تطوير نانوفيسيكلات مغطاة بغشاء الخلايا الجذعية الميزنشيمية لتعزيز توصيل الجينات

Yue Su; Zaiyong An; Daopin Wu; Di Mu; Yaxuan Liang

doi:10.3791/70316

مقالة منهجية

تطوير نانوفيسيكلات مغطاة بغشاء الخلايا الجذعية الميزنشيمية لتعزيز توصيل الجينات

DOI:

10.3791/70316

⸱

فبراير 17, 2026

Yue Su¹^,² , Zaiyong An¹^,² , Daopin Wu³ , Di Mu² , Yaxuan Liang¹^,⁴

¹Department of Biology, Faculty of Arts and Sciences, Beijing Normal University at Zhuhai, ²Guangdong Institute of Intelligence Science and Technology, ³Guangdong Hengqin United Life Science Co., Ltd., ⁴Center for Biological Science and Technology, Key Laboratory of Cell Proliferation and Regulation Biology of Ministry of Education, Zhuhai-Macao Biotechnology Joint Laboratory, Beijing Normal University at Zhuhai

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يهدف هذا البروتوكول إلى تقديم طريقة لإنتاج وتنقية محاكاة الحويصلات خارج الخلية المشتقة من MSC للعلاج الجيني. يتم حصر الحويصلة النانوية في طبقات دهنية مشتقة من MSC وتحتوي على AAVs المؤتلفة التي تحمل الجين المعني في التلومين. توفر هذه الحويصلة النانوية ناقلا معزنا لتوصيل الجينات في الجسم الحي .

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تحمل الحويصلات خارج الخلايا المشتقة من الخلايا الجذعية المتوسطة (MSC) وعدا كبيرا للتطبيقات العلاجية والطب التجديدي. الوحويصلات الكهربائية هي حويصلات نانوية تفرزها جميع أنواع الخلايا المعروفة، تحمل شحنات متنوعة تشمل البروتينات المرتبطة بالغشاء، والعوامل الذوبانة، وأنواع متعددة من الحمض النووي الريبي، والمستقلبات التي تنظم فسيولوجيا وسلوك الخلايا المستقبلة. بينما يمكن للسيارات الكهربائية المشتقة أو الهندسة من MSC توصيل البروتينات والحمض النووي الريبي العلاجي، لا يزال توصيل الحمض النووي الكهربائي عبر EV تحديا بسبب نقص آليات فعالة لفرز تسلسلات الحمض النووي إلى حويصلات. أظهرت أعمال سابقة من مجموعتنا وآخرين أن المركبات الكهربائية التي تحتوي على فيروس الالتهاب المرتبط بالغدة (AAV) تمكن من توصيل نووي مستهدف واستمرار التعبير الجيني في المختبر والحي. ومع ذلك، تم تقييد إنتاجها وعزلها بسبب انخفاض الإنتاج والإجراءات التي تستغرق وقتا طويلا. هنا، نبلغ عن تطور الحويصلات النانوية المغلفة بغشاء MSC التي تولد بواسطة طريقة بثق محددة الحجم لتوصيل الجينات بكفاءة. تحاكي هذه الحويصلات، التي يبلغ قطرها حوالي 200 نانومتر، خصائص التوكيلات الكهربائية الطبيعية أثناء تغليف ناقلات AAV المؤتلف التي تحمل تسلسلات جينية علاجية. مقارنة بالمركبات الآلية التقليدية للحويصلات الصلبة الهيكلية (MSC) حسنت كفاءة توصيل الجينات وحققت إنتاجية أعلى بكثير مع تقليل الوقت والتكلفة مقارنة بالمركبات الكهربائية الكيميائية التي تفرز طبيعيا. باختصار، نقدم منصة نانوية حويصلة غشائية جديدة تعتمد على MSC تجمع بين مزايا البنى التي تحاكي EV مع نقل الجينات بوساطة AAV. يعزز هذا النهج كفاءة التوصيل وقابلية التوسع في الإنتاج، مقدما استراتيجية واعدة لدفع العلاج الجيني نحو الترجمة السريرية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمثل العلاج الجيني نهجا تحويليا لعلاج الأمراض الجينية والمكتسبة من خلال إدخال أو استبدال أو إسكات جينات معينة لاستعادة الوظائف الخلوية الطبيعية. على مدى العقدين الماضيين، أدت التقدمات في هندسة الناقلات واستراتيجيات التوصيل إلى توسيع المشهد العلاجي للعلاج الجيني. من بين أنظمة الناقلات المختلفة التي تم تطويرها، برز فيروس العدوى الملحقة (AAV) كواحد من أنجح وأكثر المنصات اعتمادا على نطاق واسع بفضل ملف سلامته الملائم، وتحويله الفعال، وتعبيره الجيني طويل الأمد في كل من الخلايا المنقسمة وغير المنقسمة ^1,2. حتى الآن، حصلت العديد من العلاجات المعتمدة على AAV على الموافقة التنظيمية للاستخدام السريري، بما في ذلك علاجات ضمور عضلات العمود الفقري، وضمور الشبكية، والهيموفيليا، مما يمثل إنجازا مهمة في الطب الانتقالي³. كما أن التروبيزم الواسع وانخفاض المناعة لناقلات AAV مكن تطبيقها عبر مجموعة متنوعة من الأنسجة، بما في ذلك الكبد والعضلات والجهاز العصبي المركزي والعين⁴. ونتيجة لذلك، أصبحت AAV منصة رائدة لتوصيل الجينات في الجسم الحي، تدعم الدراسات ما قبل السريرية والسريرية المستمرة التي تستهدف اضطرابات الأيض والعصبية والقلب والأوعية الدموية.

