يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

اختبار تكوين المستعمرة الذي يكشف عن القدرة التكاثرية لخلايا ساركوما العظمية التي تسقط بواسطة LncRNA

432 مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/69910

⸱

يناير 16, 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Longhua Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 2Key Laboratory of Theory and Therapy of Muscles and Bones, Ministry of Education

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

يوفر هذا البروتوكول التجريبي طريقة مستقرة وفعالة من حيث التكلفة وكفاءة تجمع بين إزالة الحمض النووي الريبي (lncRNA) واختبارات تكوين المستعمرات لقياس تأثير ال lncRNA على تكاثر خلايا الساركوما العظمية.

الملخص

يؤثر التعبير الشاذ عن الحمض النووي الريبي غير المشفر الطويل (lncRNAs) بشكل عميق على تكاثر خلايا ساركوما العظمية، مما يشير إلى أنها قد تكون أهدافا علاجية محتملة. ومع ذلك، تظل الدراسات الوظيفية لل lncRNA نظرية إلى حد كبير ومقتصرة على بعض التحقق. تعتبر اختبارات تكوين المستعمرات، التي تعكس تحديدا المصير النهائي للتكاثر للخلايا المفردة، المعيار الذهبي لتقييم الإمكانات التكاثرية طويلة الأمد. هنا، أنشأ هذا البروتوكول بروتوكولا تجريبيا موثوقا باستخدام اختبارات تكوين المستعمرات في خلايا إزالة الحمض النووي الريبي لتقييم تأثير الحمض النووي الريبي اللامركزي على قدرة تكاثر خلايا الساركوما العظمية. يوفر هذا البروتوكول التجريبي اختبارا مستقرا وفعالا من حيث التكلفة وكفاءة لتقييم التأثيرات التنظيمية للرنا اللامركزي على تكاثر خلايا الساركوما العظمية. هذا النهج ليس مناسبا فقط للأبحاث على خلايا الساركوما العظمية، بل يعمل أيضا كأداة عملية لقدرة تكاثر الخلايا المنظمة بواسطة lncRNA في أورام أخرى. تضمنت هذه الدراسة بروتوكول كشف مفصل لاختبارات إزالة الحمض النووي الريبي لتكون الحمض النووي الريبي (lncRNA) وتكوين المستعمرات، مع مثال على القضاء على جين مضيف الحمض النووي النووي الصغير 6 (SNHG6) في خلايا الساركوما العظمية (143B). أكدت النتائج التجريبية كبح فعال لتعبير SNHG6، مصحوبا بانخفاض ملحوظ في عدد وحجم المستعمرات. تشير هذه النتائج إلى أن SNHG6 ضروري للحفاظ على الإمكانات التكاثرية طويلة الأمد لخلايا الساركوما العظمية (143B).

المقدمة

الحمض النووي الريبي غير المشفر الطويل (lncRNAs)، المعرفة بأنها نسخ أطول من 200 نيوكليوتيد بدون جهد ترميز البروتين، ظهرت كمنظمات مهمة للعمليات البيولوجية المتنوعة في السنوات الأخيرة 1,2. تلعب أدوارا حاسمة في بدء وتطور أنواع مختلفة من السرطان، بما في ذلك الساركوما العظمية، وسرطان البروستاتا، وسرطان الرئة 3,4,5. في ساركوما العظمية، تشير الأدلة المتراكمة إلى أن التعبير الشاذ عن الحمض النووي الريبي الطويل غير المشفر (lncRNA) له تأثير عميق على تكاثر الخلايا. على سبيل المثال، أدى إسكات LNCRNA POU3F3 إلى كبح تكاثر الخلايا بشكل كبير وتعزيز موت الخلايا المبرمجة لخلايا الساركوما العظمية (MG63 و U2OS)6. وبالمثل، أدى تقليل الحمض النووي الريبي اللينكي HOXA-AS3 إلى تقليل تكوين المستعمرات ومنع نمو خلايا U2OS وSW13537. نظرا لأن التكاثر غير المنضبط هو سمة مميزة لبيولوجيا السرطان وعامل رئيسي محدد للاستراتيجيات العلاجية، فإن توضيح تكاثر الخلايا المنظمة بواسطة lncRNA في الأورام، خاصة في الساركوما العظمية، لا يزال ذا أهمية وضرورة كبيرة.

