Method Article

بولي أكريلاميد ZrOH هيدروجيلز لأخذ عينات محلية من الكربوكسيلات المنبعثة من الجذور النامية في التربة

DOI:

10.3791/69921

⸱

April 24th, 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Faculty of Agricultural, Environmental and Food Sciences, Free University of Bolzano, 2Competence Centre for Plant Health, Free University of Bolzano, 3Institute of Plant Nutrition, Justus Liebig University Giessen

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذا البروتوكول، نفصل استخدام هيدروجيلز هيدروكسيد الزركونيوم البولي أكريلاميد (ZrOH) كطريقة غير مدمرة في الموقع لأخذ عينات من الكربوكسيلات المنبعثة من الجذور من الجذور السليمة المزروعة في التربة في مراحل تطور المحاصيل المختلفة. كما يوضح الرسم الخرائط المحلية والكمية لهذه الكربوكسيلات باستخدام كروماتوغرافيا الأيونات ومطياف الكتلة (IC-MS).

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لا يزال أخذ العينات والقياس الموثوق لخروجات الجذور الناتجة عن جذور النباتات المزروعة في التربة أمرا صعبا. طورنا أيضا طريقة غير مدمرة لأخذ العينات، ورسم الخرائط ثنائية الأبعاد، وقياس كمية سبعة كربوكسيلات (أكونيت، سترات، فومارات، لاكتات، مالات، أوكسالات، سوكسينات) المنبعثة من جذور النباتات المزروعة في صناديق الجثث. الطريقة الموضحة هنا تستخدم هيدروجيلز الزركونيوم البولي أكريلاميد (ZrOH) التي تمتص جميع الكربوكسيلات المختبرة ويمكن إخفاؤها بكفاءة تتراوح بين 95.3٪ ± 3.12٪ إلى 111٪ ± 1.99٪. تتمتع هيدروجيلات ZrOH بقدرة ارتباط عالية على الكربوكسيلات، تصل إلى 1.82 ميكرومول سم²، اعتمادا على درجة الحموضة وأنواع الكربوكسيلات، وهو تركيز أعلى من المعتاد في الريزوكرويلات. علاوة على ذلك، تبقى الكربوكسيلات المرتبطة على الهيدروجيلات ZrOH مستقرة ويمكن تخزينها لعدة أسابيع عند 4 درجات مئوية قبل التحليل. للتطبيق، تزرع النباتات في صناديق جذور مملوءة بالتربة تسمح بالوصول السهل مع أقل اضطراب في نظام الجذور. لأخذ عينات من الكربوكسيلات المنبعثة من الجذور، يتم تطبيق الهيدروجيلات ZrOH بعناية في المنطقة المعنية لمدة 24 ساعة. بعد استرجاع الهيدروجيلات ZrOH، يتم قطعها لأغراض رسم الخرائط، ويتم إخراج قطع الجل لتحليل الكربوكسيلات لاحقا (مثل عبر كروماتوغرافيا الأيونات-مطيافية الكتلة). تشير نتائجنا إلى أن هيدروجيلات ZrOH فعالة في التقاط وتحديد تركيزات الكربوكسيلات في الريزوسفير (الريزوسفير). تكمن جدة هذه الطريقة في قدرتها على أخذ عينات من إفرازات الجذور من جذور النباتات المزروعة في التربة سليمة، بالإضافة إلى إمكانية أخذ عينات محددة زمنيا، مقارنة بالطرق التقليدية (النهج الهجين بين التربة والزراعة المائية) التي غالبا ما تكون مدمرة وتسمح بأخذ عينات مرة واحدة فقط. والأهم من ذلك، أنها تمكن من توليد صور كمية عالية الدقة وثنائية الأبعاد بمقياس مليمتر، مما يسهل تصور إفرازات الكربوكسيلات على محور الجذر وتوزيعها المكاني داخل الريزوسفير (الريزوسفير). بالإضافة إلى ذلك، تسهل هذه الطريقة أخذ عينات من إفرازات الجذور في مراحل نمو مختلفة خلال دورة النمو.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تفرز جذور النباتات مركبات مختلفة في الريزوسفير، مما يشكل خصائصها الفيزيائية والكيميائية والبيولوجية1. عندما تتعرض النباتات لظروف الإجهاد اللاحيوي والحيوية، يتم تحفيز إفراز الجذور بشكل خاص. قد تؤثر إفرازات الجذور فعليا على توفر وتعبئة المغذيات/المعادن، والمجتمعات الميكروبية ونشاطها، واستقرار تجمعات التربة، ودفاعات النباتات ضد مسببات الأمراض بشكل مباشر أو غير مباشر 1,2,3. من بين أهم إفرازات الجذور الكربوكسيلات بسبب دورها في ذوبان العناصر الغذائية (بما في ذلك الفوسفور (P)، الحديد (Fe)، النحاس (Cu)، والزنك (Zn))، وتحمل المعادن الثقيلة، وتعزيز الكائنات الدقيقة المفيدة في الريزوسفير2،3،4،5.

ومن الجدير بالذكر أن الكربوكسيلات المنبعثة تشمل السترات، اللاكتات، الأوكسالات، المالات، السوكسينات، والفومارات 6,7,8. على سبيل المثال، يلعب السيترات دورا حيويا في اكتساب الف من خلال تعبئة الفسيل المرتبط بأكاسيد الألمنيوم (Al) (هيدرولوجيات) 7,9. ومع ذلك، لا يزال أخذ عينات دقيقة وقياس كمية إفرازات الجذور من النباتات المزروعة في التربة تحديا تجريبيا، ويرجع ذلك أساسا إلى صعوبة الوصول المادي إلى أنظمة الجذور المزروعة في التربة غير المضطربة والحصول على عينات إفرازات الجذور 10,11. بالإضافة إلى ذلك، تخضع المركبات المفرزة بسرعة لتحلل ميكروبي (خلال دقائق إلى ساعات) وتمتص بقوة على أسطح المعادن في التربة 1,10. تحد آخر في دراسات إفراز الجذور هو مراقبة الإفراز مع مرور الوقت، حيث تزعج معظم طرق الجمع الجذور أو تتطلب حصاد النباتات المزروعة في التربة، مما يصعب تقييم نفس الجذر مرة أخرى 1,11. لذلك، يتطلب أخذ العينات الدقيقة، والقياس، والمراقبة الدقيقة لإفرازات الجذور تقنية تلتقط التغيرات المكانية وتسهل أخذ العينات المتكررة أثناء نمو النبات11.

في الدراسة الحالية، نقدم طريقة غير مدمرة في الموقع تم تطويرها في البداية للسترات بواسطة Tiziani وآخرون، والتي تم تحسينها وتطبيقها الآن لأخذ العينات، وتحديد الموقع المكاني الدقيق، وقياس ستة كربوكسيلات إضافية (أكونيت، فومارات، لاكتات، مالات، أوكسالات، وسوكسينات) منبعثة من جذور النباتات السليمة المزروعة في التربة في صناديق الجذور. تستخدم الطريقة هيدروجيلات البولي أكريلاميد المصنوعة من هيدروكسيد الزركونيوم (ZrOH) لأخذ عينات من إفرازات الجذور13. تظهر هيدروجيلات ZrOH قدرة قوية على الارتباط بالأنيونات (بما في ذلك الكربوكسيلات الكربوكسيليات) التي يمكن إزالتها بسهولة 12,13,14. تسمح هيدروجيلات ZrOH (1) بأخذ عينات من كربوكسيلات الجذور من جذور النباتات المزروعة في التربة ببساطة عن طريق وضع الهيدروجيل على نظام الجذور مع أقل قدر من الاضطراب، (2) توفر حماية فعالة للكربوكسيلات المرتبطة ضد التمعدن الميكروبي لمدة لا تقل عن 6 أسابيع، (3) يتم الحفاظ على التوزيع المكاني للكربوكسيلات في الريزوسفير عند الارتباط بالجل، و(4) تسمح برسم خرائط كربوكسيلات 12 ثنائية الأبعاد على مقياس ملم 12.

تصنف الطرق الحالية لأخذ عينات إفرازات الجذور إما كتقنيات تعتمد على التربة من النباتات المزروعة في التربة (مثل غسل الجذور أو الهجين المائي للتربة، أجهزة جمع إفرازات التربة والجذر (SOIL-REC)، أكواب الشفط الدقيقة، أوراق الترشيح/أوراق الأجار، مصائد الإفراز وتقنية اختبار RHIZO) أو طرق أخذ عينات إفراز مائية من التربة. غسل الجذور أو النهج الهجين المائي للتربة-التربة يتضمن إزالة النبات بالكامل من التربة بعناية، وغسل نظام الجذور، ثم غمره في محلول العينات لجمع إفرازات الجذور15. تعد هذه الطريقة الأكثر استخداما لأخذ عينات الإفرازات من النباتات المزروعة في التربة بسبب بساطتها. ومع ذلك، فإن استخراج الجذور من التربة يشكل خطرا لفقدان شعيرات الجذور والجذور الدقيقة. علاوة على ذلك، هناك حاجة إلى تنظيف شامل للجذور، مما قد يضر بالجذور، ويضعف جودة وكمية إفرازات الجذور، ويمنع أخذ عينات محددة زمنيا 8,11. تتضمن طريقة SOIL-REC زراعة النباتات في نظام صندوق جذور مصمم خصيصا مع نمو الجذور بين شبكتين نايلون مساميين (≤ 30 ميكرومتر) وجمع إفرازات الجذور باستخدام أداة جمع إفرازات الجذور16,17. تحافظ هذه الطريقة على نظام الجذور، وتقلل من تلوث التربة، وتتيح جمع إفرازات الجذور بشكل متكرر. ومع ذلك، فإن إعدادها معقد (مع عدد قليل من النسخ فقط)، وتخفيف أعلى للإفرازات الناتجة عن أحجام أكبر المستخدمة في أخذ العينات، ولا تزال تتطلب تحسين، حيث أن قابليته للتكرار تحدية، وتوجد اختلافات كبيرة بين النسخ8.