على الرغم من نجاحه السريري الملحوظ، يواجه العلاج الجيني القائم على AAV عدة تحديات جوهرية لا تزال تحد من تطبيقه الأوسع. أحد القيود الرئيسية يكمن في محدودية سعة تغليف الجينوم لكبسيد AAV (~4.7 كيلوبايت)، مما يقيد استخدامه لنقل جينات علاجية كبيرة أو متعددة ^5,6. بالإضافة إلى ذلك، يتم تحديد التوزيع البيولوجي والاستواء الخلوي لناقلات AAV إلى حد كبير بواسطة أنماط المصل الخاصة بها، حيث يظهر كل منها تقاربات مميزة مع أنسجة معينة. على الرغم من استخدام استراتيجيات هندسة الكبسيد وعرض الببتيدات المكثفة لتعزيز استهداف الأنسجة وكفاءة التحويل، إلا أن تحقيق استوائية دقيقة ومتوقعة عبر سياقات بيولوجية متنوعة لا يزال^{عقبة كبيرة}. قيد حرج آخر هو انتشار الأجسام المضادة المعادلة الموجودة مسبقا (NAbs) ضد أنماط AAV الطبيعية في البشر. حتى العدادات المنخفضة من NAbs يمكن أن تقلل بشكل كبير من كفاءة نقل الناقل الكهربائي، مما يحد من أهلية المرضى ويعقد تكرار الجرعات ^8,9. تم استكشاف استراتيجيات مختلفة، مثل إعادة تصميم الكبسيد العقلانية، وأنظمة مثبطة المناعة، وتبادل البلازما العابر، لتخفيف تحييد الأجسام المضادة ^10,11، ومع ذلك تقدم هذه الأساليب راحة جزئية أو مؤقتة فقط. بشكل مجتمع، تقلل هذه القيود من الفعالية العلاجية العامة وقابلية التكرار لتوصيل الجينات التي يعبر عنها AAV في البيئات السريرية.

في السنوات الأخيرة، تم استكشاف الحمض النووي المغلف بالحويصلات خارج الخلية (EV-AAV) كناقل بديل لديه القدرة على تجاوز عدة قيود رئيسية للحويصلات التقليدية 12,13,14,15. أثناء التعبئة المتجهة، يمكن إفراز جزء من جزيئات AAV عبر مسارات الانتقال الحويصلي وتصبح مغلقة داخل الحويصلات خارج الخلية. يعتقد أن هذه العملية تتضمن بروتين مساعد مرتبط بالغشاء المشفر بواسطة AAV (MAAP)، الذي يسهل خروج الفيروس ويعزز ارتباط الغشاء^16,17. تظهر جسيمات EV-AAV الناتجة كفاءة تحويلية محسنة ومقاومة محسنة للأجسام المضادة المعادلة مقارنة ب AAV التقليدي، ويرجع ذلك أساسا إلى الغشاء الحويصلي الذي يعزز امتصاص الخلايا ويوفر حماية جزئية من التعرف على الأجسام المضادة¹⁸. ومع ذلك، وعلى الرغم من هذه المزايا، يظل إنتاج المركبات الكهربائية للطائرات المضادة للطائرات غير فعالة. عادة، يتم إفراز جزء صغير فقط من جينومات الناقلات (حوالي 0.5٪-12٪) في وسط الزراعة كأغطية AAV مرتبطة ب EV، بينما تبقى الغالبية داخل الخلية أو موجودة كحمض AAV حر^12,13. وبالتالي، يتطلب الإنتاج على نطاق واسع للحصول على عائد كاف من المتجهات. علاوة على ذلك، تم إثبات توليد المركبات الكهربائية AAV بشكل أساسي باستخدام خلايا منتج HEK293T، حيث قد تظهر المركبات الكهربائية تطهير سريع من الكبد، ونصف عمر دوران قصير، ومخاوف محتملة تتعلق بالسلامة البيولوجية. تسلط هذه القيود الضوء على الحاجة إلى استراتيجية تغليف أغشية أكثر كفاءة وقابلية للتخصيص، مما يحفز تطوير منصة AAV المغلفة بغشاء الخلية (CME-AAV) المقدمة في هذه الدراسة.

تمت دراسة الخلايا الجذعية الميزنشيمية (MSCs) وخلايا النسيج البدائي الخاصة بها بشكل موسع لإمكاناتها التجديدية وخصائصها المناعية. بعيدا عن العلاجات القائمة على الخلايا أو المركبات الكهربائية المفرزة طبيعيا، أظهرت دراسات حديثة نهجا بديلا لتحسين توصيل الأدوية باستخدام الجسيمات النانوية المغطاة بأغشية MSC 19,20,21. يمنح طلاء غشاء MSC قدرة استهداف نشطة، ويقلل من تطهير المناعة، ويطيل وقت الدورة الدموية، ويرجع ذلك على الأرجح إلى التركيب الجزيئي الجوهري للأغشية المشتقة من MSC^22,23. استنادا إلى هذا المفهوم، استخدمنا مادة غشائية مشتقة من MSC لبناء حويصلة نانوية مغلفة بغشاء الخلية من نوع AAV (CME-AAV) لتوصيل الجينات. لتحقيق ذلك، تم خلط شظايا غشاء MSC المنقاء مع جسيمات AAV المؤتلفة وخضوعها لعملية بثق محكمة، وهي تقنية أنشئت أصلا لتصنيع الليبوسومات^24,25. من خلال البثق المحدد، تتجمع مكونات الغشاء تلقائيا لتشكل حويصلات نانوية تغلف جسيمات AAV. تم تنقية CME-AAV الناتجة بشكل أكبر من AAV الحرة غير المغلفة باستخدام الطرد المركزي القائم على تدرج الكثافة. تمكن هذه الاستراتيجية من تحضير فعال وقابل للتكرار لناقلات AAV المغلفة بالغشاء، والتي تظهر كفاءة تحويل محسنة بشكل ملحوظ مقارنة بالمركبات التقليدية وتحافظ على مقاومة مماثلة للأجسام المضادة المعادلة مثل EV-AAVs. من خلال استبدال الجينات المنقولة المختلفة، تمتلك منصة CME-AAV إمكانات واسعة لعلاج مختلف الأمراض الجينية والمكتسبة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت الموافقة على جميع إجراءات الحيوانات من قبل لجنة العناية والاستخدام المؤسسي للحيوانات في جامعة بكين للمعلمين في تشوهاي، الصين. المواد المستخدمة والمواد المستخدمة مدرجة في جدول المواد.

