مقالة منهجية

طريقة جراحية لتأسيس نموذج فأر لالتهاب المفاصل العظمي في الركبة باستخدام إجراء هولث معدل

146 مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/70379

⸱

مايو 15, 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Longhua Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 2Spine Institute, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 3Key Laboratory of theory and therapy of muscles and bones, Ministry of Education (Shanghai University of Traditional Chinese Medicine), 4School of Traditional Chinese Medicine, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

يوضح هذا البروتوكول الخطوات الجراحية المتقدمة لنموذج هولث المعدل، موفرا طريقة موحدة وقابلة للتكرار لتحفيز التهاب المفاصل التجريبي.

الملخص

التهاب المفاصل العظمي في الركبة (KOA) هو مرض مزمن تنكسي في المفاصل يتميز بتنكس غضروف المفصل، وإعادة تشكيل العظم تحت الغضروطي، وتكوين العظام، والتهاب العزل، وهو النوع الأكثر شيوعا من التهاب المفاصل العظمي.

يقدم هذا البروتوكول طريقة جراحية لتحديد نموذج فأر لالتهاب المفاصل العظمي في الركبة باستخدام إجراء هولث المعدل. مقارنة بالنماذج الجراحية التقليدية أو المستحثة بالحقن مثل زعزعة استقرار الغضروف الهلالي الإنسي (DMM) وقطع الأربطة الصليبية الأمامية (ACLT)، فإن نموذج هولث المعدل يحفز بداية مرض مبكرة والتهاب مفاصل أكثر حدة. عن طريق قطع الرباط الجانبي الإنسي، والغضروف الهلالي الإنسي، والرباط الصليبي الأمامي، تعطل هذه الطريقة المحاذاة الميكانيكية لمفصل الركبة، مما يعزز تقدم التهاب المفعول الدهوي. هذا النموذج مناسب بشكل خاص لدراسة علم أمراض التهاب الفوسيوم الحاد وتقييم التدخلات العلاجية المحتملة. لتقييم شدة التهاب المفاصل، استخدمنا الموجات فوق الصوتية للحيوانات الصغيرة مع إعادة بناء ثلاثية الأبعاد (ثلاثية الأبعاد) لتجويف المفصل لقياس حجمه وتقييم تراكم السائل الزليلي. بالإضافة إلى ذلك، تم إجراء تلوين سافرانين-أو/الأخضر السريع للأقسام النسيجية لتقييم جمعية أبحاث التهاب المفاصل العظمي الدولية (OARSI) لتقييم تدمير الغضاريف.

المقدمة

التهاب المفاصل العظمي في الركبة (OA) هو مرض شائع ومزمن في المفاصل تنكس، يتميز سريريا بالألم، والتيبس، ومحدودية نطاق الحركة، وضعف العضلات حول الركبة. وانتشاره أعلى بين النساء مقارنة بالرجال. إذا لم يتم التحكم فيه بشكل كاف، يمكن أن يؤدي التهاب الفصى الدهري إلى فقدان تدريجي للقدرة البدنية، واضطراب النوم، والتعب المزمن، وفي النهاية الإعاقة. مع تقدم عمر السكان العالميين، يستمر معدل التهاب المفاصل الركبتي في الارتفاع، مما يشكل تحديا كبيرا لأنظمة الرعاية الصحية والاقتصاداتحول العالم.

من الناحية الفيزيولوجية المرضية، يمثل فقدان الغضروف السمة المركزية لالتهاب التماثيل التميزي، مصحوبا بضعف هيكلي ووظيفي في كامل أنسجة المفصل والمحيط بالمفصل. لتوضيح آليات المرض وتقييم التدخلات العلاجية، تم تطوير مجموعة متنوعة من النماذج الحيوانية التي تعيد تلخيص الجوانب الرئيسية لالتهاب الظروف البشري. من بين هذه النماذج الجراحية تستخدم بشكل متكرر. مثل عدم استقرار الغضروف الهلالي الإنسي (DMM)3 وقطع الأربطة الصليبية الأمامية (ACLT)4، تتسبب في اضطراب البنية الطبيعية للمفصل، مما يؤدي إلى تنكس الغضروف وتغيرات مشابهة للانفصال الهوائي. بدلا من ذلك، تعتمد النماذج الكيميائية على حقن داخل المفصل لعوامل تدهور المصفوفة خارج الخلية (مثل الكولاجناز أو يودوأسيتات أحادية الصوديوم)، مما يؤدي إلى موت سريع للغضروفية وتآكل الغضروف 5,6. بينما عادة ما تحقق نماذج الحقن العلم المرضي في نقطة النهاية خلال أسابيع، تتطلب النماذج الجراحية عادة دورة زمنية أطول.