تطبيق قطع صغيرة من الراتنجات أو صفائح جل الأجار أو ورق الترشيح القادر على التوازن مع المحلول المحيط أو امتصاص الإفرازات على الأجزاء الجذرية المهمة للجذور السليمة المزروعة في التربة (أي باستخدام صناديق الجذور أو نوافذ الجذور)18,19. تتيح هذه الطريقة أخذ عينات محددة زمنيا وقياس جزئي لتركيب الإفرازات المحلية، وإن كان ذلك بدقة مكانية منخفضة. من ناحية أخرى، فهي عرضة للآثار الناتجة عن التمعدن الميكروبي وصعبة التعامل. وبالمثل، تستخدم مصائد الإفراز لأخذ عينات من إفرازات الجذور من أجزاء جذور فردية، حيث يحبس جذر واحد في حجرات جانبية أفقية، مع حلقات بيرسبيكس محكمة الإغلاق تحتوي على محلول العينة، والتي تكون موضوعة محليا8. الطريقة قابلة للتطبيق على كل من الجذور المائية والمزروعة في التربة وتسمح بأخذ عينات محلية12. ومع ذلك، يتم جمع كميات قليلة، وأخذ عينات محددة زمنيا يكاد يكون مستحيلا، وعزل الجذور الفردية عرضة للإجهاد الميكانيكي الذي قد يؤثر على أيض الجذور والفرز8. تستخدم أكواب الشفط الدقيقة لجمع محلول التربة في بيئة الجذور، مما يمكن من أخذ عينات ميدانية من الجذور المزروعة في التربة20. ومع ذلك، يتم جمع كميات صغيرة، وأخذ العينات جزئيا بمرور الوقت، وتكون الإفرازات عرضة للامتزاز والتحلل الميكروبي16. تتضمن تقنية RHIZOtest زراعة الجذور بشكل مائي في أسطوانات صغيرة مع تغطية القاع بشبكة نايلون بحجم 30 ميكرومتر، ثم نقلها إلى قرص تربة، مما يسمح بتبادل المذاب بين الجذر والتربة 8,21,22. يتم جمع الإفرازات عن طريق غمر حصيرة الجذر في محلول أخذ العينات. تحافظ هذه الطريقة على الاتصال بالجذور والتربة لكنها تستخدم ظروف نمو صناعية. تقتصر على التجارب قصيرة الأمد وتفتقر إلى أخذ عينات محددة زمنيا. من بين هذه الطرق، يمكن استخدام الراتنجات فقط وأوراق الجل الأجار وورق الفلتر ومصائد الإفراز وأكواب الشفط الدقيقة لتحديد أنماط الإفراز المكاني.

تشمل طرق أخذ عينات الإفرازات المائية تقنيات الزراعة المائية وتقنيات شبه الزراعة المائية. الزراعة المائية هي طريقة شائعة وبسيطة لجمع إفرازات الجذور، حيث تزرع النباتات في محلول مغذي، ثم يستبدل بمحلول أخذ عينات (H2O، CaSO4، CaCl2، micropur) للحصول على عينات إفرازات15،23. الطريقة بسيطة وتفرض ضغطا ميكانيكيا ضئيلا على الجذور. هي قابلة للتكرار عالية ومعقمة إذا لزم الأمر، مما يزيد من جودة إفرازات الجذور ويتيح أخذ عينات دقيقة زمنيا5،16. ومع ذلك، فهو نظام صناعي للغاية يمكنه تغيير فسيولوجيا النبات، وشكلها (مثل تطور شعر الجذر)، وعمليات إفراز الجذور 6,15. في شبه الزراعة المائية، تزرع النباتات على خرز زجاجي أو رمل أو فيرميكوليت مع محلول غذائي يتسرب باستمرار، وتجمع الخروذات في محلول المحلول المتسرب 8,18. هذا النهج أقل اصطناعية قليلا مقارنة بالزراعة المائية ويسمح بأخذ عينات محددة زمنيا. ومع ذلك، فإن النظام مشبع تقريبا بالكامل بالماء، وبالتالي يتطلب نباتات تتحمل الظروف اللاهوائية جزئيا.

مقارنة بالأساليب البديلة، تقدم طريقة الهيدروجيل ZrOH عدة مزايا. تسمح هيدروجيلات ZrOH بأخذ عينات من إفرازات الجذور في زراعة التربة (بالقرب من الظروف الطبيعية) مع تقليل الاضطراب لنظام الجذور، وأخذ عينات محددة زمنيا خلال دورة حياة النبات، وجمع إفرازات الجذور لأكثر من 24 ساعة ممكن بسبب انخفاض التحلل الميكروبي وقدرة الارتباط العالية بالكربوكسيلات12. علاوة على ذلك، لا يلزم وجود مبيدات حيوية (مثل الميكروبور، NaN3) لأخذ عينات أو حفظ الهيدروجيلات، والتي لها تأثير محتمل على الجهاز التحليلي على المدى الطويل وتعيق التحليل الكيميائي. وذلك لأن الكربوكسيلات مرتبطة كيميائيا بالهيدروجيل ZrOH. بالإضافة إلى ذلك، يمكن تخزين العينات لعدة أسابيع إلى أشهر قبل التحليل، وبالتالي يمكن جمع العديد من العينات من إعداد تجريبي واحد12، وقد يعزى ذلك إلى الخصائص المضادة للميكروبات لZr في الهيدروجيل24,25. بالإضافة إلى ذلك، تتيح هيدروجيلات ZrOH رسم خرائط بجودة 2D مليمتر لمركبات منبعثة وأنيونات أخرى في الريزوسفير، مع إمكانية أخذ عينات من النظام الجذري بأكمله 12,14,26. تشغل هيدروجيلات ZrOH مساحة تخزين أقل في الثلاجة (4 °م) مقارنة بالكميات الكبيرة المطلوبة بالطرق الكلاسيكية، والتي عادة ما تخزن في الفريزر (-20 درجة مئوية). القيد الرئيسي هو التعود على إنتاج هيدروجيلز ZrOH عالية الجودة مع فقاعات هواء قليلة أو معدومة، بالإضافة إلى أن صناديق الجذور لا تزال أنظمة زراعة صناعية. قيد آخر هو أن الطريقة تم تطويرها فقط لسبعة أنواع من الكربوكسيلات (الأكونيتات، السيترات، الفومرات، اللاكتات، المالات، السوكسنات، والأكسالات)12، والسلفوناميدات (السلفاديازين، السلفاميثازين، السلفاكلوروبيريدازين، والكليندامايسين)27، والأونيونات غير العضوية (الكبريتيدات والأوكسيانيونات من P، V-فاناديوم، الأس-أرنيخ، سي-سيلينيوم، مو-موليبدينوم، Sb-أنتيمون)14،26،28،29. كما استخدم الهيدروجيل ZrOH مع كاشف الجسيمات المعلقة – حمض الإيمينوديستيك لأخذ عينات ورسم خرائط الكاتيونات (الأل، Fe، Ca-الكالسيوم، Mg-المغنيسيوم، Mn-المنغنيز، Ni-Nickel، والزن-زنك) في الريزوسفير 28,29,30.

هنا، نقدم طريقة تعتمد على الهيدروجيل ZrOH لتمكين أخذ عينات زمنية ومحلية من الكربوكسيلات من أنظمة الجذور المزروعة في التربة. نقدم وصفا مفصلا لكيفية إجراء تجربة صندوق الجذر، بما في ذلك أخذ عينات ورسم خرائط ثنائية الأبعاد لإفرازات الجذور باستخدام تقنية ZrOH. تغطي هذه الطريقة تحضير الهيدروجيل، ملء صندوق الجذور، زراعة النباتات، تطبيق الهيدروجيل، الاسترجاع والقطع، إزالة الكربوكسيلات من الهيدروجيل والتحليل، ويتبعها توليد صور ثنائية الأبعاد. بالإضافة إلى ذلك، يوفر ملاحظات حول الخطوات الحرجة، مثل تحليل الكربوكسيلات باستخدام كروماتوغرافيا الأيونات ومطياف الكتلة (IC-MS).