1. تحضير وتكوين CME-AAV عبر بروز محدد بحجم المسامات

إنتاج متجهات AAV المؤتلفة
ملاحظة: بروتوكول إنتاج AAV يتبع إجراءات منشورة سابقا ومستخدمة على نطاق واسع. تم وصف خطوات التحسين التفصيلية والتغيرات في دراسات سابقة¹²^،²⁶.
1. زراعة HEK293T الخلايا في وسط نمو كامل والحفاظ عليها عند التقاء 70٪-80٪ في يوم النقل.
2. تحضير ثلاثة بلازميدات تشفر (1) ناقل نقل AAV الحامل للجين المعدل المعني، (2) جينات مكربت/غطاء AAV المقابلة للنمط المصلي المطلوب، و(3) وظائف مساعدة الفيروسات الغدية.
3. يتم دمج خلايا HEK293T مع البلازميدات الثلاثة باستخدام طريقة نقل معتمدة (مثل فوسفات الكالسيوم أو النقل القائم على البوليمر)، وفقا للممارسة المخبرية القياسية.
4. احتضن الخلايا المنقولة لمدة 48-72 ساعة للسماح بتجميع وتراكم الخلايا الجانبية.
5. اجمع الخلايا ووسط الزراعة، وأطلق جسيمات AAV من خلال دورات تجميد وإذابة متكررة أو طريقة تحلل خلاوية مكافئة.
6. قم بطرد المركزي بالليزات بسرعة منخفضة لإزالة حطام الخلايا وجمع المادة الفائقة التي تحتوي على جزيئات AAV.
7. قم بتنقية جزيئات AAV باستخدام الطرد المركزي الفائق بتدرج الكثافة أو طريقة تنقية أخرى معتمدة.
8. قم بتبديل متجهات AAV المنقاء إلى محلول ملحي معقم مع فوسفات (PBS) وتخزين الكميات عند −80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
تحضير جزء الغشاء العضلي العسكري
ملاحظة: تم عزل الخلايا الجذعية الميزنشيمية البشرية (MSCs) وفقا للإرشادات المؤسسية. تم زراعة الخلايا وتوسيعها وفقا لظروف محددة أو بروتوكولات معدلة في المختبر. يمكن تأكيد هوية MSC من خلال تقييم تعبير العلامات الظاهرية مثل CD73 وCD90 وCD105 باستخدام قياس تدفق السيل. يتم التحقق من تعدد القدرات في الخلايا الصبغية الصلبة من خلال قدرتها على التمايز إلى الخلايا العظمية، والخلايا الغضروفية، والخلايا الدهنية في المختبر. تكون الخلايا جاهزة للجمع عندما تصل إلى التقاء بنسبة 70٪-90٪. الإجراءات التالية ليست بالضرورة ضرورية أن تجرى في ظروف معقمة.
1. قم بإزالة وسط الزراعة وافصل القطع الصلبة من طبق الزراعة باستخدام مكشطة خلية.
2. اجمع الخلايا المنفصلة في أنبوب مخروطي يحتوي على PBS وجهاز الطرد المركزي بحرارة 300 × جرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية لدفع الخلايا.
3. اغسل الخلايا مرتين باستخدام PBS، مع الطرد المركزي في كل مرة عند 300 × جرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
4. أعد تعليق الحبيبات الخلوية الأخيرة في PBS مع مزيج مثبط للبروتيز.
5. إخضاع تعليق الخلية لثلاث دورات من التجمد والذوبان لتعطيل غشاء البلازما وتوليد محلل خلوي بدائي.
6. قم بعمل بيبيتات للليزات جيدا ليتم التجانس، ثم قم بالطرد المركزي بحرارة 1000 × جرام لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية لإزالة الحطام الخلوي.
7. انقل المادة الفائقة إلى أنبوب جديد وجهاز طرد مركزي عند 18,000 × جرام لمدة ساعة واحدة عند 4 درجات مئوية لإزالة جزء الغشاء.
8. تخلص من المادة الفائقة وأعد تعليق الحبيبات الغشائية الناتجة في PBS. يمثل هذا التعليق الجزء الخام من غشاء MSC ويستخدم في تغليف AAV.
9. توحيد تعليق الغشاء عن طريق تمريره بشكل متسلسل عبر محاقن مزودة بإبر من 20 G إلى 27 G.
10. تحديد تركيز البروتين في تعليق الغشاء المتجانس باستخدام اختبار BCA. قم بتخزين التعليق عند −80 درجة مئوية، أو تابع مباشرة إلى الخطوات التالية. أعد تجانس تعليق الغشاء باستخدام حقنة بسعة 27 جالون بعد كل دورة إذابة.
تكوين CME-AAV عبر البثق
1. امزج تعليق الغشاء المحضر مع AAVs بنسبة محددة تبلغ 150 ميكروغرام بروتين غشاء لكل 1 ×¹⁰ نسخ جينومية (g.c.) من AAV. حضن الخليط عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة مع هز لطيف.
2. تحميل خليط الغشاء وAAV على جهاز بثق صغير مزود بغشاء بولي كربونات (PC) بطول 400 نانومتر. مرر العينة عبر البثق 20 مرة لتعزيز تغليف الغشاء وAAV.
3. استبدل غشاء PC بطول 400 نانومتر بغشاء 200 نانومتر وكرر عملية البثق 20 مرة لتقليل تباين حجم الحويصلات بشكل أكبر.
4. اجمع الخليط المعالج. إذا كانت هناك حاجة لكمية أكبر، قم بتجميع دفعات بثق متعددة. يحتوي التعليق الناتج على CME-AAVs، إلى جانب حويصلات غير مغلفة وغشاء فارغ. توجه فورا إلى تنقية CME-AAV.

2. تنقية CME-AAV بواسطة الطرد المركزي بتدرج الكثافة

ملاحظة: تصف هذه الخطوة فصل CME-AAV النقي عن AAVs غير المغلفة، وتجمعات البروتين، والأحماض النووية المتبقية باستخدام الطرد المركزي الفائق المعتمد على تدرج الكثافة المعتمد على الإيوديكسانول. ال CME-AAV المنقى الذي تم الحصول عليه من هذه الخطوة مناسب لكل من الدراسات المجهزة وداخل الجسم الحي . يوصى بجميع الإجراءات بإجراء تحت غطاء زراعة أنسجة معقم.

