استخدمت هذه الدراسة تسلسل 16S rRNA لمقارنة ميكروبيوم الأمعاء بين الضوابط الأصحاء، ومرضى باركنسون غير المعالجين، ومرضى باركنسون المعالجين بالبيريبيديل، وحددت فروقات في تركيب الميكروبات المرتبطة بعلاج البيريبيديل.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة بحثية
استخدمت هذه الدراسة تسلسل 16S rRNA لمقارنة ميكروبيوم الأمعاء بين الضوابط الأصحاء، ومرضى باركنسون غير المعالجين، ومرضى باركنسون المعالجين بالبيريبيديل، وحددت فروقات في تركيب الميكروبات المرتبطة بعلاج البيريبيديل.
هدفت هذه الدراسة إلى تحديد ما إذا كان علاج البيريبيديل يغير ميكروبيوتا الأمعاء لدى مرضى باركنسون، موفرا مرجعا نظريا لفهم تغيرات ميكروبيوم الأمعاء الناتجة عن البيريبيديل وآثارها السريرية المحتملة. تم تحليل عينات البراز باستخدام تسلسل جيني 16S للحمض النووي الريبوزومي (16S rRNA). تمت المقارنات بين مرضى باركنسون الذين تناولوا البيريبيديل (مجموعة البيريبيديل)، والمرضى الذين لم يتناولوا البيريبيديل (مجموعة اضطراب باركنسون)، ومجموعة الضوابط الأصحاء (المجموعة الفارغة). مقارنة بالمجموعة الفارغة، كانت الوفرة النسبية للمكورات العنقودية والرودوكوس والأجناس الأخرى أعلى في مجموعة مرض باركنسون، بينما كانت وفرة الأكروموباكتر والدلفتيا أقل. علاوة على ذلك، كانت الوفرة النسبية للأكروموباكتر، دلفتيا، وستينوتروفوموناس أعلى في مجموعة البيريبيديل مقارنة بمجموعة باركنسون، في حين كانت الوفرة النسبية للمكورات العنقودية والرودوكوس وغيرها أقل. مقارنة بالأفراد الأصحاء، أظهرت ميكروبيوتا الأمعاء لدى مرضى باركنسون تغيرات كبيرة. تختلف ميكروبيوم الأمعاء لدى المرضى الذين يتناولون البيريبيديل بشكل كبير عن تلك الخاصة بالمرضى غير المعالجين. تشير هذه النتائج إلى وجود علاقة بين البيريبديل وميكروبيوم الأمعاء المتغير لدى مرضى باركنسون.
معدل الإصابة بمرض باركنسون (PD) في تزايد تدريجي؛ ومع ذلك، لم يتم توضيح أسبابه ومنشأته المرضية بالكامل بعد. أشارت المزيد من الدراسات إلى أن ميكروبيوم الأمعاء مرتبط ارتباطا وثيقا ببداية وتطور مرض باركنسون. وثقهو وآخرون أن تركيب ميكروبيوم الأمعاء لدى مرضى باركنسون يختلف عن الأشخاص الأصحاء، وأن زيادة مسببات الأمراض المعوية قد تكون مرتبطة ببداية المرض. أكدشيبرانز وآخرون أن الوفرة النسبية للبريفوتيلا والباكتيرويدات في أمعاء مرضى باركنسون تقل. وأن هذه الأجناس البكتيرية مرتبطة ارتباطا وثيقا بوظيفة الحاجز المعوي.
بحثت عدة دراسات في العلاقة بين ميكروبيوم الأمعاء ومرض باركنسون. تشير الأبحاث إلى أن خلل الحيوية قد يلعب دورا حيويا في الفيزيولوجيا المرضية لمرض باركنسون، حيث يؤثر على الأعراض الحركية وغير الحركية من خلال آليات متعددة، بما في ذلك الالتهاب والاضطرابات الأيضية3. بالإضافة إلى ذلك، أظهرت العلاجات الدوائية لمرض باركنسون أنها تغير تركيب ميكروبيوم الأمعاء 4,5، مما يبرز التفاعل المعقد بين الأدوية وميكروبيوم الأمعاء.
