضة نسبيا، واعتمادها على الأجسام المضادة تحد من دقة MeRIP-seq وقابليتها للتكرار6. على النقيض من ذلك، يجمع MeRIP-qPCR بين التكرار المناعي وPCR الكمي، مما يوفر حساسية وخصوصية أعلى للكشف المستهدف ل m6A على RNA7 المحدد. تمكن هذه الطريقة من الكشف الحساس والمستهدف لإثراء m6A التفاضلي في الجينات المرشحة، مما يجعلها مناسبة بشكل خاص لدراسات التحقق في أبحاث السرطان المرتبطة ب m6A. تقدم هذه الطريقة بديلا فعالا من حيث التكلفة ومتاحا للمختبرات التي تهدف إلى دراسة آليات تنظيمية بوساطة m6A.

هنا، قدمنا بروتوكولا مفصلا (الشكل 1) لتقييم مستويات تعديلm-6A من c-Myc في خلايا الساركوما العظمية باستخدام MeRIP-qPCR كمثال. يعتمد MeRIP-qPCR على تخصيب الأجسام المضادة لأجزاء الحمض النووي الريبي المثيلة، بالإضافة إلى النسخ العكسي وPCR الكمي، لتقييم وجود ووفرة m6A النسبية على RNA محدد. أثبتنا أن هذا النهج يميز بفعالية اختلافات المثيلة في c-Myc ويوفر منصة موثوقة للتحقيق في الدور الوظيفي لm6Aفي خلايا الساركوما العظمية. تسلط هذه الدراسة الضوء على إمكانيات MeRIP-qPCR كأداة عملية ومحددة لأبحاث تعديل m6A في ساركوما العظمية وتمهد الطريق لتحديد أهداف علاجية جديدة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. تحضير الحمض النووي الريبي

ملاحظة: يتم استخراج الحمض النووي الريبي باستخدام مجموعة استخراج RNA. اعمل داخل خزانة سلامة حيوية نظيفة عند التعامل مع الخلايا ومواد RNA. ارتد معدات الحماية الشخصية المناسبة (معطف مختبر، قفازات، نظارات واقية). قم بتبريد الطرد المركزي إلى 4 درجات مئوية قبل التشغيل.

