مقالة بحثية

تأسيس الثقافات الأولية الغنية بالمناطق من قشرة الغدة الكظرية للفأر

DOI:

10.3791/70403

⸱

مايو 8, 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Endocrinology, Boston Children's Hospital, 2Department of Pediatrics, Harvard Medical School, 3Harvard Stem Cell Institute, 4Institute of Biomedical Science, University of São Paulo, 5Broad Institute of MIT and Harvard

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تطوير نهج قوي وقابل للتكرار لإنشاء الثقافات الأولية ثنائية الأبعاد لخلايا المنطقة الغنية بالزونا كبيبات والمنطقة الحامية للقشرة الكظرية للفأر. يحافظ هذا النظام على الخصائص الجزيئية والوظيفية الرئيسية لكل منطقة، مما يتيح دراسة مركزة لمسارات الإشارات، وإنتاج الهرمونات، وسلوك الخلايا القشرية الكظرية خارج الجسم الحي.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تغلف غدة الفأر الكظرية بطبقة خلوية متوسطة (كبسولة) وتحتوي على قشرة تحتية منظمة في مناطق متحدة المركز مميزة ذات وظائف غدد صماء متخصصة: المنطقة الكبابية (zG) التي تنتج الألدوستيرون، والمنطقة الفاسيكولاتا (zF) التي تنتج الكورتيكوستيرون. النخاع الكظري، الواقع في مركز الغدة، ينتج الكاتيكولامينات. لقد تقيدت الدراسات الميكانيكية للخلايا من كل منطقة غددة قشرية بسبب غياب نماذج في المختبر تحافظ على خصائصها الجزيئية والخلوية والوظيفية الخاصة بالمنطقة. لتجاوز هذا القيد، تم تطوير نهج تجزئة باستخدام التشريح الدقيق للغدد الكظرية في الفأر البالغ. تفصل هذه الطريقة خلايا الغدة الكظرية عن الفئران الذكور إلى جزء خارجي محظى ب zG، يحتوي على كبسولة وخلايا zG، وجزء داخلي غني ب zF يحتوي على zF وخلايا النخاع. تم استخدام هذه الكسور لتوليد ثقافات أولية ثنائية الأبعاد (ثنائية الأبعاد) مثرية إما لخلايا zG أو zF. أكد تحليل التعبير الجيني أن الثقافات الغنية ب zG تعبر عن مستويات عالية من علامات zG (Cyp11b2، Dab2، و Shh)، إلى جانب زيادة في علامات مسار Wnt/β-catenin (Wnt4، Lef1). على النقيض من ذلك، أظهرت الثقافات الغنية ب zF تعبيرا أعلى لعلامات zF (Cyp11b1 و Akr1b7) ومستويات أقل من علامات مسار Wnt/β-catenin، مما يتوافق مع توقيع النسخ zF. وقد أكد التعبير عن العلامات الستيرويدية (Nr5a1، ستار) الأصل القشري لكلا جزئي الخلية. يشير هيدروكسيلاز التيروزين إلى وجود خلايا نخاع الغدة الكظرية في الثقافات الغنية ب zF. وظيفيا، أنتجت المزارع الغنية ب zG الألدوستيرون في ظروف قاعدية وأظهرت زيادة في الإنتاج استجابة للأنجيوتنسين II، والبوتاسيوم، وهرمون الأدرينوكورتيكوتروبيك (ACTH). وعلى العكس، أنتجت الثقافات الغنية ب zF الكورتيكوستيرون في البداية وأظهرت زيادة في الإنتاج استجابة لتحفيز ACTH. بشكل عام، يمثل هذا البروتوكول نموذجا قويا وقابلا للتكرار وذو صلة بيولوجية لدراسة بيولوجيا قشرة الغدة الكظرية. يتيح هذا النظام من تحقيق مسارات الإشارات، والآليات الجزيئية، والاستجابات الفسيولوجية حسب المنطقة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

