مقالة منهجية

طريقة تفاعل الكروماتين المرتبط بالحمض النووي الريبي الريبي (RNA) بين الحمض النووي والحمض النووي

DOI:

10.3791/70090

⸱

أبريل 30, 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Systems Biology, School of Life Sciences, Southern University of Science and Technology

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا، نقدم بروتوكولا لالتقاط تفاعلات الكروماتين المرتبط بالحمض النووي الريبي الريبي (RNA) لرسم خريطة تنظيم الجينوم ثلاثي الأبعاد المرتبط بالرنا.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

طريقة تفاعل الكروماتين المرتبط بالحمض النووي الريبي (RDD) هي استراتيجية مستهدفة لرسم خريطة تفاعلات الكروماتين متعلقة برنا معين. يحدد في الوقت نفسه المواقع الجينومية المرتبطة بالحمض النووي الريبي المعني ويحل الاتصالات طويلة المدى بين هذه المواقع، مما يمكن من استنتاج التنظيم المكاني والعلاقات التنظيمية. في RDD، تستخدم مجسات مضادة بيوتينيلة مكملة للحمض النووي الريبي المستهدف لإثراء مركبات الكروماتين الرينا. تتقاطع الخلايا، ويتجزأ الكروماتين ويصلح من النهاية، ويتم ربط القرب باستخدام رابط مصمم لربط شظايا الحمض النووي المتجاورة مكانيا داخل المجمعات الملتقطة بذلك. يتم تنقية نواتج الربط، وتحويلها إلى مكتبات تسلسل، وتحليلها بواسطة تسلسل عالي الإنتاجية لتوليد خرائط تفاعل مرتكزة بالحمض النووي الريبي. يمكن تطبيق RDD على الحمض النووي الريبي الداخلي وكذلك الحمض النووي الريبي الخارجي المستخرج من الكائنات الدقيقة والفيروسات المصابة بالمضيف، وهو متوافق مع أنواع الخلايا المختلفة والظروف التجريبية. تنتج الطريقة ملفات تلامس عالية الدقة ومحددة للمواقع مناسبة لتحليل اقتران المعزز-المروج، والتنظيم بعيد المدى، وبنية الجينوم ثلاثية الأبعاد المرتبطة بالحمض النووي الريبي المنظم وغير المشفر. من خلال دمج الإثراء الكيميائي الحيوي مع ربط القرب والتسلسل من الجيل التالي، يوفر RDD سير عمل قوي وقابل للتكرار لكشف كيفية تنظيم الحمض النووي الريبي للكروماتين وتأثيره على التعبير الجيني.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لقد حول Hi-C و ChIA-PET دراسات تنظيم الجينوم ثلاثي الأبعاد (3D) من خلال تحويل القرب المكاني بين شظايا الكروماتين إلى وصلات DNA تساهمية يمكن تسلسلها لاستنتاج الاتصالات الفيزيائية عبر المقاييس من الحلقات إلى الأقسام1،2. بعيدا عن البروتينات، تشارك العديد من الحمض النووي الريبي في تفاعلات الكروماتين، مما يؤثر على التواصل بين المعزز/المثبط-المحفز وتنظيم الكروماتين من الرتبة العليا3؛ ومع ذلك، وعلى الرغم من التقدم في الفحوصات المرتبطة بالبروتين، لا يزال من الصعب تحديد كيفية تنظيم RNA معين تفاعلات الحمض النووي والحمض النووي بعيدة المدى بين مواقعه المرتبطة. الهدف العام من طريقة تفاعل الكروماتين المرتبط بالحمض النووي الريبي المرتبط بالحمض النووي الريبي (RDD)4 هو توليد خرائط تفاعل كروماتين عالية الدقة ومبنية على الحمض النووي الريبي تكشف كيف يرتبط نوع محدد من الحمض النووي بالكروماتين وينسق اتصالات الحمض النووي النووي-الحمض النووي داخل جياه المحلي، مما يمكن من الاستنتاج الآلي حول التواصل المعزز/المثبط-المعزز وبنية الجينوم الأعلى التي تركز على ذلكال RNA 5. منهجيا، يثري RDD مركبات RNA-كروماتين المتشابكة مع مجسات مضادة بيوتينيل ضد الحمض النووي الريبي المعني، ويجري ربط قرب على المعقد باستخدام رابط مصمم لربط شظايا الحمض النووي المجاورة مكانيا، ويبني مكتبات تسلسل لإنتاج ملفات اتصال محددة بالموقع مناسبة للتحليلات القائمة على الفرضيات عبر أنواع وظروف خلايا متنوعة، بما في ذلك السياقات التي تشمل RNA بكتيري أو فيروسي خارجي في مضيفين مصابين. تضع هذه الميزات RDD كنظير مرتبط بالحمض النووي الريبي لطرق تكوين الكروموسومات المعتمدة، حيث توفر معلومات اتصال قابلة للتفسير بدقة مناسبة للتحليل التنظيمي.

ينبع مبرر RDD من محدوديات استراتيجيات رسم الخرائط القائمة بين RNA-كروماتين. تحدد طرق الالتقاط المستهدفة مثل ChIRP-seq وCHART-seq إشغال الحمض النووي على مستوى الجينوم لحمض نووي واحد فقط، وهو RNA واحد لكل نموذج DNA يبلغ عن ارتباط الحمض النووي (DNA-DNA) بين المواقع 6,7 المشغولة ولكن لا تقارن عن الاتصال الفعلي للحمض النووي (DNA-DNA). امتدت الاختبارات العالمية، بما في ذلك GRID-seq وMARGI، إلى جميع الحمض النووي الريبي إلى جميع الحمض النووي، حيث فهرست قرب RNA-DNA على مستوى الجينوم لكنها تفتقر إلى وضوح صريح لاتصالات DNA-DNA ضمن مجمعات مركزة على RNA 3,8. تسجل الطرق متعددة الإرسال مثل RD-SPRITE عن تداخل موضع من الدرجة الأعلى بين العديد من الحمض النووي الريبي ومواقع الحمض النووي وتنقل جوانب منالطوبولوجيا النووية، لكن الإشارات عادة ما تهيمن عليها وفرة الحمض النووي الريبي، مما يمكن أن يحجب الحمض النووي الريبي التنظيمي منخفض الوفرة ويحد من العمق المستهدف لشبكة تفاعل RNA واحد. استراتيجيات الإثراء المرتبط بالبروتين أو العلامات بالإضافة إلى الربط، مثل ChIA-PET10، PLAC-seq11، وHiChIP12، ترسم بشكل فعال حلقات مركزة على العوامل لكنها لا تربط التفاعلات ب RNA محدد بدون وحدة التقاط خاصة بالRNA، مما يترك بعد DNA-DNA المرتبط بالRNA غير محسوم. من خلال دمج الإثراء الكيميائي الحيوي المستهدف مع ربط القرب على المعقد، يلتقط RDD مباشرة اتصالات DNA-DNA بين شظايا الكروماتين التي يشغلها الحمض النووي الريبي المعني4، ويزيد من الحساسية والنوعية للRNA منخفضة إلى متوسطة الوفرة، وينتج خرائط اتصال محددة بدقة عالية تكمل الطرق العالمية المركزة على الإشغال (ChIRP/CHART)6,7 والطرق العالمية المركزة على القرب (GRID-seq/MARGI/RD-SPRITE)3, 8,9 مع موازاة مفاهيمية استراتيجيات الربط المستندة إلى عوامل البروتين (ChIA-PET/PLAC-seq/HiChIP)10,11,12. يجب على القراء النظر في RDD عندما يتطلب سؤال بيولوجي حل العلاقات المكانية بين مواقع الكروماتين المرتبطة تحديدا برنا مستهدف - خصوصا عندما يفترض أن هذا الحمض النووي الريبي يدعم أو يجسر أو يقيد التفاعلات الجينومية طويلة المدى لضبط النسخ - أو عند إعطاء الأولوية للأهداف التنظيمية المفترضة من مجموعة الارتباط في الحمض الريبي، مع التمييز بين المحاور المباشرة التي تركز على RNA عن مجرد التواجد مع الرينا، تحديد شبكات المعزز/المثبط للحمض النووي الريبي المحدد، أو تتبع إعادة توصيل الاتصالات المرتبطة بالحمض النووي الريبي عبر الاضطرابات أو مراحل النمو أو العدوى. في مثل هذه السيناريوهات، يعالج RDD حاجة غير ملباة من خلال تقديم معلومات تفاعلية مرتبطة بالحمض النووي الريبي (RNA) مع الحساسية والخصوصية والدقة المطلوبة للدراسات الميكانيكية الدقيقة.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظة: بالنسبة لهذه الطريقة RDD، يستخدم النظام النموذجي خلايا ذبابة الفاكهة S2 وكل من ncRNA roX2 و7SK ؛ تم سرد كواشف التفاعل في الجدول 1، وتركيبات المخزن في الجدول 2، وتفاصيل الكواشف وتفاصيل الأدوات في قسم المواد . يوفر الشكل 1 نظرة عامة على بروتوكول توليد مكتبات RDD. تستخدم الإجراءات التي تتضمن الدوران (F8) المعايير التالية: F8، 20 دورة في الدقيقة، uu20، وUU30. لجميع المخازم المستخدمة من الخطوة 2 إلى الخطوة 10، يمكنك إضافة 1x مثبط للبروتين (PI) ومثبط RNase (RI، 0.05 U/μL).