  1. جهزوا الزنزانات.
    1. أزل وسط الزراعة من طبق 3.5 سم واغسل الخلايا بلطف مرة واحدة باستخدام PBS المبرد مسبقا. أضف حجما مناسبا من محلول تحليل الحمض النووي الريبي مباشرة إلى الطبق لتحليل الخلايا بالكامل واستخدم الماصة بلطف لتجانسها.
    2. انقل تعليق الخلية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق بسعة 1.5 مل.
    3. الطرد المركزي عند 1000 × جرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: تأكد من توازن الدوار وإغلاق الغطاء بإحكام.
    4. قم بإزالة أنبوب الطرد المركزي الدقيق بحذر بعد الطرد المركزي.
    5. استنشق المادة الفائقة بالكامل باستخدام ماصة بسعة 1 مل دون الإخلال بالحبيبات في الأسفل.
      ملاحظة: لا تلمس حبيبة الخلية بطرف الماصة.
  2. خلايا ليز.
    1. أضف 300 ميكرولتر من مخزن التحلل إلى حبيبة الخلية.
    2. اخلط جيدا عن طريق قلب الأنبوب 30 مرة حتى يبدو المحلول شفافا ولزجا بدون أي كتلات ظاهرة.
    3. حضن الأنبوب في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقتين.
  3. الحمض النووي الريبي الترسب.
    1. أضف 300 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 100٪ إلى الليزات (حجم متساو من مخزن التحلل).
    2. قم بعمل الماصة بلطف للأعلى والأسفل فورا (حوالي 8-10 مرات) حتى تخلط تماما.
  4. قم بربط أعمدة RNA.
    1. ضع عمود تنقية RNA في أنبوب جمع بسعة 2 مل مقدم.
    2. انقل الخليط بالكامل إلى عمود التنقية.
      ملاحظة: تجنب لمس الغشاء الأبيض في الوسط.
    3. أغلق الغطاء وجهاز الطرد المركزي عند 12,000 × جرام لمدة دقيقة واحدة.
    4. تخلص من السائل السفلي واضغط بلطف على أنبوب الجمع مقلوبا على ورق ماص لإزالة السائل المتبقي.
    5. أعد عمود التنقية إلى أنبوب التجميع.
  5. غسل الشوائب.
    1. أضف 500 ميكرولتر من محلول الغسيل (ماء خال من النوكليز) إلى عمود التنقية.
      ملاحظة: تجنب لمس الغشاء الأبيض في الوسط.
    2. استخدم الطرد المركزي عند 12,000 × جرام لمدة دقيقة واحدة ثم تخلص من السائل السفلي.
    3. استخدم الطرد المركزي مرة أخرى عند 12,000 × جرام لمدة دقيقة واحدة لإزالة السائل المتبقي.
    4. انقل عمود التنقية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق نظيف بسعة 1.5 مل.
    5. افتح الغطاء واترك العمود واقفا لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة.
  6. RNA مطلق.
    1. ضع عمود التنقية في أنبوب طرد مركزي دقيق جديد بسعة 1.5 مل.
    2. أضف 25 ميكرولتر من مخزن الاستشهار مباشرة إلى مركز الغشاء.
    3. حضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
    4. الطرد المركزي عند 12,000 × جرام لمدة دقيقة واحدة لجمع الحمض النووي الريبي في الأنبوب السفلي.
    5. أعد تطبيق الإيلوات على الغشاء وجهاز الطرد المركزي مرة أخرى عند 12,000 × جرام لمدة دقيقة واحدة لتعظيم الإنتاجية.
      ملاحظة: أضف دائما مخزن التفريغ مباشرة إلى مركز غشاء العمود. تجنب إضافته إلى الجدار الجانبي، لأن ذلك قد يمنع ذوبان الحمض النووي الريبي ويقلل بشكل كبير من الإنتاجية. أيضا، لا تثقب الغشاء بطرف الماصة.
  7. قس تركيز الحمض النووي الريبي.
    1. شطف منفذ عينة مقياس الطيف الفوتوفوتومي بسعة 1.5 ميكرولتر من مخزن الاستنساخ.
    2. استخدم 1.5 ميكرولتر من مخزن الاستشهار كمخزن فراغ. تأكد أن القراءة قريبة من الصفر.
    3. حمل 1.5 ميكرولتر من عينة RNA وقس التركيز.
    4. تقييم جودة عينات الحمض النووي الريبي باستخدام مقياس طياف ضوئي (A260/A280 = 1.8-2.2، A260/A230 = 2.0-2.5) ورحلان كهربائي هلام الأروز.

2. التكرار المناعي للحمض النووي الريبي المثيلة (MeRIP)