كبسولة رقيقة من الميزنكيميا تغلف غدة الفأر الكظرية، والتي تتكون من قسمين رئيسيين: القشرة الخارجية والنخاع الداخلي. تنقسم قشرة الغدة الكظرية للذكر البالغ إلى مناطق مميزة، المنطقة الكبيبة (zG) والمنطقة الفاسيكولاتا (zF)، ولكل منها خصائص شكلية ووظيفية فريدة 1,2,3,4. الوظيفة الأساسية لقشرة الغدة الكظرية هي إنتاج هرمونات الستيرويد، بما في ذلك الكورتيكويدات المعدنية (ألدوستيرون) والجلوكوكورتيكويدات (الكورتيكوستيرون في الفئران). ال zG هو المنطقة الخارجية والأكثر تماسكا ويتكون من خلايا بيضاوية منظمة في هياكل وردية تعبر عن إنزيم ألدوستيرون سينثاز (CYP11B2)، مما يسمح بإنتاج الألدوستيرون 2,3,5,6,7. يتم تنظيم إفراز الألدوستيرون بشكل أساسي بواسطة نظام رينين-أنجيوتنسين-ألدوستيرون (RAAS)، والبوتاسيوم، وبدرجة أقل بواسطة ACTH 5,8. يتكون zF من خلايا أكبر مرتبة في حبال شعاعية/حزميات، ويشكل الغالبية العظمى (~85٪) من القشرة الدماغية، وينظم بشكل أساسي بواسطة ACTH 2,3,5,9. تنظم عدة مسارات إشارة تطور الغدد الكظرية وصيانتها ووظيفتها من خلال تنظيم ديناميكيات الخلايا السابقة، وتقسيم المناطق، والنشاط المنشط للستيرويد. من بين هذه العوامل SF-1 (عامل الستيرويدوجين-1، Nr5a1) هو منظم رئيسي ضروري لتحديد الغدد القشرية، وتكاثرها، وإنتاج الهرمونات10. إشارات القنفذ الصوتي (Shh)، النشطة في zG، تعزز توسع الخلايا السلفية وتدعم تجديد القشرة في zG 11,12,13.

إشارة Wnt، خاصة عبر مسار β-كاتينين القانوني، ضرورية لتحديد منطقة الغدة الكظرية وسلامة القشرة. في الفأر، يتم تنظيم حجم الغدة الدماغية الطبيعي والمناطق بواسطة تدرج لنشاط إشارة WNT يمتد من الكبسولة إلى zF. يدعم هذا التدرج التعبير الموضعي لروابط WNT والمنشطات، خاصة WNT4 في zG، وWNT2B وR-spondins (RSPO1 و/أو RSPO3) في الكبسولة 7,14,15,16,17,18,19,20,21,22 . يتم الحفاظ على قشرة الغدة الكظرية بواسطة تدفق الخلايا المركزية من الخلايا السلفية المتكاثرة الموجودة في منطقة القشرة تحت الكبسولة/الخارجية في القشرة الكظرية، والتي تنتج خلايا zG متمايزة تهاجر إلى الداخل نحو ال zF. عندما تنتقل الخلايا من zG إلى zF، تمر بتغيرات في التعبير الجيني ووظائفها تعرف باسم التمايز العابر. وقد حظي هذا النموذج بدعم قوي من دراسات تتبع النسب باستخدام سلالة الفئران المعدلة وراثيا ASCre/+، والتي تستهدف بشكل خاص الخلايا المنتجة للألدوستيرون في zG 23,24,25.

تم استخدام عدة طرق في المختبر لدراسة بيولوجيا الغدة الكظرية بناء على تفكك الغدة الكظرية بالكامل 26,27,28. على سبيل المثال، وصفت دراسة تفكك قشرة الغدة الكظرية في تحليلات الفيزيولوجيا الكهربائية وتحليل الرقعة27، واستخدمت دراسة أخرى خلايا قشرة الغدة الكظرية المفككة لدراسة آليات الإشارة المتعلقة بفسيولوجيا الغدة الكظرية وتنظيم ضغط الدم26. بينما قدمت هذه المنهجيات رؤى وظيفية مهمة، إلا أنها تعتمد على الخلايا الناتجة عن تحضيرات الغدة الكظرية بالكامل بدلا من فصل المناطق القشرية قبل زراعة الخلايا.