مبادئ تصميم المجسات: بالنسبة للRNA الجديد غير المبلغ عنه، يقوم تصميم المجسات عبر الإنترنت باستخدام Stellaris Probe Designer، ثم يقوم بتصفية التسلسلات غير المحددة باستخدام أدوات محاذاة (مثل محاذاة BLAST) أو UCSC BLAT، تليها بيوتينيل 3′ للمجسات المختارة. بالنسبة للحمض النووي الريبي المستهدف الجديد، تصمم تسلسلات تطابق الحمض النووي الريبي المستهدف لتكون أدوات تحكم سلبية، كما تخضع أيضا لبيوتينيل 3′. تشمل مراقبة الجودة تصميم بادئات النسخ العكسي ضد الحمض النووي الريبي المستهدف للتحقق من صحة النسخ، وبادئات موجهة للحمض النووي الجينومي ل qPCR لتقييم التلوث؛ تتضمن بادئات تحدد مواقع الارتباط الجيني والمناطق غير المرتبطة لتقييم خصوصية الربط. تم توفير مجسات متعلقة ب roX2 و7SK في الجدول 1.

1. حصاد الخلايا والربط المزدوج

  1. زراعة خلايا ذبابة الفاكهة S2 عند 27 درجة مئوية. اهدف إلى جمع ما مجموعه تقريبا 3 ×10 9 خلايا. أعد تعليق الخلايا في وسط الزراعة مباشرة، وبعد عد تريبان-بلو، أضف 8 ×10 8 خلايا في كل أنبوب طرد مركزي مخروطي بحجم 50 مل.
    1. اخلط 2 ميكرولتر من الخلايا مع 8 ميكرولتر من DPBS، أضف 10 ميكرولتر من تريبان بلو، ثم تحميل على جهاز قياس الدم لعد الخلايا.
      ملاحظة: تم تقديم خلايا ذبابة الفاكهة S2 كمثال. عادة، 8 × 10 خلايا8 تمثل حوالي 40 مل من حجم الزراعة المعالج في أنبوب مخروطي واحد بحجم 50 مل. يمكن للمستخدمين تعديل ظروف الزراعة وجمع كميات الخلايا حسب نوع الخلية المستخدمة ووفرة الحمض النووي الريبي المستهدف.
  2. أضف الفورمالديهايد إلى تركيز نهائي 1٪ (w/v) وقم بتدوير الحرارة عند 27 °م لمدة 20 دقيقة.
    ملاحظة: قم بالتثبيت عند درجة حرارة الزراعة أو عند درجة حرارة الغرفة (RT؛ 20-25°C). ما لم يذكر ذلك، قم بتدوير الخلاط (F1، 12 دورة في الدقيقة). للخلايا الملتصقة، استخدم هزاز المداري (50 دورة في الدقيقة).
    تحذير: الفورمالديهايد سام؛ استخدم غطاء أبخرة.
  3. خلايا الحبيبات عند 845 × جرام لمدة 5 دقائق عند RT؛ تخلص من المادة الفائقة إلى النفايات الكيميائية/البيولوجية المناسبة. عادة ما يكون حجم الحبيبات الخلوية من 8 × 108 S2 حوالي 1 سم3 .
  4. أعد تعليق الحبيبة في 2 ملليمول EGS محضرة حديثا إلى حجم إجمالي 40 مل في DPBS، وقم بتدوير القرص عند 27 درجة مئوية لمدة 40 دقيقة.
    ملاحظة: قم بحل EGS في DMSO ونقل إلى DPBS (انظر الجدول 2). EGS في DMSO خطير.
  5. التبريد بإضافة 2 مل من 2.5 مولار جليسين (النهائي 0.125 م); قم بالتدوير عند 27 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
  6. الحبيبات بقوة 845 × g لمدة 5 دقائق عند RT؛ تخلص من المادة الفائقة إلى النفايات الكيميائية/البيولوجية المناسبة. اغسل الحبيبات مرتين باستخدام 40 مل من DPBS المسخن مسبقا عند 27 درجة مئوية.
  7. الحبيبات بقوة 845 × g لمدة 5 دقائق. أعد تعليق الحبيبات الخلوية في 10 مل من DPBS وعد الخلايا. قد تنخفض أعداد الخلايا خلال خطوة التشابك، عادة بحوالي 30٪.
  8. Aliquot 1 ×10 9 خلايا في كل أنبوب بسعة 50 مل؛ الحبيبات عند 845 × g لمدة 5 دقائق عند RT; تخلص من السوبرناتانت. تخزين الحبيبات عند −80 درجة مئوية.
    ملاحظة: جميع خطوات الاستجابة التالية مخصصة لمكتبة RDD واحدة.

2. تحلل الخلايا ونفاذية النوى

  1. خذ 1 × 109 S2 مزدوجة الترابط من الفريزر بدرجة حرارة −80 °C. إذابته على ماء مثلج لمدة 30 دقيقة.
  2. أعد تعليق الخلايا في 50 مل من DPBS، وقم بالطرد المركزي عند 845 × جرام لمدة 5 دقائق عند RT وتخلص من السوبرناتانت.
  3. تحلل الخلية: أعد تعليق حبيبات الخلية في 20 مل من محلول تحلل FA بنسبة 0.1٪ (بدون Triton X-100). قم بتدوير الدوران لمدة 15 دقيقة. تحقق بالمجهر؛ عدل الوقت حسب نوع الخلية. يشير التحليل الناجح إلى نفاذ غشاء البلازما وإطلاق السيتوبلازم، بحيث تصبح النوى مرئية بسهولة كهياكل مميزة تحت المجهر الضوئي القياسي (الشكل 2A).
  4. نفاذية النوى: أضف 1.8 مل من 10٪ SDS (النسبة النهائية 1٪). قم بتدوير الحرارة على 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. الطرد المركزي عند 3,200 × g لمدة 20 دقيقة عند RT وتخلص من السوبرناتانت. تحقق بالمجهر (الشكل 2B)؛ عدل الوقت حسب نوع الخلية. تبدو النوى أغمق، تشبه الحجاب الغشائي، أو بعضها منفصل. كرر ذلك حتى يكتمل التحلل.
  5. غسل النواة: أعد تعليق الحبيبة في مخزن تحلل FA بحجم 20 مل 0.1٪ (بدون ترايتون X-100)، ثم قم بالتدوير عند RT لمدة 10 دقائق، ثم استخدمها الطرد المركزي عند 3,200 × جرام لمدة 20 دقيقة عند RT، تخلص من السوبرناتان، وحدد حجم حبيبات النوى. تخزن الحبيبات النووية عند −80 درجة مئوية لاستخدامها لاحقا.