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. تحضير الهيدروجيل ب ZrOH

ملاحظة: يلزم وجود بيئة ومواد نظيفة لتحضير الجل لتجنب التلوث. استخدم فقط ماء المختبر من الدرجة الأولى (≤18 ميغام·سم) عند تحضير المحاليل، والشطف بالجل، والترطيب لضمان الجودة. تأكد من وضع حاويات النفايات السامة (السائلة والصلبة) في غطاء البخار قبل بدء تحضير الهيدروجيل. سخن الفرن إلى حوالي 42─45 درجة مئوية لمدة ساعة قبل البدء في تحضير الجل. تفاصيل المواد والمواد الكيميائية مدرجة في جدول المواد.

  1. تحضير تجميع الزجاج
    1. جهز حمام حمض بنسبة 10٪ (بدون حمض HNO₃) بإضافة 153.8 مل من 65٪ HNO₃ إلى 846.2 مل من ماء المختبر من الدرجة الأولى في غطاء بخار.
    2. انقع ألواح الزجاج (6.1 × 17 سم)، والملاقط، والفواصل على شكل حرف U من التفلون (0.25 مم أو 0.4 مم)، والمشابك البلاستيكية في الحمام الحمضي لمدة لا تقل عن 4 ساعات.
    3. أزل الألواح الزجاجية، والملاقط، والمشابك البلاستيكية، وفواصل التفلون من حمام الحمض ثم اغسلها ثلاث مرات على الأقل بماء المختبر من الدرجة الأولى. ثم دعها تجف جيدا في الهواء في تدفق طبقي أو على طاولة نظيفة.
      ملاحظة: يجب تحضير الألواح الزجاجية في نفس يوم تحضير الجل وتجنب تجفيفها بالورق لتقليل التلوث.
    4. ضع الفاصل على شكل "U" على اللوحة الزجاجية الجافة، أضف الثاني، وتثبيتهما معا باستخدام مشابك. قم بإزاحة الألواح الزجاجية بحوالي ~1 مم لتسهيل التوصيل (انظر الشكل 1A).
    5. ضع تجميع ألواح الزجاج على ورق بلاستيكي نظيف تحت غطاء الفيلم قبل صب محلول الجل.
  2. تحضير جل بولي أكريلاميد31
    1. محلول الهلام: حضر محلول هلام بسعة 100 مل عن طريق خلط 15 مل من تدرجات الانتشار في مادة الربط الهالي الرقيق (DGT) مع 47.5 مل من ماء المختبر من الدرجة الأولى في قارورة بلاستيكية نظيفة، ثم أضف 37.5 مل من محلول الأكريلاميد (40٪). حرك الخليط جيدا عند إضافة كل محلول. يمكن تخزين محلول الجل في ثلاجة (4 درجات مئوية) لمدة لا تقل عن ثلاثة أشهر.
      ملاحظة: تأكد من قياس الكميات الصحيحة من كل محلول واستخدام محلول أكريلاميد فقط بدون بيس-أكريلاميد، حيث ينتج هلام طري عند وضعه في محلول 2-(N-مورفولينو)-إيثانيسلفونيك حمض (MES).
    2. حضر محلول بيرسلفات الأمونيوم (APS) بنسبة 10٪ (بدون جهد/ضج) عن طريق إذابة 0.1 جرام APS في 1 جرام منH2O. حضر المحلول طازجا كل يوم وتأكد من ذوبه تماما قبل الاستخدام.
    3. حضر كوكتيل جل بخلط محلول جل بحجم 4 مل مع 28 ميكرولتر 10٪ APS، ثم أضف 10 ميكرولتر 99٪ N,N,N'N'-Tetramethyleethile thylenediamine (TEMED) في قوارير بلاستيكية نظيفة. اخلط بعد إضافة كل محلول. يمكن تحضير المحلول لما يصل إلى 3 جلات مع تطور الخليط بسرعة. يمكن ضبط حجم الكوكتيل حسب حجم الأطباق والفواصل المستخدمة.
      ملاحظة: تجنب الفقاعات والرغوة عند خلط المواد المختلفة.
    4. قم بعمل ماصة تدريجية لخليط الجل بين مجموعة لوح الزجاج من المنتصف كما هو موضح في الأشكال 1B,C 26. في حال وجود فقاعات هواء، قم بإزالتها بإمالة مجموعة الزجاج بلطف أو طرق على ألواح الزجاج باستخدام قلم.
      ملاحظة: للحصول على جل خال من الفقاعات، تجنب استخدام ألواح زجاجية مخدوشة واحتزنها في حمام حمضي بعد الاستخدام، واغسلها فقط قبل الاستخدام التالي بدلا من تخزينها في أكياس بولي إيثيلين. استخدم ماصة بحجم 1 مل أو 5 مل مع طرف صغير لصب الجل وأضف كوكتيل الجل ببطء من المركز حتى يتوزع بشكل متساو مع إمالة الأطباق بزاوية 45°.
    5. ضع التجميع في الفرن المسخن مسبقا وحافظ على درجة الحرارة عند 42─46 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة على الأقل لضمان تثبيت الجل تماما (دون تقطير سائل).
    6. ارفع التجميع بلطف بمساعدة شفرة حلاقة نظيفة وخالية من الصدأ من الزوايا واغسل الجل عن ألواح الزجاج باستخدام ماء المختبر من الدرجة الأولى في زجاجة غسيل (الشكل 1D–F). لتسهيل إزالة الهلام، انقعه بالماء لبضع دقائق ثم اغسله في كأس سعة 1 لتر يحتوي على ماء من الدرجة الأولى في المختبر.
      ملاحظة: تجنب سحب الجل بالملاقط في حال التصق باللوحة، فقد يؤدي ذلك إلى تشوه الهلام. بعد البلمرة، عادة ما تكون الفقاعات الظاهرة بين الجل واللوح الزجاجي بدلا من داخل الجل نفسه، ويصبح واضحا بعد إزالة اللوحة.
    7. غير الماء على الأقل 3–4 مرات خلال 24 ساعة من الترطيب (ويفضل بفواصل ساعتين بعد التحضير) لغسل المواد الكيميائية المتبقية من البلمرة. عن طريق استبدال الماء بشكل متكرر أثناء الترطيب، يتم تنتشر الشوائب مثل الكواشف غير المتفاعلة، ويتم تقليل الرقم الهيدروجيني لمنع تراكم الشحنة داخل الهلام.
    8. تخزين الجل في ماء المختبر من الدرجة الأولى (لفترة قصيرة حوالي 24 ساعة) أو 0.01 مول L-1 NaCl أو NaNO3 في الثلاجة (4 درجات مئوية) إذا لم تستخدم صفائح الهلام فورا لترسيب ZrOH. يمكن تخزين هذه الهلام في NaCl لمدة تصل إلى شهر قبل الهطول.
      ملاحظة: نوصي بترسيب الجل فور التلمرة لتقليل التلوث الذي قد يحدث أثناء الغسيل.
  3. ترسيب جلات ZrOH14
    1. قم بإذابة 3.22 جرام من أوكسيد ثنائي كلوريد الزركونيوم (ZrOCl2.8H 2O) في 40 مل من مياه المختبر من الدرجة الأولى في كأس بلاستيكي بسعة 250 مل.
    2. ضع حتى 4 صفائح جل واملأ حتى 100 مل. بدلا من ذلك، قم بإذابة 1.66 جرام من ZrOCl2.8H 2O في 20 مل من ماء المختبر من الدرجة الأولى، وضع جلين واملأ حتى 50 مل.
    3. نقع صفائح الجل لمدة لا تقل عن ساعتين لضمان توزيع Zr بشكل متساو في الجل.
    4. انقل كل جل إلى 100 مل من حمض الإيثانيسلفونيك (MES) بوزن 0.05 مول L-1 2-(N-morpholino)-إيثانيسلفونيك (MES) مخزز عند pH 6.7 (يتم ضبط الرقم الهيدروجيني ب 1 مول L-1 NaOH) للترسيب. حرك الهلام بلطف باستخدام ملقط خلال أول 30-60 ثانية للحصول على ترسيب متجانس.
    5. اهز بلطف على هز اللوحة بسرعة ≤100 دورة في الدقيقة لمدة 40 دقيقة لترسيب Zr(OH)4 بالكامل في الجلام.
      ملاحظة: يفضل تقليل سرعة الاهتزاز لتجنب التصاق الجل ببعضه البعض.
    6. ضع الجل في ماء المختبر من الدرجة الأولى في كأس سعة 1─2 لتر لمدة 24 ساعة لإزالة أيونات Cl- وتغيير الماء على الأقل 3 مرات بفواصل زمنية 2 ساعةو32. يمكن فحص الإزالة الكاملة لأيونات Cl- عن طريق قياس توصيل محلول الشطف أو إجراء اختبار كلوريد.
    7. تخزين الجل في 0.03 مول L-1 NaNO3 أو NaCl، لكن NaCl يفضل في تجارب التربة لأن النترات تعزز بسرعة النشاط الميكروبي للتربة، كما أنها عنصر غذائي رئيسي للنباتات13,32.
    8. تم اختبار الهيدروجيلز ZrOH لمدة تصل إلى 60 أسبوعا (مخزنة في ثلاجة عند 4 درجات مئوية) وأظهرت أنها تحافظ على خصائصها وأدائها الجيد (±10٪ من القيم المستهدفة)32.
  4. قطع الجل
    1. نظف صفيحة البليكسي جلاس غير المخدوشة، والملاقط، وشفرة حلاقة حادة خالية من الصدأ. في غياب صفيحة بلاكسي جلاس، يمكن استخدام أي صفيحة زجاجية سميكة وقوية.
    2. رطب صفيحة البليكسي جلاس بماء من المختبر من الدرجة الأولى للمساعدة في نشر صفائح الهيدروجيل ZrOH.
    3. افرد ورقة الهيدروجيل ZrOH على لوح البليكسي غلاس باستخدام الملقط مع التأكد من أنها مسطحة بدون فقاعات. حدد المناطق التي بها ثقوب في الصفائح؛ يجب تجنب هذه المناطق عند القطع.
    4. قم بقص صفائح الهيدروجيل من ZrOH بدقة باستخدام شفرة حلاقة حادة إلى الحجم المطلوب. إزالة الماء من اللوح بعد القطع تساعد في رؤية الأجزاء المقطعة بوضوح.
      ملاحظة: لتسهيل تحديد الجوانب في رسم الخرائط ثنائية الأبعاد، نوصي بقطع قطع الهيدروجيل من ZrOH إلى شكل شبه منحرف بزاوية قائمة مع وجود أطول جانب في الأعلى إلى اليسار.
    5. خزن الهيدروجيلز ZrOH في ماء المختبر من الدرجة الأولى (للتخزين قصير الأمد وقبل تطبيق الجل مباشرة) أو 0.03 مول L-1 NaNO3/NaCl للتخزين طويل الأمد (>24 ساعة).