نظرا لتعقيد وتنوع الغدة الكظرية النسيجة، فإن فهم الأدوار المميزة لأقسام خلاياها أمر ضروري لتوضيح الآليات الكامنة وراء وظيفة الغدة الكظرية. في هذه الدراسة، تم إنشاء زراعة خلايا قشرية للفئران أولية غنية بخلايا zG أو zF. ميزة رئيسية لهذه الطريقة هي توليد مزارع خلايا غنية ب zG، مما يمكن من تعديل مسارات الإشارات والعوامل البيئية تجريبية لدراسة دورها الخاص في بيولوجيا قشرة الغدة الكظرية بشكل أفضل. يشمل ذلك دراسة صيانة الخلايا السابقة، والآليات الكامنة وراء اللدونة الزونية والتمايز المتبادل نحو zF، ونمذجة تركيب المصفوفة خارج الخلية. بالتوازي، تولد هذه الطريقة زراعات خلايا zF غنية للغاية، مما يوفر منصة مكملة للدراسات الوظيفية والخاصة بالإشارات. معا، توفر هذه الميزات نظاما قويا يتم التحكم فيه تجريبيا لتعزيز فهم بيولوجيا الغدة الكظرية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أجريت جميع التجارب وفقا للبروتوكولات المعتمدة من لجنة رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية في مستشفى بوسطن للأطفال (IACUC) بموجب رقم الموافقة 00002611. يتم توفير قائمة كاملة بجميع المواد المستخدمة في هذا البروتوكول، بما في ذلك المواد الكيميائية والمواد الاستهلاكية والمعدات، في جدول المواد، إلى جانب أرقام المصنعين وأرقام الكتالوج المطابقة لضمان قابلية التكرار.

الزراعة الأولية لخلايا الزونا الكبيضية الكظبية والزبونة اللوثية للفئران
تم تكييف الطرق المستخدمة لتأسيس الزراعة الأولية لخلايا الغدة القشرية الذكور البالغين من النوع البري (Mus musculus, C57BL/6) في هذه الدراسة من إجراء تم تطويره أصلا لفئران سبراج-داولي28. لتأكيد فصل وهوية مجموعات خلايا زونا كبيبة وزونا فاسيكولاتا، تم استخدام نموذج تتبع النسب باستخدام فئران Cyp11b2tm1.1(cre)Brlt/+ (المعروفة أيضا باسم Cre) 1,2,3,4 وفئران Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato-EGFP) Luo/J (المعروفة أيضا باسم ROSAmT/mG)29.

التحضير قبل الإجراء
المواد
مجموعتان من الملقط والمقص للشقوق السطحية ومجموعة أخرى لشق تجويف البطن (الشكل 1A الإضافي). دفأ وسط الزراعة وPBS (37 درجة مئوية). حضرت طبقين (P60) باستخدام DMEM/F-12. تم تجهيز 3 أطباق (P60) مع PBS دافئ لغسل الغدد بالتتابع (الحمام 1، 2، و3) (الأشكال الإضافية 1B، 1–3)، وطبق واحد للحفاظ على الغدة الكظرية في محلول (الأشكال الإضافية 1B، 4). تم تحضير طبقين (P60) مع ورق ترشيح معقم على السطح (الأشكال الإضافية 1C، 1–2). جهزت طبقين من P60 مع 500 ميكرولتر من محلول الهضم ووضعت عليها علامات على الكبيبة (zG) أو الحزمة (zF) (الأشكال الإضافية 1D، zG، zF). جهزت أنبوبين، وزينت zG وzF، وأضفت 4.5 مل من محلول الهضم.

الحلول
لصنع محلول الهضم، تم إذابة الكولاجناز من النوع الأول (التركيز النهائي 4 ملغ/مل) وDNase I (التركيز النهائي 0.04 ملغ/مل) في 5 مل من وسط DMEM/F-12 النقي. قمت بترشيح المحلول إلى أنبوب بسعة 50 مل باستخدام حقنة وفلتر 0.22 ميكرومول. يجب تحضير محلول الهضم طازجا في كل مرة.

