مقالة منهجية

سير عمل حسابي قابل لإعادة إنتاج لاكتشاف الأدوية لتوحيد تحليل علم الأدوية الشبكي وتحليل الالتحام الجزيئي

462 مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/70171

⸱

أبريل 24, 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1National Institute of TCM Constitution and Preventive Treatment of Disease, Wangqi Academy of Beijing University of Chinese Medicine, Beijing University of Chinese Medicine, 2School of Traditional Chinese Medicine, Beijing University of Chinese Medicine, 3School of Traditional Chinese Medicine, Southern Medical University, 4Sunsimiao Hospital, Beijing University of Chinese Medicine

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

يوحد هذا البروتوكول الموحد علم الأدوية الشبكي والربط الجزيئي مع محاكاة الديناميكا الجزيئية (MD) لاكتشاف الأدوية. يضع معايير الفحص الكمية وخطوات قابلة للتكرار، مناسبة لفحص الأدوية متعدد الأهداف باستخدام مجموعات بيانات عامة وتحسين موثوقية النتائج.

الملخص

يتم تطبيق علم الأدوية الشبكي والربط الجزيئي على نطاق واسع في اكتشاف الأدوية، ومع ذلك غالبا ما تقوض سير العمل المجزأة والعمليات غير المتسقة قابلية تكرار النتائج. هنا، يتم وصف بروتوكول موحد يدمج هذه الأساليب في إطار قابل للتكرار لفحص الأدوية واستكشاف الآليات، مع تنظيم سير العمل إلى ثلاث مراحل متسلسلة: إعداد البيانات، التحليل الحاسوبي، والتحقق. في مرحلة التحضير، يتم تصفية مكتبات المركبات من قواعد البيانات العامة عبر معايير الامتصاص، والتوزيع، والتمثيل الغذائي، والإفراز والسمية (ADMET)، بما في ذلك التوافر الحيوي الفموي، وتشبه الدواء، والتنبؤ بالسمية، بينما يتم الحصول على أهداف علاجية محتملة من خلال التنبؤ بالأهداف ودمج قواعد بيانات مرتبطة بالأمراض لتحديد مرشحات تفاعل الأدوية مع الأمراض بشكل شامل. في مرحلة التحليل الحاسوبي، تخضع الأهداف المتداخلة لتحليلات إثراء الأنطولوجيا الجينية (GO) وموسوعة كيوتو للجينات والجينوم (KEGG) وتحليل طوبولوجي لشبكة تفاعل البروتين والبروتين لتحديد الأهداف الأساسية؛ يتم تكوين الربط الجزيئي باستراتيجيتين اختياريتين موحيدتين لهما مزايا واضحة. تستخدم الاستراتيجية التقدمية ذات الخطوتين AutoDock Vina للفحص الأولي عالي الإنتاجية لمكتبة المركبات، تليها إعادة الربط بدقة مع YASARA، مما يقضي على الإيجابيات الكاذبة من الفحص عالي الإنتاجية ويولد مجمعات بروتين-ليغاند متوافقة أصليا مع محاكاة ديناميكا جزيئية YASARA اللاحقة لتجنب الانحرافات الهيكلية الناتجة عن تحويل التنسيقات عبر البرمجيات. تكمل الاستراتيجية ذات الخطوة الواحدة عملية الالتحام الكاملة عبر YASARA فقط، مما يبسط سير العمل التشغيلي، ويحسن كفاءة التجارب، وينطبق بالكامل على أهداف بحثية محددة. في مرحلة التحقق، تقوم محاكاة MD الموحدة بتقييم استقرار مركب الليغاند-البروتين عبر مقاييس أساسية لمتوسط الجذر التربيعي (RMSD) وتذبذب متوسط الجذر التربيعي (RMSF). يعزز هذا الخط الموحد والقابل للتكرار موثوقية علم الأدوية الشبكي ودراسات الالتحام ويسهل المقارنات بين الدراسات في اكتشاف الأدوية الحاسوبية.

المقدمة

يمثل علم الأدوية الشبكي نهجا بحثيا يفك رموز أنماط التفاعل بين الأدوية والكائن الحي من منظور شبكة شاملة. 1. من خلال بناء وتحليل شبكة التفاعل التي تشمل مسار الدواء-المكون-الهدف-المرض-البيولوجي، يحدد كمي الجزيئات الرئيسية، والمسارات الأساسية، والآليات التآزرية التي تمارس من خلالها الأدوية تأثيرها. يتماشى هذا الإطار التحليلي مع المعيار الدولي لعلم الأدوية الشبكي، الذي يركز على تكامل بيانات الوسائط المتعددة وتحليل الشبكات الطوبولوجية، ويوضح في النهاية التأثيرات العلاجية العامة للأدوية، ويتنبأ بالآثار الجانبية المحتملة، أو يوفر إرشادات منهجية لتطوير الأدوية الجديدة. تم تطبيق هذه الاستراتيجية بنجاح في مجالات متنوعة، بما في ذلك فك رموز مسارات الإشارات المرتبطة بالبروتينات المستهدفة للأدوية المضادة للالتهابات غير الستيرويدية ضد كوفيد-19، واستكشاف آلية عمل علاج أمراض مثل الساركوما العظمية والسكري من النوع الثاني 2,3,4. تدفع هذه الميزة التحول الجذري من اكتشاف الأدوية ذات هدف واحد إلى اكتشاف دواء متعدد الأهداف في علم الأدوية الحديث.

الالتحام الجزيئي هو تقنية محاكاة حسابية تستخدم النمذجة الخوارزمية لتقييم التوافق المكاني وقوة التفاعل بين المركبات الصغيرة والأهداف الجزيئية الكبيرة البيولوجية، مما يتنبأ بتكوينات الارتباط المثلى 5,6. قدم موريس وآخرون AutoDock4 و AutoDockTools4، اللذان يمكنان الالتحام الآلي مع مرونة مستقبلات انتقائية؛ تعتمد هذه الأدوات على ديناميكا الجزيئات والهندسة الجزيئية، وتقيم استقرار الارتباط والألفة من خلال حساب فروق الطاقة بين الجزيئات7. تستخدم الأدوات الكلاسيكية مثل AutoDock نمذجة مستقبلات الليغاند شبه المرنة وأصبحت معيارا ذهبيا لتقييم ألفة الارتباط في مثل هذه المحاكاة7.

في اكتشاف الأدوية، تستخدم تقنيات فحص الدواء الشبكي بشكل متكرر لتحديد المكونات الرئيسية، والتي يتم التحقق منها من خلال الربط الجزيئي لتقييم ارتباطها بالبروتينات المستهدفة، مما يثبت في النهاية العلاقة بين الدواء والمرض8. ومع ذلك، تعاني التطبيقات الحالية غالبا من عدم اتساق تصميم التجارب، وإجراءات تشغيلية غير موحدة، وخطوات تحقق مفقودة. وقد وثق التقييم المنهجي لدراسات علم الأدوية الشبكي المتعلقة بالطب العشبي هذه المشكلة الواسعة الانتشار، مشيرا إلى أن تباين البيانات عبر قواعد البيانات وعدم كفاية التحقق التجريبي يؤدي إلى نتائج غير قابلة للتكرار9. هذه القيود لا تقوض فقط قابلية التكرار وموثوقية نتائج البحث، بل تعيق أيضا تحويل التنبؤات الحسابية إلى التحقق التجريبي. على عكس دراسات علم الأدوية الشبكي المعزولة التي تفتقر إلى التحقق التجريبي أو سير عمل الالتحام المجزأ بمعايير عشوائية، يدمج هذا البروتوكول كلا النهجين مع عتبات موحدة وعمليات خطوة بخطوة. هذا الإطار يلغي اختيار المعلمات الذاتية، مما يضمن إمكانية تكرار سير العمل من قبل مشغلين مختلفين بنتائج متسقة.