تحضير تدرج اليوديكسانول
1. حضر محاليل اليوديكسانول بنسبة 40٪ و25٪ عن طريق تخفيف محلول المخزون ب 10× PBS وماء منزوع الأيونات المعقم لتحقيق تركيز نهائي في 1× PBS.
2. في أنبوب مفتوح من الأعلى وجدار رقيق فائق الشفافية بحجم 13.2 مل، قم بتحديد تدرج كثافة غير متصل بعناية عن طريق وضع 1 مل من 40٪ يوديكسانول و3 مل من 25٪ يوديكسانول من الأسفل.
3. ضع بلطف 7 مل من نظام التعليق الذي يحتوي على CME-AAV من الخطوة 1.14 على أعلى التدرج. وازن الأنابيب وحملها في دوار الطرد المركزي فوق الطردي المتحرك من دلو متأرجح.
الطرد المركزي فوق الفائق وجمع كسور CME-AAV
1. قم بطرد مركزي التدرج عند 150,000 × جرام لمدة 3 ساعات عند 4 درجات مئوية باستخدام تسارع سريع وتباطؤ بطيء (المستوى 9 والمستوى 1 على التوالي).
2. قم بإزالة الأنابيب بعناية من الدوار دون إزعاج التدرج. اجمع أجزاء 1 مل من الأعلى إلى أسفل الأنبوب في أنابيب طرد مركزي دقيقة بحجم 1.5 مل معنونة (F1-F11). احتفظ بكل الكسور على الثلج.
3. تحديد وتجميع الكسور F7 وF8، التي تحتوي على CME-AAV المنقى، في أنبوب طرد مركزي فوق مفتوح جديد مفتوح الأعلى. أضف PBS إلى حجم إجمالي 11 مل وامزجه بلطف مع ماصة 1 مل.
غسل واستعادة CME-AAV
1. قم بالطرد المركزي للكسور المجمعة مرة أخرى عند 150,000 × جرام لمدة 3 ساعات عند 4 درجات مئوية باستخدام تسارع سريع وتباطؤ سريع (المستوى 9 لكلا الإعدادين).
2. تخلص من المادة الفائقة بعناية وأعد تعليق حبيبة CME-AAV في 50-200 ميكرولتر من PBS المعقمة، حسب التركيز المطلوب.
3. أليكوت حسب الحاجة وخزنها عند −80 درجة مئوية حتى الاستخدام الإضافي.

3. توصيف CME-AAV باستخدام المجهر الإلكتروني الناقل (TEM)

ملاحظة: يستخدم المجهر الإلكتروني الناقل (TEM) لتصوير شكل وحجم وبنية الغشاء لجسيمات CME-AAV. تتبع العملية بروتوكول التلوين السلبي القياسي المشابه لذلك المستخدم في الحويصلات خارج الخلية. تتم جميع الخطوات في درجة حرارة الغرفة ما لم يذكر خلاف ذلك.

تحضير العينات وتثبيتها
1. قم بتخفيف تعليق CME-AAV المنقى الناتج من الخطوة الثانية إلى تركيز يقارب 1 × 10^9-1 ×^{10 10} جسيمات/مل في PBS.
2. تثبيت العينة بإضافة كمية متساوية من بارافورمالديهايد 4٪ طازج (تركيز نهائي 2٪) وحضانه لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
3. ضع شبكة نحاسية مطلية بالكربون من فورمفار (200 شبكة) على ورقة من فيلم البارافين ووجهها الكربوني للأعلى.
4. منقطة 10 ميكرولتر من نظام تعليق CME-AAV الثابت على الشبكة وتسمح بامتصاصها لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تجنب الجفاف أثناء الامتصاص.
5. أزل السائل الزائد بلطف من حافة الشبكة باستخدام ورق التصفية دون لمس المركز.
الغسيل وما بعد التثبيت
1. قم بتعويم الشبكة، وجانب العينة للأسفل، على قطرة 50 ميكرولتر من PBS لمدة دقيقتين للغسل. كرر ذلك مرتين.
2. انقل الشبكة إلى قطرة 50 ميكرولتر تحتوي على 1٪ جلوتارالديهايد لمدة 5 دقائق لتثبيت بنية الغشاء.
3. اغسل الشبكة بشكل متتابع 5 مرات بقطرات ماء منزوع الأيونات (30 ثانية لكل منها) لإزالة الأملاح العازلة. قم بالبقع بلطف بعد الغسل النهائي.
التلوين السلبي
1. ضع الشبكة على قطرة 50 ميكرولتر من أسيتات اليورانيل المائي 2٪ لمدة دقيقة واحدة لتحقيق صبغة سلبية.
2. أزل البقع الزائدة عن طريق لمس حافة الشبكة بلطف بورق الفلتر واتركها تجف تماما في درجة حرارة الغرفة.
التصوير
1. فحص الشبكات الملونة باستخدام مجهر إلكتروني ناقل يعمل بجهد 200 كيلو فولت.
2. التقط صورا تمثيلية بتكبيرات بين 30,000× و120,000× لتقييم شكل CME-AAV وسلامة الغشاء.
3. اختياريا، قياس أقطار الجسيمات باستخدام برنامج تحليل صور TEM لتأكيد اتساق حجم الحويصلات مع نتائج NTA.
  ملاحظة: تركيز العينة - ضبط تركيز CME-AAV للحصول على كثافة جسيمات معتدلة؛ العينات المركزة بشكل مفرط تؤدي إلى تداخل الجسيمات، بينما العينات المخففة بشكل مفرط تعطي عددا قليلا من الحويصلات القابلة للكشف. تجنب التشويهات - قد يترك الغسيل غير الكامل بلورات ملحية تحجب تصور الجسيمات. تأكد من بقاء الشبكات مرطبة طوال فترة التلوين لمنع انهيار الغشاء. صبغات بديلة - يمكن استخدام حمض الفوسفوتونغستيك (PTA، 1٪-2٪، pH 7.0) كبديل لأسيتات اليورانيل إذا تم تطبيق قيود على التعامل مع الإشعاع. التخزين - يمكن تخزين الشبكات المحضرة في حاوية خالية من الغبار في درجة حرارة الغرفة لعدة أيام قبل التصوير، رغم أنه ينصح بالملاحظة الفورية لأفضل تباين.