على الرغم من وجود عدة طرق لتقييم تكاثر الخلايا، إلا أن كل منها يحمل قيودا جوهرية. الاختبارات اللونية أو الأيضية، مثل CCK-8 وMTT، مريحة وسريعة وعالية الإنتاجية. ومع ذلك، فهي توفر بشكل أساسي قراءات قصيرة الأمد وسهلة الارتباك بسبب التقلبات الأيضية، وتحمل مخاطر إضافية من التداخل البصري أو الكيميائي الضوئي من الكواشف المستخدمة8. توفر الطرق القائمة على تخليق الحمض النووي، بما في ذلك دمج BrdU وEdU، خصوصية أكبر مع حصر التحليلات السريعة لدخول طور S دون عكس نتائج التكاثر طويلة الأمد 9,10. وبالمثل، فإن التلوين المناعي لمؤشرات التكاثر، مثل Ki-67، يشير فقط إلى نشاط دورة خلية فوري ويفشل في التنبؤ بسعة التكاثر10. تمكن أنظمة المراقبة الفورية، مثل RTCA، من تحليل منحنيات النمو المستمر مع قابلية تكرار عالية، ومع ذلك فإن تكلفتها العالية وتقييدها على التقييم قصير أو متوسط المدى تقلل من عمليتها11. وعلى النقيض من ذلك، يلتقط الاختبار المستنسخ بشكل فريد قدرة الخلية الواحدة على التكاثر غير المحدود وتكوين مستعمرات مرئية، مما يعكس مصيرها النهائي مباشرة. على الرغم من كونه مكثفا في العمل ويستغرق وقتا طويلا، يظل الاختبار التكسي المعيار الذهبي لتقييم الإمكانات التكاثرية طويلة الأمد، مقدما رؤى لا يمكن تحقيقها من خلال اختبارات قصيرة الأجل أو بديلة12.

هنا، يتضمن هذا المقال بروتوكول كشف مفصل لاختبارات إزالة الحمض النووي الريبي (lncRNA) وتكوين المستعمرات، مع مثال على سقوط SNHG6 في خلايا الساركوما العظمية 143B. هذا النهج لا ينطبق فقط على أبحاث الساركوما العظمية، بل يعمل أيضا كأداة عملية للتحقيق في تكاثر الحمض النووي الريبي الريبي المختلط في أورام أخرى.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

المواد المستخدمة والمواد المستخدمة مدرجة في جدول المواد.

1. نقل البلازميدات

  1. البذور 5 × 105 خلايا 143B لكل طبق زراعة بحجم 10 سم (إجمالي طبقين)، زراعة الخلايا في وسط كامل (DMEM + 10٪ FBS) عند 37 درجة مئوية في حاضنة 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
  2. تحضير كواشف النقل بعد 24 ساعة، بما في ذلك البلازميدات (shNC و shSNHG6)، PEI، وOpti-MEM.
    ملاحظة: استخدم دوامة وتأكد من أن جميع الأنظمة متوازنة مع درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام.
  3. أخرج أربعة أنابيب طرد مركزي دقيق بسعة 1.5 مل، وضع علامات على البلازميدات (shNC و shSNHG6) وPEI (أنبوبين) باستخدام قلم علامة.
  4. أضف 500 ميكرولتر من أوبتي-MEM إلى كل أنبوب.
  5. أضف 10 ميكروغرام من البلازميدات إلى أنبوب البلازميد (shNC أو shSNHG6) وأضف 30 ميكرولتر من PEI (1μg/μL) إلى كل أنبوب PEI.
  6. اخلط بلطف صعودا وهبوطا، واحتضن على درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
  7. امزج أنبوب البلازميد وأنبوب PEI، وامزجه برفق، وحضن الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة.
  8. أخرج خلايا 143B من الحاضنة واسحب وسط الزراعة بلطف. أضف 7 مل من المتوسط الخالي من المصل إلى كل طبق. ضع علامات على الأطباق لتحديد البلازميدات التي ستضيفها (143B shNC أو 143B shSNHG6).
  9. أضف خليط النقل الجاهز مسبقا باتجاه القطرة إلى طبق الزراعة المناسب.
    ملاحظة: أضف الخليط ببطء باستخدام ماصة بحركة دائرية، ووزعه بالتساوي من الحافة الخارجية نحو مركز الطبق. الحضانة عند 37 درجة مئوية في حاضنة تحتوي على 5٪ ثاني أكسيد الكربون2.
  10. تخلص من الطبقة الفائقة بعد 8-12 ساعة، وأضف 10 مل من وسط DMEM الكامل إلى كل طبق زراعة بحجم 10 سم. حضن الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة بنسبة 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
  11. يراقب تحت مجهر الفلورة بعد 72 ساعة من التخلص من المادة الفائقة واستبدالها بوسط DMEM كامل.