3. تجزئة الكروماتين

  1. أعد تعليق حبيبات النوى في 15 مل من محلول تحلل FA بنسبة 0.1٪ (باستخدام Triton X-100). أليكوت 1.5 مل من تعليق النوى في كل أنبوب اختبار دائري قاع بقطر 14 مل، لتجنب الفقاعات.
    1. حدد حجم الحبيبات قبل السونيك للمقارنة، وكرر السونيكايشن إذا بقيت الرصاصة كبيرة بعد الصوت.
  2. سونيكيت بسعة 38٪ لمدة 4.5 دقيقة، مع دورات تشغيل 30 ثانية / 30 ثانية إيقاف. اجمع كل الكروماتين الصوتي في أنبوب وطرد مركزي بسعة 15 مل بقوة 3,200 x g لمدة 20 دقيقة عند RT، ثم انقل المادة الفائقة (~13 مل) إلى أنبوب جديد بسعة 15 مل.

4. الكروماتين المسبق مع خرز C1

  1. جهز خرزات ستربتافيدين C1: أضعه 400 ميكرولتر من خرزات ستربتافيدين C1 في أنبوب بسعة 1.5 مل (100 ميكرولتر لكل 1 ×10 9 خلايا S2)، وضعه على مغناطيس لمدة 30 ثانية، وإزالة الفائق. اغسله مرتين باستخدام 200 ميكرولتر من محلول تحلل 0.1٪ من FA (باستخدام Triton X-100)، ثم أعد تعليق في 100 ميكرولتر من محلول تحلل 0.1٪ FA (باستخدام Triton X-100).
  2. الكروماتين المسبق الشفاف: أضف 100 ميكرولتر من حبات ستريبتافيدين C1 المحضرة إلى أنبوب يحتوي على ~13 مل من الكروماتين الفائق الصوتي (من الخطوة 3.2); تدوير لمدة 20 دقيقة عند RT؛ وضعه على رف مغناطيسي لمدة دقيقة واحدة وانقل الفائق (الكروماتين المسبق) إلى أنابيب جديدة بسعة 50 مل؛ خذ 10 ميكرولتر وخزنها عند −20 درجة مئوية ل QC1 (الشكل 3A).

5. هجين مسبار الحمض النووي الريبي مع الكروماتين المصحح مسبقا

  1. أضف 2 مجلدين (26 مل) من مخزن التهجين الجاهز حديثا إلى حجم واحد (13 مل) من الكروماتين المنظف مسبقا؛ تدور 30 دقيقة في RT.
  2. أليكوت الخليط إلى ثلاثة أنابيب بسعة 15 مل؛ أضف 6 ميكرولتر من مجسات بيوتينيلية بقوة 100 ميكرومولار (أوليغونيوكليوتيد DNA، الجدول 1) لكل عينة (2 ميكرولتر لكل أنبوب 15 مل)؛ تدور عند 37 درجة مئوية خلال الليل. أغلق أغطية الأنابيب بالفيلم.

6. تثبيت المجس - مركب الكروماتين على خرز C1

  1. حجب حبات ستريبتافيدين C1 مع حاجز حاجز: خذ 400 ميكرولتر من خرزات الستربتافيدين C1 الطازجة واغسل مرتين باستخدام 800 ميكرولتر من محلول تحلل 0.1٪ FA (بدون ترايتون X-100)؛ أضف 400 ميكرولتر من مخزن الحجب وحضن على الخلاط (F8) لمدة 30 دقيقة عند RT. ضعه على مغناطيس لمدة 10 دقائق وتخلص من السوبرناتانت؛ غسل ثلاث مرات باستخدام 800 ميكرولتر من محلول تحلل 0.1٪ FA (بدون Triton X-100). في كل غسل، استخدم الماصة بلطف لتخلطها، وضعها على المغناطيس لمدة لا تقل عن 30 ثانية، ثم تخلص من السوبرناتان.
  2. أعد تعليق حبيبات C1 في 400 ميكرولتر من مخزن التهجين.
  3. ثبت مركب المسبار-الكروماتين على حبات ستربتافيدين C1: أضف حبات ستربتافيدين C1 المعالجة بمخزن العزل إلى الكروماتين المهجين المقابل وقم بتدوير لمدة 2.5 ساعة عند RT.
  4. نقل تفاعل التثبيت من أنابيب بسعة 15 مل إلى أنبوب بسعة 1.5 مل باستخدام رف مغناطيسي. ضع كل أنبوب بسعة 15 مل على رف مغناطيسي لمدة 5 دقائق؛ أزل السوبرناتانت. أعد تعليق الخرزات بمحلول غسيل بسعة 1 مل ثم انتقل إلى أنبوب جديد بسعة 1.5 مل.
  5. اغسل الخرزات خمس مرات باستخدام 800 ميكرولتر من مخزن الغسيل، ثم مرتين باستخدام مخزن TE. للغسل، أضف المخزن المؤقت (Buffer)، ثم احتضن على خلاط (F1، 12 دورة في الدقيقة) لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية، وضعه على رف مغناطيسي لمدة 30 ثانية، ثم تخلص من السوبرناتانت.
  6. ثبت الخرزات في 1000 ميكرولتر من مخزن TE (1x PI) عند RT.

7. حجب المواقع غير المشغولة على حبيبات C1 باستخدام يودوأسيتيل-PEG2-بيوتين (IPB) المغير الطبيعة

  1. إذابة 4.8 ملغ من IPB في 400 ميكرولتر من محلول الغسيل IPB؛ قم بتدوير الدوران لمدة 15 دقيقة.
  2. حل β-ME: أضف 1 ميكرولتر من β-ME إلى 312 ميكرولتر من H₂O؛ قم بالمزج والدوران على RT لمدة 15 دقيقة.
  3. إزالة طبيعة IPB: أضف 44 ميكرولتر من محلول β-ME إلى 400 ميكرولتر من IPB؛ قم بالمزج والدوران على RT لمدة 15 دقيقة.
  4. حجب خرزات C1: أضف 220 ميكرولتر من ال IPB المتحول إلى خرزات C1 المرتبطة بمركب المسبار-الكروماتين (في 1000 ميكرولتر TE)؛ قم بتدوير الدوران لمدة 15 دقيقة.
  5. اغسل خرزات C1 ب TE خمس مرات. أضف المخزن المؤقت (buffer)، ثم حضن على خلاط (F8) لمدة 5 دقائق عند RT، ثم ضعه على رف مغناطيسي لمدة 30 ثانية، ثم تخلص من السوبرناتانت.