بصفته منهيذا غير انتقائي لمستقبلات الدوبامين، يلعب البيريبيديل دورا أساسيا في إدارة مرض باركنسون؛ يمكن أن يحسن الأعراض الحركية لدى المرضى عن طريق تحفيز مستقبلات الدوبامين6. ومع ذلك، غالبا ما يكون استخدامه السريري محدودا بسبب ردود الفعل السلبية، خاصة الأعراض الهضمية مثل الغثيان والقيء والانزعاج في البطن. لا تزال الآلية الأساسية لهذه الآثار الجانبية غير واضحة، وما إذا كانت مرتبطة بتغيرات في ميكروبيوم الأمعاء الناتجة عن البيريبيديل لا يزال غير معروف.
لقد حظي الرابط بين ميكروبيوم الأمعاء وردود الفعل السلبية للأدوية باهتمام متزايد في السنوات الأخيرة. قامهيل-بيرنز وآخرون بتحليل ميكروبيوم الأمعاء لدى مرضى باركنسون ووجدوا أن تنوع ميكروبيوتا الأمعاء مرتبط بالاستجابة للعلاج الدوائي. بالإضافة إلى ذلك، قد تؤثر منشطات الدوبامين على حركة الأمعاء وتركيب الميكروبات9. يعتقد أن الآليات وراء هذه التغيرات تتعلق بتغيرات في توقيت نقل الأمعاء، والتي تؤثر بدورها على تنوع ووفرة الميكروبات. علاوة على ذلك، يمكن لميكروبيوتا الأمعاء أن تؤثر على امتصاص الدواء ومعدل الأيض10، مما يؤثر على فعالية وآثار جانبية لهذه الأدوية. ومع ذلك، لا يزال هناك نقص في الأبحاث المنهجية حول ما إذا كان وكيف يضبط البيريبيديل، وهو عامل شائع الاستخدام لمرض باركنسون، بنية ميكروبيومات الأمعاء، بالإضافة إلى العلاقة بين هذه التحولات الميكروبية وردود أفعالها السلبية في الجهاز الهضمي.
في هذه الدراسة، قارنا بنية ميكروبيوتا الأمعاء بين الضوابط الأصحاء، ومرضى باركنسون غير المعالجين، ومرضى باركنسون الذين عولجوا بالبيريبيديل. افترضنا أن علاج البيريبيديل مرتبط بتغيرات واضحة في تركيب ميكروبيوم الأمعاء لدى مرضى باركنسون، وأن هذه التغيرات الميكروبية قد تكون مرتبطة بآثار جانبية معوية مرتبطة بالبيربيديل. هدفنا هو تحديد التغيرات الميكروبية المحددة المرتبطة بالبيريبيديل واستكشاف ارتباطها المحتمل بالآثار الجانبية على الجهاز الهضمي، مما يوفر أساسا نظريا لفهم آلية التفاعلات السلبية المرتبطة بالبيريبيديل.
تعد ميكروبيوم الأمعاء اتجاها مهما للبحث حول مسببات مرض باركنسون11. من خلال مراقبة تأثيرات البيريبيديل على ميكروبيوم الأمعاء لدى مرضى باركنسون، تساعد هذه الدراسة في توضيح الأهمية السريرية لتغيرات ميكروبيومات الأمعاء المرتبطة بالأدوية وتوفر مرجعا لتحسين الاستخدام السريري وإدارة السلامة للبيريبيديل.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
تمت مراجعة هذه الدراسة من قبل لجنة الأخلاقيات في المستشفى الأول التابع لجامعة أنهوي للطب الصيني (رقم مراجعة الأخلاقيات: 2025AH-101، تاريخ الموافقة الأخلاقية: 2025-07-02).
مواضيع البحث
تم تسجيل مرضى باركنسون وضباط صحيين في المستشفى الأول التابع لجامعة أنهوي للطب الصيني. تم جمع عينات براز جديدة للتحليل المتابع. تم جمع عينات براز طازجة، وتحويلها إلى أنابيب EP معقمة، ثم تجمدها فورا في النيتروجين السائل، ثم تخزينها عند −80 درجة مئوية للحفاظ على المدى الطويل. كانت معايير إدراج مرضى باركنسون كما يلي: (1) تم تشخيصهم سريريا بمرض باركنسون؛ (2) العمر >70 سنة؛ (3) بالنسبة لمجموعة بيريبيديل: بدأت العلاج الأحادي بالبيريبديل بعد التسجيل ولم تتعرض سابقا لهذا الدواء؛ بالنسبة لمجموعة اضطرابات باركنسون: عدم الخضوع للعلاج بأدوية مضادة لباركنسون؛ (4) لا توجد أمراض جهازية خطيرة أخرى، مثل أمراض القلب الخطيرة، أمراض الكبد، أمراض الكلى، أو السرطان. قبل التسجيل، كان يتم الحصول على موافقة مكتوبة مستنيرة من كل مشارك. كانت معايير الاستبعاد كما يلي: (1) المضاعفات الشديدة لمرض باركنسون، مثل ضعف الحركة الشديد؛ (2) تلقى علاجا مضادا حيويا مؤخرا؛ (3) وجود حالات صحية أخرى قد تؤثر على نتائج الدراسة، مثل أمراض الأمعاء الالتهابية، متلازمة القولون العصبي، وغيرها؛ (4) يعاني من حساسية تجاه البيريبيديل. كان الأشخاص الأصحاء من مجموعة الضابطين (المجموعة الفارغة) أفرادا متطابقا في العمر (>70 سنة) بدون تاريخ من أمراض الجهاز الهضمي العصبية أو الرئيسية.
كان مطلوبا من جميع المشاركين الحفاظ على عاداتهم الغذائية المعتادة قبل التسجيل. لم يتلق أي منها بروبيوتيك أو بريبايوتيك أو مكملات ألياف غذائية أو مكملات غذائية أخرى. بالإضافة إلى ذلك، لم يتلق جميع المشاركين أي علاج مضاد حيوي لمدة لا تقل عن ثلاثة أشهر قبل جمع العينة. لم يتم إجراء أي تدخل غذائي موحد خلال الدراسة، لكن تم توجيه جميع المشاركين للحفاظ على نمط حياة ونظام غذائي مستقر لتقليل التأثيرات المربكة المحتملة على ميكروبيوم الأمعاء.
مجموعة البحث
تم تقسيم مجموعة الدراسة هذه إلى ثلاث مجموعات: مجموعة باركنسون (n = 10): عينات براز تم جمعها من مرضى باركنسون الذين لم يتناولوا أدوية مضادة لباركنسون. مجموعة بيريبيديل (n=10): عينات براز تم جمعها من مرضى باركنسون بعد 21 يوما متتاليا من العلاج بالبيريبيديل (50 ملغ، مرتين يوميا). مجموعة الضابط الفارغة (n=5): عينات براز مأخوذة من أفراد أصحاء.