  1. تحضير خليط التقاط المناعة
    1. احصل على أنبوب PCR جديد بسعة 0.2 مل.
    2. أضف المكونات كما هو مذكور في الجدول 1 (مثال على تفاعل واحد).
  2. التقاط المناعة
    1. أغلق غطاء الأنبوب بإحكام. ضع أنبوب PCR على جهاز دوار أو هزاز دوارة.
    2. حضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 90 دقيقة.
      ملاحظة: تأكد من خلط المحلول بشكل مستمر وبلطف.
  3. انقسام الحمض النووي الريبي
    1. بعد الحضانة، أضف 10 ميكرولتر من معزز الهضم النووي (NDE) و2 ميكرولتر من خليط إنزيم الانقسام (CEM) إلى كل أنبوب.
    2. اخلط بلطف عن طريق الطباعة للأعلى والأسفل من 5 إلى 6 مرات.
    3. حضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 4 دقائق.
    4. تحضير التحكم في RNA المدخل
      1. لضمان الاتساق بين التكرار المناعي (IP) وعينات الإدخال، قم بمعالجة جزء من الحمض النووي الريبي بالتوازي كعنصر تحكم في الإدخال.
      2. نقل 1 ميكروغرام من إجمالي الحمض النووي الريبي (10٪ من المدخلات) من كل عينة إلى أنبوب PCR منفصل. أضف 20 ميكرولتر من مخزن التقاط المناعة (ICB)، و1.5 ميكرولتر من الظواهر الاقترابية من الاقتراب، و1 ميكرولتر من CEM، واحتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقتين.
  4. الإثراء المغناطيسي والغسل
    1. ضع أنبوب PCR على حامل مغناطيسي.
    2. دع الأنبوب يجلس لمدة دقيقتين حتى يصبح المحلول صافيا ويتم التقاط الخرزات على جدار الأنبوب.
    3. استنشق بعناية وتخلص من السوبرناتانت دون إزعاج الخرز.
    4. أبق الأنبوب على حامل مغناطيسي وأضف 150 ميكرولتر من مخزن الغسيل (WB).
    5. قم بإزالة الأنبوب من الحامل المغناطيسي وقم بإمالته رأسا على عقب برفق لإعادة تعليق الخرزات بالكامل.
    6. أعد الأنبوب إلى الحامل المغناطيسي. انتظر دقيقة إلى دقيقتين حتى يزول المحلول، ثم تخلص من السوبرناتانت.
    7. كرر خطوة الغسل ثلاث مرات.
    8. اغسل الخرزات مرة أخرى ب 150 ميكرولتر من محلول هضم البروتين (PDB) بنفس الطريقة.
  5. إطلاق واسترداد الحمض النووي الريبي المخصب
    1. تحضير محلول هضم البروتين العامل عن طريق خلط البروتيناز K و PDB بنسبة 1:9. (لكل تفاعل، حضر 20 ميكرولتر: 2 ميكرولتر من بروتيناز K + 18 ميكرولتر من PDB).
    2. أزل الأنبوب من الحامل المغناطيسي بعد الغسل النهائي.
    3. أضف 20 ميكرولتر من محلول هضم البروتين الطازج إلى حبيبة الخرزة وامزج بلطف.
    4. ضع أنبوب PCR في جهاز تدوير حراري وحضن على درجة حرارة 55 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
    5. ضع أنبوب PCR مرة أخرى على الحامل المغناطيسي. انتظر حتى يزول المحلول (حوالي دقيقتين).
    6. انقل الفائق بالكامل بحذر (حوالي 20 ميكرولتر) إلى أنبوب PCR جديد بسعة 0.2 مل.
      ملاحظة: الحمض النووي الريبي الآن في السوبرناتانت. تخلص من الخرزات.
  6. تنقية الحمض النووي الريبي
    1. أضف 20 ميكرولتر من محلول تنقية الحمض النووي الريبي (RPS) إلى كل أنبوب عينة، وأنبوب تحكم سالب، وأنبوب إدخال.
    2. أضف 160 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 100٪.
    3. خرز ربط RNA دوامة لإعادة تعليقها.
    4. أضف 2 ميكرولتر من خرزات ربط الحمض النووي الريبي المعلقة إلى كل أنبوب.
    5. اخلط جيدا لأعلى وأسفل على الأقل 10 مرات.
    6. حضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق للسماح بارتباط الحمض النووي الريبي.
    7. ضع الأنبوب على الحامل المغناطيسي. انتظر حتى يزول المحلول (حوالي دقيقتين).
    8. تخلص من السوبرناتانت بعناية دون إزعاج الخرز.
    9. أبق الأنبوب على حامل مغناطيسي وأضف 150 ميكرولتر من الإيثانول الطازج المحضر بنسبة 90٪. حضانة لمدة 30 ثانية.
    10. تخلص من الإيثانول بنسبة 90٪. كرر غسلة الإيثانول بنسبة 90٪ مرة أخرى (غسلتان إجمالا).
    11. أزل الأنبوب من حامل القاعدة المغناطيسية.
    12. أضف 13 ميكرولتر من محلول الإزالة إلى الخرزات المجافة.
    13. حضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق لإطلاق RNA.
    14. ضع الأنبوب مرة أخرى على الحامل المغناطيسي. انتظر حتى يزول المحلول (حوالي دقيقتين).
    15. انقل بعناية المادة الفائقة بالكامل (حوالي 13 ميكرولتر) إلى أنبوب PCR جديد خال من RNase.
    16. استخدم فورا أو خزن RNA عند -20 درجة مئوية.