2. اختبار تكوين المستعمرة

  1. أزل الوسط من طبق الزراعة بحجم 10 سم (shNC و shSNHG6)، أضف 1.5 مل من تريبسين-إيدتا لهضم الخلايا، ثم استخدم الماصة بلطف لفصلها، ثم أضف 5 مل من الوسط الكامل لإنهاء الهضم.
  2. انقل تعليق الخلية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق بسعة 15 مل.
  3. قم بإزالة 20 ميكرولتر من تعليق الخلية وعد أعداد الخلايا.
    ملاحظة: يجب إجراء عد الخلايا عدة مرات لضمان اتساق أرقام الخلايا في مجموعة shNC ومجموعة shSNHG6. هنا، نجمع 3 × 10خلايا 5 للتحقق من RT-PCR لكفاءة إيقاف SNHG6.
  4. البذور 2 × 103 خلايا لكل بئر في صفيحة ذات 6 آبار. أضف وسط DMEM الكامل إلى حجم نهائي 2 مل وزراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة 5٪ ثاني أكسيد الكربون 2.
    ملاحظة: استبدل الوسيط بمتوسط DMEM كامل طازج كل يومين.
  5. راقب تكوين المستعمرة يوميا.
    ملاحظة: أنهي الزراعة عندما تحتوي معظم المستعمرات في مجموعة السيطرة (shNC) على ≥50 خلية، أو بعد 10-14 يوما من الحضانة، أيهما يأتي أولا.
  6. أخرج الخلايا من الحاضنة وتخلص من السوبرناتانت.
  7. اغسل الخلايا مرتين بمحلول 1 مل من PBS لكل بئر، وتخلص من PBS بعد كل غسل.
  8. ثبت الخلايا بمحلول فورمالين 10٪ بسعة 1 مل لمدة 15 دقيقة، ثم تخلص من محلول الفورمالين بنسبة 10٪.
  9. اغسل الخلايا مرتين بمحلول 1 مل من PBS لكل بئر، وتخلص من PBS بعد كل غسل.
  10. ضع خلايا صبغ بمحلول صبغ بنفسجي بحجم 1 مل بنسبة 0.5٪ لمدة 10-30 دقيقة، ثم تخلص من محلول التلوين.
  11. اغسل الخلايا بلطف بماء الصنبور الجاري ببطء.
  12. تجفيف الخلايا في الهواء في درجة حرارة الغرفة.
  13. التقط الصور باستخدام الكاميرا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

لتقييم تأثير nncRNA SNHG6 على القدرة التكاثرية لخلايا الساركوما العظمية، نجحنا في إنشاء نظام إسقاط بوسائل البلازميدات وأجرينا اختبارات تكوين المستعمرات. شمل سير العمل التجريبي نقل الخلايا 143B بالبلازميدات واختبار تكوين المستعمرات (الشكل 1).

تم تأكيد كفاءة النقل الخلوي ل 143B بواسطة المجهر الفلوري بعد 72 ساعة من النقل (الشكل 2). أظهرت النتائج أن شدة الفلورة ل 143 خلية في مجموعة التحكم (shNC) ومجموعة إ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

استهداف الحمض النووي الريبي اللانومي المرتبط بالسرطان علاجيا، بالإضافة إلى الاستفادة من فائدتها التشخيصية كمؤشرات حيوية، يمثل نهجا ناشئا في إدارة السرطان. تحديد أدوار الحمض النووي الريبي اللينسي في مسببات الساركوما العظمية أمر بالغ الأهمية لتقدم التشخيص والعلاج والتوقعات المرضية.

يجب اتباع خطوات حاسمة لضمان نجاح هذا الاختبار. أولا، إثبات تعليق خلية واحدة هو شرط مطلق لاختبارات الاستنساخ الموثوقة، حيث أن وجود تجمعات الخلايا قد يؤدي إلى مستعمرات زائفة ويضعف صحة ا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