من بين التقنيات الجراحية المتاحة، اخترنا وطورنا نموذج هولث بسبب تسريع ظهور OA7. من خلال الجمع بين قطع الأربطة الصليبية الأمامية والخلفية مع استئصال الأرباط الجانبي الإنسي واستئصال الغضروف الإنسي الكلي، يحفز هذا النموذج بشكل موثوق تلف غضروفي شديد وسريع التقدم وتغيرات في العظم تحت الغضروف. الإطار الزمني القصير لفشل المفصل الهيكلي يجعل نموذج هولث المعدل مناسبا بشكل خاص لدراسات التهاب المفاصل الحاد أو تحت الحاد، ونقترح أن بروتوكولنا المحسن يوفر منصة عملية وقابلة للتكرار للتحقيقات قبل السريرية المستقبلية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تمت الموافقة على جميع الإجراءات التجريبية من قبل لجنة أخلاقيات الحيوان في جامعة شنغهاي للطب الصيني التقليدي. تم شراء فئران ذكور C57BL/6 تتراوح أعمارهم بين 6-8 أسابيع ووزنها حوالي 20 جراما من بائعين تجاريين (انظر جدول المواد) (رقم موافقة الأخلاقيات: PZSHUTCM2312210005).

1. الرعاية قبل العملية

  1. اترك للفئران التكيف لمدة أسبوع على الأقل قبل الجراحة.
  2. قم بتعقيم جميع أدوات الجراحة قبل الجراحة وقم بتعقيم مساحة العمل.
  3. شغل جهاز التخدير الغازي، وضع الفأر في غرفة الحث لمدة 5 دقائق باستخدام 2-3٪ من الإيزوفلوران لبدء التخدير العام.
    ملاحظة: تأكد من الحفاظ على معدل تدفق الأكسجين بين 0.5 نيلوتون-لتر/دقيقة و1 نينولتون/دقيقة.
  4. بعد التخدير، انقل الفأر إلى منصة الجراحة وحافظ على التخدير باستخدام 1-1.5٪ من الإيزوفلوران عبر قناع تخدير حتى انتهاء الجراحة (1-1.5٪ إيزوفلوران).
  5. ضع الفأر في وضعية الاستلقاء على الظهر مع مواجهة مفاصل الركبة للأعلى، لضمان الاستقرار والوصول السليم إلى موقع الجراحة.
  6. تأكد من عمق التخدير بفحص عدم وجود ردود فعل، ثم ضع كريم إزالة الشعر لإزالة الشعر حول مفصل الركبة بالكامل.
  7. أزل الكريم المتبقي بعناية باستخدام الشاش أو عشاش القطن، ثم قم بتعقيم الجلد المكشوف أولا بنسبة 75٪ إيثانول، ثم صبغة اليود لضمان ظروف معهرة.

2. الإجراء الجراحي (الشكل 1)

  1. مد الطرف الخلفي للفأر وطبق الجر لشد الجلد. قم بعمل شق طولي بطول 0.5-1 سم على الجانب الإنسي لمفصل الركبة اليمنى باستخدام شفرة جراحية معقمة.
    ملاحظة: جميع الإجراءات الجراحية الموضحة أدناه أجريت تحت المجهر الجراحي.
  2. قم بسحب الجلد وقم بتشريح غير حاد للفافة الأساسية لكشف كبسولة المفصل بالكامل، ورؤية الرباط الرضفية.
  3. قم بفحص وقطع اللفافة التي تغطي الرباط الجانبي الإنسي (MCL) باستخدام إبرة حقن دقيقة.
  4. اقطع الرماية الخلفية الخلفية باستخدام المقصات المجهرية تحت التكبير.
  5. قم بتحريك الرباط الرضفي باستخدام إبرة لكشف المساحة داخل المفصل وتحديد الغضروف الهلالي الإنسي.
  6. اقطع الرباط الغضروفي الإنسي (MMTL) باستخدام المقص الدقيق بعد القطع، وافحص الأنسجة بلطف بإبرة لتأكيد الانفصال الكامل والحركة في الغضروف الهلالي.
  7. تحديد وقطع الرباط الصليبي الأمامي (ACL)، مع الحرص على تجنب تلف الرباط الصليبي الخلفي (PCL) أو الغضروف الهلالي الجانبي. عادة ما يؤدي ذلك إلى ظهور علامة أمامية إيجابية بعد العملية، مما يؤكد عدم استقرار المفصل.
    ملاحظة: اختبار الدرج: قبل إغلاق الجرح، كان الفخذ يثبت بيد واحدة بينما كان الكاحل ممسكا باليد الأخرى، مما يحافظ على الظنوب والفخذ في وضع عمودي. تم تطبيق الإزاحة الأمامية الخلفية النسبية بين عظم الساق وفخذها يدويا؛ أشارت الحركة الانتقالية الملحوظة إلى وجود علامة إيجابية في الدرج، مما يؤكد اضطراب الرباط الصليبي.
  8. ولتحفيز التهاب المفاصل العظمي الأكثر شدة، يمكن إجراء قطع متزامن لكل من الرباط الصليبي الأمامي (ACL) والرباط الصليبي الخلفي (PCL) مع استئصال الغضروف الهلالي الإنسي (MMT) (كما في نموذج هولث الكلاسيكي).
    ملاحظة: هذه الخطوة اختيارية ويمكن تنفيذها حسب الحاجة؛ إذا تم اختياره، يشكل هذا نهج النمذجة لنموذج هولث الكلاسيكي.