8. إصلاح نهاية الكروماتين (على الخرز)

  1. أضف 693 ميكرولتر من خليط إصلاح النهاية إلى الكروماتين على خرز C1 وامزج جيدا؛ ثم أضف 7 ميكرولتر من بوليميراز الحمض النووي T4.
  2. حضن على الخلطة الحرارية (800 دورة في الدقيقة) عند 12 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة؛ ثم على الميكسر (F8) على 16 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
  3. اغسل الخرزات ثلاث مرات باستخدام 800 ميكرولتر من محلول ChIA-PET البارد المثلج، ثم مرة واحدة باستخدام TE. في كل غسل، استخدم الماصة بلطف لتخلطها، وضعها على المغناطيس لمدة لا تقل عن 30 ثانية، ثم تخلص من السوبرناتان.

9. ذيل الكروماتين A (على الخرز)

  1. أضف 693 ميكرولتر من خليط الذيل A إلى الكروماتين على حبات C1 وامزج جيدا، ثم أضف 7 ميكرولتر من شظية كلينو (3'-5' exo-).
  2. حضانة على الخلاط (F1، 12 دورة في الدقيقة) عند 37 درجة مئوية لمدة 50 دقيقة. اغسل الخرزات ثلاث مرات باستخدام 800 ميكرولتر من محلول التخزين البارد ChIA-PET، ثم مرة واحدة باستخدام حاجز الشفاف.

10. ربط القرب بالكروماتين (على الخرز)

  1. أضف 1,390 ميكرولتر من خليط ربط القرب إلى الكروماتين على خرزات C1. احتضن على الخلاط (F8) على RT لمدة 5 دقائق.
  2. ثم أضف 10 ميكرولتر من ليغاز الحمض النووي T4. قم بتدوير الميكسر (F8) على RT لمدة 5 دقائق، ثم انتقل إلى F1 (12 دورة في الدقيقة) عند RT لمدة 50 دقيقة، ثم 16 درجة مئوية طوال الليل.
  3. اغسل الخرزات ثلاث مرات باستخدام 800 ميكرولتر من مخزن ChIA-PET البارد جدا، ثم مرتين باستخدام مخزن TE.

11. إطلاق الحمض النووي للكروماتين المرتبط بالاقتراب من خرزات C1

  1. أضف 480 ميكرولتر من محلول التخلص من LC ChIP إلى الكروماتين على حبات C1، وامزج جيدا، وأضف 20 ميكرولتر من 20 ملغ/مل من بروتيناز K لفك الربط المتبادل.
  2. حضن على خلاط حراري (950 دورة في الدقيقة) عند 65 درجة مئوية طوال الليل.

12. تنقية الحمض النووي المرتبطة بالاقتراب (باستخدام الفينول: الكلوروفورم: كاشفات IAA)

  1. قم بتدوير أنبوب قفل الطور عالي الكثافة عند 13,500 × جرام لمدة دقيقتين عند RT. أضف منتجات مفكوكة (500 ميكرولتر) إلى أنبوب قفل الطور عالي الكثافة.
  2. أضف 500 ميكرولتر من فينول:كلوروفورم:IAA (باستخدام رأس ماصة بسعة 5 مل) إلى أنبوب قفل الطور عالي الكثافة. اخلط بلطف يدويا.
    تحذير: ارقص في غطاء بخاري.
  3. الطرد المركزي عند 13,500 × g لمدة 6 دقائق عند RT. أثناء الطرد المركزي، جهز أنبوبا بسعة 1.5 مل بإضافة 52 ميكرولتر من أسيتات الصوديوم 3 مولار (pH 5.5) إلى القاع. ضع 1 ميكرولتر من الجليكوجين مع صبغة زرقاء على الغطاء. لا تخلط أو تغلق الأنبوب في هذه المرحلة.
  4. انقل السائل الفائق بسرعة من أنبوب قفل الطور عالي الكثافة إلى الأنبوب المحضر بسعة 1.5 مل.
  5. أضف 520 ميكرولتر من الأيزوبروبانول البارد جدا إلى أنبوب 1.5 مل. اخلط برفق، ثم ضعه على -80 درجة مئوية طوال الليل.
  6. أزل الأنبوب من -80 درجة مئوية واذيب عند التيار الدائري (~10 دقائق). الطرد المركزي عند 13,500 x g لمدة ~1 ساعة عند 4 °م لترسيب الحمض النووي. سيكون هناك حبيبة زرقاء في أسفل الأنبوب.
  7. اغسل حبيبات الحمض النووي بنسبة 75٪ إيثانول وأزل السوبرناتانت بعناية. أضف 800 ميكرولتر من الإيثانول البارد بنسبة 75٪، ثم استخدم الطرد المركزي بحرارة 13,500 × جرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية، ثم أزل السوبرناتانت. كرر غسل الإيثانول مرة واحدة.
    تحذير: إزالة المادة الفائقة مباشرة بعد الطرد المركزي: أولا برأس بحجم 1 مل، ثم برأس بسعة 100 ميكرولتر. قد تزيل الأنابيب الدافئة الحبيبة الزرقاء.
  8. بعد آخر غسل بالإيثانول، قم بغسل الطرد المركزي بحرارة 13,500 x g لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية لجمع أي بقايا إيثانول في القاع، ثم إزالة الإيثانول المتبقي بعناية.
  9. جفف حبيبة الحمض النووي في فراغ (عادة من دقيقة و30 إلى دقيقتين). أعد تعليق حبيبة الحمض النووي في 10 ميكرولتر من مخزن الخروج واحتضن عند RT لمدة حوالي ساعتين. قم بقياس الحمض النووي باستخدام محدد حمض نووي وتقييم الجودة باستخدام نظام الرحلان الكهربائي الأوتوماتيكي (الشكل 3B-C).

13. وسم الحمض النووي Tn5 المرتبط بالاقتراب

  1. اختبار الوسم Tn5: جهز حجم تفاعل إجمالي قدره 50 ميكرولتر وفقا للجدول 1. في أنبوب PCR على الثلج، أضف بشكل تسلسلي 50 نانوغرام من حمض نووي QC1، وDDH₂O، و12.5 ميكرولتر من مخزن الوسم 4x. وأخيرا، أضف الكمية المطلوبة من إنزيم Tn5. اخلط بلطف عن طريق الرش بالضغط على النبرة من 10 إلى 20 مرة بعد كل إضافة، لتجنب ظهور الفقاعات. قم بتدوير الأنبوب لفترة وجيزة حسب الحاجة.
    ملاحظة: الخلط بلطف وتجنب الفقاعات أمر حاسم للوسمة. بالإضافة إلى ذلك، يجب تحسين مقدار Tn5 تجريبيا لتحقيق توزيع الشظايا المطلوب (غالبا 200 bp-1 kb)، ويمكن للمستخدمين تعديل نطاق الحجم عن طريق ضبط مدخل Tn5.
  2. تفاعل الوسم: حضانة التفاعل عند 55 درجة مئوية لمدة 10 دقائق في جهاز PCR مع ضبط الغطاء على 70 درجة مئوية، ثم حافظ على 4 درجات مئوية.
  3. إطلاق Tn5 وتنقية الحمض النووي: أضف 50 ميكرولتر من مخزن تبسيط ChIP و1 ميكرولتر من بروتيناز K إلى الحمض النووي الموسوم (للحصول على تركيز نهائي ل SDS بنسبة 0.5٪). اخلط واحتضن على الترموميكسر على 65 درجة مئوية و900 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة. قم بتنقية الحمض النووي باستخدام مجموعة تنقية الحمض النووي وقياس كمية الحمض النووي باستخدام نظام الرحلان الكهربائي الأوتوماتيكي للشعيرات الدموية (الشكل 3D).
    ملاحظة: في هذه المرحلة، يجب أن تتراوح شظايا الحمض النووي بشكل رئيسي بين 200 نقطة أساس إلى 1 كيلو بايت. يجب تحسين نسبة الإنزيم إلى الحمض النووي بين Tn5 تجريبيا.
  4. توسيع نطاق الوسم في Tn5: استنادا إلى نتائج اختبار Tn5، قم بتوسيع التفاعل للحمض النووي المرتبط بالاقتراب باستخدام نفس الظروف. بعد الوسم، أخرج العينة من جهاز PCR وضعها على الثلج. قم بتدوير الدوران لفترة وجيزة، ثم حضن عند RT لمدة دقيقتين، ثم أضف 5.5 ميكرولتر من 10٪ SDS (بدون تركيز؛ تركيز SDS النهائي: 1٪). اخلط بعمل الأنابيب للأعلى والأسفل من 10 إلى 20 مرة، مع تجنب الفقاعات، ثم لف للأسفل لفترة وجيزة. حضن العينات عند 37 درجة مئوية في جهاز PCR لمدة لا تقل عن 15 دقيقة. يمكن تخزين الحمض النووي الموسوم عند -20 درجة مئوية لعدة أيام.