2. إعداد تجربة صندوق الجذور

ملاحظة: تزرع النباتات في صناديق جذور مملوءة بالتربة، تختلف في التصميم. نوصي باستخدام صناديق الجذور المزودة بفتحات في الأسفل أو الخلف لتسهيل الري وضمان توزيع المياه بشكل موحد (انظر الشكل التكميلي 1). التفاصيل حول المواد والمواد الكيميائية مدرجة في جدول المواد.

  1. تحديد سعة تعبئة صندوق الجذور واحتجاز الماء26
    1. قم بغربال التربة المجففة بالهواء باستخدام منخل بحجم 2 مم وتوحيد التربة. نوصي باستخدام تربة متوسطة الملمس، لكن يمكن أيضا استخدام تربة رملية أو طينية بشرط استخدام تقنيات معالجة محددة (مثل نوع الريزوبوكس، الحشو، الفتح، والري).
    2. وزن جميع مكونات صندوق الجذور (الفارغ) مع المشابك وورق البلاستيك وسجل الوزن (انظر الشكل الإضافي 2C). أضف 2–3 صناديق جذور إضافية إلى العدد المطلوب لتحديد سعة احتجاز الماء (WHC).
    3. تقدير كتلة التربة الجافة المطلوبة لملء صندوق الجذور. عادة ما يتم ملء صندوق الجهدها حتى 2 سم تحت سطح السطح. الكثافة الكلية الموصى بها هي حوالي 1.0–1.4 جرام سم³.
    4. اعتمادا على نوع صندوق الجذور وسهولة التعامل معه، املأ صندوق الجهدها بعناية بالتربة الجافة. أثناء وبعد الحشو، يمكن تسوية التربة باستخدام صفيحة مسطحة دون ضغطها. يمكن أيضا استخدام تربة رطبة قليلا لملء صندوق الجذور للحفاظ على بنية التربة، خاصة للتربة الطينية ذات الملمس الناعم أو الثقيل (انظر Wagner وآخرون 26 للوصف التفصيلي).
    5. بدلا من ذلك، إذا تم ملء صندوق الجذور من الأعلى، ثبت ورق الألمنيوم البلاستيكي على صندوق الجذور، وغطه باللوحة الأمامية، ثم قم بتثبيت (انظر الشكل الإضافي 2A–D).
    6. لأجل الراحة، قم بتركيب غشاء نيوكليبور أثناء عملية التعبئة وتأكد من استبعاده بشكل مسطح على السطح. هناك حاجة إلى غشاء نوكليبور عند أخذ عينات من إفراز الجذور.
    7. سجل وزن صناديق الجذور المملوءة بالتربة مع المشابك. احسب كتلة التربة الجافة (متر تربة جافة) لكل صندوق جذور عن طريق طرح وزن صناديق الجثور الفارغة من تلك المملوءة بالتربة، وسجل الوزن.
    8. يتم تحديد سعة احتجاز المياه أولا عن طريق تشبع صناديق الجنود بماء منزوع الأيونات ثم السماح لها بالتصريف لمدة ~8 ساعات. وزن صناديق الجذور وحساب كتلة الماء (mw) بطرح وزن صناديق الجذور المملوءة بالتربة المسجلة في الخطوة 2.1.7 من الوزن الحالي. ثم تحديد WHC (g g-1) بقسمة mw علىm التربة الجافة، والنتيجة هي نسبة.
      ملاحظة: لا تستخدم صناديق الجثور المستخدمة لتحديد الوصايا العالية للخرائط الفعلية، لأن تشبع المياه قد يؤدي إلى فقدان الهواء وبالتالي إلى آثار الأكسدة الاختزال (الأكسدة).
    9. يجب الحفاظ على المحتوى المائي الأمثل لمعظم النباتات أثناء النمو عند 50٪─60٪ WHC (أي عامل WHC، fWHC = 0.5─0.6)، وذلك حسب نوع التربة ونوع النبات. قدر كمية الماء التي يجب إضافتها (m w اضافة) لكل صندوق جذور كما يلي: mw أضف = WHC × fWHC × mتربة جافة.
    10. اسق صندوق الجذور قبل الزراعة بإضافة m. إذا تم الري من خلال الفتحات، أضف 5-10 مل من الماء إلى السطح.
    11. سجل كتلة صناديق الجذور المروية التي تحتاجها لري النباتات أثناء نمو النبات.
  2. زراعة وإدارة النباتات12,26
    1. قم بتعقيم البذور قبل الإنبات أو الزراعة. من الممارسات الشائعة وضعها في 70٪ إيثانول لمدة 3 دقائق ثم في 1٪ NaClO لمدة 15 دقيقة لمنع نمو الفطريات. ثم شطف البذور بماء منزوع الأيونات (حوالي 6─7 مرات).
    2. قم بنبات البذور مسبقا بين أوراق الترشيح أو لفائف الإنبات المبللة بالماء أو 0.05 ملم مول L−1 CaSO4 حتى يخرج الجذر.
    3. انقل شتلة واحدة إلى كل صندوق جذور، وضعها بالقرب من الطبق الأمامي، غطها بقليل من التربة، ثم أضف بعض الماء.
    4. لف صناديق الجذور بورق الألمنيوم لمنع الانخفاض الكيميائي الضوئي في الغلاف الجذري، ومنع نمو الطحالب والكائنات الدقيقة الأخرى التي تقوم بالتمثيل الضوئي، بالإضافة إلى تجنب إجهاد الجذور عند تعرضها للضوء. بدلا من ذلك، تتوفر صفائح أمامية سوداء لا تسمح بمرور الضوء ويمكن استخدامها بدلا من رقائق الألمنيوم.
    5. ضع صناديق الجذور على رف لتكون صناديق الجذور مائلة في غرفة النمو أو الدفيئة مع تحكم في درجة الحرارة، والرطوبة النسبية، وشدة الضوء. نوصي بميل 25°─35°.
    6. سقي صناديق الجذور بشكل جاذبي على الأقل مرتين وثلاث مرات في الأسبوع، حسب احتياجات النبات. يتم ذلك عن طريق وزن صناديق الجذور وإضافة الماء لتعويض الفرق عن الوزن المسجل في الخطوة 1.2.11. ومع ذلك، عندما تكون الكتلة الحيوية للنبات كبيرة ويزداد الطلب على المياه، يجب أخذ الكتلة الحيوية في الاعتبار، ويجب تعديل حجم الري وفقا لذلك.
    7. تجرى ممارسات إدارة المحاصيل المحددة (مثل التسميد) وفقا للإعداد التجريبي، وخصائص التربة، وأنواع النباتات المزروعة، والاحتياجات السائدة لمكافحة الأمراض والآفات أثناء نمو النبات.
    8. تعتمد فترة النمو وأخذ عينات إفراز الجذور بشكل كبير على حجم صناديق الجذور وأنواع النباتات وأهداف الدراسة.

3. أخذ عينات من إخراج الجذور 12,26

ملاحظة: هنا نقدم تفاصيل حول أخذ عينات غير مدمرة من إفرازات الجذور. تأكد من تجهيز جميع المواد المطلوبة قبل أخذ العينة وأن الفراغات التجريبية مدرجة أثناء أخذ العينات. التفاصيل المتعلقة بالمواد والمواد الكيميائية مدرجة في جدول المواد.