3. الرعاية بعد العملية

  1. أغلق الشق بغرز نايلون 4-0 وقم بتعقيم موقع الجراحة بصبغة اليود.
  2. ضع الفأر على وسادة تسخين مضبوطة في درجة الحرارة حتى يستعيد وعيه ويظهر تنفسه ونشاطا حركيا طبيعيا. وبعد أن تعافى تماما وعدم إظهار أي علامات ضيق، أعده إلى قفصه المنزلي.
  3. راقب سلامة الغرز بشكل مستمر لمدة 3-5 أيام بعد الجراحة. إذا لوحظ كسر الغرز، أعد تخدير الفأر وقم بإعادة الخياطة
  4. أعط مضادات حيوية عضلية لمدة تصل إلى 3 أيام بعد الجراحة لمنع العدوى بعد العملية.
    ملاحظة: يستخدم إعطاء المضادات الحيوية للوقاية من العدوى بعد العملية. يتم تحديد التخفيف بعد العملية بناء على أهداف تجريبية؛ في أبحاث التهاب المفاصل العظمي، عادة ما يتم حجب المسكنات خلال المرحلة الحادة لتجنب التقييم العلاجي الخلفي.
  5. راقب موقع الجراحة يوميا بحثا عن علامات التورم أو الإفرازات أو الالتهاب الموضعي.
  6. قم بقتل الفأر في نقطة الدراسة النهائية، وفقا للبروتوكولات المعتمدة، وتشريح مفصل الركبة للتحليل الأنسجي أو التصويري.
    ملاحظة: في هذه الخطوة، اعتمدنا بروتوكول القتل الرحيم للحيوانات التجريبية عن طريق التخدير بجرعة زائدة. تم تحقيق ذلك عن طريق حقن محلول بنتوباربيتال الصوديوم داخل الصفاق بجرعة >100 ملغ/كغ في الفئران.