4. قياس كمية CME-AAV باستخدام qPCR

ملاحظة: تصف هذه الخطوة طريقة قائمة على qPCR لقياس نسخ الجينوم CME-AAV (g.c./μL). يركز البروتوكول على إعداد العينات الخاصة ب CME-AAV وتقارير البيانات. يجب أن تتبع جميع الجوانب الأخرى لإعداد ودورة qPCR الممارسات المخبرية القياسية وتعليمات الشركة المصنعة لمجموعة qPCR المختارة.

العينة والتحضير القياسي
1. قم بإذابة كميات CME-AAV المنقاة على الجليد وامزج بلطف عن طريق التوصيل بالماصات. تجنب الدوامة.
2. تحضير تخفيف معيار AAV من 1 × 10⁶ إلى 1 × 10³ g.c./μL بواسطة تخفيف متتابع بمقدار 10 أطعات باستخدام ماء منزوع الأيونات خال من النوكلياز أو مخزن TE. جهز المعايير طازجة أو مرتبة وتخزينها عند −20 درجة مئوية للاستخدام قصير الأمد.
3. جهز الضوابط التالية: ضابط بدون قالب (NTC؛ ماء)، وتحكم سالب (PBS أو مصفوفة فارغة)، وضابط موجبة (عينة AAV بتركيز معروف)، إذا كان متوفرا.
4. تحضير خليط qPCR الرئيسي على الثلج وفقا لتعليمات الشركة المصنعة للكيمياء المختارة (تعتمد على الصبغة أو المجس).
دورة qPCR وتحليل البيانات
1. شغل qPCR باستخدام معايير الدورة التي يوصي بها مصنع الخلطة الرئيسية ل qPCR.
2. تولد منحنى قياسي عن طريق رسم C_t (محور y) مقابل لوغاريتيم₁₀ (تركيز قياسي بوحدة g.c./μL) (محور x). ملاءمة انحدار خطي للحصول على ميل (m) وتقاطع y (b).
3. احسب تركيز جينوم CME-AAV لكل عينة مكررة باستخدام معادلة الانحدار:
  أو
  
  حيث C هو نسخ جينومية لكل ميكرولتر.
4. المتوسط التقني يكرر ويبلغ عن تركيز CME-AAV النهائي كg.c./μL.
  ملاحظة: نظرا لأن إزالة الحرارة أثناء تحضير qPCR تعطيل كل من الغشاء المغلف وكبسيدات AAV، فلا حاجة لاستخراج DNA منفصل. لا تجري معالجة DNase على العينات قبل التحليل الحراري؛ يمكن ل DNase الوصول إلى جينومات AAV وتحطيلها بمجرد تعطيل الكابسيد/الأغشية، ولكن قبل أن تصل العينة إلى درجات حرارة تعطل DNase. يجب مطابقة المعايير حيثما أمكن: إعداد منحنى معياري من معيار AAV محدد جيدا. إذا اختلفت عيناتك أو معاييرك في تكوين الجينوم (AAV أحادي السلسلة مقابل AAV المكمل الذاتي/مزدوج الخيوط)، قم بضبط القيم المبلغ عنها وفقا لذلك. تصميم البرايمر/المجس: قد تستهدف البادئات أي تسلسل AAV محفوظ؛ على سبيل المثال، تستخدم عادة البادئات التي تستهدف منشط CMV (أعلى الجين المنتقل).

5. قياس ملفات جسيمات CME-AAV

استخدم تحليل تتبع الجسيمات النانوية (NTA)، أو الاستشعار المقاومي القابل للضبط (TRPS)، أو تقنيات تحليل الجسيمات المماثلة لتحديد توزيع حجم وتركيز الجسيمات في تحضيرات CME-AAV.
يذوب عينات CME-AAV المنقاء على الجليد ويتجانس بلطف عن طريق التوصيل قبل التحليل. إجراء القياسات وفقا للممارسة المخبرية القياسية وتعليمات الشركة المصنعة للأداة المختارة، كما هو موضح في البروتوكولات المنشورة^{سابقا 12}^،²⁷^،²⁸^،²⁹.

6. التحليل الصناعي لنقل الجينات ببوساطة CME-AAV

ملاحظة: تصف هذه الخطوة إجراء تقييم توصيل الجينات والتعبير الجيني المترجم بواسطة CME-AAV في الخلايا المزروعة. يتم عرض الاختبار باستخدام خلايا HEK293T وCME-AAV9. EGFP، لكنه يمكن تكييفه لأنواع خلايا أخرى أو تراكيب المراسلة. AAV9 التقليدي (غير مغلف بالغشاء). يعمل EGFP كضابط إيجابي، بينما تستخدم PBS أو جسيمات AAV الفارغة كعناصر تحكم سالبة.