3. RT-qPCR

  1. قم بعكس نسخ الحمض النووي الريبي المغني ب m6A إلى cDNA
    1. استخدم RNA منقى من مجموعة m6A-IP، أو Input، أو IgG للنسخ العكسي.
    2. قم بإعداد تفاعل النسخ العكسي (RT).
      ملاحظة: تأكد من وجود مدخلات RNA متساوية بين جميع المجموعات للسماح بالمقارنة الموثوقة في تحليل qPCR في مرحلة اللاحقة.
  2. تضخيم qPCR
    1. تحضير تفاعلات qPCR باستخدام كيمياء SYBR Green. أضف 10 ميكرولتر من خليط SYBR Green Master (2×)، و0.5 ميكرولتر من البرايمر الأمامي (10 ميكرومول)، و0.5 ميكرولتر من البرايمر العكسي (10 ميكرومول)، و7 ميكرولتر من ddH2O، و2 ميكرولتر من cDNA إلى كل أنبوب، وامزج جيدا واستخدم الطرد المركزي لفترة وجيزة قبل تحميله في جهاز qPCR.
      ملاحظة: قم بتعيين ثلاثة آبار مكررة لكل عينة cDNA (الإدخال، IgG، m6A-IP). راجع الجدول 2 لقائمة البادئات.
    2. شغل برنامج qPCR.
      1. نفذ تفاعلات qPCR على جهاز دورة حرارية في الوقت الحقيقي باستخدام البرنامج التالي: ضبط الإزالة الأولية عند 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية؛ تعمل 40 دورة تتكون من إزالة الطبيعة عند 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية، والتلدين عند 58 درجة مئوية لمدة 10 ثوان، والتمديد عند 72 درجة مئوية لمدة 30 ثانية.
      2. بعد التضخيم، أجري تحليل منحنى الصهر بضبط إزالة الطبيعة عند 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية، ثم التبريد على 60 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة، ثم رفع درجة الحرارة تدريجيا إلى 95 درجة مئوية بمعدل منحدر 0.5 درجة مئوية/ثانية مع اكتساب الفلورة المستمر لتأكيد خصوصية المنتجات المضخمة.
  3. تحليل البيانات
    1. حلل قيم Ct لمجموعتي الهدف والمجموعة الضابطة.
    2. حساب الإثراء باستخدام إحدى الطرق التالية:
      1. الطرق 1: طريقة الإدخال ٪
        ٪المدخل = 2[Ct(Input)−Ct(IP)] × DF × 100٪
        ملاحظة: Ct (الإدخال) وCt (IP) يمثلان قيم عتبة الدورة لعينات الإدخال وIP على التوالي، وعامل التخفيف (DF) هو عكس نسبة الإدخال المستخدمة في qPCR (مثلا، إذا تم استخدام 10٪ من إجمالي RNA كمدخل، فإن DF = 10).
      2. الطرق 2: طريقة Ct المقارنة (طريقة 2^-ΔΔCt )
        ΔCt sample=CtIP−CtIgG
        معالج Ct=ΔCt معالج، Fold=2−ΔΔCt.
        ملاحظة: حافظ على كميات RNA المدخلة، إعداد التفاعل، وكفاءة البرايمر متسقة عبر جميع العينات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

هنا نقدم نتيجة تمثيلية لتحليل MeRIP-qPCR، وهي مستوى تعديلm6Aل c-Myc في خلايا hFOB1.19 و143B. كما هو موضح في الشكل 2، كان تخصيب c-Myc بالجسم المضاد المضاد لm-6A أعلى بشكل ملحوظ مقارنة ب IgG الضابط، الذي أظهر فقط مستويات خلفية، مما يشير إلى أن الجسم المضاد المضاد ل m-6A فعال ومحدد في آن واحد. كما لاحظنا أن مستوى تعديلm6Aل c-Myc كان أعلى بشكل ملحوظ في 143B مقارنة بخلايا hFOB1.19 (P < 0.001). تشير هذه النتيجة ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

برز MeRIP-qPCR كأداة قيمة لدراسة تعديلات RNA m6A ذات تطبيقات واسعة. ويعد مفيدا بشكل خاص في التحقق من نتائج التسلسل عالي الإنتاجية وتحديد مواقع التعديل بدقة داخل مناطق محددة من الجينات المستهدفة أثناء الدراسات الميكانيكية. علاوة على ذلك، يمكن تطبيق هذه الطريقة بسهولة في معظم مختبرات علم الأحياء الجزيئي بسبب تكلفتها المنخفضة نسبيا وبساطتها التشغيلية، مما يجعلها نهجا فعالا وعمليا لأبحاث علم الأحياء السريري8.