4. تقييم تطوير التوازن المفتوح

  1. قبل القتل الرحيم، قيم تورم المفاصل وأجر تصوير بالموجات فوق الصوتية لتقييم التغيرات الهيكلية في مفصل الركبة. قيم أداء الحركة في الفأر من خلال إجراء اختبار الروتارود.
    ملاحظة: التخدير بالإيزوفلوران مطلوب لفحص الموجات فوق الصوتية في الفئران.
  2. بعد القتل الرحيم، قم بتشريح مفصل الركبة وإزالة العضلات واللفافة المحيطة بحذر مع الحفاظ على عظم الساق والشظية وعظم الفخذ.
    ثبت المفاصل وأزيل الكالسيف منها في محلول 10٪ من حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA) لمدة لا تقل عن 30 يوما، مع استبدال المحلول مرتين في الأسبوع لضمان إزالة الكالسية الكاملة.
  3. غرس مفاصل الركبة الخالية من الكلب في البارافين وتحضير مقاطع سهمية بسماكة 4 ميكرومتر8.
  4. ابدأ بجمع الأجزاء بمجرد أن يصبح الغضروف الهلالي واضحا. صبغ الأقسام بلون سافرانين O واللون الأخضر السريع لرؤية الغضروف وشكل العظم تحت الغضروف. تقييم تدهور الغضروف باستخدام نظام تقييم OARSI9 .
  5. إجراء التلوين الأخضر Safranin O-Fast (مجموعة تجارية مستخدمة، انظر جدول المواد)
    1. إزالة البارافينية وإعادة الترطيب
      1. قم بإزالة البارافينات من الزيلين لمدة 3 دقائق، وكرر 3 مرات.
      2. أعد ترطيبه عبر سلسلة إيثانول متدرجة (100٪، 90٪، 80٪) لإزالة البقايا من الزيلين، لمدة دقيقتين لكل منهما.
        ملاحظة: يجب استخدام سلسلة الإيثانول بترتيب تنازلي للتركيز.
      3. اشطف بالماء المقطر لمدة دقيقة واحدة ثم صففه لفترة وجيزة.
    2. صبغة الحديد هيماتوكسيلين من ويغرت
      1. ضع محلول ويغرت العملي على الأقسام، ثم صبغ لمدة 5 دقائق.
      2. اشطف بالماء المقطر لمدة دقيقة واحدة ثم صففه لفترة وجيزة.
    3. تمايز الأحماض
      1. ضع محلول التميز الحمضي على الأقسام لمدة 15 ثانية.
      2. اغسله بالماء لمدة 10 دقائق وقم بتصريف الماء الزائد.
        ملاحظة: وقت التمايز أمر بالغ الأهمية -- التمايز المطول يمنع التلوين الأخضر السريع، بينما يؤدي التمايز غير الكافي إلى صبغة خضراء عميقة وسريعة مع امتصاص ضعيف للسافرانين
    4. التلوين الأخضر السريع
      1. ضع محلول أخضر سريع على الأقسام لمدة 5 دقائق، ثم صففه لفترة وجيزة.
      2. ضع محلول حمضي ضعيف لإزالة بقية الصبغة الخضراء السريعة لمدة 15 ثانية، ثم صففه لفترة وجيزة.
    5. تلوين سافرانين
      1. ضع محلول سافرانين O على الأقسام لمدة 4.5 دقائق.
      2. انقل الأقسام بسرعة إلى 90٪ إيثانول لإزالة فائض السافرانين أوكيسيجين، 2-3 ثوان.
        ملاحظة: قد يتم تمديد هذه الخطوة بشكل مناسب حسب شدة صبغة السفرانين.
    6. الجفاف والتنظيف
      1. جفف الأجزاء بإيثانول 100٪ لمدة دقيقة واحدة.
      2. نظف أجزاء من الزيلين للجفاف الكامل، دقيقتين، كرر العملية 3 مرات.
        ملاحظة: يجب عدم خلط الزيلين المستخدم في هذه الخطوة مع ذلك المستخدم في القسم 4.5.1؛ قد يؤثر التلوث المتبادل على جودة المقطع.
    7. التركيب باستخدام بلسم محايد
      1. ضع أجزاء في غطاء أبخرة للسماح لزائدة الزيلين بالتبخر.
      2. أزل الأجزاء، وضع كمية مناسبة من البلسم المحايد على العينة، وغطه بعناية بغطاء داخلي.
      3. افحص الأقسام تحت المجهر الخفيف بحثا عن فقاعات هواء وقم بإزالة أي فقاعات بعناية.
      4. تخزين الأقسام في صندوق شرائح وضعه في فرن بدرجة حرارة 60 درجة مئوية لمدة 24 ساعة لضمان تجيب كامل للبلسم المحايد.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

تم إجراء الفحوصات الطولية لمفصل الركبة باستخدام نظام الموجات فوق الصوتيةالدقيقة 8 مع خطوة مسح بحجم 4 مم ودقة محورية 0.04 مم. في اليوم السابع بعد العملية، كشفت إعادة البناء ثلاثية الأبعاد عن زيادة ملحوظة في حجم تجويف المفاصل في مجموعة النموذج مقارنة بمجموعة الوهمية (الشكل 2A,B). أكد اختبار إرهاق الروتارود10,11 هذه النتيجة، وأظهرت انخفاضا كبيرا في قدرة التحمل عل...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

بالمقارنة مع طرق نمذجة الجراحة الأخرى، مثل عدم استقرار الغضروف الهلالي الإنسي (DMM) ونماذج قطع الأربطة الصليبية الأمامية (ACLT)، فإن نموذج هولث المعدل يحفز التهاب المفاصل العظمي من خلال إصابات مشتركة في الأربطة والغضروف الهلالي. يحدد هذا التعطيل الهيكلي المحدد التغيرات في ميكانيكا المفاصل الحيوية عبر مستويات مختلفة. ACLT4 يؤثر على الاستقرار الدوراني (الدوران الداخلي والخارجي) ويقلل من استقرار الجانب الأمامي الخلفي، مما يؤدي إلى علامات الأدراج الإيجابية. يتسبب DMM<...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يعلن المؤلفون عدم وجود مصالح متنافسة.