  1. قم بخفض محتوى الماء في صناديق الجثور تدريجيا إلى 90٪─95٪ من ال WHC (80٪ للمحاصيل شديدة الحساسية لإجهاد الأكسجين) في يوم واحد أو على الأقل ساعتين قبل أخذ العينة. يمكن تحقيق ذلك بدقة من خلال حساب كمية الماء المراد إضافتها (mw اضافة) في الخطوة 2.1.9 باستخدام 90٪─95٪ WHC، ثم إعادة حساب الوزن الكلي لصندوق الجذور والتربة الرطبة وتقدير وزن النبات. باستخدام توازن، أضف ماء منزوع الأيونات حتى يصل صندوق الجزي إلى الوزن المعاد حسابه.
  2. افتح ورق الألمنيوم من صندوق الجذور، حدد ورسم المنطقة محل الاهتمام على اللوحة الأمامية. هذه الخطوة مطلوبة فقط إذا كان من المقرر أخذ عينات فقط من أجزاء الجذور أو النباتات الصغيرة.
  3. اقطع رقائق بلاستيكية وهيدروجيل ZrOH (راجع الخطوة 1.3) إلى الأبعاد المحددة حسب المنطقة المعنية وحجم صندوق الجذور. إذا لم يتم تركيب غشاء النيوكليوبور أثناء عملية التعبئة، قم بقصه إلى الأبعاد المطلوبة، أكبر قليلا من الهيدروجيل ZrOH.
  4. ضع صناديق الجذور على حامل مسطح مع مواجهة اللوحة الأمامية القابلة للإزالة للأعلى وافتحها بحذر (انظر الشكل 2A). أخرج ورق الألمنيوم البلاستيكي ببطء مع التأكد من عدم إزعاج الجذور والتربة.
  5. ضع المسطرة على منطقة الاهتمام والتقط صورا عالية الدقة، والتي ستكون ضرورية لمعالجة البيانات لاحقا. تعمل المسطرة كمرجع لتحديد الحجم بدقة مباشرة من الصورة أثناء المعالجة، خاصة إذا كان لا بد من أخذ عينات من العديد من صناديق الجذور.
  6. أضف كمية صغيرة من الماء إلى منطقة الجذر المستهدفة حتى يظهر طبقة ماء رقيقة على السطح (انظر الشكل 2B). يسهل محتوى رطوبة أعلى (يفضل 90٪–95٪ WHC أو 80٪ للمحاصيل شديدة الحساسية لإجهاد الأكسجين) في التربة تلامسا جيدا بين التربة والجل أثناء أخذ العينات. يشترط وجود نسبة رطوبة أعلى لتدفق الجزيئات باستمرار إلى الهيدروجيل.
  7. ضع غشاء النواة المقصوص مسبقا مباشرة على سطح التربة/منطقة الجذر المعنية، وتأكد من استبعاده بشكل مسطح على واجهة التربة مع الجذر (انظر الشكل 2C).
  8. ضع الهيدروجيل ZrOH مباشرة وبأكبر قدر ممكن على غشاء النواة في المنطقة المعنية، والتقط صورة مع المسطرة الموضوعة على الجانب الأيسر من الهيدروجيل ZrOH (انظر الشكل 2D). يمكن للمسطرة المساعدة في تحديد حجم الهيدروجيل ZrOH، وفي حال حدوث أي تغييرات في خصائص ZrOH، وتحديد الجوانب أثناء التخزين المطول (>سنة واحدة).
  9. حماية الهيدروجيل ZrOH من اللوحة الأمامية عن طريق وضع رقائق بلاستيكية على الهيدروجيل ZrOH (انظر الشكل 2D).
  10. أغلق صندوق الجذور بلطف لتقليل حركة الهيدروجيل ZrOH. يمكن أيضا تحقيق حركة قليلة للهيدروجيل ZrOH عند إغلاق صندوق الجثور عن طريق تثبيت ساندويتش الهلام (غشاء النواة + الهيدروجيل ZrOH + رقائق البلاستيك) على صفيحة أمامية نظيفة من صندوق الريزوفيك باستخدام شريط كهربائي من الفينيل، كما وصفه فاغنر وآخرون26.
  11. لف صندوق الجذور بورق الألمنيوم مرة أخرى وأعده إلى غرفة النمو/الدفيئة لمدة 24 ساعة. يمكن جمع إفرازات الجذور لفترات أطول أو أقصر، بشرط ألا يجف الهلام، وذلك حسب الإعداد التجريبي وأهداف الدراسة.
  12. بعد فترة التطبيق، افتح صندوق الجذور برفق، أزل الشريط والغشاء بعناية، واستخرج الهيدروجيل. ضع الهيدروجيل في كيس معقم محكمة الإغلاق، أضف بضع قطرات ماء قبل الإغلاق، ثم خزن في الثلاجة (4 درجات مئوية) حتى يتم تحليله. خزن الجل الفارغ بطريقة مشابهة لجهاز التحكم. لأغراض رسم الخرائط ثنائية الأبعاد، ارفع الهيدروجيل ZrOH مع ورقة بلاستيكية وحدد السطح العلوي.
  13. قم بإزالة الجذور وتحديد معايير الشكل للجذر، وزنه الطازج، والوزن الجاف لتطبيع بيانات الإفرازات إذا لم تجر تجارب حل زمني.
  14. أغلق صندوق الجثور وضعه مرة أخرى في غرفة المناخ أو الدفيئة إذا أجريت دراسات محددة زمنيا.

4. الإزالة وقياس الكربوكسيلات12

ملاحظة: يتطلب إعداد الفراغات والمعايير المعالجة من المياه الطازجة من الدرجة الأولى في المختبرات ومعايير تحليلية عالية النقاء لتحضير الفراغات والمعايير. كضمان جودة، يجب استخدام معايير مراقبة جودة معتمدة. تأكد من أن المحاليل (العينات والمعايير) خالية من الجزيئات عن طريق ترشيح العينات عبر مرشحات نايلون بقياس 0.2 ميكرومتر أو 0.45 ميكرومتر قبل التحليل لمنع انسداد الأنابيب. تفاصيل المواد والمواد الكيميائية مدرجة في جدول المواد.

  1. قم بإزالة الهيدروجل المحملة والفارغة من الثلاجة، وقس الأبعاد باستخدام مسطرة، ثم احسب حجم كل منها باستخدام سمك 0.4 مم لفاصل 0.25 مم و0.64 مم لفاصل 0.4 مم. لرسم الخرائط ثنائية الأبعاد، قم بقص الهيدروجيلز ZrOH إلى الحجم المطلوب باستخدام شفرة حلاقة نظيفة. ضع في اعتبارك أن الحد الأدنى حوالي 2 × 2 مم بسبب صعوبة قطع القطع الصغيرة والتعامل مع أحجام الإزالة المناسبة.
    ملاحظة: بدلا من المسطرة، استخدم ورق رسم بياني (ورق رسم بياني مليمتري) على جانب واحد من صفيحة البليكسي جلاس المستخدمة في القطع، مما يسهل قطع الهيدروجيلز ZrOH إلى قطع شبه مثالية. تم تأكيد سماكة الهيدروجيلز من ZrOH باستخدام كاليبر فيرنييه.
  2. ضع الهيدروجيل من ZrOH أو قطع الهيدروجيل ZrOH في قوارير بلاستيكية، ثم قم بإخراجها بإضافة 0.5 مول L-1 NaOH باتباع نسبة 1 مل من المحلول لكل 0.196 سم3 ZrOH هيدروجيل، ثم اهتز على هز لوح لمدة 24 ساعة عند 150 دورة في الدقيقة.
  3. في حال كان حجم الإزالة منخفضا في حالة قطعة هيدروجيل ZrOH صغيرة جدا (مثل 2 × 2 مم)، أضف ماء من الدرجة الأولى في المختبر حسب الوزن للوصول إلى 45-60 ميكرولتر، حسب الحد الأدنى للحجم المطلوب للطريقة التحليلية المستخدمة لقياس الكربوكسيلات (على سبيل المثال، IC-MS يحتاج على الأقل 45 ميكرولتر من العينة للسامبلر الذاتي، حسب الجهاز). سجل الكمية الدقيقة من الماء المضافة لجعل الحجم يصل إلى 45-60 ميكرولتر، حيث سيكون ذلك مطلوبا لعامل التخفيف وحساب التركيز الفعلي.
  4. قم بترشيح العينات (فلاتر نايلون بحجم 0.2 ميكرومتر أو 0.45 ميكرومتر) ونقلها إلى القوارير. نوصي باستخدام قوارير IC بلاستيكية بسعة 1.5 مل لأنها يمكن تجميدها دون أن تنكسر. يمكن أيضا استخدام قوارير 330 ميكرولتر للأحجام الصغيرة، لكن يجب توخي الحذر لضمان عدم وجود فقاعات هواء.
  5. يتم قياس كمية كروبوكسيلات محلول الإزالة باستخدام الطريقة التحليلية المفضلة (مثل IC-MS، HPLC). نوصي بفصلها باستخدام IC مع كشف التصلب المتعدد. بدلا من ذلك، يمكن استخدام الكروماتوغرافيا السائلة عالية أو فائقة الأداء (HPLC أو UHPLC) مع عدة كواشف، بما في ذلك MS المتقدم (مثل كواشف وقت الطيران أو Orbitrap) أو الكواشف المطيعية الضوئية.
  6. في نهاية القياس، يمكن تخزين العينات، مع المعايير، في الفريزر. نوصي بتخزين جميع المحاليل التي تحتوي على الكربوكسيلات عند -20 درجة مئوية لمدة سنة قصوى. لفترات التخزين التي تزيد عن سنة، يمكن إعداد معايير جديدة وقياسها كفحص جودة.
  7. احسب الكمية الإجمالية لكل كربوكسيلات في الحجم الكلي للإلوات (أي حجم NaOH + حجم الهيدروجيل + ماء مضاف) وقم بتطبيعه حسب وزن الجذر أو مساحة الجذر، واضرب في عوامل كفاءة التفريغ: 0.94 للأكونيتات، 1.00 للسترات، 0.90 للفومارات، 1.02 للاكتتات، 1.05 للمالات، 0.91 للأكسالات و1.00 للسكسينات (انظر الجدول التكميلي 1). تأكد من أخذ عوامل التخفيف في الاعتبار إذا تم إجراء أي منها أثناء الإزالة والقياس.