لضمان النجاح، تعتمد ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

وقد دعمت هذه الدراسة منح من المؤسسة الوطنية لعلوم الطبيعة (82174408، 82374477، 82474535 و 82205145).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
إيثانول 100٪شركة شنغهاي تايتان العلمية المحدودة، أمريكا1158566
143BATCC، أمريكاATCC CRL-8303TM
2×؛ مزيج QPCR الأخضر SYBRشركة بكين تشيهينغشينغ للتكنولوجيا الحيوية المحدودة، الصينFS-Q1002
دينوفيكس DS-11 دينوفيكسDS-11 مقياس الطيف الفوتوني
DMEM mediumشركة ويسينت، الصين319-005-CL
DMEM/F-12 متوسطةجيبكو، أمريكا11320033
إبيكويك كت & مجموعة إثراء RNA (MeRIP) RUN m6Aإبيجنتيك، أمريكاP-9018-24
مصل الأبقار الجنينيشركة ويسينت، الصين086-150
hFOB1.19بنك الخلايا التابع للأكاديمية الصينية للعلوم، الصينGNHu14
m6A مجموعة اختبار مثيلة RNAأبكام، إنجلتراab185912
مجموعة النسخ العكسي للميكروRNAEZBioscience-EZB، أمريكاA0010CGQ
نظام الوقت الحقيقيبيو-راد، أمريكاCFX96
مجموعة استخراج الحمض النووي الريبي الكليEZBioscience-EZB، أمريكاB0004DP
إنزيم TrypLE Expressجيبكو، أمريكا12604021

المراجع

  1. Ma, S., et al. The interplay between m6A RNA methylation and noncoding RNA in cancer. J Hematol Oncol. 12 (1), 121(2019).
  2. Zhu, Z. M., Huo, F. C., Zhang, J., Shan, H. J., Pei, D. S. Crosstalk between m6A modification and alternative splicing during cancer progression. Clin Transl Med. 13 (10), e1460(2023).
  3. Hu, T., Wang, G., Wang, D., Deng, Y., Wang, W. m6A methylation modification: Potential pathways to suppress osteosarcoma metastasis. Int Immunopharmacol. 145, 113759(2025).
  4. Nagarajan, A., Janostiak, R., Wajapeyee, N. Dot blot analysis for measuring global N6-methyladenosine modification of RNA. Methods Mol Biol. 1870, 263-271 (2019).
  5. Yang, Y., et al. Current progress in strategies to profile transcriptomic m6A modifications. Front Cell Dev Biol. 12, 1392159(2024).
  6. McIntyre, A. B. R., Gokhale, N. S., Cerchietti, L., Jaffrey, S. R., Horner, S. M., Mason, C. E. Limits in the detection of m6A changes using MeRIP/m6A-seq. Sci Rep. 10 (1), 6590(2020).
  7. Meyer, K. D., Saletore, Y., Zumbo, P., Elemento, O., Mason, C. E., Jaffrey, S. R. Comprehensive analysis of mRNA methylation reveals enrichment in 3' UTRs and near stop codons. Cell. 149 (7), 1635-1646 (2012).
  8. Zheng, H. X., Zhang, X. S., Sui, N. Advances in the profiling of N6-methyladenosine (m6A) modifications. Biotechnol Adv. 45, 107656(2020).
  9. Matsuzawa, S., Wakata, Y., Ebi, F., Isobe, M., Kurosawa, N. Development and validation of monoclonal antibodies against N6-methyladenosine for the detection of RNA modifications. PLoS One. 14 (10), e0223197(2019).
  10. Law, J., Günther, S., Watanabe, S. Epitranscriptome mapping of N6-methyladenosine using m6A immunoprecipitation with high-throughput sequencing in skeletal muscle stem cells. Methods Mol Biol. 2640, 431-443 (2023).
  11. Mathur, L., Jung, S., Jang, C., Lee, G. Quantitative analysis of m6A RNA modification by LC-MS. STAR Protoc. 2 (3), 100724(2021).
  12. Slama, K., et al. Determination of enrichment factors for modified RNA in MeRIP experiments. Methods. 156, 102-109 (2019).
  13. Guo, W., et al. Single-molecule m6A detection empowered by endogenous labeling unveils complexities across RNA isoforms. Mol Cell. 85 (6), 1233-1246.e7 (2025).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

N6 G
اختبار MeRIP-qPCR للكشف عن مستويات تعديلm6A من الحمض النووي الريبي المحدد في خلايا الساركوما العظمية
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.