14. حجب خرزات M280

  1. خذ 20 ميكرولتر من خرز M280 واغسل مرتين باستخدام 200 ميكرولتر من 1x B&W. للغسل، أضف حاجز، أعد تعليق الخرز عن طريق التنبيه، قم بالدوران لفترة وجيزة، وضع المغناطيس لمدة 30 ثانية، وإزالة السوبرناتان.
  2. حجب الخرز باستخدام مخزن الحجب: أعد تعليق خرزات M280 في 100 ميكرولتر من مخزن الحجب؛ قم بتدوير الخلاط (F8) على RT لمدة 45 دقيقة.
  3. غسل الخرز: قم بتدوير القرص لفترة وجيزة، وضعه على المغناطيس لمدة 10 دقائق، ثم تخلص من مخزن الحجب. اغسل الخرزات مرتين باستخدام 200 ميكرولتر من مفردين من مخزنا بالأبيض والأسود.
  4. حجب الخرزات باستخدام الحمض النووي الجينومي: أعد تعليق الخرزات في 100 ميكرولتر من 2x B&W، أضف 100 ميكرولتر من الحمض النووي الجيني المقصوص (~500 نانوغرام، 300-500 بيتانيجات)، اخلط جيدا، وقم بتدوير الخلط (F8) على RT لمدة 30 دقيقة.
  5. تخلص من خليط الحمض النووي الجينومي واغسل خرزات مرتين باستخدام 200 ميكرولتر من 1x بالأبيض والأسود.

15. تثبيت الحمض النووي المرتبط على خرزات M280

  1. ربط الحمض النووي المرتبط بخرزات M280: تخلص من 1x مخزن أسود وأبيض. أضف كل الحمض النووي المجزأ إلى خرزات M280، وامزج، وقم بتدوير الخلاط (F8) على RT لمدة 45 دقيقة.
  2. قم بتدوير الذراع لفترة وجيزة، وضعها على المغناطيس، وتخلص من السوبرناتانت. اغسل خمس مرات باستخدام 500 ميكرولتر من محلول الغسيل المسخن مسبقا عند 37 درجة مئوية؛ مرة واحدة ب 500 ميكرولتر من 1x بالأبيض والأبيض؛ ومرة واحدة مع 200 ميكرولتر من 1x بالأبيض والأبيض. ضعها على مغناطيس لمدة دقيقة واحدة، اخلطها بلطف في قاع الأنبوب، وتخلص من السوبرناتانت. أضف 30 ميكرولتر من محلول الإزالة إلى الخرزات (لا تخلط).
    1. للغسل، أضف المخزن المؤقت (Buffer)، ثم احتضن 5 دقائق على الخلاط (F8)، ثم ضعه على مغناطيس 30 ثانية، ثم تخلص من السوبرناتانت. يمكن تخزين الخرزات التي تحتوي على حمض نووي مرتبط عند -20 درجة مئوية.

16. تضخيم الحمض النووي المرتبط على خرزات M280

  1. جهز تفاعل PCR (وفقا لمجموعة تحضير مكتبة الحمض النووي). انقل أنابيب PCR إلى جهاز PCR وقم بإعداد البرنامج.
    ملاحظة: دورات تضخيم PCR ضرورية لجودة المكتبة النهائية؛ زيادة عدد الدورات تقلل من تعقيد المكتبة. قم بتحسين عدد الدورات تجريبيا وعموما لا تتجاوز 15 دورة.
  2. منتج تنقية PCR باستخدام خرز مغناطيسي (الشكل 3E). اختيار الحجم: استخدم (0.8-0.61) خرزات مغناطيسية للقيام باختيار مزدوج الحجم لمكتبة RDD.
    1. يجب أن تتراوح مكتبة الحمض النووي النهائية بشكل رئيسي بين 250 إلى 600 نقطة تحمل (الشكل 3F). تأكد من قياس 10-30 نانوغرام من حمض المكتبة النووي بواسطة مقياس الحمض النووي للتسلسل.
  3. التسلسل: موضوع تسلسل Illumina بمعدل 2×150 نقطة حمل. يعتمد عمق التسلسل على تعبير الحمض النووي الريبي، وكثافة مواقع الربط، والأنماط الجينومية بأكملها. هنا، يتشبع roX2 عند ~23M قراءات و7SK عند ~8M قراءات، لذا يحتاج الأخير إلى عمق أقل. ابدأ حسب النوع، ثم قيم التكرار لأي عمق إضافي: ~ 5M لذبابة الفاكهة، ~20M للبشر/الفأر، مع تعديل مقاييس مراقبة الجودة.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوضح هذا البروتوكول طريقة RDD للكشف عن تفاعلات DNA مع الكروماتين المرتبطة بالحمض النووي الريني. يبدأ سير العمل بالإثراء الكيميائي الحيوي لمجمعات RNA-كروماتين باستخدام مجسات بيوتينيلية، يليه ربط الاقتراب لربط شظايا الحمض النووي المجاورة مكانيا. بعد بناء مكتبات التسلسل، يتم إجراء تسلسل عالي الإنتاجية.

يتم تبسيط التحليل الحيوي لبيانات RDD بواسطة منصة ChIA-PIPEرقم 13. تشمل الخطوات الرئيسية في هذا المسار التحليلي: تقليم روابط التسلسل من القراءات الخام، وربط القراءات ذات الأطراف المزدوجة إلى الجينوم المرجعي، وتصفية أزواج القراءة الفريدة المحددة، وإزالة تكرارات PCR، وتعيين التفاعلات لمواقع RNA المستهدفة بناء على إحداثيات المسبار. عادة، يتم الاحتفاظ بحوالي 50٪ من القراءات المتسلسلة بنجاح بعد التصفية بنظام الرابط والجودة. ثم تم تجميع أحداث التفاعل الصالحة لإنشاء خرائط اتصال خاصة بالمواقع، مما يوفر ملفات تعريف مفصلة لبنية الكروماتين الموجهة بالحمض النووي الريبي. بالنسبة لبيانات RDD، نفذنا ثلاثة تعديلات ChIA-PIPE: تم استخدام تسلسل رابط RDD ("ACGCGATATCTTATCTGACT") بدلا من رابط ChIA-PET الافتراضي ("ACGCGATGGCTACTTGACTGACTGACT"); تم إجراء تجميع الحلقات مع امتداد PET مختصر بمقدار 50 بت إضافي بالإضافة إلى 500 بت للتحكم الافتراضي لزيادة دقة مواقع تفاعل RNA؛ وتم حساب تغطية إثراء الحمض النووي الريبي باستخدام deepTools (bamCoverage v3.5.1) باستخدام حجم حاوية 1 بيت. هذه التعديلات - تكوين الربط يقلل من توسيع PET للتجميع الدقيق، وتغطية عالية الدقة تكيف مع ChIA-PIPE لمكتبات RDD.