5. رسم الخرائط ثنائي الأبعاد

ملاحظة: لا يوجد برنامج محدد لإنشاء صور ثنائية الأبعاد لبيانات الإفراز. يمكن إجراء التعيين باستخدام Microsoft Excel وPython.

  1. أدخل البيانات التي تم الحصول عليها في الخطوة 4.7 من كل قطعة جل في الخلية المقابلة داخل الشبكة ثنائية الأبعاد (صفوف × أعمدة). يتم توليد الشبكة فوق الصور الملتقطة من الجذور أثناء أخذ العينات (انظر الخطوة 4.1).
  2. حدد حجم الشبكات وتحقق من تطابق البيانات.
  3. اختر مقياس الألوان وحدد رموز الألوان التي تمثل أدنى وأعلى القيم.
  4. حدد نطاق البيانات الرقمية للرمز لضمان تطابقه بدقة مع المقياس المختار.
  5. أنشئ خريطة حرارة وتأكد من عدم وجود تسميات أو خطوط شبكة. يمكن إنشاء خريطة الحرارة بسهولة في برنامج R باستخدام مثال R Script المرفق في الملف التكميلي 1.
  6. يعالج الصورة ويضعها بجانب صورة الجذور التي تم الحصول عليها أثناء أخذ العينات لتتمكن من تفسير التوزيع المكاني للكربوكسيلات.
    ملاحظة: اليوم، يمكن أيضا إجراء التعيين باستخدام أدوات الذكاء الاصطناعي. الإجراء بسيط: ببساطة انسخ والصق الشبكة الرقمية من إكسل في الدردشة، ثم اطلب خريطة حرارية بأبعاد قطعة الجل المطلوبة ومقياس اللون للخط. ضع في اعتبارك أن الناتج قد لا يكون مثاليا دائما من المحاولة الأولى، لكن تكرار العملية عادة ما يعطي نتائج دقيقة. يوفر هذا النهج ميزة كونه أسرع بكثير من الطرق اليدوية.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تطوير طريقة الهيدروجيل ZrOH في البداية لأخذ عينات السيترات من جذور النباتات المزروعة في التربة واستخدمت بنجاح لحل التوزيع المكاني للإفراز11. قبل اعتماد هذه الطريقة للكربوكسيلات الأخرى، قمنا بتوصيف الهيدروجيلات ZrOH لضمان ملاءمتها للاستخدام مع الكربوكسيلات الأخرى أيضا (انظر الجدول التكميلي 1). بالإضافة إلى ذلك، قمنا بإزالة وتحليل الهيدروجيلات المخزنة من ZrOH المخزنة من تجربة ريزوبوكس أجريت في 2019. يمكن لمواد الهيدروجيلز ZrOH أن تمتص 100٪ من الكمية المحملة ضمن 5 ساعات (~0.2 ميكرومول، 10 مل) للأكونيتات، السيترات، الفومارات، اللاكتات، المالات، الأوكسالات، والسوكسنات، باستخدام نفس معايير التطهير التي وضعها تيزياني وآخرون ( 1 مل، 0.5 مول لتر-1 NaOH). يمكن لهيدروجيلات ZrOH الارتباط بما يصل إلى 3.29 ميكرومول سم-2 ± 0.40 ميكرومول سم-2 من الكربوكسيلات (انظر الجدول التكميلي 1)، وهي أعلى بكثير من تلك التركيزات (غالبا في نطاق النانومولات) الموجودة عادة في الريزوسفير (غالبا في نطاق النانومول). علاوة على ذلك، تبقى الهيدروجيلات المحملة بالكربوكسيلات ZrOH مستقرة ويمكن تخزينها لعدة أسابيع قبل التحليل، مما يقلل من التحلل الميكروبي أثناء وبعد أخذ العينة.

تظهر النتائج في الشكل 3 تصورا ثنائي الأبعاد للتوزيع المكاني لإفرازات السترات على طول جذر عنقودي لنبتة Lupinus albus L (لوبين) المزروعة في التربة ومزروعة في تربة تعاني من نقص في P. تتضمن الخريطة 48 قياسا فرديا أجريت على قطع جل بحجم 5 × 2 مم، حيث تم تقطيع جل ZrOH في أغسطس 2025 بعد أخذ عينات السترات في أغسطس 2019. من الواضح أن هيدروجيلات ZrOH امتصت بشكل فعال السترات المنبعث، مع نتائج قابلة للقياس حتى على جل صغير (0.10سم 2)، دون الحاجة إلى تركيز مسبق للسيليات. تم العثور على أعلى معدلات إفراز السترات في مناطق جذور العناقيد (حتى 2.8 نانومول سم-2 جل h-1)، مما يعادل 67.2 نانومول سم-2 هلام في اليوم الأول، بينما لوحظت أدنى معدلات على قطع الجل المتلامسة مع التربة فقط. تراوحت طول جذور العناقيد من 0.2 مم إلى 15.6 مم، مع طول إجمالي 250 مم. تؤكد هذه النتائج ملاءمة الهيدروجيلات لأخذ عينات الكربوكسيلات المفرجة من الجذور لمدة 24 ساعة. تمكنت هيدروجيلات ZrOH أيضا من الارتباط بالكربوكسيلات الأخرى مثل اللاكتات، الفومارات، المالات، والأكسالات، بالإضافة إلى السترات (الجدول 1). يشير اكتشاف معظم الكربوكسيلات من الهيدروجيلات ZrOH، التي تم تخزينها عند 4 درجات مئوية لمدة 6 سنوات، إلى تحلل طفيف للكربوكسيلات الكربوكسيليات. ومع ذلك، تجري التجارب لجمع المزيد من المعلومات بشكل ملحوظ حول الكربوكسيلات السبعة التي تم اختبارها من أنواع نباتية مختلفة.

figure-results-1
الشكل 1: خطوات حاسمة لتحضير جل البولي أكريلاميد بالبولي أكريلاميد. (أ) محاذاة مجموعة الألواح الزجاجية مع إزاحة ~1 مم. (ب) صب الجل و(ج) توزيع محلول الجل بشكل متساو داخل اللوحة من مركز اللوحة. (د) رفع اللوحة الزجاجية باستخدام شفرة حلاقة من الزاوية. (ه) نقع الجل للمساعدة في فصلها عن اللوحة الزجاجية. (و) غسل الجل إلى كأس. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-2
الشكل 2: أخذ عينات من إفراز الجذور من جزء من نظام جذور النبات المزروع في الريزوبوكس باستخدام الهيدروجيلات ZrOH. (أ) فتح صندوق الجذور بعد إزالة اللوحة الأمامية والبلاستيك. (ب) ترطيب مناسب لواجهة التربة مع الجذر باستخدام ماء منزوع الأيونات في زجاجة غسيل. (ج) غشاء نقش النواة النووي متصل بواجهة تربة-جذر رطبة. (د) صندوق الجذور مع تطبيق هيدروجيل ZrOH على المنطقة المعنية، مغطى بورق ألمنيوم بلاستيكي للحماية من اللوحة الأمامية. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-3
الشكل 3: أخذ عينات إفراز الجذور باستخدام الهيدروجيل ZrOH وصورة ثنائية الأبعاد على مقياس المليمتر لإفرازات السيترات. (أ) صورة لهيجيل ZrOH موضع فوق منطقة الجذر محل الاهتمام أثناء أخذ العينات لتوليد شبكات تستخدم للخرائط. (B) صورة ثنائية الأبعاد بمقياس المليمتر تظهر توزيع معدل إفراز السترات (nmol cm–2 gel h–1) جذر أبيض من Lupinus albus L. (لوبين) ينمو في تربة تفتقر للفوسفور. كل شبكة تمثل قطعة هلام بحجم 5 × 2 مم. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

المصنعالعلاجأكونيتاتستراتفوماراتياللاكتاتمالاتالأكسالاتسوكسينات
ملغ P كغ-1 تربةNMOL CM-2 H-1
لوبين50 0.020.210.15 0.06
لوبين250 0.020.40.170.020.2
لوبين250 0.050.310.090.010.19
لوبين0 0.030.210.150.020.1
رايس (DJ123)250 0.010.240.040.020.1
رايس (DJ123)250 0.010.390.12 0.1
الأرز (نيريكا4)50 0.010.240.35 0.09