الحيوانات
للحصول على الزراعة الأولية المغنية لخلايا الفئران الكظرية والمنطقة الفاسيكولاتا، استخدم 10–15 فأرا ذكرا شابا، تبلغ أعمارهم تقريبا 6–7 أسابيع. الإناث لديهن غدد كظرية أكبر قليلا من الذكور، ويمكن استخدام أي من الجنسين بهذا البروتوكول. ومع ذلك، في هذه الدراسة، تم استخدام الذكور فقط لتجنب التداخل المحتمل من منطقة X الموجودة لدى الإناث الصغيرات، مما يضمن الفصل الدقيق للمناطق. تم قتل الفئران عن طريق استنشاق ثاني أكسيد الكربون وفقا لإرشادات رعاية الحيوانات المؤسسية. تم تأكيد الوفاة بغياب التنفس ونقص الاستجابة الذهنية. تم تشريح الغدد الكظرية فورا، خلال 3–5 دقائق من تأكيد الوفاة، للحفاظ على بقاء الأنسجة.

وضعية وتعرض البطن
وضع الفأر في وضعية ظرافة ظهرية على سطح مستو معقم (الشكل 1A). تم تعقيم فراء الحيوان بنسبة 70٪ كحول. تم استخدام الملقط والمقص للشقوق الجلدية، والمجموعة الثانية للشق في تجويف البطن. تم عمل شق أولي في المنطقة الإربية من البطن، يمتد جانبيا نحو الصدر من كلا الجانبين ليكشف عن الصفاق (الشكل 1B). تم سحب الجلد بعناية، تليها عضلات البطن، لكشف تجويف البطن (الشكل 1C). يجب أن يكون الشق الأولي سطحيا لتجنب تلف الأعضاء الداخلية. تقدم إلى طبقة العضلات مع شق حذر، ثم كشف تجويف البطن. تجنب تمزق الأوعية الدموية، لأن النزيف قد يصعب تحديد موقع الغدد الكظرية ويؤخر تجمعها. غير الأدوات الجراحية لتقليل التلوث الميكروبي.

تحديد وجمع الغدة الكظرية اليسرى
تقع الغدة الكظرية اليسرى في الوسط وأعلى الكلية اليسرى في الخلف الصفاقي، ذات شكل بيضاوي ولون وردي، محاطة بأنسجة دهنية بيضاء (الأشكال 1D–G). أثناء إزاحة الأعضاء المجاورة بعناية باستخدام ملقط غير حاد لتحسين الرؤية، استخدم المقص لإزالة معظم الأنسجة الدهنية باستخدام قطع قصيرة ومتحكم بها، معزولة الغدة الكظرية. تجنب الإمساك المباشر بالغدة الكظرية لمنع تلف كبسولتها. تم وضع الغدة مباشرة بعد العزل في طبق زراعة P60 يحتوي على 10 مل من DMEM/F-12 المسخن مسبقا عند 37 درجة مئوية (الشكل 1F).

تحديد وجمع الغدة الكظرية اليمنى
تقع الغدة الكظرية اليمنى جانبيا وأعلى الكلية اليمنى في خلف الصفاق، ذات شكل بيضاوي ولون وردي (الأشكال 1E–H). قد يكون تحديد هذه الغدة الكظرية أكثر تحديا بسبب قربها من أعضاء أخرى، مثل الكبد والقولون الصاعد، بالإضافة إلى الأوعية الدموية القريبة. أثناء إزاحة الأعضاء المجاورة بعناية باستخدام ملقط حاد لتحسين الرؤية، استخدم المقص لإزالة معظم الأنسجة الدهنية باستخدام قطع قصيرة ومتحكم بها، مع عزل الغدة الكظرية مع الحرص على عدم إتلاف الكبسولة. تم وضع الغدة مباشرة بعد العزل في طبق زراعة P60 مع 10 مل من DMEM/F-12 المسخن مسبقا عند 37 درجة مئوية. الغدد الكظرية تدمج في نفس الطبق (الشكل 1F). خلال الإجراء، من الضروري التعامل مع الأوعية الدموية الرئيسية في المنطقة بحذر لتجنب الجروح العرضية التي قد تسبب نزيفا وتعقد عملية التثبيت. الأوعية الرئيسية التي يجب الحذر منها تشمل الأوردة الكلوية والشرايين الكلوية. جمعت الغدة الكظرية مع بعض الأنسجة الدهنية الملتصقة. هذا يسهل التعامل مع الغدة ويحمي من تلف الكبسولات والتلوث (الشكل 1I).

العمل في شفاط تدفق طبقي معقم
قبل نقل الغدد إلى غطاء التدفق الطبقي، تم مسح الطبق بالكحول بنسبة 70٪. تم غسل الغدد الكظرية ب PBS ثلاث مرات في درجة حرارة الغرفة (25 درجة مئوية) (في الصحون 1 و2 و3 وجمعت في الطبق 4) (الشكل الإضافي 1B). يساعد ورق الفلتر في التصاق الدهون ويضمن نتائج أفضل. أثناء تحضير عدة غدد، يجب الحفاظ على الأنسجة المنفصلة في DMEM المدفئة مسبقا للحفاظ على الصلاحية. تم الإمساك بالغدة الكظرية بواسطة نسيج الدهون الملتصق (الأشكال 1I–J)، وتم تشريح الدهون بعناية على ورق الترشيح (الشكل الإضافي 1C، الطبق 1)، باستخدام ملقط دقيق وحركات محكمة لتجنب إتلاف الكبسولة. النتيجة المتوقعة هي غدة ناعمة وسليمة خالية من الدهون الزائدة والأنسجة الضامة، كما هو موضح في الشكل 1K. تم نقل الغدد الكظرية بعناية إلى ورق مرشح جديد (الشكل الإضافي 1C، الطبق 2) لتسهيل التشريح الدقيق للاستئصال الدقيق. تم قرص الكبسولة بلطف باستخدام ملقط دقيق، وباستخدام شفرة المشرط، تم إجراء شق شعاعي في الغدة دون قطع الأنسجة بالكامل.

تم كشف محتويات القشرة الداخلية بلطف عن طريق دفعها للخارج عبر الشق عبر الضغط الميكانيكي الطفيف باستخدام الملقط. ظلت الكبسولة وzG متصلتين بطرف الملقط، بينما كانت المادة الغدية المطرودة الداخلية تتوافق مع zF والنخاع. يجب أن يبدأ الهضم الإنزيمي فقط بعد معالجة جميع الغدد (الشكل 1L)، بسبب الانفصال الميكانيكي للمناطق الخارجية والداخلية.

الهضم
تم تصنيف أنبوبين ك OF (الجزء الخارجي: الكبسولة والزغ) أو IF (الجزء الداخلي: zF والنخاع) (الشكل 1M). تمت إضافة ما مجموعه 4.5 مل من محلول الهضم المسخن مسبقا (37 درجة مئوية)، وتم نقل محلول OF وIF إلى الأنابيب المناسبة. تم حضن العينات عند درجة حرارة 37 درجة مئوية في حاضنة رطبة تحتوي على 5٪ CO₂ لمدة 30 دقيقة، وتم تدوير الأنابيب بلطف كل 10 دقائق، عن طريق قلبها يدويا 2–3 مرات لضمان تعرض منتظم لمحلول الإنزيم. قد يختلف الوقت المطلوب للهضم حسب جودة ونشاط وظروف تخزين الكولاجيناز. بعد 30 دقيقة، تم تفكيك النسيج عن طريق الرش بالماصات صعودا وهبوطا 40 مرة بضربات بطيئة ومتحكم بها، باستخدام ماصة مصلية بحجم 5 مل لتوليد خليط خلية واحدة. بعد تفكك النسيج، من المثالي ألا تبقى شظايا مرئية، ويجب أن يبدو الوسط عكرا. إذا كانت الشظايا لا تزال موجودة، فقد ينظر في هضم إضافي لمدة 15 دقيقة.

الغسيل والطلاء
بعد الهضم، تم غسل الخلايا بإضافة 45 مل من DMEM/F-12 لإزالة الإنزيم المتبقي (الشكل 1 M). تم طرد العينات على حرارة 150 × جرام لمدة 12 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (25 درجة مئوية). بعد الطرد المركزي، يتوقع وجود حبيبات صغيرة ومضغوطة ذات مظهر وردي إلى أصفر فاتح قليلا، بينما يجب أن يبقى الفائق صافيا وخاليا من الجسيمات المرئية. تمت إزالة السوبرناتينت بعناية والتخلص منها، مع الحرص على عدم إزعاج الحبيبة. تم إعادة تعليق الحبيبة في وسط زراعة مسخن مسبقا (37 درجة مئوية) وفقا للحجم النهائي المطلوب للطلاء (انظر أدناه). تم الحفاظ على كثافة طلاء مثالية تبلغ حوالي 70٪ لضمان بقاء وحيوية الزرعة. تم تقدير عدد الخلايا باستخدام غرفة عد نيوباور قبل الطبق، وتم تعديل عدد الخلايا المزروعة حسب مساحة طبق الزراعة لتحقيق التقاء المطلوب. قم بتغليف الخلايا الخارجية الغنية بالزي جي (OF) بكثافة تقارب حيوان واحد لكل بئر (عادة ما تنتج ~1.5–2.5 × 104 خلايا) وخلايا الكسر الداخلية الغنية ب zF عند ~0.63 حيوان لكل بئر (عادة ما تنتج ~2.5–4.0 × 104 خلايا) في صفيحة مكونة من 48 بئرا.

صيانة زراعة الخلايا
كانت الخلايا تزرع في وسط الزراعة المذكور أعلاه وتحافظ عليها تحت ظروف قياسية في حاضنة رطبة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO₂. بعد 24 ساعة من الزراعة، تم استبدال الوسط لإزالة الحطام وأي خلايا دم متبقية. تعزز هذه الخطوة النمو الأمثل. تم سحب الطبق بعناية، وأضيف متوسط جديد مسخن مسبقا (37 درجة مئوية). انتظر على الأقل 48 ساعة قبل تقييم الخلايا في التجارب الوظيفية. يوصى بالانتظار ثلاثة أيام قبل إجراء التجارب الوظيفية لضمان ترسيخ الزراعة بشكل جيد. قد تتطلب الزراعة الممتدة بعد هذه الفترة التريبسين والمرور، مما قد يؤدي إلى اختيار الخلايا وفقدان خصائص الزراعة الأولية.

تحليل البيانات والإجراءات الداعمة
تحضير زراعة الخلايا الأولية للغدة الكظرية
تم إنشاء زراعة أولية للغدد الكظرية الكاملة باتباع نفس الإجراءات لجمع الأنسجة، والهضم، والغسل، والتلوين، واستخدمت كضوابط قياسية للاختبارات الجزيئية والوظيفية.

تحليل التعبير الجيني
لتنقية الحمض النووي الريبي الكلي من خلايا OF وIF، تم تجانس الخلايا المزروعة في TRIReagent باستخدام مجموعة RNA، وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. تم تقييم سلامة وتركيز الحمض النووي الريبي باستخدام التحليل الطيفي. شملت معالجة الحمض النووي الريبي الكلي التحويل العكسي إلى cDNA باستخدام مجموعة النسخ العكسي cDNA عالية السعة. تم إجراء تحليل التعبير الجيني بواسطة تحليل PCR الكمي في الوقت الحقيقي (qPCR) باستخدام جهاز التدوير الحراري. تم استخدام النسخ التقنية للتحكم في التغيرات. تم استخدام تمهيدات TaqMan Universal PCR Master Mix وتاك مان بالفأرة (الجدول 1). تم اختيار قيمة عتبة الدورة (CT) ضمن نطاق التضخيم الخطي لكل عينة تم تشغيلها في مكررة. تم تطبيعه بواسطة جينات التحكم الداخلي β الأكتين والبروتين الريبوزومي 18S (Rps18). تم حساب مستويات التعبير النسبية باستخدام طريقة 2–ΔΔCt رقم 30. تعرض بيانات ثلاث تجارب مختلفة كمتوسط ± انحراف معياري (SD). أجرينا ثلاث تجارب مستقلة.