يعرض الشكل 4 نتائج RDD تمثيلية لاثنين من RNA غير المشفرين: roX214 (الشكل 4A,C؛ الأخضر)، وهو RNA مركب تعويض الجرعة يشارك في تنظيم بنية كروموسوم X والتعبير الجيني في ذبابة الفاكهة، و7SK15 (الشكل 4B,D؛ بنفسجي)، وهو RNA نووي صغير محفوظ للغاية يعدل استطالة النسخ عن طريق تنظيم نشاط P-TEFb في الميتازويات. يتم عرض تفاعلات ربط الحمض النووي الريبي والكروماتين التي يكتشفها RDD مع بيانات RNAPII ChIA-PET (الأقواس الزرقاء)، مما يبرز العلاقة الهيكلية بين الحلقات المرتبطة بالRNA والعناصر التنظيمية الرئيسية مثل المحفزات (P)، والمعززات (E)، ومواقع بدء أو نهاية النسخ (TSS/TES). تدعم ذروات التفاعل البارزة في البيانات المجمعة نموذجا حيث يتوسط كل من roX2 و7SK في تلامسات الكروماتين بعيدة المدى مع معزز ومروج حرج.

يتم تحقيق التحليل متعدد الأبعاد من خلال دمج التفاعلات المرتبطة ب RDD مع خرائط تكوين الكروماتين على مستوى جينوم Hi-C (خرائط الحرارة الحمراء في اللوحة السفلية) وعلامات الجينوم فوق الجينوم (H3K27ac، H3K27me3)، والنسخ الناشئ (RNA-seq)، وبيانات RNAPII ChIA-PET (الشكل 4C,D). في هذه المناطق، تظهر المجالات المرتبطة طوبولوجيا (TADs) بوضوح، حيث غالبا ما تقع حلقات الكروماتين الموجهة بالحمض النووي الريبي عند حدود TAD أو تمتد عبر عدة TADs. يتيح التوضيح الإضافي باستخدام تعديل الهيستون وبيانات النسخ التمييز بين مناطق الكروماتين النشطة وغير النشطة. تم تحديد المراكز التنظيمية الرئيسية التي تركز على RNA في الشكل.

تظهر أنماط مميزة لكل ncRNA المختلفة. يتميز roX2 بالارتباط في مناطق TES والدوران مع TSs، وغالبا ما يتمركز عند حدود TAD ويشكل اتصالات طويلة المدى يمكنها عبور عدة TADs. على النقيض من ذلك، يرتبط 7SK بشكل رئيسي بالمعززات ويشكل حلقات قصيرة المدى مع محفزات مجاورة، عادة دون عبور حدود TAD.

تؤكد هذه النتائج مجتمعة أن RDD طريقة موثوقة وعالية الدقة لتحليل تنظيم الكروماتين ثلاثي الأبعاد الخاص بالحمض النووي الريبي. يتيح هذا النهج تحقيقا مباشرا في الأدوار المكانية للحمض النووي الريبي التنظيمي في بنية الجينوم والتعبير الجيني عبر بيئات بيولوجية متنوعة.

figure-results-1
الشكل 1: مخطط سير عمل توليد مكتبات RDD. تظهر خطوات سير العمل المركزية لتوليد مكتبة RDD بالتسلسل ومصحوبة برسومات تخطيطية مقابلة. يبدأ الإجراء بالربط المزدوج وتصنيف الكروماتين، يليه التهجين باستخدام مسبار RNA معدل بالبيوتين وتثبيتها عبر الستربتافيدين. تشمل الخطوات التالية التتبع A-tailing، وربط القرب باستخدام الروابط المعدلة بالبيوتين، وبناء المكتبات. بعد ربط الحمض النووي، يتم إجراء التنقية، والتجزئة بوساطة Tn5، وتخصيب البيوتين، وتضخيم المكتبة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-2
الشكل 2: صور مجهرية تمثيلية لخلايا ذبابة الفاكهة S2 تظهر معايير مراقبة الجودة البصرية لتحلل الخلايا ونفاذها للنوى. (أ) يتميز تحلل الخلايا الناجح بنفاذ غشاء البلازما وإطلاق السيتوبلازم، مما يجعل النوى مرئية بوضوح. (ب) يشير النفاذ الناجح إلى النوى من خلال تورم الخلايا، وانفصال جزئي لغشية البلازما، ووجود نوى سليمة ومرئية بوضوح. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-3
الشكل 3: تحليل الكهروفيروجرام لتحضيرات الكروماتين. لقطة شاشة لنظام الرحلان الكهربائي الشعري يرسم عينات كروماتين مختلفة. (أ) تعرض الكروماتين المجزأ (الصوت) بحجم يتراوح بين حوالي 1000 إلى 3000 حق، مما يشير إلى نجاح التجزئة. (B) يوضح الكروماتين المرتبط بالحمض النووي الريبي (المجسات المرتبطة بالرنا + غير المرتبطة)، مع ذروة أصغر تمثل المجسات غير المرتبطة، كما يشير السهم. (ج) يظهر كروماتين مرتبط بالحمض النووي الريبي، ويظهر أيضا نطاق تركيز يتراوح بين 1000 إلى 3000 قطعة حرارة، مما يعكس مركبات بروتينات الحمض النووي الريبي. (د) يصور الكروماتين موسوم ب Tn5، كاشفا عن نطاق يدل على كفاءة الوسم. (ه) يعرض توزيع حجم الشظايا في مكتبة التسلسل بعد التضخيم، ويمتد تقريبا بين 180-1000 بيت. (و) يوضح توزيع حجم الشظايا في مكتبة التسلسل بعد اختيار الحجم، مع إثراء الشظايا بشكل رئيسي في نطاق ~250-600 بيت. تشير قيم وحدات الفلورة النسبية (RFU) لكل عينة، مما يدل على القياس الفعال لسلامة الكروماتين وحجمه. تمثل القمم البنفسجية العلامة العليا. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-4
الشكل 4: النتائج التمثيلية ل RDD لتفاعلات الكروماتين المرتبطة ب ncRNA. (أ-ب) يعرض المواقع الجينومية لارتباط ncRNA roX2 (الأخضر) و7SK (البنفسجي)، إلى جانب حلقات تفاعل الكروماتين البعيدة المقابلة. تكشف بيانات RNAPII ChIA-PET (أزرق) عن علاقة تنظيمية واضحة بين هذه ال ncRNA والتعبير الجيني، مع ذروة تشير إلى قوة التفاعل. الاختصارات: TSS = موقع بدء النسخ؛ TES = موقع نهاية النسخ؛ P = مروج؛ E = المعزز. (C-D) يقدم رؤية ذات أبعاد أعلى للعلاقة بين حلقات الكروماتين المرتبطة ب ncRNA roX2 و7SK وTADs (الأحمر)، بالإضافة إلى اختلاف حالات الكروماتين النشطة وغير النشطة ومستويات التعبير الجيني. تسلط الدوائر الضوء على المناطق التي تتفاعل فيها تفاعلات كبيرة بين الحسابات الدائمة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الجدول 1: كواشف تفاعل RDD. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.