تحضير الخلايا
1. زراعة HEK293T الخلايا تحت ظروف قياسية (DMEM مع 10٪ FBS، 1٪ بنسلين-ستريبتومايسين) عند 37 °م في 5٪ CO₂.
2. يتم زرع الخلايا في صفائح بذرة 48 أو 96 بئر لتصل إلى حوالي 70٪ عند التقاء التيار (عادة بعد 24 ساعة من البذر). ضبط كثافة البذر حسب حجم البئر (مثلا: ~5 × 10⁴ خلايا لكل بئر لصفيحة ب 48 بئر أو ~1 × 10⁴ خلايا لكل بئر لصفيحة ب 96 بئر).
3. اسمح للخلايا بالارتباط والتوازن لمدة 24 ساعة قبل إضافة الناقلات.
تطبيق المتجهات
1. جهز CME-AAV9. EGFP و AAV9. حلول تعمل EGFP في PBS المعقمة. الجرعة الفيروسية النموذجية: 5 × 10⁸ جرام لكل 48 بئر (التعديل بناء على قوة المروج، الجين المستهدف، والأهداف التجريبية).
2. لكل بئر، أضف نسخا متساوية من الجينوم (g.c.) من CME-AAV9. EGFP أو AAV9. EGFP مباشرة إلى وسيط الثقافة.
3. تشمل آبار التحكم السالبة ذات حجم مكافئ لجسيمات PBS أو جسيمات AAV فارغة.
4. لف اللوحة بلطف لضمان توزيع منتظم والعودة إلى الحاضنة.
5. استمر في الحضانة لمدة 24-72 ساعة، حسب نشاط الداعم وحركة التعبير الجيني الناقل. بالنسبة ل EGFP المدفوع ب CMV في خلايا HEK293T، يلاحظ عادة فلورة قوية خلال 48 ساعة.
التصوير وتحليل الخلايا الحية
1. عندما تكون جاهزا للتصوير، قم بسحب وسط الزراعة بلطف واغسل الخلايا مرتين باستخدام PBS لإزالة الجزيئات غير المرتبطة. تجنب إزاحة الخلايا.
2. أنوية خلايا الصبغة باستخدام Hoechst 33342 (متوافق مع الخلايا الحية) وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. لا تستخدم DAPI للخلايا الحية.
3. إجراء تصوير فلوري بالخلايا الحية باستخدام مجهر فلوري مقلوب مزود بمرشحات مناسبة (مثلا، الإثارة 488 نانومتر/انبعاث 513 نانومتر ل EGFP؛ الإثارة 350 نانومتر/انبعاث 460 نانومتر لهوشست).
4. استخدم أهدافا بحجم 10× أو 20× لقياس كفاءة التحويل، وهدف 63× لتحديد المواقع تحت الخلوية عالية الدقة إذا لزم الأمر.
5. اكتساب خمسة مجالات رؤية على الأقل لكل بئر (مثل أربع زوايا ومركز واحد) باستخدام معلمات تصوير متطابقة (وقت التعريض، الكسب، الفتحة، إلخ).
6. احفظ جميع الصور بصيغ خام وألوان رمادية للتحليل الكمي.
تحليل الصور الكمي
1. الصور المفتوحة في برنامج ImageJ (FIJI) أو برنامج مكافئ.
2. قياس شدة الفلورة المتوسطة لكل من قناتي EGFP وHoechst لكل حقل.
3. تحديد شدة الخلفية باختيار منطقة بدون إشارة فلورية ومتوسط قيم البكسل.
4. احسب الشدة المصححة لكل قناة:
  _صححت=_أعني-_{أنا خلفية}
5. احسب الشدة الممطرة لكل حقل كما يلي:
6. متوسط شدة التطبيع من خمسة حقول على الأقل لكل بئر، وأبلغ عن متوسط SD ± عبر ثلاثة نسخ بيولوجية مستقلة.
  ملاحظة: عادة ما يظهر CME-AAV زيادة في شدة الفلورة مقارنة ب AAV التقليدي عند تطبيق نسخ جينوم متساوية، مما يعكس تحسنا في امتصاص الخلايا و/أو الحماية من الأجسام المضادة المعادلة. تعتمد كفاءة التحويل المثلى على جودة تحضير CME-AAV، ونوع الخلية، وقوة المروج، وعيار الفيروس. إذا لوحظت إشارات ضعيفة، زد إدخال نسخة الجينوم، وتأكد من سلامة الناقل بواسطة qPCR، وتحقق من معايرة المجهر. قد تستخدم تراكيب فلورية أخرى (مثل mCherry، mNeonGreen، tdTomato) أو تراكيب لوسيفيراز حسب الاحتياجات التجريبية. عند العمل مع الخلايا الأولية أو غير الملتصقة، قم بضبط ظروف البذر والتصوير وفقا لذلك (مثل تغطية الألواح بالبولي-إل-ليسين أو استخدام شرائح الحجرة).

7. تقييم CME-AAV - توصيل الجينات الوسيطة في نموذج الفأر

ملاحظة: تصف هذه الخطوة تقييم توصيل الجينات بوساطة CME-AAV في الجسم الحي باستخدام نموذج الفأر.

تحضير الحيوانات
1. استخدم فئران من النوع البري مثل C57BL/6. تأكد من أن جميع إجراءات الحيوانات معتمدة من لجنة رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية وتنفذها وفقا للوائح ذات الصلة.
2. اختر فئران عمرها بين 4-6 أسابيع لتحقيق أفضل اتساق عبر التجارب.
3. الحفاظ على الحيوانات في ظروف سكن قياسية مع إمكانية الوصول إلى الطعام والماء قبل الحقن.
تحضير واستخدام المتجهات
1. اختر نمط مصل AAV وفقا لغرض الدراسة والنسيج المستهدف. في هذه الدراسة، تم استخدام AAV9 وCME-AAV9.
2. تحضير ناقلات فيروسية تشفر جين تقرير اللوسيفيراز (مثل CME-AAV9.luciferase) للتصوير غير الغازي.
3. قم بتخفيف ناقلات الفيروس في محلول ملحي معقم إلى تركيز نهائي يبلغ 1 × 10¹° نسخ جينومية (g.c.) لكل 50 ميكرولتر لكل فأر.
4. سخن الذيل بلطف باستخدام وسادة تسخين أو ماء دافئ لتوسيع الوريد قبل الحقن.
5. قم بتحميل 50 ميكرولتر من التعليق الفيروسي في حقنة أنسولين 31 جيلون وحقنها ببطء في الوريد الذيلي الجانبي لتقليل التسرب وتمزق الوريد.
6. بعد الحقن، أعد الفئران إلى أقفاصها وراقبها حتى تتعافى تماما.
تصوير التوهج الحيوي في الجسم الحي
1. بعد أسبوعين من العطية، يتم تخدير الفئران بالأيزوفلوران (وفقا للبروتوكولات المعتمدة من المؤسسات) وحقن D-لوسيفيرين (150 ميكروغرام/جم وزن الجسم؛ سيغما) داخل الصفاق في PBS.
2. ضع الفئران المخدرة في نظام تصوير تلويع حيوي.
3. التقاط صور التوهج كل دقيقتين بعد الحقن حتى تصل الإشارة إلى هضبة.
4. قم بقياس التلألؤ الحيوي باستخدام البرامج المناسبة. حدد مناطق الاهتمام (ROIs) حول المناطق المضيئة وحساب إجمالي تدفق الفوتونات (فوتونات/ثانية) لكل حيوان.
5. يشمل المجموعات المعالجة ب AAV9.luc والمجموعات التي تم حقنها ب PBS كمجموعة ضابطة إيجابية وسالبية على التوالي للمقارنة.
تصوير خارج الجسم
ملاحظة: هذه الخطوة اختيارية.
1. مباشرة بعد التصوير الحي ، قم بقتل الفئران وجمع الأعضاء الرئيسية (الكبد، القلب، الطحال، الكلى، والدماغ).
2. صور الأعضاء المعزولة تحت معايير تصوير متطابقة باستخدام نفس نظام IVIS لتحديد تعبير اللوسيفيراز الخاص بالنسيج.
  ملاحظة: قد يتم اعتماد طرق إعطاء بديلة (مثل الحقن العضلي، داخل الدماغ، أو الحقن داخل الصفاق) حسب الأهداف التجريبية. تعكس شدة التلمع الحيوي كلا من كفاءة توصيل الجينات والتوزيع الحيوي للأنسجة. عادة ما يظهر تعبير اللوسيفيراز الذي يعبر عنه CME-AAV بداية مبكرة وذروة معززة مقارنة ب AAV الحر بسبب الاندويتوز الناتج عن الغشاء بواسطة الخلايا المتصاعدة. تأكد من ثبات جرعة اللوسيفيرين وتوقيت وإعدادات التصوير عبر العينات لمقارنة دقيقة. توفر الجرعة الفيروسية الموصوفة (1 × 10¹° g.c. لكل فأر) عادة إشارة قابلة للكشف بعد 2-4 أسابيع من الحقن، لكن قد يكون من الضروري تحسين النماذج الحيوانية أو الجهات المختلفة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم عزل الخلايا الصلبة الصلبة المستقيمة المستخدمة في هذه الدراسة من نسيج الحبل السري البشري وفقا للبروتوكولات وفقا للإرشادات الأخلاقية ذات الصلة. تم إعداد كسور غشاء MSC وفقا للبروتوكول الموصوف. AAV9. تم إنتاج EGFP داخليا باستخدام نظام نقل مزدوج البلازما العابر في HEK293T الخلية، كما تم الإبلاغ سابقا^{عن 12,26}. لتصنيع CME-AAV، وتحضيرات الغشاء، وAAV9. تم حضانة EGFP بمعدل 150 ميكروغرام من بروتين الغشاء لكل جينوم فيروسي 1 × 10¹°، كما هو...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