وقد تم دعم هذا العمل بمنح من المؤسسة الوطنية لعلوم الطبيعة (82174408، 82374477، 82474535، و 82205145).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
أنابيب ميكروتيوب بحجم 1.5 ملميركAXYMCT150C
الفورمالين المحايد 10٪ مخزنفيكتريكس5205000
100 - 1000 μ إل إل بلو تيبس الموسعشركة شنغهاي للعلوم الحيوية المحدودةBS10401ML
مختبر أطباق زراعة الخلايا بقياس 100 ممشركة ووشي نست للتكنولوجيا الحيوية المحدودة704001
143BATCCATCC CRL-8303TM
أنبوب الطرد المركزي بسعة 15 ملشركة شنغهاي للعلوم الحيوية المحدودةBL2002150
لوحة زراعة الخلايا ذات 6 الآبارشركة ووشي نست للتكنولوجيا الحيوية المحدودة703001
حاضنة CO2شركة ثيرمو فيشر تكنولوجي (الصين) المحدودة.300583057
كريستال فيوليتتي سي آي شنغهايC0428
DMEM mediumشركة ويسنت319-005-CL
أبحاث إبندورف بلسإبندورف3123000233
FBS - جودة فائقةشركة ويسنت086-150
قلم ماركشركة زيبرا تريدينغ (شنتشن) المحدودة.YYST5
أوبتي-ممجيبكو31985070
باستور بيبيتيلابجيكBS-XG-O3L
مخزن PBS (مسحوق جاف)لابجيكBL601A
جزيرة الأمير إدواردالعلوم متعددة24765
أطراف البيبيتميركAXYT200Y
إنزيم TrypLE Expressجيبكو12604021
تريبسين/إيدتاجيبكوR001100

المراجع

  1. Chen, N., et al. IAV inhibits the host antiviral defense mediated by LncRNA-LRIR to enhance viral replication. Int J Biol Macromol. 322 (Pt 1), 146665(2025).
  2. Zhu, J., Mo, Y. Y., Peng, W. X. RNA binding protein-mediated competing endogenous RNA mechanism in cancer. Gene. 963, 149606(2025).
  3. Zhang, Y., et al. KIAA1429-mediated ZFPM2-AS1 m(6)A modification promotes the proliferation, migration and invasion of osteosarcoma cells. Oncol Lett. 30 (4), 453(2025).
  4. Oh, M., Kadam, R. N., Charania, Z. S., Somarowthu, S. LncRNA SChLAP1 promotes cancer cell proliferation and invasion via its distinct structural domains and conserved regions. J Mol Biol. 437 (19), 169350(2025).
  5. Wang, G., et al. TBX5-AS1 induces ER stress and suppresses lung cancer growth and tumor stemness via the miR-494-3p/ATF6 axis. Cell Stress Chaperones. 30 (6), 100113(2025).
  6. Xu, S., et al. lncRNA POU3F3 promotes osteosarcoma progression through GPX4-modulated ferroptosis by interaction with IGF2BP2 to facilitate NRF2 mRNA stability. Genes Dis. 12 (5), 101439(2025).
  7. Li, R., et al. LncRNA HOXA-AS3 promotes cell proliferation and invasion via targeting miR-218-5p/FOXP1 axis in osteosarcoma. Sci Rep. 14 (1), 16581(2024).
  8. Ghasemi, M., Turnbull, T., Sebastian, S., Kempson, I. The MTT assay: Utility, Limitations, pitfalls, and interpretation in bulk and single-cell analysis. Int J Mol Sci. 22 (23), (2021).
  9. Harris, L., Zalucki, O., Piper, M. BrdU/EdU dual labeling to determine the cell-cycle dynamics of defined cellular subpopulations. J Mol Histol. 49 (3), 229-234 (2018).
  10. Romar, G. A., Kupper, T. S., Divito, S. J. Research techniques made simple: Techniques to assess cell proliferation. J Invest Dermatol. 136 (1), e1-e7 (2016).
  11. Stefanowicz-Hajduk, J., Ochocka, J. R. Real-time cell analysis system in cytotoxicity applications: Usefulness and comparison with tetrazolium salt assays. Toxicol Rep. 7, 335-344 (2020).
  12. Franken, N. A., Rodermond, H. M., Stap, J., Haveman, J., van Bree, C. Clonogenic assay of cells in vitro. Nat Protoc. 1 (5), 2315-2319 (2006).
  13. Brix, N., Samaga, D., Belka, C., Zitzelsberger, H., Lauber, K. Analysis of clonogenic growth in vitro. Nat Protoc. 16 (11), 4963-4991 (2021).
  14. Rajendran, V., Jain, M. V. In vitro tumorigenic assay: Colony forming assay for cancer stem cells. Methods Mol Biol. 1692, 89-95 (2018).
  15. Guzman, C., Bagga, M., Kaur, A., Westermarck, J., Abankwa, D. ColonyArea: An ImageJ plugin to automatically quantify colony formation in clonogenic assays. PLoS One. 9 (3), e92444(2014).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

SNHG6 RT qPCR
اختبار تكوين المستعمرة الذي يكشف عن القدرة التكاثرية لخلايا ساركوما العظمية التي تسقط بواسطة LncRNA
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.