لذلك، فإن وضع إجراءات تشغيلية موحدة لتحديد الأهداف الدوائية المحتملة والمسارات من خلال فحص الدواء الشبكي، إلى جانب الالتحام الجزيئي للتحقق من نشاط ارتباط الدواء بالهدف، يمكن أن يوفر أدلة تجريبية لدراسة آليات عمل الأدوية وفحص الأدوية المرشحة10. هذا البروتوكول مناسب بشكل خاص للفحص متعدد الأهداف لمكونات الأدوية والجزيئات الصغيرة الاصطناعية باستخدام قواعد بيانات الأوميكس والكيميائية وبنية البروتين المتاحة للجمهور؛ ولا ينطبق على الأهداف التي لا تحتوي على هياكل بلورية محلولة، أو على فحص الأدوية اليتيمة ذات الهدف الواحد التي لا توجد شبكات تفاعل مرتبطة بالمرض معروفة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

يتضمن هذا البروتوكول فقط التحليلات الحاسوبية لقواعد البيانات المتاحة للجمهور ولا يتضمن استخدام البشر أو الحيوانات الفقارية أو الأنسجة البيولوجية. جميع سير العمل الملخص الموضح في هذا القسم موضح في الشكل 1.

figure-protocol-1
الشكل 1: ملخص سير العمل. المستطيلات الخضراء تمثل مكونات الأدوية البديلة، والمستطيلات الحمراء تمثل الأمراض، والقطع الناقص الأصفر يحتوي على المواقع الإلكترونية والبرمجيات المستخدمة، والمستطيلات البرتقالية تحتوي على الملفات أو البيانات التي تم الحصول عليها، بالإضافة إلى الخطوات الرئيسية، والألماس البنفسجي يمثل النتائج النهائية المطلوبة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

1. الحصول على مكونات وأهداف الأدوية

  1. ابحث في قاعدة بيانات PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/) باستخدام الأسماء الكيميائية ككلمات مفتاحية للحصول على سلاسل SMILES (نظام إدخال الخط المبسط للإدخال الجزيئي) المقابلة.
  2. قم بالدخول إلى موقع ADMETlab 3.0 (https://admetlab3.scbdd.com/)، واختر خيار تقييم ADMET تحت تبويب الخدمات، وأدخل سلاسل SMILES، ثم اضغط على زر الإرسال .
  3. تصفية نتائج ADMET بناء على المؤشرات: الامتصاص، التوزيع، الأيض، الإخراج، السمية، الكيمياء الطبية، وقواعد السموم فقط. احتفظ فقط بالمركبات التي تستوفي جميع معايير العتبة المحددة مسبقا لكل مؤشر (الجدول 1).
  4. ادخل إلى موقع ProTox 3.0 (https://tox.charite.de/protox3/index.php?site=home)، وأدخل سلاسل SMILES للمركبات المفلترة، واختر وحدة TOX PREDICTION ، وحدد جميع خيارات التنبؤ المطلوبة (مثل سمية الأعضاء، أو مسرطنتها)، وقم بإجراء التنبؤ.
  5. استبعاد المركبات التي تحمل سمية متوقعة تتجاوز حدود السلامة المحددة مسبقا بناء على نتائج ProTox 3.0 (الجدول 2).
  6. تجميع المركبات التي تجتاز فحص ADMET وProTox 3.0 في قاعدة بيانات مكونات دوائية منظمة (مثل Excel أو CSV) مع أعمدة لاسم المركب، وSMILES، وحالة الفحص.
  7. ادخل إلى موقع SwissTargetPrediction (https://swisstargetprediction.ch/)، واختر Homo sapiens من قائمة الكائنات المنسدلة، وأدخل سلاسل SMILES لمكونات الدواء في قاعدة بيانات مكونات الدواء، واضغط على زر توقع الأهداف ، واجمع جميع الأهداف المتوقعة التي يكون لديها درجة احتمالية أكبر من 0.
  8. ادخل إلى موقع SEA (نهج مجموعة التشابه) (https://sea.bkslab.org/) وأدخل نفس سلاسل SMILES المستخدمة أعلاه للتنبؤ بالأهداف، وقم بتصفية النتائج لتحتفظ فقط بالمدخلات في حقل المفتاح المستهدف التي تنتهي ب _Human وقيمة p أقل من 0.05.
  9. دمج قوائم الأهداف التي تم الحصول عليها من SwissTargetPrediction وSEA في مكتبة أهداف واحدة لتأثير الأدوية. إزالة الأهداف المكررة وتوحيد أسماء الأهداف إلى رموز جينية رسمية (مثل استخدام إرشادات HGNC) عبر Uniprot (https://www.uniprot.org/).
    ملاحظة: يمكن حفظ مكتبة أهداف الدواء كملف CSV لاستخدامها لاحقا.

الجدول 1: معايير الحد الأدنى ADMETlab 3.0 لفحص سلامة الأدوية. يلخص الجدول قيم القطع الموصى بها ونتاۋات التصنيف للخصائص الفيزيائية الكيميائية الرئيسية، ومعايير ADME، وتفاعلات الأيض، ونقاط نهاية السمية، ومسارات السمية، وقواعد السمية. تصنف التنبؤات إلى ثلاثة مستويات خطر (منخفضة، متوسطة، وعالية) بناء على قيم الاحتمالية (< 0.3، 0.3 - 0.7، > 0.7) أو نطاقات كمية، مما يتيح التقييم المنهجي لملفات سلامة المركبات أثناء اكتشاف الأدوية المبكر. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.

الجدول 2: معايير عتبة ProTox-3.0 لتوقع السمية في اكتشاف الأدوية. يلخص الجدول نقاط السمية الرئيسية التي تنبأ بها ProTox 3.0، مع التركيز على المعايير الحيوية لتقييم سلامة الأدوية أثناء اكتشاف الأدوية المبكر. كل نقطة نهاية تعيد تصنيفا ثنائيا (نشط أو غير نشط) مصحوبا بدرجة احتمالية (0-1)، حيث يشير نشط إلى خطر محتمل للسمية. يجب إعطاء الأولوية لسمية الأعضاء (سمية الكبد، سمية القلب)، ونقاط نهاية السمية (السرطانية، الطفرات، السمية المناعية)، وتثبيط أيض CYP، حيث أن هذه هي الأسباب الرئيسية للاستنزاف السريري. تشير الضربات الفعالة المتعددة عبر نقاط النهاية إلى إمكانية سمية واسعة وتستدعي تقليل الأولوية للمركبات. يتم تقييم السمية الحادة من خلال تصنيف LD50 وGHS المتوقعين، مع اعتبار الفئة 1 - 3 (< 300 ملغ/كجم) شديدة السمية. توفر درجات الاحتمالات مستويات ثقة لكل توقع. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.

2. الحصول على أهداف الأمراض

ملاحظة: عند فحص قواعد البيانات، قم بتوحيد قواعد تسمية الجينات المستهدفة لمنع الإغفالات الناتجة عن اختلافات في التسمية.

  1. الوصول إلى خمس قواعد بيانات متعلقة بالأمراض: OMIM (https://www.omim.org/)، Disgenet (https://disgenet.com/)، TTD (https://ttd.idrblab.cn/)، GeneCards (https://www.genecards.org/)، وPharmGkb (https://www.pharmgkb.org/). طبق معايير الفحص الخاصة بقاعدة البيانات التالية: بالنسبة لبطاقات الجينات، قم بتصفية الإدخالات ذات درجة الصلة ≥ 1.0؛ في DisGeNET، اختر الإدخالات المرتبطة بالمرض المستهدف؛ في PharmGKB، اقتصر النتائج على الإدخالات المتعلقة بالجينات باختيار خيار الجين ؛ أما بالنسبة ل TTD، فاحتفظ بالإدخالات التي يتطابق فيها عمود المرض مع المرض المستهدف.
  2. لكل قاعدة بيانات، استخدم الاسم الرسمي للمرض المستهدف (مثل مرض الزهايمر) ككلمة بحث لاسترجاع جميع الأهداف المرتبطة.
  3. قم بتجميع قوائم الأهداف من جميع قواعد البيانات الخمسة في جدول بيانات واحد. إزالة الأهداف المكررة عن طريق مقارنة رموز الجينات عبر القوائم.
  4. توحيد جميع أسماء الأهداف المتبقية إلى رموز جينية رسمية عبر Uniprot لحل تناقضات التسمية. حفظ القائمة الموحدة وغير المكررة كمكتبة أهداف للأمراض (بصيغة CSV أو Excel).
    ملاحظة: يمكن حفظ مكتبة هدف المرض جنبا إلى جنب مع مكتبة هدف الدواء-الفعل (الخطوة 1.9) لاستخدامها لاحقا في الخطوة 3.

3. اكتساب أهداف شائعة لأمراض الأدوية

  1. الوصول إلى أداة الويب Venny 2.1.0 (https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/). استيراد مكتبة هدف الدواء-الفعل (الخطوة 1.9) ومكتبة هدف الأمراض (الخطوة 2.4) إلى حقلي الإدخال في Venny 2.1.0 لإنشاء مخطط Venn يوضح التداخل بين مجموعتي الهدف.
  2. استخرج أهداف التقاطع من نتائج مخطط فين. صنفها كأهداف شائعة لأمراض الأدوية (نقاط تفاعل محتملة) وحفظها كملف CSV.