تسلسل الحمض النووي الريبوزومي 16S
تم إجراء التسلسل على منصة تسلسل، كما ورد في دراسات أخرى12،13، باختصار، تم عزل الحمض النووي الميكروبي الكلي من عينات براز باستخدام طريقة كبريتات الصوديوم الدوديسيل (SDS)14،15،16. تم التحقق من سلامة الحمض النووي المستخرج بواسطة الرحلان الكهربائي الهلام ب 1٪ من الأغاروز، وتم تحديد تركيز ونقاء الحمض النووي باستخدام مقياس طياف الضوئي. تم تضخيم المنطقة فائقة المتغيرة V3-V4 من جين 16S rRNA البكتيري من الحمض النووي الجينومي باستخدام بادئات متدهورة 341F (5'-CCTAYGGGRBGCASCAG-3') و806R (5'-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3') باستخدام دورة حرارة تفاعل بوليميراز المتسلسل (PCR). تم تضخيم جين الحمض النووي البكتيري 16S rRNA تحت الظروف الحرارية التالية: خطوة أولية قبل الإزالة عند 94 درجة مئوية لمدة دقيقتين، تليها 28 دورة تتضمن إزالة الطبيعة بمقدار 94 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، وتلدين بمقدار 55 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، وتمديد 72 درجة مئوية لمدة 30 ثانية. تم إجراء تمديد أخير عند 72 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، ثم تم الحفاظ على التفاعل عند 4 درجات مئوية. تحتوي خلطات PCR على 2× خليط رئيسي PCR بسعة 25 ميكرولتر، وبرايمر أمامي (10 ميكرومول) 2 ميكرولتر، وبرايمر عكسي (10 ميكرومول) 2 ميكرولتر، وحمض DNA قالب بمقدار 10 نانوغرام، وأخيرا ddH2O حتى 50 ميكرولتر. أجريت تفاعلات PCR على ثلاث نسخ. تحتوي خلطات PCR على 2× خليط رئيسي PCR بسعة 25 ميكرولتر، وبرايمر أمامي (10 ميكرومول) 2 ميكرولتر، وبرايمر عكسي (10 ميكرومولار) 2 ميكرولتر، وحمض DNA القالب 10 نانوغرام، وأخيرا ddH2O حتى 50 ميكرولتر. أجريت تفاعلات PCR على ثلاث نسخ. تم استخراج منتج PCR من هلام أغاروز بنسبة 2٪ وتنقيه باستخدام مجموعة استخراج هلامية. تم استخدام مجموعة التحضير لمكتبة الحمض النووي Universal Plus ل MGI V2 لبناء المكتبة: (1) رابط شظي؛ (2) استخدام التغطية المغناطيسية لإزالة الأجزاء المتصلة ذاتية الوصلات في الوصلة؛ (3) إثراء قوالب المكتبة من خلال تضخيم PCR؛ (4) خرزات مغناطيسية لاستعادة منتجات PCR؛ (5) تدوير منتجات PCR. بعد التحقق من صحة المكتبة، تم إجراء التسلسل.
نقاط تفتيش الجودة: نقطة التحقق 1 (جمع العينات): تم تجميد العينات فورا بعد الجمع وتخزينها عند −80°م. أي عينة تظهر عليها علامات واضحة على الذوبان أو التلوث تم التخلص منها. نقطة التحقق 2 (استخراج الحمض النووي): النقاء المقبول: A260/A280 = 1.8–2.0، A260/A230 ≥1.8; تم التحقق من السلامة بواسطة شريط واحد عالي الوزن الجزيئي على هلام أغاروز بنسبة 1٪. نقطة التحقق 3 (تضخيم PCR): نطاق واحد عند ~460bp على جل أجاروز بنسبة 2٪ يشير إلى تضخيم ناجح (بادئات 341F/806R، منطقة V3-V4); إذا كان غائبا أو غير محدد، قم بضبط درجة حرارة التلدين أو تركيز القالب. كان تركيز الاسترداد مطلوبا ≥0.5 نانوغرام/ميكرولتر للتحضير في المكتبة. نقطة التحقق 4 (تحضير المكتبة والترتيب): يتم تنفيذها بواسطة منشأة التسلسل وفقا لبروتوكولاتهم القياسية المعتمدة؛ لم يتم تطبيق نقطة تفتيش داخلية إضافية (مثل مقاسات التحليل الحيوي).
السلامة والتخلص من النفايات: تم ارتداء القفازات ومعاطف المختبر أثناء جميع عمليات التعامل مع العينات. تم تنظيف أسطح العمل بنسبة 70٪ إيثانول. تم توظيف جميع المواد الاستهلاكية الملوثة (الأطراف، الأنابيب، الجل) بمعدل تعقيم (121°C، 20 دقيقة) قبل التخلص منها كنفايات بيولوجية خطرة.