الجدول 2: تركيبات مخزن RDD. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

خطوات حاسمة في الطريقة
تقدير كمية مجسات الحمض النووي الريبي ومستويات الحمض النووي الريبي المقابلة في الكروماتين أمر بالغ الأهمية. يمكن أن تؤدي المجسات الزائدة إلى احتلال مجسات غير مرتبطة بمواقع الستربتافيدين أثناء خطوة التثبيت، مما قد يعيق التقاط تفاعلات الحمض النووي الريبي المستهدف. بالإضافة إلى ذلك، فإن إضافة الكثير من الستريبتافيدين تهدر المواد وتتطلب المزيد من IBP المعدل لإغلاق المواقع الخالية بشكل فعال. يمكن أن يؤثر عدم كفاية الحجب سلبا على كفاءة ربط القرب اللاحق، خاصة وأن رابط الربط القرب يحتوي أيضا على تعديلات على البيوتين. إذا لم يتم تنفيذ الحجب بشكل كاف، قد ترتبط أجزاء من الرابط مباشرة بحبات الستربتافيدين، مما يعقد النتائج. علاوة على ذلك، يجب تقدير نسبة الرابط إلى الكروماتين بعناية - فالكثير من الرابط قد يؤدي إلى وسم كلا طرفي حمض الكروماتين النووي، مما يعيق الربط القريب الفعال.

تعديلات على الطريقة
في هذه الدراسة، نوضح طريقة RDD باستخدام خلايا ذبابة الفاكهة S2 مع roX2 ncRNA كمثال. تحتاج أحجام الكواشف إلى تعديل بناء على نوع الخلية ومستويات تعبير ncRNA؛ إذا كان تعبير ncRNA مرتفعا، يمكن تقليل كمية الخلية أو زيادة تركيز مجبار RNA، والعكس صحيح. على الرغم من أن هذا البروتوكول يثبت الكروماتين على الخرز، إلا أن النهج البديل يتضمن إجراء ربط قريب في الموقع يليه الإثراء بمجسات RNA.

الخصوصية، والتحكم، ومراقبة الجودة
لقد وصفنا سابقا وأكدنا RDD وأجرينا RDDs متوازية على عدة RNAs، مما أظهر خصوصية قوية؛ يمكن للقراء الرجوع إلى العمل السابق 4,16. يتطلب RDD إثراء معتمدا على المجس والموقع المحدد، ويكون قابلا للتكرار، وعند الإمكان، التحقق متعامدا. التفاعلات الحقيقية تحقق ثلاثة معايير: الإثراء في المواقع المستهدفة من قبل المجس مقابل المناطق غير المرتبطة القريبة؛ الاعتماد على المجس (غياب أو أقل بشكل ملحوظ في الضوابط السلبية); وقابلية التكرار عبر النسخ البيولوجية والتحقق المستقل (مثل RT-qPCR). تم تصميم مجسات مضادة للحساسية باستخدام Stellaris، وتم فحصها بواسطة BLAST/BLAT لإزالة الأهداف الخارجة، وطلبها ببيوتين 3'، وتم التحقق منها بواسطة RT وqPCR (بما في ذلك فحوصات تلوث الحمض النووي وتخصيب الموقع مقابل غير الموقع). نوصي بثلاثة عناصر ضبط — مجسات بدون مسبار، وعشوائية/غير مستهدفة، ومجسات RNA غير مرتبطة أو مناطق غير مرتبطة — ونقيم الخصوصية من خلال مقارنة qPCR أو تغطية التسلسل عبر عينات الهدف والضابطة، والإبلاغ عن إثراء الطي والخلفية. بالنسبة للحمض النووي الريبي منخفض الوفرة، قم بزيادة كثافة المجس (ضمن قيود خارج الهدف)، ورفع عمق التسلسل، وإجراء التحقق المتعامد.

استكشاف الأخطاء وإصلاحية في الطريقة
إذا كانت تفاعلات RNA-كروماتين الملتقطة منخفضة بشكل ملحوظ، فقد تحتاج كفاءة ربط القرب إلى تحسين من خلال تعديل كميات الرابط والكروماتين. بالإضافة إلى ذلك، لوحظت قمم عالية من المجسات غير المرتبطة من خلال الكهروميكروغرامات الشعرية التلقائية. تشير النتائج إلى إضافة عدد كبير جدا من المجسات، ويمكن تصحيحها بتقليل الكمية المستخدمة.

قيود الطريقة
ميزة رئيسية لطريقة RDD هي كفاءتها في التقاط تفاعلات محددة مرتبطة بالكروماتين مع RNA، مما يعني أن كل تجربة يمكنها التركيز فقط على RNA واحد محدد في كل مرة. علاوة على ذلك، نظرا لأن ربط القرب مصمم لاكتشاف التفاعلات الزوجية، فلا يمكن تقييم التفاعلات متعددة المواقع في نفس الوقت.

أهمية الطريقة
طريقة RDD لا تكشف فقط عن مواقع ارتباط الحمض النووي الريبي، بل توضح أيضا علاقات التفاعل بين تلك المواقع، مما يعزز فهمنا لبنية الكروماتين.

الاستخدامات العملية والإمكانات المستقبلية ل RDD
RDD مناسب لمختلف أنواع RNA المرتبطة بالكروماتين، بما في ذلك RNA المضيف الداخلي والRNA الخارجي من الفيروسات أو الكائنات الدقيقة الأخرى، مما يبرز تطبيقه الواسع في مجالات بحثية مختلفة.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