4. بناء شبكات تفاعل البروتين والبروتين (PPI) وتحليل الأهداف الأساسية

  1. الوصول إلى قاعدة بيانات STRING (https://cn.string-db.org/). اختر الإنسان العاقل كالكائن الحي من القائمة المنسدلة.
  2. استيراد أهداف الأدوية الشائعة (الخطوة 3.2) إلى حقل إدخال STRING. اضبط الحد الأدنى لمعدل التفاعل المطلوب على مستوى ثقة عالية (0.700) وانقر على البحث لتوليد بيانات PPI. تصدير بيانات PPI كملف TSV (قيم منفصلة من علامات التبويب).
  3. افتح برنامج Cytoscape مع إضافة CytoNCA مثبتة مسبقا. استيراد ملف PPI TSV إلى Cytoscape باستخدام قائمة File > استيراد > Network from File .
  4. شغل إضافة CytoNCA بالنقر على التطبيقات > CytoNCA > Open. اختر خمسة مقاييس مرجعية لفحص الأهداف الأساسية: البين، القرب، الدرجة، المتجه الذاتي، وLAC.
    ملاحظة: خمسة مقاييس طوبولوجية رئيسية مستخدمة هي: المسافة (مركزية البين، قياس تردد ظهور الهدف في جميع المسارات الأقصر في الشبكة)، القرب (مركزية القرب، تعكس متوسط أقصر طول مسار من الهدف إلى جميع الأهداف الأخرى في الشبكة)، الدرجة (درجة الاتصال المحلي، حيث تحدد عدد التفاعلات المباشرة بين الهدف والأهداف الأخرى)، المتجه الذاتي (مركزية المتجه الذاتي، حيث يوزن كل من اتصال الهدف وأهمية أهدافه المتصلة)، وLAC (متوسط الاتصال المحلي، يقيم كثافة الاتصال بين العقد المجاورة مباشرة للهدف).
  5. شغل تحليل الشبكة بالنقر على قائمة أدوات > تحليل الشبكة ، ثم اضغط على موافق. قم بتصدير نتائج التحليل إلى جدول CSV.
  6. احسب القيمة الوسيطة لجميع المقاييس الخمسة واحتفظ بالأهداف التي تحقق أو تتجاوز الوسيط. كرر الخطوة 4.5 عدة مرات حتى يتبقى 10 إلى 20 هدفا.
  7. قم بترتيب الأهداف المتبقية حسب مقياس الدرجة (من الأعلى إلى الأدنى) واختيار أولى 10 أهداف كجينات أساسية. حفظ قائمة الجينات الأساسية كملف CSV.
    1. لتقليل الإيجابيات الكاذبة وضمان أن الأهداف الملائمة هيكليا فقط هي التي تتابع الالتحام الداخلي، قم بإجراء تقييم إضافي للجدوى الهيكلية وقابلية الدواء: تحقق من قاعدة بيانات PDB للبنى البلورية عالية الدقة المتاحة (≤ 2.5 أونغروم) أو تقييم ما إذا كان يمكن بناء نموذج تجانس موثوق؛ استخدام أدوات التنبؤ الجيبي لتأكيد وجود مواقع ربط مناسبة؛ وإجراء مقارنات متقاطع مع الأدبيات أو قواعد البيانات الوظيفية للتحقق من الصلة الموثقة بمسار المرض.
    2. خفض الأولوية للأهداف التي تفتقر إلى توفر هيكلي، أو جيوب قابلة للأدوية، أو صلة الأمراض في دراسات التثبيت. لا يزال بالإمكان إجراء تحليل إثراء GO وKEGG باستخدام القائمة الكاملة للأهداف الأساسية من هذه الخطوة، لأنه لا يتطلب معلومات هيكلية.
      ملاحظة: يمكن تغيير عدد الجينات في الخطوتين 4.6 و4.7 حسب الحاجة. عادة ما يبقى 10 إلى 20 هدفا بعد الخطوة 4.6، وينصح بالحفاظ على 10 جينات أساسية على الأقل في الخطوة 4.7 لضمان حجم بيانات كاف لتحليل إثراء GO وKEGG موثوق واتجاهات التصور المتسقة.

5. تحليل وتصور إثراء GO وKEGG

ملاحظة: هذا الجزء يوضح وظائف الجينات على مستوى المكون الخلوي، والوظيفي، والمسارات داخل الخلية.

  1. الوصول إلى أداة الويب DAVID (https://davidbioinformatics.nih.gov/home.jsp). اختر قائمة الجينات كنوع إدخال واستورد الجينات الأساسية إلى حقل الإدخال.
  2. اضبط المعرف على OFFICIAL_GENE_SYMBOL واختر الإنسان العاقل في اختيار الأنواع. ثم اضغط على إرسال القائمة لرفع الجينات الأساسية.
  3. لتحليل إثراء GO، اختر فئات GOTERM_BP_DIRECT و GOTERM_CC_DIRECT و GOTERM_MF_DIRECT .
  4. لتحليل تخصيب KEGG، اختر فئة KEGG_PATHWAY . حدد عتبة الدلالة إلى p < 0.05 لكل من تحليلات GO وKEGG.
  5. انقر على مخطط التعليقات الوظيفية لتوليد نتائج الإثراء. تصدير نتائج GO وKEGG كملفات CSV. استخدم برنامج R Studio مع ggplot2 لإنشاء مخططات شريطية أو مخططات فقاعية لأفضل 10 مصطلحات/مسارات مثرية.
    ملاحظة: يمكن تعديل عدد المصطلحات/المسارات المعروضة حسب المتطلبات.

6. الالتحام الجزيئي باستخدام أوتودوك فينا

ملاحظة: الخطوتان 6 والخطوة 7 كلاهما خطتا الالتحام الجزيئي. الخطوة 6 تستخدم برنامج AutoDock Vina 1.1.2، بينما تستخدم الخطوة 7 برنامج YASARA 10.3.16. استخدام YASARA يسهل المحاكاة اللاحقة للديناميكا الجزيئية ل YASARA. إذا كانت نتائج الالتحام من AutoDock Vina مطلوبة، يجب أن تكون نتائج الالتحام في YASARA متسقة مع نتائج AutoDock Vina. هذا يتجنب التناقضات الناتجة عن تبديل البرمجيات ويضمن أيضا موثوقية نتائج التحقق من محاكاة الديناميكا الجزيئية، بطريقة مفصلة: افتح نتيجة "result.pdb" للخطوة 6.31 باستخدام LigPlot+ (الإصدار 2.3) لإنشاء مخطط تفاعل ثنائي الأبعاد، وتحديد البقايا الرئيسية التي تتفاعل مع الليجند، ثم اختيار بقايا المفتاح في خطوة الالتحام 7.18 من YASARA، وضبط حجم الصندوق ليغطي جيب الربط، لتعظيم اتساق مواقع الالتحام بين Vina وYASARA. لاحقا، عند اختيار نتائج الالتحام المثلى في الخطوة 7.19، تأكد من أن البواقي المتفاعلة بين الليغاند والمستقبل تبقى متسقة مع تلك التي تم تحديدها من نتائج AutoDock Vina. يركز هذا الشرط على الحفاظ على أنماط التفاعل الأساسية بدلا من المطابقة الذرية الدقيقة؛ من المتوقع حدوث اختلافات طفيفة في تكوينات البقايا الطرفية بسبب الاختلافات في معلمات مجال القوة ومرونة السلاسل الجانبية. طالما تم الحفاظ على التفاعلات الحرجة مع بقايا المواقع النشطة الرئيسية، يمكن اعتبار نتائج الالتحام متسقة لأغراض التحقق المتبادل. إذا لم يكن الالتحام بتقنية AutoDock Vina (الخطوة 6) مطلوبا، يمكن تنفيذ الخطوة 7 مباشرة.