المعلوماتية الحيوية
تم أولا فك التتابع الخام لجين 16S rRNA، وخضعت لترشيح عالي الجودة باستخدام fastp (الإصدار 0.20.0)، وتجميعها عبر FLASH (الإصدار 1.2.11) وفقا لمعايير الفحص الموحدة. باختصار: (1) تم تقليص تسلسلات Raw 300 نقطة أساس عندما انخفض متوسط درجة الجودة إلى أقل من 20 خلال نافذة انزلاق 50 نقطة نقطة. تمت إزالة القراءات ذات الأطوال المقطوعة التي تقل عن 50 بيسا أو التي تحتوي على قواعد غامضة؛ (2) تم إجراء تجميع التسلسل فقط للتداخلات التي تتجاوز 10 نقاط قوت، مع تحديد أقصى نسبة عدم تطابق لمنطقة التداخل عند 0.2. تم القضاء على القراءات غير المزدوجة التي لم يتم تجميعها؛ (3) تم تقسيم العينات الفردية بناء على تسلسلات الباركود والبادئية لتعديل الاتجاه لاحقا. تم تنفيذ مطابقة الباركود بمحاذاة دقيقة، بينما سمح مطابقة البادئات بحد أقصى لوجود 2 عدم تطابق للنوكليوتيد. تم تحليل قراءات 16S rRNA باستخدام خط أنابيب الرؤى الكمية في علم البيئة الميكروبية (QIIME) (الإصدار 1.8.0)17. تمت إضافة تسلسلات الوسوم إلى قراءات النهايات المزدوجة باستخدام FLASH (الإصدار 1.2.11)18. تم إجراء التقليم باستخدام UPARSE (الإصدار 7.0.1090) بطول لا يقل عن 200 قطعة أساس ومتوسط جودة 25، تلاها التجميع عند حد حد 97٪ لتوليد وحدات تصنيفية تشغيلية (OTUs)19. تم تصنيف قراءات OTU التمثيلية تصنيفيا عبر تصنيف RDP 2.2، مع حد ثقة ≥0.6. تم تحديد وفرة الوسوم والقراءة بالمقارنة باستخدام USEARCH Global20. تم تحديد تسلسلات الكيميرية بناء على المقارنات مع قاعدة بيانات جولد باستخدام UCHIME (v4.2.40)21. تم إجراء تحليل الإحداثيات الرئيسية (PCoA) لاحقا على مجموعة البيانات المتفرقة بناء على اختلاف براي–كيرتس، مع تحديد عتبة التشابه التسلسلي عند 97٪ للتجميع. تم تحليل وحدات OTUs الممثلة والملفات التصنيفية المقابلة بشكل إضافي باستخدام برنامج R (الإصدار 3.1.1). تم تطبيق خوارزمية حجم تأثير التحليل الخطي المميز (LEfSe)، المبنية على حجم تأثير التحليل الخطي المميز (LDA)، على مؤشرات الفحص الحيوي ذات الفروق التفاضلية الكبيرة على مستوى OTU. تركز هذه الطريقة على كل من الدلالة الإحصائية والأهمية البيولوجية من خلال تحديد الميزات التي تحتوي على اختلافات متسقة بين المجموعات أولا (باستخدام اختبار كروسكال-واليس للمقارنة متعددة المجموعات) ثم تقدير حجم تأثير كل ميزة وفيرة تفاضليا باستخدام LDA. تعرف درجة LDA >2.0 بأنها زيادة كبيرة في الوفرة22.