الجدول 1: معدلات إفراز الأكونيتات، السترات، الفومارات، اللاكتات، المالات، الأوكسالات، والسوكسينات في نباتات Lupinus albus L. (lupin) وOryza sativa L. (الأرز) المزروعة في التربة التي تتعرض لتربة بجرعات 0 و50 و250 ملغ من P kg-1 . LOQ هو الحد الأقصى للقياس

الجدول التكميلي 1: معاملات الترشيح NaOH (1 مل، 0.5 مول لتر-1) (كفاءة الإزالة وعامل التصحيح) وسعة الهيدروجيل ZrOH لسبعة كربوكسيلاتات. البيانات هي المتوسطات ± الانحرافات المعيارية للمتوسط (n = 4 لكفاءة الإزالة وسعة الكربوكسيلات الفردية و n = 40 لخليط الكربوكسيليات). يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الشكل الإضافي 1: تمثيل تخطيطي لصندوق الجذور الموصى به لتسهيل الري. يتكون صندوق الجهدها من إطار صندوق جذور مزود بفتحات ري متساوية في الأسفل والخلف لتسهيل توزيع المياه بشكل متساو أثناء الري، ولوح أمامي شفاف قابل للإزالة لمراقبة نمو الجذور أثناء التجربة. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الشكل الإضافي 2: عملية تجميع صندوق الجذور وملء التربة. (أ) غط الثقوب في الجزء الخلفي من إطار صندوق الجذور بشريط لاصق. (ب) تثبيت (غشاء النواة)، ثم ورق الألمنيوم البلاستيكي على الجانب الأمامي أو المفتوح من إطار صندوق الريزوبوكس (تأكد من أنه مشدود ومسطح بما فيه الكفاية). (ج) ضع اللوحة الأمامية وثبت صندوق الجذور المشدود. (د) املأ صندوق الريزوبوكس مع إمالته نحو الأمام بحيث تسقط الجزيئات الدقيقة على السطح القابل للإزالة للحصول على سطح أملس، كما في الصورة. (ه) بدلا من ذلك، املأ إطار صندوق الجذور المغطى (A) من الجانب المفتوح، ثم تسويته مع الصفيحة القابلة للإزالة، ثم تغطيته بغشاء النيوكليوبور، وورق البلاستيك، واللوحة الأمامية. (و) الإعداد النهائي لصندوق الريزوبوكس، تم سقيه وزراعته. تم عرض إجراء ملء بديل في فاغنر وآخرون (2020). يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الملف التكميلي 1: يتضمن الملف تفاصيل عن السكريبت R المستخدم لإنشاء خريطة حرارية. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

طريقة أخذ عينات الكربوكسيلات الموضحة هنا تستخدم هيدروجيلات ZrOH، والتي يعد تحضير وتعامل الجل بشكل صحيح أمرا بالغ الأهمية. للتعامل مع هيدروجيلات ZrOH، نوصي بإبقائها رطبة بضع قطرات من ماء المختبر. أثناء التحضير، من المهم صب الجل بسرعة بعد تحضير خليط الجل (الخطوة 1.1.3) وضمان عدم تكون فقاعات بين الألواح الزجاجية. الفقاعات الموجودة في مركز الهيدروجيل ZrOH ضرورية بشكل خاص، لأنها قد تتداخل مع أخذ العينات. على النقيض من ذلك، يمكن إزالة الفقاعات من الحواف عن طريق تقليم الجل قبل التطبيق. علاوة على ذلك، ترتبط الكربوكسيلات المنبعثة من الجذور بترسب ZrOH في الهيدروجيلات، مما يجعل توزيع Zr المتساوي أثناء الهطول أمرا ضروريا. يمكن أن يؤدي توزيع Zr غير المتساو داخل الجل إلى انتشار جانبي للكربوكسيلاتات، مما يشوه توزيعها المكاني ويضعف موثوقية التموضع ثنائي الأبعاد26. يمكن تحقيق توزيع متساو ل Zr عن طريق غمر هلام البولي أكريلاميد في محلول ZrOCl2·8H2O لأكثر من ساعتين في كأس أوسع وبوضع عدد أقل من الجل12 (الخطوة 1.2.3). علاوة على ذلك، يمكن التحقق من توزيع Zr باستخدام مجهر إلكتروني ماسح (SEM، S-3400N II، هيتاشي، اليابان) كما أوصى به Guan وآخرون 14، الذين طوروا الهيدروجيلات ZrOH. ومع ذلك، فإن SEM غير ممكن كإجراء قياسي للعينات الضخمة.

خطوة حاسمة أخرى تتعلق بحشو صندوق الجذور، وتطبيق غشاء النيوكليبور، والري قبل تطبيق الجل لأخذ عينات الكربوكسيليت. يجب توخي الحذر عند ملء والتعامل مع التربة الرملية أو الطينية الثقيلة لضمان سطح أملس بشكل منتظم، وهو أمر ضروري لاتصال الجل الصحيح، مع الحفاظ على ظروف جيدة التصريف. السطح الأملس ضروري أيضا لتثبيت غشاء النواة بشكل صحيح. من الضروري إقامة اتصال جيد بين الجذر وهيدروجيل ZrOH من خلال التصق غشاء النيوكلبور بشكل صحيح بسطح التربة مع أقل فقاعات هواء. قبل تطبيق جل ZrOH، من الضروري أيضا تشبع التربة بشكل صحيح حتى يمكن تثبيت الهيدروجيل ZrOH بإحكام ومسطحا والحفاظ على رطوبته للحفاظ على سلامته أثناء أخذ العينات. عند قطع الجل لرسم خرائط الكربوكسيلات ثنائية الأبعاد، قد يكون تحقيق قص دقيق بمليمترات أمرا صعبا؛ لذلك، نوصي بعدم النزول بدقة أقل من 2 × 2 مم. بالإضافة إلى ذلك، بما أن الهلام ينكمش عند الجفاف، فمن الضروري الحفاظ على رطوبته بعد أخذ العينة للحفاظ على سلامته (الخطوة 3.12). تم تكييف الطريقة الحالية من تيزياني وآخرون 12 الذين أوصوا باستخدام NaN3 كمثبط ميكروبي لمنع تحلل الكربوكسيلات. في هذا البروتوكول، لا نستخدم أي مثبطات ميكروبية تستخدم عادة لأخذ عينات إفرازات الجذور (NaN3 أو micropur، وهي مادة مبنية على AgCl3)23، بسبب تداخلها مع الطرق التحليلية والتأثيرات المحتملة على نظام IC-MS.

حتى الآن، تم التحقق من صحة الطريقة فقط لسبعة كربوكسيلات (الأكونيتات، السيترات، الفومارات، اللاكتات، المالات، الأوكسالات، السوكسينات)، بينما يتكون إفراز الجذور من خليط معقد من المركبات (مثل الفينوليكيات، الأحماض الأمينية، الكربوهيدرات، والكربوكسيلاتات). هذه المركبات المهمة الأخرى غير محسوبة حاليا في الطريقة، ولم يتم توصيف هيدروجيلات ZrOH لأخذ العينات. وجود أوكسيانيونات أخرى في التربة (مثل الفوسفات والنترات) قد يؤثر على امتصاص الكربوكسيلات والسعة والشفافية، بالإضافة إلى قياس الكربوكسيلات على IC أو HPLC. بالإضافة إلى ذلك، أخذ عينات من أنظمة جذور كاملة كبيرة جدا من نباتات أكبر (مثل الأشجار أو الشجيرات) قد يكون تحديا كبيرا بسبب صعوبة إنتاج هيدروجيلات ZrOH الكبيرة جدا (>30 سم). ومع ذلك، فإن هذه مشكلة في جميع تقنيات أخذ عينات الإفرازات الحالية8. قيد إضافي هو استخدام صناديق الجذور. على الرغم من أن نمو النباتات في صناديق الجذور أكثر واقعية بكثير من الأنظمة المائية8، إلا أنه يبقى إعدادا اصطناعيا، مع مساحة ثلاثية الأبعاد محدودة لتطور الجذور33. علاوة على ذلك، يحدث أخذ العينات على سطح ثنائي الأبعاد، مما قد يؤدي نظريا إلى فقدان الكربوكسيلات المنبعثة في اتجاهات أخرى غير متلامسة مع الهلام. ومع ذلك، يمكن التخفيف من هذا القيد عن طريق الانتشار، وزيادة قدرة الارتباط الهيدروجيلات ZrOH للكربوكسيلات، والمحتوى العالي من الماء في تربة الريزوسفير أثناء التطبيق. ومع ذلك، هناك حاجة إلى تحقق إضافي لتحديد هذه الجوانب.