خطوات حرجة في بروتوكول CME-AAV

يصف هذا البروتوكول طريقة لتوليد أنظمة AAV مغلفة بغشاء MSC، وتعد عدة خطوات حاسمة لنجاح تكوين CME-AAV. أولا، المعالجة المسبقة بعناية لغشاء الخلية أمر ضروري. الهدف من هذه الخطوة هو الحصول على شظايا غشائية مناسبة للبثق مع تقليل التلوث من الحمض النووي النووي والبروتينات السيتوسولية والعضيات تحت الخلية. بالإضافة إلى ذلك، يعد حجم شظايا الغشاء عاملا رئيسيا في كفاءة البثق. الشظايا الكبيرة جدا قد تسد غشاء بثق البولي كربونا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الدكتور داوبين وو موظف في شركة قوانغدونغ هينغتشين يونايتد لايف ساينس المحدودة. لم توفر الشركة تمويلا لهذه الدراسة ولم يكن لها دور في تصميم الدراسة أو جمع البيانات أو تحليل البيانات أو إعداد المخطوطات أو قرار النشر. المؤلفون الباقون يعلنون عدم وجود مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد دعم العمل برنامج العلوم والتقنية في قوانغدونغ (2023B0303010002) إلى إدارة البيانات، ومؤسسة البحث الأساسي والتطبيقي في قوانغدونغ (2025A15150111134) ومشروع البحث متعدد التخصصات لكلية الآداب والعلوم في جامعة بولندونغ البريطانية (12900-311324240581) إلى YL. وقد دعم هذا العمل أيضا من خلال الأجهزة والخبرة الفنية التي قدمها مركز الأجهزة والخدمات للعلوم والتكنولوجيا في جامعة بكين للمعلمين.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسم	الشركة	رقم فهرسي
Bioluminescence imaging system	PerkinElmer	IVIS Spectrum optical imaging system (Lumina III)
D-Luciferin potassium salt	Yeasen Biotechnology	40902ES03
Fetal bovine serum	Yeasen Biotechnology	40130ES76
Fluorescence microscope	Zeiss	Axio Observer 7
Formvar/carbon-coated copper grid 200 mesh	Millipore-Sigma	TEM-FCF400CU
Glutaraldehyde	Millipore-Sigma	354400
HBSS	Gibco	C14175500BT
Hieff Unicon qPCR TaqMan Probe Master Mix	Yeasen Biotechnology	11205ES08
High-glucose Dulbecco's modified Eagle's medium	Hyclone	SH30243
High-speed centrifuge	Beckman Coulter	Avanti J-E
Hoechst 33342	Beyotime	C1022
NTA instrument	Malvern Panalytical	NanoSight NS300
Open-top thinwall ultra-clear tube for ultracentrifuge	Beckman Coulter	344059
OptiPrep iodixanol	Millipore-Sigma	D1556
Paraformaldehyde 4%	Beyotime	P0099
PBS	Biosharp	BL302A
Penicillin-streptomycin	Millipore-Sigma	V900929
qPCR instrument	Applied Biosystems	QS6 real-time PCR system
Rotor for high-speed centrifuge	Beckman Coulter	JA-25.50
SW 41 Ti Swing-bucket rotor for ultracentrifuge	Beckman Coulter	331362
Transmission electron microscope	JEOL	JEM-2100F
Ultracentrifuge	Beckman Coulter	Optima XE-100
Uranyl acetate	Electron Microscopy Sciences	NC1375332
Whatman Nuclepore polycarbonate membranes filters (200 nm)	Cytiva	10417004
Whatman Nuclepore polycarbonate membranes filters (400 nm)	Cytiva	10417104