الطرق الإحصائية
أجريت تحليلات إحصائية باستخدام SPSS. تم تحليل البيانات الموزعة بشكل طبيعي باستخدام تحليل التباين أحادي الاتجاه (ANOVA). تم تحليل البيانات التي لم تتبع التوزيع الطبيعي باستخدام اختبار ويلكوكسون للمجموع الرتب. تم التعبير عن جميع البيانات الكمية كمتوسط ± خطأ معياري (SE) للمعاملات التي تتوافق مع توزيع طبيعي، بينما تم عرض البيانات غير الموزعة بشكل طبيعي كمتوسط بنطاق رباعي. تم اعتبار قيمة p < 0.05 ذات دلالة إحصائية.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
اختلافات التنوع الميكروبي المرتبطة بعلاج البيريبيديل
نتائج مراقبة جودة استخراج الحمض النووي (نطاق التركيز، النقاء) مقدمة في الجدول التكميلي 1. يتم عرض جودة تضخيم PCR (حجم النطاق، تركيزات الاسترداد) في الجدول التكميلي 2. مقاييس مراقبة جودة التسلسل (أعداد القراءة، العمق، التغطية) مفصلة في الجدول التكميلي 3. تم استخدام مؤشرات ACE، Chao1، InvSimpson، Shannon، وSimpson لتحليل ميكروبيوتا الأمعاء في عينة البراز. أظهر...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
يحتل مرض باركنسون المرتبة الثانية من أكثر اضطرابات التنكس العصبي شيوعا على مستوى العالم، يسبقه فقط مرض الزهايمر23. منذ عام 1970، يستخدم البيريبيديل، كمنشط لمستقبلات الدوبامين، على نطاق واسع في علاج مرض باركنسون24. ومع ذلك، في الممارسة السريرية، قد يسبب البيريبيديل بعض التفاعلات السلبية مثل الغثيان، والقيء، وعدم الراحة في الجهاز الهضمي. تظهر الأبحاث المتزايدة أن تطور مرض باركنسون، بالإضافة إلى التدخل العلاجي باستخدام منبهات مستقبلات الدوبامي...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
يذكر المؤلفون أنه لا توجد مصالح متنافسة.
وقد دعم هذا البحث مشروع تمويل مرشحي احتياطي القادة الأكاديميين في مقاطعة أنهوي (رقم 2022H287)، ومشروع المواهب المتميزة للصحة والنظافة في مقاطعة أنهوي (رقم ahsjhmypygc20230074)، ومشروع البحث العلمي الإقليمي في أنهوي حول وراثة وابتكار الطب الصيني التقليدي (2025CCCX017)، والمشروع الخاص للتكامل السريري الأساسي لجامعة أنهوي للطب الصيني (JCLCA2025009).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 2× reaction buffer (Taq MasterMix) | Kangweii | CW0690 | |
| Agarose | (general) | غير مطبق | molecular biology grade |
| AxyPrep DNA Gel Extraction Kit | Axygen Biosciences | (غير متوفر) | |
| Benchtop high-speed freezing centrifuge | Hunan Kosei | GTR116C | |
| DNA extraction reagents (SDS, phenol, chloroform, ethanol) | (general) | غير مطبق | |
| DNBSEQ-G99 PE300 sequencing platform | MGI Tech Co., Ltd | DNBSEQ-G99 | |
| Gel electrophoresis apparatus | Beijing Liuyi | DYY-8C | |
| Gel imaging system | Shanghai Jiapeng | JP-2880 | |
| LEfSe software | (open source) | النسخة عبر الإنترنت | |
| NanoDrop spectrophotometer | Hangzhou Haipe | Aurora-900 | |
| PCR machine | Hangzhou Langji | A200 | |
| Piribedil | Servier | 6094078 | |
| Primers: 341F and 806R (synthesized) | (custom synthesis) | غير مطبق | |
| QIIME software | (open source) | http://qiime.org | الإصدار 1.8.0 |
| Quantus Fluorometer | Promega | E6150 | |
| Qubit 4.0 Fluorometer | Invitrogen | Q33226 | |
| SDS (sodium dodecyl sulfate) | (general) | غير مطبق | |
| UPARSE software | (open source) | http://drive5.com/uparse | الإصدار 7.0.1090 |
| VAHTS Universal Plus DNA Library Prep Kit for MGI V2 | Vazyme | NDM627-01 |