  1. احصل على ملف SDF (ملف بيانات الهيكل) للمركبات الدوائية المسماة ligand.sdf من قاعدة بيانات PubChem من خلال البحث عن سلاسل SMILES المقابلة (الخطوة 1.1).
  2. افتح ملفات SDF باستخدام برنامج Chem3D. تحت خيار الحساب، اختر MM2 واضغط على تقليل الطاقة لإجراء تقليل الطاقة الحر لبنية المركبات.
  3. حفظ البنية المصغرة كملف ligand.mol2 عن طريق ملف الاختيار > حفظ باسم. احصل على ملف بتنسيق PDB (بنك بيانات البروتين) لمستقبل البروتين للجين الأساسي من قاعدة بيانات RCSB PDB (https://www.rcsb.org/؛ ابحث حسب معرف PDB أو اسم الجين) باسم receptor.pdb.
    1. أعط الأولوية للهياكل ذات الدقة ≤ 2.5 أونغروميت ومواقع ارتباط محلولة إذا كانت متاحة. عند اختيار الهيكل، افحص المدخل من حيث اكتمالها (مثل وجود جميع المجالات المتوقعة، غياب الحلقات الكبيرة غير المحلولة)، والطفرات المحتملة التي قد تؤثر على ارتباط الليجند، وما إذا كانت عوامل مساعدة مهمة وظيفيا (مثل الهيم، أيونات المعادن) أو الليغاندات المتبلورة معا مشمولة.
    2. بالنسبة للأهداف ذات التجميعات الأوليغوميرية المعروفة، فكر فيما إذا كان الشكل الأحادي أو متعدد المستويات مناسبا لسؤال البحث؛ يمكن تنزيل التجميع البيولوجي إذا كانت التفاعلات الثنائية أو التفاعلات ذات الرتبة الأعلى ذات صلة. سيخضع الهيكل المختار لمزيد من التحضير في الخطوات التالية، لذا يساعد الفحص الأولي في تجنب التعقيدات اللاحقة.
  4. افتح المستقبل. pdb باستخدام برنامج PyMOL. اكتب إزالة العضوية في سطر الأوامر واضغط Enter لإزالة الروابط الصغيرة من بنية البروتين.
    ملاحظة: إذا كنت تستخدم الليغاند المتبلور المشترك لتحديد موقع الربط، قم أولا بتسجيل إحداثيات مركز الليغاند ثلاثية الأبعاد، ثم اكتب إزالة العضوية في سطر أوامر PyMOL واضغط Enter لحذف الجزيئات الصغيرة المتبلورة معا؛ وإلا، قم بتشغيل أمر إزالة العضوية مباشرة لإزالة الجزيئات الصغيرة المتبلورة معا.
  5. اكتب إزالة المذيب في سطر الأوامر واضغط Enter لإزالة جزيئات الماء الحر من بنية البروتين؛ استخدم الأمر select metal_cofactor وresn [اسم بقايا العامل المساعد المستهدف] لتحديد أيونات أو عوامل معدنية حرجة وظيفيا (مثل HEM، Zn2⁺، Mg2⁺) وتأكيد احتفاظها في الهيكل.
  6. قم بتصدير المستقبل النظيف من PyMOL ك receptor_clean.pdb بالنقر على ملف > تصدير جزيء > حفظ.
  7. افتح receptor_clean.pdb في UCSF Chimera 1.19. عرض التسلسل بالنقر على أدوات > تسلسل > لفحص الحلقات المفقودة المجاورة لموقع الربط (المناطق المفقودة تشير إليها بمربعات خطوط حمراء). إذا كانت هناك حلقات مفقودة، أعد بنائها باختيار Structure > Modeller (الحلقات/التنقيح) من قائمة نافذة التسلسل، واختيار الهيكل المفقود غير النهائي، وتعيين عدد مناسب من النماذج (مثل 5)، والمضي قدما في الحساب. بعد الانتهاء، اختر النموذج الأكثر منطقية.
  8. تحسين البنية في كيميرا. استخدم أداة Rotamers (مكتبة دنبراك) على البقايا المحددة لتحسين السلاسل الجانبية، مع إضافة التصادم والروابط الهيدروجينية عبر قائمة الأعمدة للتقييم واختيار التشكيلات التي تحتوي على تعارضات قليلة (0 - 1 مفضلة) وروابط H ملائمة. ثم أضف الهيدروجين وخصص الشحنات باستخدام Dock Prep (AMBER ff14SB). وأخيرا، قم بتقليل الطاقة باستخدام أداة تقليل البنية، مع تثبيت ذرات العمود الفقري باختيارها (sel @ca,c,n,o)، وعكس الاختيار، وتمكين الذرات الثابتة. حفظ البنية المعالجة ك receptor_optimized.pdb باختيار ملف > حفظ PDB.
    ملاحظة: تخطي تحسين السلسلة الجانبية للبقايا المرتبة جيدا. Dock Prep يتولى تلقائيا البروتونينشن. يجب إجراء التقليل مع تثبيت العمود الفقري.
  9. أعد فتح receptor_optimized.pdb في PyMOL وحدد موقع الارتباط القانوني. إذا كان هناك رابط متبلور مشترك، استخدم إحداثياته لمركز الشبكة: سجل مركز الرابط، ثم أزله بإزالة العضوي. إذا لم يكن هناك رابط متبلور مشترك، حدد موقع الربط بناء على بقايا المفاتيح المعروفة من الأدبيات (مثل Select binding_site، resi XXX-XXX) أو عن طريق تحديد جيب الربط المفترض بصريا باستخدام أدوات التنبؤ بالجيوب للتحقق من صحة التقييم البصري. سجل إحداثيات المركز ثلاثية الأبعاد (x/y/z) للموقع المحدد لإعداد صندوق الشبكة.
    ملاحظة: الإحداثيات المسجلة هنا تستخدم لمركز شبكة أوتودوك فينا. لتعريف قائم على البقايا، يجب حساب المركز الهندسي للبقايا المختارة؛ أما بالنسبة للجيب الذي تم تحديده بصريا أو بواسطة أدوات التنبؤ، فيتم استخدام مركز التجويف. عند تحديد موقع الربط، يجب النظر فيما إذا كانت استراتيجية الالتحام المقصودة تستهدف الموقع التستوستري (النشط) أو الموقع الأللوستري. بالنسبة للاستهداف التستوستري، يجب تعريف موقع الارتباط بناء على رابطة متبلورة مشتركة أو بقايا موقع نشط محفوظ تم الإبلاغ عنها في الأدبيات. بالنسبة للاستهداف الألوستري، قد تستخدم أدوات التنبؤ الجيبي لتحديد المواقع المحتملة للبقايا الألوستيريكية، خاصة للأهداف التي لديها لوائح ألوستريكية معروفة. في غياب معلومات مسبقة، يمكن أن يساعد الالتحام العالمي المتبوع بتجميع نقاط الارتباط المتوقعة في تحديد المواقع المحتملة للربط المشترك. تمكن هذه المرونة البروتوكول من استيعاب حملات اكتشاف الأدوية العماثية والألوستيريكية.
  10. قم بتصدير الهيكل النهائي المحسن من PyMOL ك receptor.pdb بالنقر على ملف > تصدير جزيء > حفظ.
  11. افتح receptor.pdb في AutoDock Tools 4.2.6 بالنقر على ملف > قراءة الجزيء. حدد بقايا مرنة. انقر على تعديل > بقايا مرنة > اختر بقايا موقع الارتباط المتوقعة أن تخضع لتغيرات شكلية عند الارتباط بالليغاند (اختر ≤ 10 بقايا).
    ملاحظة: تسمح هذه الخطوة لسلاسل جانبية محددة بالتحرك أثناء التحام، مع الأخذ في الاعتبار تأثيرات التوافق المستحث.
  12. احفظ المستقبل الذي يحتوي على بقايا مرنة كملف PDB. انقر على ملف > حفظ، اختر كتابة PDB من القائمة المنسدلة. في نافذة سجلات PDB المتاحة، اختر ATOM و CONECT، ثم اضغط ADD، ثم اضغط موافق. احفظ الملف ك receptor.pdb.
    ملاحظة: يحتوي ملف PDB هذا على معلومات حول البقايا المرنة وسيتم استخدامه لإنشاء ملف PDBQT.
  13. جهز الجزيء الكبير للإرساء. انقر على Grid > Macromolecule > Select، اختر ملف receptor.pdb ، ثم اختر جزيء. احفظ المستقبل كملف PDBQT بالنقر على ملف > Save As وتسميه receptor.pdbqt.
    ملاحظة: تقوم أدوات أوتودوك بتعيين الشحنات وأنواع الذرات، وحفظ المستقبل بصيغة PDBQT الأصلية لأوتودوك، جاهزا لتوليد صناديق الشبكة وحسابات الإرساء.
  14. انقر على قائمة الليجاند ، اختر الإدخال، ثم اضغط فتح. اختر ligand.mol2 واضغط موافق. انقر على قائمة الليجند ، اختر الالتواءات، ثم اضغط على اكتشاف الالتواءات. ستحدد أدوات الأوتودوك تلقائيا الروابط القابلة للدوران في بنية الليغاند (مثل الروابط المفردة في سلاسل الألكيل، وروابط الأميد باستثناء الروابط الببتيدية).
  15. في نافذة اختيار الالتواء، تحقق من الروابط القابلة للدوران المكتشفة (احتفظ بجميع الروابط القابلة للدوران الصالحة، واستثنا الروابط الصلبة مثل الروابط الحلقية العطرية). انقر على تعيين لتأكيد تعريفات الالتواء، ثم اضغط على الإغلاق.
    ملاحظة: الحفاظ على الروابط القابلة للدوران الصالحة يضمن أن الليغاند يمكن أن يتبنى تكوينات مختلفة أثناء الالتحام (ليغاند مرن)، مع الحفاظ على صلابة المستقبل — وهذا هو جوهر الالتحام شبه المرن في أوتودوك فينا.
  16. انقر على قائمة Ligand مرة أخرى، اختر Output، ثم اضغط Save as PDBQT. سم الملف ligand.pdbqt واحفظه في نفس المجلد الذي يحتوي عليه receptor.pdbqt.
  17. انقر على قائمة العرض ، اختر الهيكل الثانوي. انقر على عرض فقط، ثم اختر الخطوط واضغط إلغاء العرض لتبسيط عرض البروتين.
  18. انقر على قائمة الشبكة ، اختر مربع الشبكة. قم بضبط قيم x وy وz (إحداثيات المركز) والتباعد (Å) لوضع الصندوق فوق موقع البروتين النشط.
    ملاحظة: إذا كان موقع الارتباط غير معروف، استخدم أدوات التنبؤ الجيبي (مثل CASTp، DoGSite) لتحديد جيوب الارتباط المفترضة. تغطية البروتين بالكامل تزيد بشكل كبير من الإيجابيات الكاذبة والتكلفة الحسابية ولا ينصح بها.
  19. انقر على ملف > إغلاق حفظ التيار، ثم اضغط على الشبكة > الإخراج > حفظ GPF لحفظ إعدادات صندوق الشبكة ك Grid.gpf.
  20. افتح Grid.gpf باستخدام محرر نصوص وسجل مركز الشبكة (قيم x، y، z) ونقاط NPT (قيم بحجم x، y، z) من الملف.
  21. أنشئ ملف نصي جديد باسم Config.txt واكتب المحتوى التالي:
    المستقبل = المستقبل.pdbqt
    ليغاند = ليغاند.pdbqt
    center_x = [مركز الشبكة × القيمة من Grid.gpf]
    center_y = [قيمة مركز الشبكة y من Grid.gpf]
    center_z = [قيمة مركز الشبكة z من Grid.gpf]
    size_x = [npts x قيمة من Grid.gpf]
    size_y = [قيمة n pts y من Grid.gpf]
    size_z = [قيمة z من Grid.gpf]
    energy_range = 5
    num_modes = 10
    استبدل النص الموجود بين قوسين بقيم من Grid.gpf (الخطوة 6.19).
    ملاحظة: يجب تعيين معامل energy_range كأقصى فرق طاقة مسموح به بالنسبة للنموذج الأمثل المركب، بوحدات بالكيلوكالري/مول. على سبيل المثال، تعيينه على 5 يعني أن أوتودوك فينا سينهي الحسابات عندما يصل فرق الطاقة عن النموذج الأمثل إلى 5 كيلو كالوري/مول. بالإضافة إلى ذلك، يحدد num_modes عدد نماذج الربط التي يجب توليدها، والذي يتم تعيينه عادة على 10.
  22. ضع ملفات vina_split.exe و vina.exe في نفس المجلد مع receptor.pdbqt و ligand.pdbqt و Config.txt.
  23. افتح وحدة تحكم نظام ويندوز، وانتقل إلى الدليل باستخدام أمر cd (مثل cd C:\DockingFiles).
  24. اكتب الأمر التالي واضغط Enter: vina.exe --config config.txt --log log.txt --out output.pdbqt
  25. انتظر اكتمال الالتحام (تختلف المدة حسب النظام). سيظهر ملفان: log.txt (نتائج الإرساء) وoutput.pdbqt (بنية الربط ذات الطاقة الأدنى). لضمان قابلية التكرار، يتم إجراء ثلاث عمليات إرساء مستقلة باستخدام بذور عشوائية مختلفة. يؤكد RMSD < 1.0 Å بين الوضعيات العليا الاتساق.
    ملاحظة: كمرجع تجريبي، يمكن تفسير طاقات ارتباط أوتودوك فينا (كيلوكالوري/مول) على النحو التالي: ≤ -7 (ألفة عالية، تشكيلات نشطة محتملة)، -7 إلى -5 (ألفة متوسطة)، ≥ -5 (ألفة منخفضة). هذه العتبات تعتمد على النظام ويجب التحقق منها ببيانات تجريبية.
    1. لتقييم دقة الالتحام والقدرة على التمييز لهدف معين، يوصى بنهجين تكامليين للتحقق من الصحة. استخدم التحقق من إعادة الالتفاف باستخدام الروابط البلورية لتقييم ما إذا كان البروتوكول يمكنه إعادة إنتاج أنماط الربط التي تمت ملاحظةها تجريبيا، مع RMSD < 2.0 Å كمعيار قبول قياسي.
    2. استخدم تحليل الإثراء باستخدام مجموعات بيانات المعيار العامة (مثل DUD-E) لتقييم قدرة البروتوكول على التمييز بين المركبات النشطة الحقيقية والمركبات الطعمة المتطابقة مع الخصائص؛ يشمل ذلك حساب منحنيات ROC (توفر مقياسا عالميا لأداء التصنيف) وعوامل الإثراء مثل EF1٪ (قياس إثراء المواد النشطة في النسبة الأعلى ترتيبا). معا، تساعد هذه الخطوات في التحقق في تحديد حدود التقارب المناسبة وضمان أداء فحص موثوق للفئة المستهدفة.
  26. افتح برنامج PyMOL. استورد output.pdbqt و receptor.pdbqt بالنقر على ملف > فتح. احفظ الهيكل المدمج ك result.pdb بالنقر على ملف > حفظ باسم.
  27. قم بمسح مساحة عمل PyMOL بالنقر على ملف > New Session، ثم أعد فتح result.pdb لعرض مركب الليغاند-البروتين.