تقدم طريقة الهيدروجيل ZrOH لأخذ عينات من الكربوكسيلات المنبعثة من الجذور عدة مزايا مقارنة بالطرق الشائعة الاستخدام (أي الهجينة بين التربة والزراعة المائية والأساليب المائية). تسمح هذه الطريقة الجديدة بأخذ عينات ميدانية من الكربوكسيلات من أنظمة جذور التربة غير المتأثرة، وأخذ عينات محددة زمنيا (سانتنر، مولباخر وآخرون، بيانات غير منشورة)، ورسم خرائط ثنائية الأبعاد على مقياس mm. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام الهيدروجيلات ZrOH على الجذور لمدة لا تقل عن 24 ساعةو12 ساعة. كذلك، يجب أن يكون من الممكن أخذ عينات متكررة من نفس مقطع الجذر على فترات زمنية أطول. هذه الطريقة أكثر تطورا وتوصيفا بكثير من الطرق المشابهة، مثل تطبيق أوراق الترشيح8. يمكن أخذ عينات لفترة طويلة باستخدام الهيدروجيلات ZrOH بسبب سعة عالية من الجل للكربوكسيلات، على سبيل المثال أدنى كمية 0.44 ميكرومول سم² ± 0.04 ميكرومول سم² للمالات حتى أعلى 1.66 ميكرومول سم² ± 0.10 ميكرومول سم² للسكسينات عند pH 4.00 بإجمالي 3.29 ميكرومول سم² ± 0.40 ميكرومول سم² عند خلط الكربوكسيلات (انظر الجدول التكميلي 1). حذف خطوة غسل الجذور (التي تستغرق عادة 20-30 دقيقة لكل نبات) في طريقة الهجين بين التربة والزراعة المائية يقلل بشكل كبير من تلف نظام الجذور والاحتيازات المرتبطة به، مما يؤدي إلى بيانات أكثر واقعية وتمثيلا.

ومن الجدير بالذكر أن الهيدروجيلات المحملة من ZrOH لا تتطلب ظروف تخزين خاصة، بل فقط التبريد، ولم نجد أي تركيز مسبق ضروري بعد الغسل في تطبيقاتنا حتى الآن. ترتبط الهيدروجيلات ZrOH أيضا بأنيونات أخرى، يتم إخراجها تحت نفس الظروف ويمكن تحليلها بواسطة IC14,34. وهذا يسمح بربط إفرازات الكربوكسيلات بالتوزيع المكاني للمغذيات في الريزوسفير29.

في الختام، يعد هذا النهج الجديد في أخذ عينات من الكربوكسيلات المنبعثة من الجذور خطوة أساسية في أبحاث الجذور. نظرا لأن الكربوكسيلات تلعب دورا حيويا في تعبئة واكتساب مغذيات النباتات (مثل P، Fe) 35,36، بالإضافة إلى تجنيد الكائنات الدقيقة المفيدة، يمكن استخدام هذه الطريقة لفحص الأصناف بحثا عن صفات الجذور وتربية النباتات.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصرح المؤلفون بعدم وجود مصالح مالية متنافسة أو علاقات شخصية معروفة قد أثرت على العمل المذكور في هذه الورقة.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر الدعم المالي الممول من "مقاطعة بولزانو/بوزن ذاتية الحكم – جنوب تيرول" (المشاريع المشتركة Südtirol-DFG 2023، D-SÜD، رقم العقد 6/34، CUPI53C22003410003، DGT Exudates AG2222) ومن "المؤسسة الألمانية للأبحاث الألمانية" (DFG، رقم المشروع 525026426). كما نعترف بالدعم المالي لصندوق النشر المفتوح في جامعة بوزن-بولزانو الحرة. وبعمق الحزن، نشكر أيضا الراحل الدكتور فابيو تريفيزان، الذي كان تفانيه وخبرته ضروريين في تطوير الأساليب التحليلية وتطوير مشروع إفرازات الجذور في DGT.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
الإيثانولسيغما-ألدرتش70%
حمض الأكساليكسيغما-ألدرتش194131-250G98%
حمض الأكونيتيك العابرسيغما-ألدرتش122750-25G98%
أوكتاهيدرات أكسيد ثنائي كلوريد الزركونيوم (ZrOCl2 × 8H2O، 98٪)ثيرمو ساينتفيكA12342.2298%
حمض الستريكسيغما-ألدرتشC83155-500G99%
نترات الصوديومVWR للكيماوياترقم الدفعة: 19H224150100%
حمض النيتريك (HNO3)سيغما-ألدرتشرقم CAS: 7697-37-2>65٪ للتحليل والتسجيل والتنظيم؛ ريغ. Ph Eur، ISO
حمض الفوماريكسيغما-ألدرتش240745-100G>99٪
هيدروكسيد الصوديومسيغما-ألدرتشS8045-500G≥ 98%
بيرسلفات الأمونيوم (APS_(NH4)2S2O8)ثيرمو ساينتفيك201531000≥ 98.0٪، نقي جدا، للرحلان الكهربائي
حمض السكسينيكسيغما-ألدرتشS3674-100G≥ 99%
2-(N-مورفولينو)-حمض الإيثانيسلفونيك (MES) المخزنسيغما-ألدرتشM8250-250G≥ 99.5%
كلوريد الصوديومسيغما-ألدرتش71376-1KG≥ 99.5%
رابط متقاطعشركة DGT Research Ltd (لانكستر، المملكة المتحدة)نا2٪، مشتقة أغروز
الهزاز الصفائح أو الأفقيأي  
كروماتوغرافيا الأيونات أو IC-MSثيرمو فيشر ساينتيفكنايمكن استخدام أي كروماتوغرافيا سائلة عالية الأداء أو فائقة الأداء (HPLC أو UHPLC) مع كواشف متنوعة، بما في ذلك الكواشف المتقدمة للكروماتوغرافيا السائلة (مثل الزمن الطيران أو Orbitrap) أو الكواشف الطيفية الضوئية
مقياس الرقم الهيدروجينييمكن استخدام أي قطب حموضة مختبر
الفرنالمجلدنايمكن استخدام أي فرن صغير يحافظ على درجة حرارة معينة، ويفضل أن يكون أصغر حجما.
النايلون filters_13 مم 0.45 وميكرو؛ Mتقنية مرشح GVSرقم الدفعة: 7135431يمكن أيضا استخدام مرشحات نايلون أكبر، لكن يفضل الأصغر لأن حجم الفلات صغير.
كبريتات الكالسيوم ديهيدراتسيغما-ألدرتشC3771-1KG /CAS-No: 10101-41-4يمكن أيضا استخدام CaSO4.
محلول الأكريلاميد، 40٪جي-بيوساينسز786-508لا تستخدم محلول الأكريلاميد الممزوج ب   بيس-أكريلاميد. مركب سام يجب التعامل معه بحذر في حالة دخان.
صناديق الجذورhttps://www.rhizosphere.com/ناصناديق الجذر لدينا مصممة خصيصا بناء على تصميم Rhizosphere.com
مجموعة قنينة بولي بروبيلين، 1.5 ملثيرمو ساينتفيك79812القوارير البلاستيكية المداخلة تفضل لأنها يمكن تجميدها دون أن تنكسر. 330 وميكرو؛ يمكن أيضا استخدام L ولكن يجب توخي الحذر لضمان عدم وجود فقاعة هواء
حمض الأكونيتيك المعياريثيرمو ساينتفيكA16010.06تقني. 85٪
N,N',N',N'-
تترام ميثيل إيلين ديامين (TEMED)		سيغما-ألدرتشرقم الدفعة: BCBN1173Vمركب سام يجب التعامل معه بحذر
قوارير PP بسعة 250 ملسارستيدترقم الدفعة:2406082
رقائق الألمنيومالسوبرماركت المحلينا
Beakers_1 ل/2 لتر
المشابكالمستودع المحلينا
صفيحة زجاجية (6.1 × 17 × 0.4 سم)المستودع المحلينا
حمض الماليك L-(-)-سيغما-ألدرتشM6413-25G
معيار اللاكتات للدوائر المتكاملةسيغما-ألدرتش07096-100ML
طاولة التدفق الطبقي
حمض اللاكتيك اللامائيثيرمو ساينتفيكL13242.14
الحفر النيوكليبور Membrane_0.2 وميكرو؛ mسيتيفارقم الدفعة: A29983896
رقائق الألمنيوم/أكياس بلاستيكيةالمستودع المحلينا
الملقط البلاستيكيسيماديني602
لوحة بليكسجلاسالمستودع المحلينا
قوارير PP بسعة 30 ملمنتجع أبتاكا الصحيرقم الدفعة: 250552
PTFE spacer_0.25/0.4 مم & nbsp;https://www.krishplasticindustries.com/teflon-sheet.html
شفرات الحلاقةالمستودع المحلينا
الحاكممكتبة محليةنا
هيبوكلوريت الصوديوم (NaClO)كارلو إيربا ريكواشاترقم CAS: 7681-52-9
Syringes_1 ملليترهينكي ساس وولف (هينكي-جيت)رقم المجموعة: 22A17C8
شريط كهربائي من الفينيلالمستودع المحلينا

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

ZrOH HydrogelsRoot Exudate SamplingCarboxylate QuantificationSpatial MappingRhizobox CultivationPolyacrylamide HydrogelIon ChromatographyMass SpectrometryRoot ExudationRhizosphere Analysis

Related Articles