تحليل الميتاجينوميات لحجم الفيروسات في الحمض النووي لعينات البراز البشري

ملخص

نقدم بروتوكولا مرنا لتوليد ميتاجينومات كسر فيروسية عالية الجودة (viromes) من عينات براز بشري. تم تطوير هذا البروتوكول في الأصل لفيروميكس التربة، وهنا تم تطبيق هذا البروتوكول بنجاح على عينات البراز، مما مكن من توصيف قوي لفيروسفير الأمعاء البشري.

الملخص

فهم الفيروسفير البشري السليم (المكون الفيروسي للميكروبيوم) يتطلب قياسات دقيقة لتركيب مجتمع الفيروسات عبر مجموعة متنوعة من أنواع الفيروس. استنادا إلى الخبرة السابقة في طرق بيئة مجتمع فيروسات التربة، نعرض هنا سلسلة من الأساليب المخبرية لإثراء واستخراج الحمض النووي من فيروسات الحمض النووي خارج الخلية في عينات البراز البشري. يتم تقديم بروتوكول أساسي عامل، مع خيارات للانحرافات في خطوات مختلفة. يتضمن النهج العام إضافة حاجز سائل (افتراضي: محلول ملحي معزز بالفوسفات المعززة بالبروتين، PPBS) لتسهيل إزالة جزيئات الفيروس الحرة من مصفوفة البراز، والطرد المركزي لفصل الجزء السائل الذي يحتوي على جزيئات فيروسية، والترشيح (الافتراضي: 0.2 ميكرومتر حجم المسام) لإزالة معظم الخلايا، وتركيز الجسيمات الفيروسية (الافتراضي: الطرد المركزي فوق السطحي)، وإزالة الأحماض النووية الحرة مع النوكلياز قبل تحلل الفيروس، ثم استخراج الحمض النووي للتسلسل. كما تم ملاحظة تقنيات بديلة، بما في ذلك المخازن المختلفة، وأحجام المرشحات، وطرق التركيز. بشكل عام، تتوفر عدة خيارات لتوليد حمض نووي فيرومي عالي الجودة للتتابع. بدلا من تخصيص النهج لمعدات وموارد محددة، يجب أن تجعله مرونة البروتوكول قابلا للتطبيق على نطاق واسع عبر المختبرات التي تحتوي على معدات علم الأحياء الجزيئي القياسية المتنوعة.

المقدمة

الفيرومكس، أو التسلسل غير المستهدف لحجم حجم الفيروسات في المجتمعات المختلطة، يمكن أن يوفر رؤى حول تنوع وتطور وبيئة الفيروسات غير المزروعة. منذ الجهود المبكرة لتصنيف مجتمعات الفيروسات في الأمعاء قبل أكثر من 20 عاما، والتي استخدمت بشكل ملحوظ أساليب تم تطويرها لعينات بيئية مثل مياه البحر¹، استمرت طرق الفيروميكس في تمكين الاكتشافات في علم البيئة الفيروسي داخل الميكروبيوم^{البشري 2}. ومع ذلك، لا يوجد بروتوكول فيرومكس عالمي واحد، ويمكن أن تؤثر الاختلافات في التقنيات على نتائج التسلسل ^3,4، مما يؤثر في النهاية على تفسير ديناميكيات مجتمع الف....

البروتوكول

جميع المشاركين الذين تم تجنيدهم لجمع عينات البراز قدموا موافقة مستنيرة. تمت الموافقة على بروتوكولات جمع العينات من قبل مجلس مراجعة مؤسسات جامعة كاليفورنيا في ديفيس، وتتوافق الدراسات مع إعلان هلسنكي. تم اقتباس هذا البروتوكول من Emerson وآخرون (2022)¹⁷.

1. تحضير المواد

1. تحضير محلول ملحي مخزن بالفوسفات معزز بالبروتين (PPBS، 10x PBS، 1٪ ك-سترات، 150 ملليمولار MgSO₄، 2٪ ألبومين مصل البقري (BSA))¹⁸.
   ملاحظة: هناك مخازم أخرى شائعة الاستخدام في بروتوكولات الفيروميكس المغنيسيوم المالحي (SM)¹⁹ والمخزن المع....

النتائج

أظهر جهد استكشافي لتطبيق هذا البروتوكول على عينة براز مجمدة واحدة (تمت معالجتها بتقنية ثلاثية للفيرومات) إلى جانب عينتين من التربة فعاليته في إنتاج فيرومات عالية الجودة من أنواع عينات مختلفة. باستخدام بيانات تسلسل مصفاة الجودة وبيانات تجميع جديدة مولدة بواسطة هذا البروتوكول، تم تحديد تسلسلات الفيروسات المفترضة باستخدام أداة تحديد الفيروسات مفتوحة المصدر²⁰. ثم تم استخدام القراءات التي تم رسمها إلى الكونتيجيدات الفيروسية المحددة كتقدير للوفرة النسب.......

المناقشة

يقدم هذا البروتوكول طريقة بسيطة وقابلة للتكيف نسبيا لتوليد الفيروم. تم إثباته في التربة^{14، 15، 16، 21}، وتم تطبيقه بنجاح هنا على عينات البراز البشري. هذا البروتوكول هو الأفضل لاستعادة فيروسات الحمض النووي خارج الخلية وسليمة، وليس مصمما لاستعادة الفيروسات داخل الخلية أو البارفات (رغم أن بعضها قد يستعاد من الخلايا الملوثة)، أو فيروسات الحمض النووي الكبيرة جدا، أو .......

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
مسحوق مصل البقر الألبومين (BSA) خالي من الإنزيمات والبروتيز	كواشف فيشر الحيوية	BP9706100	لوصفة PPBS (الخطوة 1.1)
مجموعة DNeasy PowerSoil Pro	كياغين	47016	مجموعة استخراج الحمض النووي (الخطوة 4.1)
مجموعة مكتبة KAPA DNA HyperPrep	روش	لا يوجد	تم ترتيب المكتبات التي تولدها هذه المجموعة باستخدام منصة Illumina NovaSeq 6000 (2 × 150 بيت).
كبريتات المغنيسيوم (MgSO4)، لامائية، > 99.5%	سيغما-ألدرتش	M7506	لوصفة PPBS (الخطوة 1.1)
محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)، 10x، رقم الهيدروجينيوم 7.4، خال من RNase	إنفيتروجين	AM9624	لوصفة PPBS (الخطوة 1.1)
مرشحات غشاء الحقن من بولي إيثير سلفون (PES)، معقمة، 28 مم، 0.2 & mu؛ m	كورنينغ	431229	للترشيح بالحقنة (الخطوة 2.9)
أنابيب الطرد المركزي المخروطية من البولي بروبيلين، معقمة، 50 مل	أوليمبوس بلاستكس	28-108
سترات البوتاسيوم أحادي الهيدرات (بلوري/معتمد)	فيشر كيميكال	P222	لوصفة PPBS (الخطوة 1.1)
كيوبت  أنابيب الفحص	إنفيتروجين	س32856	لقياس كمية الحمض النووي (الخطوة 5.1)
فلوروميتر الكيوبت 4	إنفيتروجين	Q33238	لقياس كمية الحمض النووي (الخطوة 5.1)
مجموعات قياس كمية الحمض النووي الكيوبت dsDNA	إنفيتروجين	Q32850	لقياس كمية الحمض النووي (الخطوة 5.1)
RQ1 DNase الخالي من RNase	بروميغا	PR-M6101	يشمل مخزن التفاعل، وDNase، وحل الإيقاف
مرشحات غشاء البولي إيثير سلفون (PES) المحبة للماء (PES)، معقمة، 32 مم، 5.00 وميكرو؛ m	سايتيفا (سابقا بال لاب)	28150-956	للترشيح بالحقنة (الخطوة 2.9)
دوار الطرد المركزي الفائق: دوار من النوع 50.2 Ti بزاوية ثابتة، 50,000 دورة في الدقيقة، 302.000 × g، 12 × 39 م	بيكمان كولتر	337901	نستخدم أيضا دوار بيكمان كولتر Type 70 Ti الثابت الزاوية من التيتانيوم (الفئة 337922). الطرد المركزي لمدة 3 ساعات إذا كنت أستخدم 70 Ti.
أنابيب الطرد المركزي فوق الفائق: زجاجة بولي كربونات بسعة 26.3 مل مع مجموعة غطاء، 25 × 89 مم	بيكمان كولتر	355618	متوافقة مع دوارات بيكمان كولتر من النوع 50.2 Ti (الفئة 337901) والنوع 70 Ti (الفئة 337922)
الطرد المركزي فوق الفائق: جهاز الطرد المركزي الخارق للأرضية من شركة بيكمان إنسترومنتس أوبتيما LE-80K	بيكمان كولتر	365668	نستخدم أيضا جهاز Beckman Coulter L8-70M المبرد فوق المركزي (Cat. 344196)