7. الالتحام الجزيئي باستخدام YASARA

ملاحظة: تعد هذه الخطوة إعادة الالتحام والمعالجة المبدقة لمحاكاة ديناميكا جزيئية (MD) لاحقة، وهي تحقق تدريجي لنتائج الفحص الأولي عالي الإنتاجية من الخطوة 6. تستخدم الخطوة 6 أوتودوك فينا، الأداة القياسية الذهبية للفحص الافتراضي عالي الإنتاجية، لفحص الجزيئات المرشحة بسرعة ذات ألفة ارتباط ممتازة من مكتبة المركبات. تعتمد هذه الخطوة YASARA للالتحاس، حيث أن وحدة الالتحام الخاصة بها متوافقة تماما مع منصة محاكاة YASARA MD، والتي يمكنها تجنب الانحرافات الهيكلية الناتجة عن تحويل تنسيقات الملفات والتبديل البرمجي، وتوفر هيكلا معقدا أوليا موحدا لمحاكاة MD لاحقا. لجميع الجزيئات المرشحة التي تم فحصها بواسطة AutoDock Vina في الخطوة 6، يجب أن تكون نتائج الالتحام (بما في ذلك وضعية الارتباط في الجيب النشط والتفاعلات الرئيسية للأحماض الأمينية) متوافقة مع تلك الموجودة في AutoDock Vina، ويجب أن يحافظ تصنيف الألفة النسبية على نفس الاتجاه قبل الانتقال إلى محاكاة MD. درجات الالتحام المطلقة ليست قابلة للمقارنة مباشرة بين البرنامجين بسبب اختلاف خوارزميات الحساب. يمكن أن يقضي هذا الشرط على الاتساق النتائج الإيجابية الكاذبة الناتجة عن اختلافات البرمجيات، ويضمن استقرار خصائص الارتباط للجزيئات المرشحة، ويضمن موثوقية واستمرارية التحقق المنطقي من صحة محاكاة MD اللاحقة.

  1. استخدم OpenBabel لتحويل ملف ligand.sdf إلى ملف ligand.pdb.
    ملاحظة: يستخدم OpenBabel هنا فقط لتحويل الصيغة. سيتم إجراء المعالجة الفعلية للرابطة للديناميكا الجزيئية تلقائيا بواسطة YASARA في الخطوات التالية.
  2. افتح برنامج YASARA. انقر على ملف > تحميل واختر ligand.pdb لاستيراد الليجند. انقر على تعديل > تنظيف > All لإزالة العيوب الهيكلية من الرابط.
    ملاحظة: تقوم هذه الخطوة بتنظيف الهندسة الأساسي. ستقوم YASARA بعد ذلك بتعيين معلمات مجال القوة تلقائيا للليجند باستخدام تقنية AutoSMILES المدمجة، والتي تطبق شحنات حقل القوة الكهرماني العام (GAFF) وAM1-BCC لضمان التوافق مع حقل القوة AMBER14 المستخدم للبروتين. يعد هذا التحليل ضروريا لحسابات الطاقة الدقيقة في محاكاة الالتحام ومحاكاة MD.
  3. انقر على الخيارات > درجة الحموضة الافتراضية، واختر الرقم الهيدروجيني المناسب (مثلا 7.4 للحالات الفسيولوجية)، ثم اضغط موافق.
  4. انقر على Dock > Force field لضبط حقل قوة الإرساء، مما يضمن اتساق المعلمات مع محاكاة MD اللاحقة.
    ملاحظة: AMBER14 هو الحقل القوة الموصى به لسير عمل اكتشاف الأدوية هذا في YASARA 10.3.16، حيث يوفر تغطية شاملة للمعلمات للبروتينات ومتوافق تماما مع بروتوكولات محاكاة MD القياسية. بالنسبة لبقايا البروتينات القياسية، يتم تعيين المعلمات تلقائيا من القوالب المدمجة في حقل القوة. بالنسبة للروابط الجزيئية الصغيرة، يقوم YASARA تلقائيا بإجراء المعاملات باستخدام تقنية AutoSMILES المدمجة، التي تحدد أنواع الذرات GAFF (حقل القوة الكهرماني العام) وشحنات AM1-BCC. يضمن ذلك التوافق بين معلمات البروتين والرابط، مما يمكن من حسابات الطاقة بدقة في محاكاة الالتحام والمحاكاة MD. يمكن اختيار حقل قوة أكثر ملاءمة وفقا لنسخة YASARA الفعلية المستخدمة والخصائص المحددة للنظام.
  5. انقر على محاكي > حدد > خلية المحاكاة حول جميع الذرات لتحديد حدود العمل. انقر على محاكي > حدود الخلايا > دورية لتمكين شروط الحدود الدورية.
  6. انقر على الخيارات > اختر التجربة > تقليل الطاقة، ثم اضغط على ركض لتقليل طاقة الرابط.
  7. انقر على ملف > حفظ باسم، ثم سم ملف ligand.pdb، ثم اضغط موافق لاستبدال ملف PDB الأصلي في الليغاند. انقر على ملف > جديد لمسح مساحة العمل، ثم اضغط على ملف > تحميل واختر ملف receptor.pdb.
  8. كرر الخطوات من 7.2 إلى 7.7 لمستقبل البروتين، مع حفظ الملف المعالج كملف مستقبل.pdb جديد.
  9. انقر على ملف > جديد، ثم انقر على ملف > تحميل واختر كل من ligand.pdb و receptor.pdb. كرر الخطوات من 7.3 إلى 7.5 لتحديد الرقم الهيدروجيني، وتعريف خلية المحاكاة، وتمكين الحدود الدورية للمعقد.
  10. انقر على المعالجات > تعيين وحدة المعالجة المركزية واختر عدد أنوية المعالج المطلوب استخدامها. انقر على المعالجات > تعيين وحدة معالجة الرسوميات واختر جهاز معالجة الرسومات لتسريع العمليات الحسابية.
  11. انقر على ملف > احفظ ك > مشهد YASARA، ثم سم الملف sce\nesult.sce (أنشئ مجلد sce إذا لم يكن موجودا)، ثم اضغط موافق.
  12. انقر على الخيارات > Macro وMovie > Set Target، اختر sce\nesult.sce، ثم اضغط OK. انقر على الخيارات > Macro وMovie > Play macro، اختر ملف ماكرو dock_run.mcr ، ثم اضغط موافق.
  13. انقر على المحاكي > تحديد خلية المحاكاة > حول ذرات محددة وكرر 7.5، ثم اضغط على الاستمرار لبدء عملية الإرساء.
  14. انتظر اكتمال الإرساء. سيتم إنشاء ملفات تحمل لاحقة yob؛ name.log تحتوي على طاقة الارتباط وبقايا مستقبلات الاتصال.
    ملاحظة: لضمان عقلانية التحقق من محاكاة الديناميكا الجزيئية، اختر نتيجة الالتحام في YASARA التي تتوافق مع نتيجة الالتحام في AutoDock Vina.