براءة اختراع (براءة اختراع صينية رقم. ZL202210182253. X) المتعلق بتقنية RDD الموصوفة في هذا البروتوكول تم منحه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد تم دعم هذا العمل بمنح من برنامج البحث والتطوير الوطني للمفاتيح في الصين (2022YFC3400400 و2022YFC3400401) والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (32170644).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
0.5 مليون توقيت شرق شرق الولايات المتحدةإنفيتروجينAM9260G
1 م أسيتات المغنيسيومسيغما-ألدرتش63052-100ML
1 M Tris-HCl pH 7.0إنفيتروجينAM9851
1 متر تريس-HCl pH 8.0إنفيتروجينAM9856
أنابيب 1.5 ملإبندورف30108051
10 مللي مولار dATPإنفيتروجين18252015
10٪ SDS (وزن/حجم)إنفيتروجينAM9822
10×؛ مخزن الذيل ANEBB7002S
10×؛ مخزن الإصلاح النهائيNEBB6002S
10×؛ مخزن ليغاز الحمض النووي T4NEBB0202S
10×؛ مخزن TBEإنفيتروجينAM9863
أنابيب اختبار ذات قاع دائري بسعة 14 ملكورنينغ352057
2×؛ مزيج PCR الرئيسيNEBM0541
20&00; مخزن SSCإنفيتروجينAM9770
200-μ أنابيب PCR Lسانغون بيوتيكF611541-0010
زجاجات تخزين PET مربعة بسعة 250 ملكورنينغ431531
2-ميركابتوإيثانول (β-ME)سيغما-ألدرتشM6250-100 مل! تحذير: بيتا؛ أنا سام؛ استخدمه دائما في غطاء بخار.
أنابيب 2 ملإبندورف22431048
3 M أسيتات الصوديوم pH 5.5إنفيتروجينAM9740
5 M NaCl إنفيتروجينAM9759
أسيتات بوتاسيوم 5 مسيغما-ألدرتش95843-100ML-F
زجاجات تخزين PET مربعة بسعة 500 ملكورنينغ431532
التوازن التحليليسارتوريوسBP211D
عداد الخلايا الآليكونترستارIC1000
نظام الرحلان الكهربائي الأوتوماتيكيالبايوبتيكC100100
المجسات البيوتينيليةجينيويزراجع <القوي>الجدول 1
مسحوق الانسدادإنفيتروجينT2015
أوليغوس ربط الجسورجينيويزراجع <القوي>الجدول 1
حاضنة CO2ثيرمو ساينتفيك51033549
كبريتات ثنائي ميثيل (DMSO)سيغما-ألدرتشD2650-100 مل
مجموعة تحضير مكتبة الحمض النووي V2 ل IlluminaفازيمTD501
مجموعة تنقية الحمض النوويزيموD4013
دولبيكو' محلول ملحي مخزن بالفوسفات (DPBS) (1&0;)جيبكو14190250
كوكتيل مثبط بروتياز خال من EDTAروش11836170001
EGS (إيثيلين جليكول بيس[succiniMidylsuccinate])ثيرمو ساينتفيك21565
مخزن الاستواءتشياغن19086
كحول الإيثيلي، نقيسيغما-ألدرتشE7023-500 مل
محلول الفورمالديهايدسيغما-ألدرتش47608-250mL-F! تحذير: الفورمالديهايد سام؛ استخدمه دائما في غطاء بخار.
الفوراميدإنفيتروجينAM9342
نظام التصوير الهلاميتانون3500R
الجلايسينإنفيتروجين50046-1 كجم
الجليكوجين مع صبغة زرقاءإنفيتروجينAM9516
خرطوشة عالية الحساسيةالبايوبتيكC105105
أنابيب قفل الطور عالية الكثافة (1.5 ملمتر)تشياغن129046
مجموعة اختبار الفلورومترية عالية الحساسية dsDNAإنفيتروجينس32851
مجموعة الفهرس V2 لجهاز IlluminaفازيمTD202
يودوأسيتيل-PEG2-بيوتين (IPB)ثيرمو ساينتفيك21334
كحول الأيزوبروبيلسيغما-ألدرتشI9030! تحذير: كحول الأيزوبروبيل سام؛ استخدمه دائما في غطاء بخار.
خرطوشة قاعدة كيلوالبايوبتيكC105106
قطعة كلينو (3'→ 5' exo-) NEBM0212L
الخرز المغناطيسيبيكمانA63881
رف الفصل المغناطيسي   لأنبوب 15 ملإنفيتروجين12301D
رف الفصل المغناطيسي   لأنبوب 2 ملإنفيتروجين12321D
رف الفصل المغناطيسي لأنبوب PCRNEBS1515S
حاضنة الأحياء الميكروبيولوجيةثيرمو ساينتفيكIMH180
المجهرنيكونإكليبس TS2
المكسرإلميRM-2L
N,N-ثنائي ميثيل فوراميد (DMF)سيغما-ألدرتش227056-100ML! تحذير: DMF سام؛ استخدمه دائما في غطاء بخار.
جهاز الطرد المركزي الدقيق غير المبردإبندورف5405000204
ماء خال من النوكليز (غير معالج ب DEPC، 1000 مل)إنفيتروجينAM9932
ماء خال من النوكلياز (غير معالج ب DEPC، 50 مل)إنفيتروجينAM9937
مقياس الحمض النوويإنفيتروجينQ33226
هزاز المدارالبلورةSYC-2102
الفينول: الكلوروفورم:IAAسولاربيولوجياP1012-100 مل
محلول البروتيناز KإنفيتروجينAM2548
الطرد المركزي المبردإبندورف22628180
الحاضنة المبردةثيرمو ساينتفيكIMP180
الطرد المركزي الدقيق المبردإبندورف5404F1621754
الثلاجةهايرDW-25L262
مثبط RNaseأمبيونAM2696
أنابيب 15 مل خالية من RNaseإنفيتروجينAM12500
أنابيب 50 مل خالية من RNaseإنفيتروجينAM12502
سونيكاتورسونيكس آند الموادVCX130
الخرزات المغناطيسية المطلية بالستريبتافيدين C1إنفيتروجين65001
خرزات مغناطيسية مغطاة بالستريبتافيدين M-280 إنفيتروجين11205D
ليغاز الحمض النووي T4  NEBM0202S
بوليميراز الحمض النووي T4NEBM0203S
درجة حموضة مخزن TE 8.0إنفيتروجينAM9849
دورة حراريةبيو-راد1851148
خلاط حراريإبندورف5382000023
ترايتون X-100أكروس أورجانيكس327371000-100 مل
فريزر فائق الحرارةثيرمو ساينتفيك995
مركز الفراغتوميMV-100

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rao, S. S. P., et al. A 3D map of the human genome at kilobase resolution reveals principles of chromatin looping. Cell. 159 (7), 1665-1680 (2014).
  2. Fullwood, M. J., et al. An oestrogen-receptor-α-bound human chromatin interactome. Nature. 462 (7269), 58-64 (2009).
  3. Li, X., et al. GRID-seq reveals the global RNA-chromatin interactome. Nat Biotechnol. 35 (10), 940-950 (2017).
  4. Tian, S. Z., et al. 3D chromatin structures associated with ncRNA roX2 for hyperactivation and coactivation across the entire X chromosome. Sci Adv. 10 (30), eado5716(2024).
  5. Rinn, J., Guttman, M. RNA and dynamic nuclear organization. Science. 345 (6202), 1240-1241 (2014).
  6. Chu, C., Qu, K., Zhong, F. L., Artandi, S. E., Chang, H. Y. Genomic Maps of Long Noncoding RNA Occupancy Reveal Principles of RNA-Chromatin Interactions. Mol Cell. 44 (4), 667-678 (2011).
  7. Simon, M. D., et al. The genomic binding sites of a noncoding RNA. Proc Natl Acad Sci. 108 (51), 20497-20502 (2011).
  8. Yan, Z., et al. Genome-wide colocalization of RNA-DNA interactions and fusion RNA pairs. Proc Natl Acad Sci. 116 (8), 3328-3337 (2019).
  9. Quinodoz, S. A., et al. RNA promotes the formation of spatial compartments in the nucleus. Cell. 184 (23), 5775-5790 (2021).
  10. Li, X., et al. Long-read ChIA-PET for base-pair-resolution mapping of haplotype-specific chromatin interactions. Nat Protoc. 12 (5), 899-915 (2017).
  11. Fang, R., et al. Mapping of long-range chromatin interactions by proximity ligation-assisted ChIP-seq. Cell Res. 26 (12), 1345-1348 (2016).
  12. Mumbach, M. R., et al. HiChIP: efficient and sensitive analysis of protein-directed genome architecture. Nat Meth. 13 (11), 919-922 (2016).
  13. Lee, B., et al. ChIA-PIPE: A Fully Automated Pipeline for Comprehensive ChIA-PET Data Analysis and Visualization. Sci Adv. 6 (28), eaay2078(2020).
  14. Meller, V. H., et al. Ordered Assembly of roX RNAs into MSL Complexes on the Dosage-Compensated X Chromosome in Drosophila. Curr Biol. 10 (3), 136-143 (2000).
  15. Egloff, S., Studniarek, C., Kiss, T. 7SK small nuclear RNA, a multifunctional transcriptional regulatory RNA with gene-specific features. Transcription. 9 (2), 95-101 (2018).
  16. Tian, S. Z., et al. Landscape of the Epstein-Barr virus-host chromatin interactome and gene regulation. EMBO J. 44 (13), 3872-3915 (2025).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة