يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

تحليل الميتاجينوميات لحجم الفيروسات في الحمض النووي لعينات البراز البشري

389 مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/70187

⸱

مارس 24, 2026

 ,  ,  ,  , 
1Department of Plant Pathology, University of California, Davis

في هذه المقالة

ملخص

نقدم بروتوكولا مرنا لتوليد ميتاجينومات كسر فيروسية عالية الجودة (viromes) من عينات براز بشري. تم تطوير هذا البروتوكول في الأصل لفيروميكس التربة، وهنا تم تطبيق هذا البروتوكول بنجاح على عينات البراز، مما مكن من توصيف قوي لفيروسفير الأمعاء البشري.

الملخص

فهم الفيروسفير البشري السليم (المكون الفيروسي للميكروبيوم) يتطلب قياسات دقيقة لتركيب مجتمع الفيروسات عبر مجموعة متنوعة من أنواع الفيروس. استنادا إلى الخبرة السابقة في طرق بيئة مجتمع فيروسات التربة، نعرض هنا سلسلة من الأساليب المخبرية لإثراء واستخراج الحمض النووي من فيروسات الحمض النووي خارج الخلية في عينات البراز البشري. يتم تقديم بروتوكول أساسي عامل، مع خيارات للانحرافات في خطوات مختلفة. يتضمن النهج العام إضافة حاجز سائل (افتراضي: محلول ملحي معزز بالفوسفات المعززة بالبروتين، PPBS) لتسهيل إزالة جزيئات الفيروس الحرة من مصفوفة البراز، والطرد المركزي لفصل الجزء السائل الذي يحتوي على جزيئات فيروسية، والترشيح (الافتراضي: 0.2 ميكرومتر حجم المسام) لإزالة معظم الخلايا، وتركيز الجسيمات الفيروسية (الافتراضي: الطرد المركزي فوق السطحي)، وإزالة الأحماض النووية الحرة مع النوكلياز قبل تحلل الفيروس، ثم استخراج الحمض النووي للتسلسل. كما تم ملاحظة تقنيات بديلة، بما في ذلك المخازن المختلفة، وأحجام المرشحات، وطرق التركيز. بشكل عام، تتوفر عدة خيارات لتوليد حمض نووي فيرومي عالي الجودة للتتابع. بدلا من تخصيص النهج لمعدات وموارد محددة، يجب أن تجعله مرونة البروتوكول قابلا للتطبيق على نطاق واسع عبر المختبرات التي تحتوي على معدات علم الأحياء الجزيئي القياسية المتنوعة.

المقدمة

الفيرومكس، أو التسلسل غير المستهدف لحجم حجم الفيروسات في المجتمعات المختلطة، يمكن أن يوفر رؤى حول تنوع وتطور وبيئة الفيروسات غير المزروعة. منذ الجهود المبكرة لتصنيف مجتمعات الفيروسات في الأمعاء قبل أكثر من 20 عاما، والتي استخدمت بشكل ملحوظ أساليب تم تطويرها لعينات بيئية مثل مياه البحر1، استمرت طرق الفيروميكس في تمكين الاكتشافات في علم البيئة الفيروسي داخل الميكروبيومالبشري 2. ومع ذلك، لا يوجد بروتوكول فيرومكس عالمي واحد، ويمكن أن تؤثر الاختلافات في التقنيات على نتائج التسلسل 3,4، مما يؤثر في النهاية على تفسير ديناميكيات مجتمع الفيروسات ويعيق المقارنات بين الدراسات. هناك حاجة إلى بروتوكولات محسنة، إلى جانب فهم شامل لكيفية تشكيل الخيارات المنهجية لملفات الفيروم، لتوصيف الفيروسفير البشري بشكل قوي.

على الرغم من عدم وجود بروتوكول عالمي للفيرومكس، فإن الأساس العام لطرق الفيرومكس يتضمن فصل وتركيز الجسيمات الشبيهة بالفيروس خارج الخلية (فيريونات) حسب حجمها و/أو كثافتها، وإزالة الأحماض النووية الحرة (المشتقة جزئيا من حطام الخلايا أو الكابسيدات الفيروسية المتضررة) قبل تحلل الفيروس، واستخراج الحمض النووي النووي و/أو الحمض النووي الريبي للتسلسل. بعض تقنيات الفيرومكس تختار لصالح أو ضد أنواع فيروسية محددة، سواء كان اختيارا متعمدا من الباحثين أو كحد منهجي غير مقصود. يستخدم الترشيح بالحقنة أو التفريغ بشكل متكرر لإزالة الخلايا الميكروبية والحطام الآخر، ويؤثر حجم المرشح بشكل جوهري على جودة وتركيب الفيروم القابل للاستعادة. على سبيل المثال، يمكن أن يزيد الترشيح من نقاء الفيروم5، لكنه قد يستبعد الجسيمات الفيروسية الأكبر 6,7. طرق تركيز الفيريون، مثل الطرد المركزي الفوقي، ترسيب البولي إيثيلين جليكول (PEG)، الطرد المركزي الفائق بتدرج الكثافة، والترشيح الفائق، لها أيضا مقايضة بين النقاء والإنتاجية وتكاليف المعدات 3,8. من المعروف أن الكيمياء الاحتياطية المتعددة فعالة في الفيرومكس. قد لا يكون لها تأثيرات كبيرة على توصيف الفيرومات،لكن مخازن التخزين وإعادة التعليق يمكن أن تؤثر على تعافي الفيروس وملفات تعريف الفيروم الناتجة عن التحليل المعلوماتيالحيوي 10،11. وأخيرا، نظرا لأن تركيزات حمض النووي الفيروسي قد تكون منخفضة في العينات الطبيعية، تختار العديد من الدراسات تضخيم الحمض النووي الفيروسي قبل بناء المكتبة (مثل التضخيم المتعدد الإزاحة (MDA) أو التضخيم المستقل عن التسلسل الواحد (SISPA)). ومع ذلك، فإن بعض هذه التقنيات تقدم تحيزا كبيرا12,13. بشكل عام، بينما يمكن للعديد من طرق الفيرومكس توليد الفيرومات بنجاح، فإن البروتوكولات المحسنة التي تعترف بالتحيزات وتكون موحدة إلى حد ما ستمكن من أبحاث فيروم دقيقة وقابلة للتكرار.

تقدم هذه المقالة سير عمل مرن لتوليد الفيرومات من عينات البراز البشري. مقتبس من تقنيات الفيرومكس المثبتةللتربة 14,15,16، يتضمن هذا البروتوكول عدة خطوات تسهل التعديل، مما يمكن الباحثين من تكييفه مع معداتهم واحتياجاتهم البحثية. الطريقة القياسية لفيرومكس التربة الموضحة أدناه، والتي تم تطبيقها بنجاح على عينات التربة والبراز المجمد، تنتج فيرومات عالية الجودة دون خطوة تضخيم الحمض النووي الفيروسي قبل بناء المكتبة. تم اختبار الاقتراحات لتعديلات البروتوكول بدرجات متفاوتة في دراسات أخرى، لكن تأثيراتها المحددة واللاحقة على تسلسلات فيروس البراز البشري لم تدرس هنا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

جميع المشاركين الذين تم تجنيدهم لجمع عينات البراز قدموا موافقة مستنيرة. تمت الموافقة على بروتوكولات جمع العينات من قبل مجلس مراجعة مؤسسات جامعة كاليفورنيا في ديفيس، وتتوافق الدراسات مع إعلان هلسنكي. تم اقتباس هذا البروتوكول من Emerson وآخرون (2022)17.

1. تحضير المواد

  1. تحضير محلول ملحي مخزن بالفوسفات معزز بالبروتين (PPBS، 10x PBS، 1٪ ك-سترات، 150 ملليمولار MgSO4، 2٪ ألبومين مصل البقري (BSA))18.
    ملاحظة: هناك مخازم أخرى شائعة الاستخدام في بروتوكولات الفيروميكس المغنيسيوم المالحي (SM)19 والمخزن المعدل لبيرايم بوتاسيوم-سترات (AKC')11.
    1. أضف 10 مل من 10 مرات PBS، و10 جرام من كستاسيترات، و18.05 جرام من MgSO4 اللامائي إلى زجاجة زجاجية قابلة للتعقيم بسعة 1 لتر واملأها إلى 1 لتر بماء مختبر فائق النقي. اضبط الرقم الهيدروجيني إلى 6.5 (عادة يتطلب حوالي 50 ميكرولتر من 6 M HCl أو حوالي 100 ميكرولتر من 2 M HCl). اترك قضيب تحريك داخل الزجاجة لاستخدامه في الخطوة 1.1.2.
    2. استخدم الزجاجة باستخدام جهاز تخزين مؤقت وزجاجة زجاجية قابلة للتلقي بسعة 1 لتر فارغة. بعد التداخل الداخلي، بمجرد أن يبرد المحلول إلى درجة حرارة الغرفة، ضعه على طبق تحريك مغناطيسي وأضف ببطء 20 جرام من BSA مباشرة إلى الزجاجة، مع إضافة حوالي 5 جرام من BSA في كل مرة (لتجنب الرغوة، تقليل تحريك المحلول بشكل مفرط، مثلا ابدأ بمعدل تحريك بطيء وزد تدريجيا).
    3. قم بترشيح حجم المخزن الكامل عبر فلتر فراغ معقم بحجم 0.22 ميكرومتر إلى زجاجة 1 لتر الفارغة المعقمة من الخطوة 1.1.2. احتفظ بمخزن المخزن عند 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.
      ملاحظة: يمكن تخزين مخزن PPBS عند 4 درجات مئوية لمدة حوالي 3 أشهر، لكنه لا يكون مستقرا على المدى الطويل عند تخزينه فوق درجة الصفر.
  2. جهز أنابيب الطرد المركزي فوق الفائق.
    ملاحظة: يستخدم هذا البروتوكول الطرد المركزي فوق الفائق لتركيز الفيروسات. تشمل الطرق الشائعة الأخرى ترسيب البولي إيثيلين جليكول (PEG)، والطرد المركزي الفائق بتدرج الكثافة (مثل تدرجات كلوريد السيزيوم)، والترشيح الفائق.
    1. لتنظيف أنابيب الطرد المركزي فوق الفائق، أولا، قم بفرك الأنابيب باستخدام ماء المختبر فائق النقي. ثم شطف الأنابيب بماء مختبر فائق النقي.
    2. املأ الأنابيب ب 1 M NaOH واتركه ينقع لمدة ساعة على الأقل (يمكنك تركه ينقع طوال الليل). نظف أغطية الطرد المركزي البلاستيكية/المطاطية وحلقاتها بغمرها في 1 M NaOH.
      ملاحظة: لا تغمر أغطية الأغطية المعدنية ذات اللولب في NaOH.
    3. بعد النقع، اشطف ثلاث مرات بماء مختبر فائق النقي، ثم شطف مرة واحدة باستخدام ماء خالي من النوكلياز وعالي الجودة لعلم الأحياء الجزيئي. جفف الأنابيب عن طريق العكس والنقر بلطف، أو تركها تجف تماما طوال الليل. ضع علامة على كل أنبوب طرد مركزي فوق الفائق بمعرف العينة.
  3. قم بتبريد دوار الطرد المركزي فوق الفائق عند 4 درجات مئوية بترك الدوار في الثلاجة أو الغرفة الباردة طوال الليل.

2. تنقية وتركيز الفيرايونات

  1. وزن البراز في أنبوب مخروطي معقم وخالي من DNase وRNase وDNA بحجم 50 مل.
    ملاحظة: قد تعتمد كمية البراز المستخدمة على كمية المادة العينة المتوفرة. هنا، تم استخدام 2 جرام من البراز. إذا كان يجب تخزين المادة غير المستخدمة في العينة مجمدة، فكر في أخذ العينة بالكامل قبل التجميد لتقليل دورات التجمد والذوبان المستقبلية.
  2. أضف 8 مل من مخزن PPBS مباشرة إلى الأنابيب المخروطية التي تحتوي على البراز (المخروطي #1). أعد تعليقها تماما عن طريق الدوامة.
  3. اهز الأنابيب عند 300 دورة في الدقيقة عند 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق.
    ملاحظة: إذا لزم الأمر، يمكن الرج في درجة حرارة الغرفة، لكن ينصح بدرجة حرارة 4 درجات مئوية.
  4. عينات الطرد المركزي في شكل مخروط #1 عند 4000 × جرام عند 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق.
    ملاحظة: استخدم دوار دلو متأرجح، إذا أمكن، لتسهيل فصل الكثافة الرأسية لتسهيل الخطوات التالية.
  5. قم بإخراج الفائق بحذر إلى مخروطي جديد معقم بحجم 50 مل (مخروطي #2) وتخزين عند 4 درجات مئوية (يحتوي الفائق هنا على الفيروسات). لا تتخلص من الأنبوب المخروطي الذي يحتوي على الحبيبة (المخروطي #1)، حيث يستخدم مرة أخرى في الخطوة 2.6.
  6. كرر الخطوات 2.2-2.5 مرتين إضافيتين (حتى تمر العينة المخروطية #1 بإعادة تعليق إجمالية 3 مرات مع بامز، 3 مرات اهتزاز، و3 مرات الطرد المركزي) واستمر في تجميع المادة الفائقة في مخروط #2.
    ملاحظة: يجب أن تتراكم ثلاث طلقات ~24 مل سوبرناتانت إجمالا.
  7. قم بالطرد المركزي بأنبوب مخروطي بحجم 50 مل يحتوي على سائل فائق متراكم (مخروطي #2) لمدة 8 دقائق عند 10,000 × جرام عند 4 درجات مئوية.
  8. قم بجولة ثانية من الطرد المركزي. أولا، قم بإخراج المادة الفوقية من المخروطي #2 إلى أنبوب مخروطي جديد بحجم 50 مل (مخروطي #3). الطرد المركزي المخروطي #3 لمدة 8 دقائق عند 10,000 × جرام عند 4 درجات مئوية.
  9. باستخدام ترشيح الحقنة، قم بتصفية الفائق من المخروط #3 بشكل متسلسل مع تجنب الحبيبات عند أو بالقرب من أسفل الأنبوب. الفلتر المسبق باستخدام فلتر حقن بولي إيثر سلفون (PES) معقم بحجم 5.0 ميكرومتر، يليه فلتر حقن PES معقم بحجم 0.20 ميكرومتر، مباشرة في أنبوب الطرد المركزي فوق الفائق.
    ملاحظة: الغرض من الترشيح المسبق باستخدام مرشحات 5.0 ميكرومتر هو تقليل انسداد مرشحات 0.20 ميكرومتر. قد يكون من الضروري التخلص من واستبدال مرشحات الحقنة إذا انسددت. يمكن إجراء الترشيح في خطوة واحدة عن طريق تكديس مرشح 5 ميكرومتر فوق مرشح 0.20 ميكرومتر، مربوطا بحقنة واحدة، ومباشرة في أنبوب طرد مركزي فائق. يفضل أغشية PES، حيث يمكن لمواد أغشية أخرى احتفاظ بالفيروسات (مثل ألياف الزجاج) أو الانسداد بشكل أسرع (مثل فلورايد البوليفينيليدين، PVDF). 0.45 ميكرومتر هو حجم مرشح شائع آخر.
  10. تحقق من كتلة جميع أنابيب الطرد المركزي الفائق مع محتوى العينة، وقم بتزويج الأنابيب في الطرد المركزي الخارق بناء على الكتلة. إذا لزم الأمر، أضف PPBS إلى الأنبوب الأخف في كل زوج لمعادلة الوزن (ضمن هامش خطأ 0.05 جرام للأنابيب المزدوجة فقط).
  11. جهاز الطرد المركزي فوق المغناطيسي عند 112,000 x g عند 4 درجات مئوية تحت الفراغ لمدة ساعتين و25 دقيقة.
    ملاحظة: اعتمادا على الدوار المستخدم، ستختلف مدة الدوران (وفقا لمعامل الرواسب = 58). راجع جدول المواد الخاص بالدوار المستخدم هنا. قبل إزالة الأنابيب من جهاز الطرد المركزي الفائق، لاحظ اتجاه كل أنبوب في الدوار للمساعدة في تحديد موقع الرصاصة الفيروسية. أحيانا، بعد الطرد المركزي فوق السطحي، لا تكون الرصاصة الفيروسية مرئية، ويجب توخي الحذر الإضافي عند إزالة المادة الفائقة في الخطوة التالية.

3. إعادة تعليق الحبيبات الفيروسية وعلاج DNase

  1. إزالة الفائق إما عن طريق الديكانت أو باستخدام الماصة، مع الانتباه لعدم إزعاج الحبيبة، التي قد تكون هشة (تحتوي الحبيبات على الفيروسات المركزة).
    ملاحظة: كما ذكر في الخطوة 2.11، قد تكون الحبيبة مرئية أو لا، لكن غالبا ما يمكن رؤية حبيبة بنية أو صفراء بحجم ثقب ثقب.
  2. عالج العينات ب DNase.
    ملاحظة: إذا اخترت عدم معالجة عينات DNase، تابع الخطوة 4 واتبع "إذا لم يتم إجراء علاج DNase". يرجى الرجوع إلى النقاش للبحث حول إجراء علاج DNase.
    1. أعد تعليق الحبيبة في 100 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكلياز وذو درجة الأحياء الجزيئية في أنبوب طرد مركزي دقيق موسوم بحجم 1.5 مل.
    2. قم بعمل خليط معالجة DNase الرئيسي بإضافة 10 ميكرولتر من مخزن تفاعل DNase و10 ميكرولتر من DNase لكل عينة سيتم معالجتها. بيبت لخلطها جيدا.
      ملاحظة: حضر كمية كافية من خليط معالجة DNase الرئيسي لتفاعلات إضافية تأخذ في الاعتبار فقدان الحجم المحتمل أثناء الرش في الخطوة 3.2.3.
    3. أضف 20 ميكرولتر من خليط معالجة DNase الرئيسي إلى الفيروسات المعلقة. اخلط جيدا عن طريق العزف اللطيف على الماصات. حضن على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
    4. أضف 10 ميكرولتر من محلول توقف DNase لتعطيل النوكليز. دوامة قصيرة.

4. استخراج الأحماض النووية الفيروسية

  1. قم باستخراج الحمض النووي باستخدام مجموعة استخراج الحمض النووي المدرجة في جدول المواد.
    ملاحظة: قم بإجراء تعديلين على تعليمات الشركة المصنعة. 1) بعد الخطوة الأولى في إجراء الطقم، سخن أنبوب الخرزات الذي يحتوي على الفيوريون في المخزن CD1 عند 65 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، ثم تابع عملية الاستخراج وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. 2) خلال خطوة إزالة الحمض النووي (الخطوة 16 في إجراء الطقم)، حضن الأعمدة في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق بعد إضافة C6.
    1. إذا تم إجراء معالجة DNase: بعد تعطيل النوكليازات (في الخطوة 3.2.4)، استخدم الحجم الكامل كمدخل لاستخراج الحمض النووي (أي في الخطوة الأولى من إجراء مجموعة استخراج الحمض النووي، أضف هذا الحجم إلى أنبوب الخرزة الذي يحتوي على 800 ميكرولتر من CD1). تأكد من عدم ترك أي محلول خلفك (هذا المحلول يحتوي على الفيرويونات).
    2. إذا لم يتم معالجة DNase: أضف 100 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكلياز وعالي الجودة إلى أنبوب الطرد المركزي الفائق الذي يحتوي على الحبيبة من الخطوة 3.1. اكشط الحبيبة بلطف وأعد تعليقها. استخدم الحبيبة المعلقة كإدخال لاستخراج الحمض النووي.

5. قياس كمية الحمض النووي

  1. قم بقياس الحمض النووي المستخرج باستخدام الطريقة المفضلة القائمة على التألق.
    ملاحظة: نادرا ما تكون نتائج حمض فيروم النووي مرتفعة بما يكفي للقياس المعتمد على الامتصاص؛ ومع ذلك، يمكن أن يكون هذا مفيدا في تحديد الملوثات الكيميائية.
  2. للتخزين قصير الأمد، خزن الحمض النووي عند -20 درجة مئوية بعد القياس. للتخزين لفترات طويلة، خزن عند -80 درجة مئوية. الحمض النووي جاهز الآن للتحضير والتسلسل في المكتبة. يرجى الرجوع إلى جدول المواد لمجموعة تحضير المكتبة ومنصة التسلسل المستخدمة هنا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

أظهر جهد استكشافي لتطبيق هذا البروتوكول على عينة براز مجمدة واحدة (تمت معالجتها بتقنية ثلاثية للفيرومات) إلى جانب عينتين من التربة فعاليته في إنتاج فيرومات عالية الجودة من أنواع عينات مختلفة. باستخدام بيانات تسلسل مصفاة الجودة وبيانات تجميع جديدة مولدة بواسطة هذا البروتوكول، تم تحديد تسلسلات الفيروسات المفترضة باستخدام أداة تحديد الفيروسات مفتوحة المصدر20. ثم تم استخدام القراءات التي تم رسمها إلى الكونتيجيدات الفيروسية المحددة كتقدير للوفرة النسب...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يقدم هذا البروتوكول طريقة بسيطة وقابلة للتكيف نسبيا لتوليد الفيروم. تم إثباته في التربة14، 15، 16، 21، وتم تطبيقه بنجاح هنا على عينات البراز البشري. هذا البروتوكول هو الأفضل لاستعادة فيروسات الحمض النووي خارج الخلية وسليمة، وليس مصمما لاستعادة الفيروسات داخل الخلية أو البارفات (رغم أن بعضها قد يستعاد من الخلايا الملوثة)، أو فيروسات الحمض النووي الكبيرة جدا، أو ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

المؤلفون لا يفرضون أي تضارب مصالح.

شكر وتقدير

نشكر الدكتورة شون آدامز، ترينا نوتس، ومحمد ر. علي (جامعة كاليفورنيا، كلية الطب ديفيس) على جمع وتوفير عينة البراز وفقا لبروتوكولات IRB والمعايير الأخلاقية. نشكر الدكتور ماثيو آر. أولم (جامعة كولورادو، بولدر) على تعاونه في تحليل عينة البراز. وقد دعم هذا البحث من قبل الصندوق المشترك للمعاهد الوطنية للصحة (برنامج فيروس الإنسان)، جائزة # U01DE034198. كما حظيت LSH بدعم جزئي من وزارة الطاقة الأمريكية (DOE)، مكتب العلوم، مكتب البحوث البيولوجية والبيئية (BER)، برنامج علوم الجينوم، رقم الجائزة DE-SC0023127 (منحة ل JBE، منحة PI سيدني غلاسمان).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
مسحوق مصل البقر الألبومين (BSA) خالي من الإنزيمات والبروتيزكواشف فيشر الحيويةBP9706100لوصفة PPBS (الخطوة 1.1)
مجموعة DNeasy PowerSoil Proكياغين47016مجموعة استخراج الحمض النووي (الخطوة 4.1)
مجموعة مكتبة KAPA DNA HyperPrepروشلا يوجدتم ترتيب المكتبات التي تولدها هذه المجموعة باستخدام منصة Illumina NovaSeq 6000 (2 × 150 بيت).
كبريتات المغنيسيوم (MgSO4)، لامائية، > 99.5%سيغما-ألدرتشM7506لوصفة PPBS (الخطوة 1.1)
محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)، 10x، رقم الهيدروجينيوم 7.4، خال من RNaseإنفيتروجينAM9624لوصفة PPBS (الخطوة 1.1)
مرشحات غشاء الحقن من بولي إيثير سلفون (PES)، معقمة، 28 مم، 0.2 & mu؛ mكورنينغ431229للترشيح بالحقنة (الخطوة 2.9)
أنابيب الطرد المركزي المخروطية من البولي بروبيلين، معقمة، 50 ملأوليمبوس بلاستكس28-108
سترات البوتاسيوم أحادي الهيدرات (بلوري/معتمد)فيشر كيميكالP222لوصفة PPBS (الخطوة 1.1)
كيوبت  أنابيب الفحصإنفيتروجينس32856لقياس كمية الحمض النووي (الخطوة 5.1)
فلوروميتر الكيوبت 4إنفيتروجينQ33238لقياس كمية الحمض النووي (الخطوة 5.1)
مجموعات قياس كمية الحمض النووي الكيوبت dsDNAإنفيتروجينQ32850لقياس كمية الحمض النووي (الخطوة 5.1)
RQ1 DNase الخالي من RNaseبروميغاPR-M6101يشمل مخزن التفاعل، وDNase، وحل الإيقاف
مرشحات غشاء البولي إيثير سلفون (PES) المحبة للماء (PES)، معقمة، 32 مم، 5.00 وميكرو؛ m سايتيفا (سابقا بال لاب)28150-956للترشيح بالحقنة (الخطوة 2.9)
دوار الطرد المركزي الفائق: دوار من النوع 50.2 Ti بزاوية ثابتة، 50,000 دورة في الدقيقة، 302.000 × g، 12 × 39 مبيكمان كولتر337901نستخدم أيضا دوار بيكمان كولتر Type 70 Ti الثابت الزاوية من التيتانيوم (الفئة 337922). الطرد المركزي لمدة 3 ساعات إذا كنت أستخدم 70 Ti.
أنابيب الطرد المركزي فوق الفائق: زجاجة بولي كربونات بسعة 26.3 مل مع مجموعة غطاء، 25 × 89 ممبيكمان كولتر355618متوافقة مع دوارات بيكمان كولتر من النوع 50.2 Ti (الفئة 337901) والنوع 70 Ti (الفئة 337922)
الطرد المركزي فوق الفائق: جهاز الطرد المركزي الخارق للأرضية من شركة بيكمان إنسترومنتس أوبتيما LE-80Kبيكمان كولتر365668نستخدم أيضا جهاز Beckman Coulter L8-70M المبرد فوق المركزي (Cat. 344196)

المراجع

  1. Breitbart, M., et al. Metagenomic Analyses of an Uncultured Viral Community from Human Feces. J Bacteriol. 185 (20), 6220-6223 (2003).
  2. Liang, G., Bushman, F. D. The human virome: assembly, composition and host interactions. Nat Rev Microbiol. 19 (8), 514-527 (2021).
  3. Callanan, J., Stockdale, S. R., Shkoporov, A., Draper, L. A., Ross, R. P., Hill, C. Biases in Viral Metagenomics-Based Detection, Cataloguing and Quantification of Bacteriophage Genomes in Human Faeces, a Review. Microorganisms. 9 (3), 524(2021).
  4. Garmaeva, S., Sinha, T., Kurilshikov, A., Fu, J., Wijmenga, C., Zhernakova, A. Studying the gut virome in the metagenomic era: challenges and perspectives. BMC Biol. 17 (1), 84(2019).
  5. Lewandowska, D. W., et al. Optimization and validation of sample preparation for metagenomic sequencing of viruses in clinical samples. Microbiome. 5 (1), 94(2017).
  6. Conceição-Neto, N., et al. Modular approach to customise sample preparation procedures for viral metagenomics: a reproducible protocol for virome analysis. Sci Rep. 5 (1), 16532(2015).
  7. Palermo, C. N., Shea, D. W., Short, S. M. Analysis of Different Size Fractions Provides a More Complete Perspective of Viral Diversity in a Freshwater Embayment. Appl Environ Microbiol. 87 (11), e00197-e00221 (2021).
  8. Kleiner, M., Hooper, L. V., Duerkop, B. A. Evaluation of methods to purify virus-like particles for metagenomic sequencing of intestinal viromes. BMC Genomics. 16 (1), 7(2015).
  9. Fudyma, J. D., et al. Exploring viral particle, soil, and extraction buffer physicochemical characteristics and their impacts on extractable viral communities. Soil Biol Biochem. 194, 109419(2024).
  10. Zhai, X., et al. The impact of storage buffer and storage conditions on fecal samples for bacteriophage infectivity and metavirome analyses. Microbiome. 11 (1), 193(2023).
  11. Trubl, G., Solonenko, N., Chittick, L., Solonenko, S. A., Rich, V. I., Sullivan, M. B. Optimization of viral resuspension methods for carbon-rich soils along a permafrost thaw gradient. PeerJ. 4, e1999(2016).
  12. Roux, S., et al. Towards quantitative viromics for both double-stranded and single-stranded DNA viruses. PeerJ. 4, e2777(2016).
  13. Kim, K. H., Bae, J. W. Amplification methods bias metagenomic libraries of uncultured single-stranded and double-stranded DNA viruses. Appl Environ Microbiol. 77 (21), 7668(2011).
  14. ter Horst, A. M., et al. Minnesota peat viromes reveal terrestrial and aquatic niche partitioning for local and global viral populations (vol 9, 233, 2021). Microbiome. 9 (1), (2021).
  15. Sorensen, J., Zinke, L., ter Horst, A., Santos-Medellín, C., Schroeder, A., Emerson, J. DNase Treatment Improves Viral Enrichment in Agricultural Soil Viromes. mSystems. 6 (5), e00614-e00621 (2021).
  16. Santos-Medellín, C., Estera-Molina, K., Yuan, M., Pett-Ridge, J., Firestone, M. K., Emerson, J. B. Spatial turnover of soil viral populations and genotypes overlain by cohesive responses to moisture in grasslands. Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (45), e2209132119(2022).
  17. Emerson, J. B., Geonczy, S. E., Santos-Medellín, C., ter Horst, A. M., Fudyma, J. D. Soil Viromics Protocol - Emerson Lab v1. Protocols.io. , https://protocols.io/view/soil-viromics-protocol-emerson-lab-v1-b7nyrmfw/v1 (2022).
  18. Göller, P. C., Haro-Moreno, J. M., Rodriguez-Valera, F., Loessner, M. J., Gómez-Sanz, E. Uncovering a hidden diversity: optimized protocols for the extraction of dsDNA bacteriophages from soil. Microbiome. 8 (1), 17(2020).
  19. Larsen, F. SM buffer. , Protocols.io. https://www.protocols.io/view/sm-buffer-8epv5967jg1b/v1 (2021).
  20. Camargo, A. P., et al. Identification of mobile genetic elements with geNomad. Nat Biotechnol. , (2023).
  21. Santos-Medellín, C., Blazewicz, S. J., Pett-Ridge, J., Firestone, M. K., Emerson, J. B. Viral but not bacterial community successional patterns reflect extreme turnover shortly after rewetting dry soils. Nat Ecol Evol. 7 (11), 1809-1822 (2023).
  22. Halary, S., Temmam, S., Raoult, D., Desnues, C. Viral metagenomics: are we missing the giants. Curr Opin Microbiol. 31, 34-43 (2016).
  23. Williamson, S. J., et al. Metagenomic exploration of viruses throughout the Indian Ocean. PLoS One. 7 (10), e42047(2012).
  24. Liang, G., et al. The stepwise assembly of the neonatal virome is modulated by breastfeeding. Nature. 581 (7809), 470-474 (2020).
  25. Hillary, L. S., Knotts, T. A., Adams, S. H., Ali, M. R., Olm, M. R., Emerson, J. B. DNA extraction and virome processing methods strongly influence recovered human gut viral community characteristics. bioRxiv. , (2025).
  26. Santos-Medellín, C., Zinke, L. A., ter Horst, A. M., Gelardi, D. L., Parikh, S. J., Emerson, J. B. Viromes outperform total metagenomes in revealing the spatiotemporal patterns of agricultural soil viral communities. ISME J. 15 (7), 1956-1970 (2021).
  27. Gregory, A. C., Zablocki, O., Zayed, A. A., Howell, A., Bolduc, B., Sullivan, M. B. The Gut Virome Database Reveals Age-Dependent Patterns of Virome Diversity in the Human Gut. Cell Host Microbe. 28 (5), 724-740 (2020).
  28. Yilmaz, S., Allgaier, M., Hugenholtz, P. Multiple displacement amplification compromises quantitative analysis of metagenomes. Nat Methods. 7 (12), 943-944 (2010).
  29. Kosmopoulos, J. C., Klier, K. M., Langwig, M. V., Tran, P. Q., Anantharaman, K. Viromes vs. mixed community metagenomes: choice of method dictates interpretation of viral community ecology. Microbiome. 12 (1), 195(2024).
  30. Zhai, X., Gobbi, A., Kot, W., Krych, L., Nielsen, D. S., Deng, L. A single-stranded based library preparation method for virome characterization. Microbiome. 12 (1), 219(2024).
  31. Hillary, L. S., Adriaenssens, E. M., Jones, D. L., McDonald, J. E. RNA-viromics reveals diverse communities of soil RNA viruses with the potential to affect grassland ecosystems across multiple trophic levels. ISME Commun. 2, 34(2022).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

تحليل الميتاجينوميات لحجم الفيروسات في الحمض النووي لعينات البراز البشري
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.