8. محاكاة الديناميكا الجزيئية

  1. انقر على ملف > جديد لمسح مساحة العمل. ثم اضغط على ملف > تحميل > كائن YASARA واختر result.yob.
  2. في لوحة محتوى المشهد (على الجانب الأيمن)، قم بتوسيع جميع إدخالات Mol. انقر على تعديل > تقسيم > Object، اختر كل محتويات Mol في لوحة التسلسل، ثم اضغط على OK.
  3. انقر على تعديل > الانضمام > الكائن، اختر كل محتويات Mol ما عدا المدخلين الأول والأخير (الليغاند)، ثم اضغط موافق. اختر أول إدخال مول واضغط موافق مرة أخرى لإعادة الانضمام إلى البروتين.
  4. تابع لإعادة ترقيم المكونات. اختر إعادة الترقيم تحت التحرير وانقر على الكائنات. ينتج عن ذلك جزأين: الجزء الأول هو مركب مستقبلات البروتين، والجزء الثاني هو الرابط الجزيئي الصغير.
  5. انقر على تعديل > النقل، ثم انقر على خيار الكائن من القائمة المنسدلة. في لوحة التسلسل، اختر أولا محتوى الليغاند الجزيء الصغير بالنقر على الإدخال المقابل. ثم اختر محتوى مستقبلات البروتين بالنقر على إدخاله والنقر على موافقة لتأكيد زوج الاختيار.
  6. في نافذة المنبثقة التالية، اختر الخيار الذي يبدأ ب Fix atoms على الشاشة أثناء النقل، ثم اضغط على موافق.
  7. كرر الخطوات من 7.2 إلى 7.5، ثم اضغط على المحاكي > درجة الحرارة واختر 298K. انقر على ملف > حفظ ك > مشهد YASARA، سم الملف sce\nesultrun.sce، ثم اضغط موافق.
  8. انقر على ملف > جديد لمسح مساحة العمل. ثم انقر على الخيارات > Macro&Movie > Set Target، اختر sce\nesultrun.sce، ثم اضغط موافق.
  9. تأكد من أن حقل القوة المختار في الخطوة 7.4 يستخدم أيضا لمحاكاة MD؛ عادة ما يرث ماكرو md_run.mcr إعدادات حقل القوة الحالية. انقر على الخيارات > ماكرو ماكرو > تشغيل الماكرو، اختر ملف ماكرو md_run.mcr ، ثم انقر موافقا لبدء محاكاة الديناميكيات الجزيئية.
  10. قم بإجراء ثلاث محاكاة مستقلة ل MD (3 × 100 نانوثانية) بسرعات أولية مختلفة لمركب البروتين-الليجاند وإجراء تحليل إحصائي للمسارات الثلاثة لضمان موثوقية النتائج. خلال العملية، سيتم توليد ملفات بصيغة المحاكاة. على سبيل المثال، إذا تم حفظ المسار كل 100 رطل، فإن محاكاة 100 نانوثانية ستولد 1000 ملف مع لاحقة المحاكاة.
  11. بمجرد اكتمال الخطوة 8.10، اضغط على الخيارات > ماكرو وفيلم > تعيين الهدف، اختر ملف sce\nesultrun.sce ، واضغط موافق.
  12. انقر على الخيارات > Macro&Movie > Play macro، اختر md_analyze.mcr و md_analyzebindenergy.mcr و md_analyzeres.mcr واضغط OK.
  13. بعد الانتهاء من جميع التحليلات الثلاثة، سيتم توليد ملفات البيانات المقابلة result_run_analysis.tab و result_run_bindenergy.tab و result_run_analysisres.tab.
  14. أولا، حلل result_run_analysis.tab، الذي يوفر 10 معلمات أساسية: الطاقة (طاقة النظام الكلي)، الرابطة (طاقة الرابطة)، الزاوية (طاقة زاوية الرابطة)، ثنائية الزاوية (طاقة الزاوية الثنائية الهيدرالية)، السطحية (طاقة المستوية)، الكولوم (الطاقة الكهروستاتيكية)، VdW (طاقة فان دير فالس)، CA (Cα RMSD للبروتين RMSD)، العمود الفقري (العمود الفقري البروتيني RMSD)، والذرات الثقيلة (RMSD الذرة الثقيلة).
  15. استخلاص عمود الزمن (ns) وأعمدة المعلمات المقابلة لتقييم ما إذا كان النظام يصل إلى التوازن الطاقي. تأكيد استقرار النظام من خلال استقرار الطاقة الكامنة ضمن نطاق تقليح ضيق بعد 10 - 20 نانوثانية الأولى. تقييم الاستقرار الشكلي من خلال مراقبة انحراف متوسط التربيع الجذري (RMSD) لذرات Cα، والعمود الفقري للبروتين، والذرات الثقيلة. اعتبرت المحاكاة مستقرة هيكليا بمجرد وصول هذه القيم إلى هضبة.
  16. كنقاط مرجعية تجريبية لمركبات البروتين-الليجاند ذات الحجم النموذجي، يمكن اعتبار قيم Cα وRMSD التي تستقر تحت 2.5 أنغومتر، إلى جانب RMSD الذري الثقيل أقل من 3.5 أوغسترومتر، مؤشرات داعمة للاستقرار التكويني. الأهم، استخدم المعيار الأساسي والإلزامي ووجود طور هضبة واضحة في مسار RMSD، بدلا من الالتزام الصارم بهذه القيم العددية فقط.
    ملاحظة: هذه القيم العتبية تجريبية ويجب تفسيرها في سياق حجم البروتين المحدد ومرونته. المؤشر الحاسم للتقارب هو الهضبة المستمرة، مما يشير إلى أن البنية قد استقرت حول مجموعة شكلية متسقة.
  17. بعد ذلك، حلل result_run_bindenergy.tab، الذي يوفر طاقة الارتباط بين الليجند والهدف عبر مسار المحاكاة. احسب متوسط طاقة الارتباط عبر كامل فترة المحاكاة. في تنفيذ MM-PBSA من YASARA، تشير القيم الإيجابية إلى ارتباط أقوى. عادة ما يشار إلى التفاعل المتوسط القوي والمستقر بمتوسط طاقة ارتباط موجبة وكبيرة بما فيه الكفاية (القيمة الرقمية المحددة تعتمد على النظام ولكن يمكن معايرتها مقابل الروابط المعروفة أو البيانات التجريبية)، إلى جانب انحراف معياري صغير بالنسبة للمتوسط (مثل معامل التباين < 50 - 60٪)، مما يعكس تذبذبا محدودا أثناء المحاكاة.
    ملاحظة: يتم حساب طاقة الارتباط المبلغ عنها في هذه الخطوة باستخدام طريقة MM-PBSA الصارمة، على عكس ماكرو طاقة الارتباط الافتراضي YASARA الذي يستخدم تقريبا أسرع (BoundaryFast). التقريب الافتراضي مناسب للفحص السريع أو المقارنات النسبية، بينما يوصى بطريقة MM-PBSA للحصول على طاقات ارتباط مطلقة حرة أكثر دقة. كما ذكر المؤلف صراحة في رأس ماكرو YASARA: الطاقات الإيجابية أكثر تشير إلى ارتباط أفضل، أما الطاقات السلبية فلا تعني عدم وجود ارتباط. لذلك، يجب على المستخدمين تفسير القيم الموجبة على أنها دلالة على ارتباط أقوى، مع اعتماد المقدار العددي على نظام البروتين-الليغاند المحدد.
  18. وأخيرا، حلل الملف result_run_analysisres.tab، الذي يوفر بيانات لكل بقايا تشمل معرف البقايا وRMSD وBackbone RMSD وHeavyAtoms RMSD وRMSF. ركز التحليل على مرحلة الإنتاج المستقرة التي تم تحديدها. أولا، حدد البواق داخل الموقع النشط للهدف (مثل تلك ضمن 5 أنغوستروم من الليجند). ثم استخدم البيانات لتقييم الاستقرار التكويني لهذه البقايا الفردية في الموقع النشط أثناء المحاكاة.
    ملاحظة: كنقاط مرجعية تجريبية لبقايا المواقع النشطة المستقرة في مركبات البروتين-الليغاند، تعتبر قيم RMSF أقل من 1.0 أونغروم وتقلبات RMSD ضمن 1 - 1.5 أونغستروم خلال الطور المستقر عادة دلالة على تشكيلات محلية محفوظة جيدا. قد تشير البقايا التي تتجاوز RMSF فيها 2.0 Å إلى مرونة أكبر؛ يجب رسم هذه البواقي على البنية ثلاثية الأبعاد لتحديد ما إذا كانت تتوافق مع مناطق مرنة ذات صلة وظيفيا (مثل الحلقات أو المساحات السطحية) أو تشير إلى عدم استقرار محتمل داخل جيب الربط. هذه الإرشادات العددية ليست قواعد مطلقة؛ المعيار الأساسي هو غياب انحراف التكوين الكبير، والذي يجب تقييمه بالتزامن مع التقارب الكلي للنظام الذي تم تحديده.
  19. بمجرد تنظيم ملفات البيانات، يتم استيراد البيانات المنظمة إلى بريزم لإنشاء مخططات متوافقة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

بعد تحليل الأدوية الشبكية للوراتادين ضد التهاب الأنف التحسسي (AR)، تم اختيار التفاعل بين اللوراتادين وPTGS2 كدراسة حالة تمثيلية لتوضيح التطبيق خطوة بخطوة لبروتوكول الالتحام الجزيئي ومحاكاة MD. يهدف هذا المثال إلى إظهار تنفيذ سير العمل وتفسير البيانات، بدلا من تقديم تحقق بيولوجي للتفاعل المحدد. للتقييم الكمي مقابل البيانات التجريبية، يشجع المستخدمون على تطبيق البروتوكول على أنظمة ذات خصائص جيدة وذات تقارب ربط معروفة متوفرة في قواعد البيانات العامة.

تحدي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

الأهمية والخطوات الحاسمة
يجمع هذا البروتوكول بين علم الأدوية الشبكي، والربط الجزيئي، ومحاكاة الديناميكا الجزيئية، مما يوفر مزايا واضحة مقارنة بالطرق المستقلة أو سير العمل المزدوج، ويمكن أن يساعد في معالجة أوجه القصور الرئيسية وفجوات الموثوقية في اكتشاف الأدوية الحالي. تعتمد العملية بأكملها على ثلاث خطوات حاسمة تضمن موثوقيتها، كل منها يعالج تحديا أساسيا في فحص الأدوية الحاسوبي. أولا، التكامل متعدد قواعد البيانات (مثل PubChem لهياكل الجزيئات الصغيرة، 5 قواعد بيانات لأهد...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يعلن جميع المؤلفين أنهم لا يواجهون تضاربا في المصالح.

شكر وتقدير

برنامج البحث والتطوير الوطني الرئيسي في الصين (2024YFC3506300، 2024YFC3506301)، التخصص الرئيسي عالي المستوى للإدارة الوطنية للطب الصيني التقليدي-الطب الدستوري الصيني التقليدي (No.zyyzdxk-2023251)، البرنامج العام للمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (82204948)، خطة اختراق التخصصات الأساسية ومتعددة التخصصات لوزارة التعليم الصينية (JYB2025XDXM612)، المشاريع الخاصة الكبرى للعلوم والتكنولوجيا في مقاطعة هوبي (2023BCA005)، مشروع أبحاث العلماء الرئيسيين في مختبر شيزن هوبي (HSL2024SX0002)

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
ADMETlab 3.0معهد شنغهاي للطب الطبي (SIMM)، الأكاديمية الصينية للعلوملا يوجدمنصة إلكترونية للتنبؤ بخصائص ADMET (الامتصاص، التوزيع، الأيض، الإخراج، السمية)؛ يستخدم لتقييم البروفائيل الدوائية والسمية للروابط (URL: ؛ https://admetlab3.scbdd.com/)
أدوات أوتودوك (أوتودوك 4)معهد سكريبس للأبحاثأوتودوك 4.2.6مجموعة برمجيات لمحاكاة الالتحام الجزيئي؛ يشمل AutoDock 4 للالتحام وAutoDockTools (ADT) لإعداد ملفات إدخال البروتين والليجاند (إضافة الهيدروجينات، تعيين الشحنات، إعداد الروابط القابلة للدوران)، تعريف شبكات الإرساء، وتحليل نتائج الإرساء.
أوتودوك فينامعهد سكريبس للأبحاثأوتودوك فينا 1.1.2برمجيات الالتحام الجزيئي مفتوحة المصدر؛ يستخدم للتنبؤ بمواجهات الارتباط والوضعيات بين الروابط الجزيئية الصغيرة ومستقبلات البروتين
Chem3Dبيركين إلمر للمعلوماتيةChem3D 2024برامج النمذجة الجزيئية؛ يستخدم لبناء وتحسين وتصور البنى ثلاثية الأبعاد للروابط الجزيئاتية الصغيرة
سيتوسكيباتحاد سايتوسكيب (معهد علم الأحياء النظمي)سايتوسكيب 3.10.3برمجيات مفتوحة المصدر لتصور وتحليل الشبكات البيولوجية؛ يستخدم لبناء وتحرير شبكات تفاعل الجينات/البروتين
ديفيد (قاعدة بيانات للتعليق التوضيحي، والتصوير والاكتشاف المتكامل)المعهد الوطني للحساسية والأمراض المعدية (NIAID)، الولايات المتحدة الأمريكيةلا يوجدأداة إلكترونية للتعليق الوظيفي وتحليل الإثراء؛ يستخدم لإجراء تحليل إثراء مسارات GO (علم الجينات الجينية) وKEGG (موسوعة كيوتو للجينات والجينات) للجينات المستهدفة (URL: ؛ https://david.ncifcrf.gov/)
قاعدة بيانات DisGeNETمركز برشلونة للحوسبة الفائقة (BSC)لا يوجدقاعدة بيانات الروابط بين الجينات والأمراض؛ يستخدم لتحديد الجينات المرتبطة بأمراض محددة (URL: ؛ https://disgenet.com/)
قاعدة بيانات جينكاردزمعهد وايزمان للعلوملا يوجدقاعدة بيانات متكاملة للجينات البشرية؛ يستخدم لاسترجاع معلومات جينية شاملة (مثل التعبير، الوظيفة، الارتباطات المرضية) (الرابط:  ؛ https://www.genecards.org/)
ليغبلسمختبر البيولوجيا الجزيئية الأوروبي - المعهد الأوروبي للمعلوماتية الحيوية (EMBL-EBI)ليغبلس 2.3برامج لتوليد مخططات تفاعل البروتين والليجاند ثنائية الأبعاد تلقائيا من ملفات الإحداثيات ثلاثية الأبعاد. يصور بشكل تخطيطي الروابط الهيدروجينية، والتلامسات الكارهة للماء، وبقايا موقع الارتباط. متاح عند التسجيل عبر البريد الأكاديمي على الإنترنت  https://www.ebi.ac.uk/thornton-srv/software/LigPlus/ .
قاعدة بيانات OMIMكلية الطب بجامعة جونز هوبكنز (بالتعاون مع NCBI)لا يوجدالميراث المندلي على الإنترنت في الإنسان؛ يستخدم لاسترجاع معلومات عن الاضطرابات الجينية والجينات المرتبطة بها (URL: ؛ https://www.omim.org/)
OpenBabelفريق تطوير OpenBabelلا يوجدصندوق أدوات كيميائي مفتوح المصدر؛ يستخدم لتحويل تنسيقات الملفات الجزيئية (مثل من .mol2 إلى .pdb) بين منصات البرمجيات المختلفة
قاعدة بيانات PharmGKBجامعة ستانفوردلا يوجدقاعدة معرفة علم علم الجينوم الدوائي؛ يستخدم لاسترجاع معلومات عن التفاعلات بين الجينات والدواء والمتغيرات الدوائية الجينية (URL: ؛ https://www.pharmgkb.org/)
المنشوربرنامج جراف بادبريزم 9يستخدم في الرسوم العلمية، وتحليل البيانات (مثل رسم منحنيات توزيع طاقة الربط، وتحليل أشرطة الخطأ) وتوليد أرقام بجودة النشر.
بروتوكس 3.0Charité - Universitä تسميديزين برلين، ألمانيالا يوجدأداة إلكترونية للتنبؤ بنقاط السموم للجزيئات الصغيرة؛ يستخدم لتقييم السمية المحتملة للروابط المرشحة (URL: ؛ https://tox.charite.de/protox3/index.php?site=home)
قاعدة بيانات PubChemالمركز الوطني لمعلومات التكنولوجيا الحيوية (NCBI)، الولايات المتحدة الأمريكيةلا يوجدقاعدة بيانات عامة للمعلومات الكيميائية؛ يستخدم لاسترجاع البنى ثنائية الأبعاد وخصائص الفيزيائيوكيميائيا للروابط الجزيئية الصغيرة (URL:  https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)
باي مولشرö دينجر، ذ.م.مباي مول 2.6.1برامج التصوير الجزيئي؛ يستخدم لعرض وتحرير وتوليد صور عالية الجودة لمجمعات البروتين-الليغاند
استوديو Rبوزيت، PBCRstudio 2025.09.1+401بيئة تطوير متكاملة (IDE) لبرمجة R؛ يستخدم للتحليل الإحصائي للبيانات البيولوجية وتوليد مخططات GO/KEGG
قاعدة بيانات RCSB PDBمختبر البحث التعاوني في المعلوماتية الحيوية الهيكلية (RCSB)لا يوجدقاعدة بيانات هياكل البروتين؛ يستخدم لاسترجاع البنى ثلاثية الأبعاد لمستقبلات البروتين بصيغة PDB (العنوان:  https://www.rcsb.org/)
SEA (نهج فرقة التشابه)معهد سكريبس للأبحاثلا يوجدأداة إلكترونية للتنبؤ بالأهداف بناء على التشابه الكيميائي؛ يستخدم لتكمل SwissTargetPrediction لتأكيد أهداف الليغاند (URL:  https://sea.bkslab.org/)
الوتراتحاد الأوتار (EBI، SIB، إلخ)لا يوجدقاعدة بيانات للتفاعلات المعروفة والمتوقعة بين البروتينات؛ يستخدم لبناء شبكات تفاعل الجينات/البروتين (URL:  https://string-db.org/)
توقعات الأهداف السويسريةالمعهد السويسري للمعلوماتية الحيوية (SIB)لا يوجدخادم إلكتروني للتنبؤ بأهداف البروتين المحتملة للجزيئات الصغيرة؛ يستخدم لتحديد المستقبلات المرشحة للروابط (URL: ؛ http://swisstargetprediction.ch/)
قاعدة بيانات TTDمعهد اكتشاف وتطوير الأدوية (IDRBL)، جامعة صن يات-سينلا يوجدقاعدة بيانات الأهداف العلاجية؛ يستخدم لاسترجاع المعلومات حول الأهداف الدوائية الموثوقة والمحتملة (URL: ؛ https://db.idrblab.net/ttd/)
كيميرا جامعة كاليفورنيا في سان فرانسيسيومصدر للحوسبة الحيوية، التصور، والمعلوماتية (RBVI)، جامعة كاليفورنيا، سان فرانسيسكوجامعة كاليفورنيا في سان فرانسيسكو كيميرا 1.19برامج التصور الجزيئي والتحليل؛ يستخدم في تحضير بنية البروتين بما في ذلك إعادة بناء الحلقة المفقودة (عبر واجهة Modeller)، وتحسين السلاسل الجانبية (مكتبة Dunbrack rotamer)، وضبط حالة البروتون، وتقليل الطاقة باستخدام حقل القوة AMBER ff14SB. الإصدار 1.19 (صدر في مارس 2025) يصلح قدرات جلب هيكل PDB  . متاح مجانا للاستخدام غير التجاري على   https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ .
قاعدة بيانات UniProtاتحاد يوني بروت (EBI، SIB، PIR)لا يوجدقاعدة بيانات شاملة لتسلسل البروتين ووظائفه؛ يستخدم لاسترجاع تسلسلات البروتين، والهياكل، والتعليقات الوظيفية (URL: ؛ https://www.uniprot.org/)
فيني 2.1.0المركز الوطني للتكنولوجيا الحيوية&الاكتيوت؛ أ (CNB-CSIC)، إسبانيالا يوجدأداة إلكترونية لإنشاء مخططات فين؛ يستخدم لتصور التداخلات بين مجموعات الجينات (مثل الجينات المستهدفة من قواعد بيانات مختلفة) (العنوان:  https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)
ياساراياسارا للعلوم الحيويةياسارا 10.3.16برمجيات النمذجة والمحاكاة الجزيئية؛ يستخدم في الالتحام الجزيئي (الخطوة 3.7) والمحاكاة اللاحقة للديناميكا الجزيئية للتحقق من نتائج الالتحام

المراجع

  1. Hopkins, A. L. Network pharmacology: The next paradigm in drug discovery. Nat Chem Biol. 4 (11), 682-690 (2008).
  2. An, W., et al. Mechanisms of rhizoma coptidis against type 2 diabetes mellitus explored by network pharmacology combined with molecular docking and experimental validation. Sci Rep. 11 (1), 20849(2021).
  3. Hu, M., et al. Use of network pharmacology and molecular docking to explore the mechanism of action of curcuma in the treatment of osteosarcoma. Sci Rep. 13 (1), 9569(2023).
  4. Oh, K. K., Adnan, M., Cho, D. H. Network pharmacology approach to decipher signaling pathways associated with target proteins of NSAIDs against COVID-19. Sci Rep. 11 (1), 9606(2021).
  5. Kuntz, I. D., Blaney, J. M., Oatley, S. J., Langridge, R., Ferrin, T. E. A geometric approach to macromolecule-ligand interactions. J Mol Biol. 161 (2), 269-288 (1982).
  6. Sahu, M. K., Nayak, A. K., Hailemeskel, B., Eyupoglu, O. E. Exploring recent updates on molecular docking: Types, method, application, limitation & future prospects. Int J Pharma Res Allied Sci. 13 (2), 24-40 (2024).
  7. Morris, G. M., et al. Autodock4 and autodocktools4: Automated docking with selective receptor flexibility. J Comput Chem. 30 (16), 2785-2791 (2009).
  8. Li, C., et al. Characterization of the molecular mechanisms underlying lurasidone-induced acute manic episodes in bipolar depression: A network pharmacology and molecular docking approach. CNS Neurosci Ther. 31 (4), e70383(2025).
  9. Lee, W. Y., et al. Evaluating current status of network pharmacology for herbal medicine focusing on identifying mechanisms and therapeutic effects. J Adv Res. 76, 799-815 (2025).
  10. Shahzadi, Z., et al. Network pharmacology and molecular docking: Combined computational approaches to explore the antihypertensive potential of Fabaceae species. Bioresour Bioprocess. 11 (1), 53(2024).
  11. Che, X., Zhang, L. Blind docking methods have been inappropriately used in most network pharmacology analysis. Front Pharmacol. 16, 1566772(2025).
  12. Ren, M., Ma, J., Qu, M. Network pharmacology integrated with molecular docking and molecular dynamics simulations to explore the mechanism of shaoyao gancao tang in the treatment of asthma and irritable bowel syndrome. Medicine .(Baltimore). 103 (50), e40929(2024).
  13. Jorgensen, W. L. The many roles of computation in drug discovery. Science. 303 (5665), 1813-1818 (2004).
  14. Gao, L., et al. Molecular dynamics simulation-driven focused virtual screening and experimental validation of fisetin as an inhibitor of Helicobacter pylori htra protease. Mol Divers. 29 (6), 6243-6258 (2025).
  15. Schaefer, M. H., Serrano, L., Andrade-Navarro, M. A. Correcting for the study bias associated with protein-protein interaction measurements reveals differences between protein degree distributions from different cancer types. Front Genet. 6, 260(2015).
  16. Richter, S., Fetzer, I., Thullner, M., Centler, F., Dittrich, P. Towards rule-based metabolic databases: A requirement analysis based on KEGG. Int J Data Min Bioinform. 13 (3), 289-319 (2015).
  17. Gu, S., et al. Benchmarking ai-powered docking methods from the perspective of virtual screening. Nat Machine Intell. 7 (3), 509-520 (2025).
  18. Zhang, P., et al. Network pharmacology: Towards the artificial intelligence-based precision traditional chinese medicine. Brief Bioinform. 25 (1), 1-12 (2023).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

ADMET KEGG

مقالات ذات صلة