شكر وتقدير

تم تمويل هذه الدراسة من قبل خطة عمل الابتكار في العلوم والتكنولوجيا في شنغهاي (23YF1447900 إلى CJM)، وبرنامج تشينغوانغ من مؤسسة تطوير التعليم في شنغهاي ولجنة التعليم البلدية في شنغهاي (23CGA53 إلى CJM)، والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (من U24A6013 إلى XH).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
حقنة حقن بسعة 1 مل//المواصفات: 30 جرام وزنا؛ 0.13 مم
نظام تصوير الموجات فوق الصوتية ثلاثية الأبعاد Vevo 3100البصريةVevo 2100نظام تصوير بالموجات فوق الصوتية عالي التردد مدمج مع برنامج Vevo LAB لتحليل البيانات.
غرزة نايلون 4-0//
75٪ إيثانولشركة شنغهاي تايتان العلمية المحدودةG73537O
فئران ذكور C57BL/6J (عمرها 6-8 أسابيع)شركة شنغهاي جيسيجي لمختبر الحيوانات المحدودة./
كريم إزالة الشعرفيتالمجموعة: C021123001
صبغة اليود//
إيزوفلورانRWD R650-IE
الملقط الدقيقRWD F12013-10
المقص الصغيرRWD S11035-08
مجموعة صبغة Safranin O المعدلة وFast Green StainسولاربيولوجياG1371
حامل الإبرRWD F21001-12
شفرات جراحية (10#)RWD S31010-01
المجهر الجراحيأوليمبوسSZ61

المراجع

  1. Sharma, L. Osteoarthritis of the Knee. N Engl J Med. 384 (1), 51-59 (2021).
  2. Chen, D., et al. Osteoarthritis: toward a comprehensive understanding of pathological mechanism. Bone Res. 5, 16044(2017).
  3. Glasson, S. S., Blanchet, T. J., Morris, E. A. The surgical destabilization of the medial meniscus (DMM) model of osteoarthritis in the 129/SvEv mouse. Osteoarthritis Cartilage. 15 (9), 1061-1069 (2007).
  4. Zhou, X., et al. Antioxidant taurine inhibits chondrocyte ferroptosis through upregulation of OGT/Gpx4 signaling in osteoarthritis induced by anterior cruciate ligament transection. J Adv Res. 77, 551-567 (2025).
  5. Jal Janusz, M., et al. Moderation of iodoacetate-induced experimental osteoarthritis in rats by matrix metalloproteinase inhibitors. Osteoarthritis Cartilage. 9 (8), 751-760 (2001).
  6. Meng, X., et al. An impaired healing model of osteochondral defect in papain-induced arthritis. J Orthop Translat. 26, 101-110 (2021).
  7. Rogart, J. N., Barrach, H. J., Chichester, C. O. Articular collagen degradation in the Hulth-Telhag model of osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 7 (6), 539-547 (1999).
  8. Xu, H., et al. Utilization of longitudinal ultrasound to quantify joint soft-tissue changes in a mouse model of posttraumatic osteoarthritis. Bone Res. 5, 17012(2017).
  9. Glasson, S. S., Chambers, M. G., Van Den Berg, W. B., Little, C. B. The OARSI histopathology initiative - recommendations for histological assessments of osteoarthritis in the mouse. Osteoarthritis Cartilage. 18 (Suppl 3), S17-S23 (2010).
  10. Lubrich, C., Giesler, P., Kipp, M. Motor behavioral deficits in the Cuprizone model: Validity of the rotarod test paradigm. Int J Mol Sci. 23 (19), 11342(2022).
  11. Piel, M. J., Kroin, J. S., van Wijnen, A. J., Kc, R., Im, H. J. Pain assessment in animal models of osteoarthritis. Gene. 537 (2), 184-188 (2014).
  12. Obeidat, A. M., et al. A standardized approach to evaluation and reporting of synovial histopathology in two surgically induced murine models of osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 32 (10), 1273-1282 (2024).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

الفيديو قريباً

مقالات ذات صلة