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wang, D., Tai, P. W. L., Gao, G. Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery. Nat Rev Drug Discov. 18 (5), 358-378 (2019).
Li, C., Samulski, R. J. Engineering adeno-associated virus vectors for gene therapy. Nat Rev Genet. 21 (4), 255-272 (2020).
Mendell, J. R., et al. Current clinical applications of in vivo gene therapy with AAVs. Mol Ther. 29 (2), 464-488 (2021).
Crunkhorn, S. Profiling aav tropism. Nat Rev Drug Discov. 22 (3), 183(2023).
Kosaka, M., et al. Evaluation of the loading capacity and patterns of packaged DNA in AAV genomes of different sizes using long-read sequencing. Mol Ther Methods Clin Dev. 33 (2), 101474(2025).
McCarty, D. M. Self-complementary AAV vectors; advances and applications. Mol Ther. 16 (10), 1648-1656 (2008).
Lopez-Gordo, E., Chamberlain, K., Riyad, J. M., Kohlbrenner, E., Weber, T. Natural adeno-associated virus serotypes and engineered adeno-associated virus capsid variants: Tropism differences and mechanistic insights. Viruses. 16 (3), 442(2024).
Louis Jeune, V., Joergensen, J. A., Hajjar, R. J., Weber, T. Pre-existing anti-adeno-associated virus antibodies as a challenge in AAV gene therapy. Hum Gene Ther Methods. 24 (2), 59-67 (2013).
Wei, C. Prevalence of adeno-associated virus-9-neutralizing antibody in Chinese patients with Duchenne muscular dystrophy. Hum Gene Ther. 35 (1-2), 26-35 (2024).
Directed evolution of AAV mutants for enhanced gene delivery. Schaffer, D. V., Maheshri, N. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc, 2004, 3520-3523 (2004).
Zhao, W., et al. Engineering sialylated N-glycans on adeno-associated virus capsids for targeted gene delivery and therapeutic applications. J Control Release. 380, 563-578 (2025).
Liu, B., et al. Aav-containing exosomes as a novel vector for improved gene delivery to lung cancer cells. Front Cell Dev Biol. 9, 707607(2021).
Li, X. Extracellular vesicle-encapsulated adeno-associated viruses for therapeutic gene delivery to the heart. Circulation. 148 (5), 405-425 (2023).
Wang, W., et al. Intravitreal injection of an exosome-associated adeno-associated viral vector enhances retinoschisin 1 gene transduction in the mouse retina. Hum Gene Ther. 32 (13-14), 707-716 (2021).
Breuer, C. B., et al. In vivo engineering of lymphocytes after systemic exosome-associated AAV delivery. Sci Rep. 10 (1), 4544(2020).
Cheng, M., et al. Probing aspects of extracellular vesicle-associated AAV allows increased vector yield and insight into its transduction and immune-evasive properties. Mol Ther Methods Clin Dev. 33 (1), 101407(2025).
Elmore, Z. C., et al. The membrane-associated accessory protein is an adeno-associated viral egress factor. Nat Commun. 12 (1), 6239(2021).
Deshetty, U. M., Sil, S., Buch, S. Gene therapy for the heart: Encapsulated viruses to the rescue. Extracell Vesicles Circ Nucl Acids. 5 (1), 114-118 (2024).
Fan, X., et al. Targeted repair of spinal cord injury based on miR-124-3p-loaded mesoporous silica camouflaged by stem cell membrane modified with rabies virus glycoprotein. Adv Sci (Weinh). 11 (21), e2309305(2024).
Yao, C., et al. Self-assembly of stem cell membrane-camouflaged nanocomplex for microRNA-mediated repair of myocardial infarction injury. Biomaterials. , 257-120256 (2020).
Tian, Y., et al. Biomimetic mesenchymal stem cell membrane-coated nanoparticle delivery of mkp5 inhibits hepatic fibrosis through the Ire/xbp1 pathway. J Nanobiotechnology. 22 (1), 741(2024).
Kang, K., et al. Exosomes secreted from CXCR4 overexpressing mesenchymal stem cells promote cardioprotection via akt signaling pathway following myocardial infarction. Stem Cells Int. 2015, 659890(2015).
Han, X., et al. Mesenchymal stem cells in treating human diseases: Molecular mechanisms and clinical studies. Signal Transduct Target Ther. 10 (1), 262(2025).
Ong, S. G., Chitneni, M., Lee, K. S., Ming, L. C., Yuen, K. H. Evaluation of extrusion technique for nanosizing liposomes. Pharmaceutics. 8 (4), 36(2016).
Tackenberg, M. W., Kleinebud, P. Encapsulation of liquids via extrusion--A review. Curr Pharm Des. 21 (40), 5815-5828 (2015).
Bai, J. -J., et al. Dean-flow-coupled elasto-inertial focusing accelerates exosome purification to facilitate single vesicle profiling. Anal Chem. 95 (4), 2523-2531 (2023).
He, S., et al. Biomimetic gene delivery system coupled with extracellular vesicle-encapsulated AAV for improving diabetic wound through promoting vascularization and remodeling of inflammatory microenvironment. J Nanobiotechnology. 23 (1), 242(2025).
Smith, S. M., et al. Functional equivalence of stem cell and stem cell-derived extracellular vesicle transplantation to repair the irradiated brain. Stem Cells Transl Med. 9 (1), 93-105 (2020).
Liang, Y., Lehrich, B. M., Zheng, S., Lu, M. Emerging methods in biomarker identification for extracellular vesicle-based liquid biopsy. J Extracell Vesicles. 10 (7), e12090(2021).
Verma, S., et al. Seroprevalence of adeno-associated virus neutralizing antibodies in males with Duchenne muscular dystrophy. Hum Gene Ther. 34 (9-10), 430-438 (2023).
Yan, B., Liang, Y. New therapeutics for extracellular vesicles: Delivering CRISPR for cancer treatment. Int J Mol Sci. 23 (24), 15758(2022).
Hu, C. M. Erythrocyte membrane-camouflaged polymeric nanoparticles as a biomimetic delivery platform. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (27), 10980-10985 (2011).
Aryal, S., et al. Erythrocyte membrane-cloaked polymeric nanoparticles for controlled drug loading and release. Nanomedicine (Lond). 8 (8), 1271-1280 (2013).
Zhang, W., Huang, X. Stem cell membrane-camouflaged targeted delivery system in tumor. Mater Today Bio. 16, 100377(2022).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Mesenchymal Stem Cells Extracellular Vesicles Gene Delivery Nanovesicle Platform AAV Vectors Membrane Enveloped Nanovesicles Regenerative Medicine Therapeutic Gene Transfer EV Mimicking Size Defined Extrusion

تطوير نانوفيسيكلات مغطاة بغشاء الخلايا الجذعية الميزنشيمية لتعزيز توصيل الجينات

في هذه المقالة

ملخص

الملخص

المقدمة

البروتوكول

النتائج

المناقشة

الإفصاحات

شكر وتقدير

المواد

المراجع

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

مقالات ذات صلة