تحفيز إفراز الألدوستيرون والكورتيكوسترون في الزرعات الأولية ZG و ZF
تم إنشاء والحفاظ على الزراعة الأولية لخلايا زونا كلوبيرولوزا (ZG) والمنطقة الفاسيكولاتا (ZF) عند درجة حرارة 37 درجة مئوية في غلاف جوي رطب يحتوي على 5٪ CO₂. تم طلاء حوالي 5 × 104 خلايا لكل بئر في صفيحة مكونة من 48 بئر باستخدام وسط نمو كامل. بعد أربعة أيام من الزراعة المستمرة، عكست قياسات الإفراز الأساسي إنتاج الهرمونات التراكمي خلال هذه الفترة. في اختبارات التحفيز، تم استنشاق الوسط، وغسلت الخلايا مرة واحدة بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) لإزالة العوامل المتبقية. بعد ذلك، أضيف 200 ميكرولتر من الوسط الطازج إلى كل بئر، وتمثل الفحوصات التالية إفرازا محفزا حادا ضمن نافذة زمنية محددة. في اختبارات تحفيز الألدوستيرون، تم تزويد وسط الزراعة بأنجيوتنسين II (Ang-II، 10 نانومتر)، والبوتاسيوم (K+)، وككلوريد البوتاسيوم (KCl، 10 ملليمو)، وACTH (10 نانومال). تم استخدام كلوريد الصوديوم (NaCl، 10 ملليمتر) كوسيلة تحكم للمركبة. في اختبارات تحفيز الكورتيكوستيرون، تم اتباع نفس الإجراءات، لكن تم تعزيز الوسط ب ACTH (10 نانوملار)، أو فورسكولين (10 ميكرومول)، أو NaCl (10 ملليموتر) كوسيلة تحكم للمركبة. بعد 6 ساعات من الحضانة عند 37 درجة مئوية و5٪ CO، تم جمع الزائفات الزائدة في الزراعة وتخزينها عند −80 درجة مئوية لقياس الهرمونات لاحقا، كما هو موضح سابقافي 31. تم تحلل الخلايا الملتصقة المتبقية لاستخلاص البروتين، وتم تطبيع مستويات الهرمونات إلى إجمالي محتوى البروتين في الليزات المقابل.

استخراج البروتين وتطبيع قياسات الألدوستيرون والكورتيكوستيرون
تم استخراج البروتين باستخدام تحليل RIPA ومحلول الاستخلاص، مع إضافة مزيج مثبط بروتياز 1x Halt Halt. تم إعادة تعليق الخلايا عن طريق التوصيل بأنابيب لأعلى وأسفل 15 مرة باستخدام رأس ماصة P200 ثم تم تصويتها باستخدام جهاز قياس المجس. تم تحديد تركيز البروتين باستخدام مجموعة اختبار بروتين BCA وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.

قياس الألدوستيرون بواسطة التحليل المناعي الإشعاعي (RIA)
تم تحديد تركيز الألدوستيرون في المواد الفائقة لزراعة الخلايا باتباع بروتوكول الشركة المصنعة. باختصار، تمت إضافة 50 ميكرولتر من المادة الفائقة و150 ميكرولتر من 1٪ BSA في PBS، بالإضافة إلى 500 ميكرولتر من متتبع الألدوستيرون المشيع، إلى أنابيب مغطاة بالأجسام المضادة الألدوستيرون. بعد الخلط، تم حضن الأنابيب في درجة حرارة الغرفة (25 درجة مئوية) لمدة 18 ساعة. ثم تم تفريغ خليط الحضانة، وتم حساب الإشعاع في الأنابيب باستخدام عداد غاما ذاتي Cobra II31. تم تطبيع مستويات الألدوستيرون إلى بروتين كلي، كما هو موضح سابقا.

قياس الكورتيكوسترون
تم قياس تركيزات الكورتيكوستيرون في مكونات الزراعة الخلوية باستخدام مجموعة اختبار المقاومة المناعية المرتبط بالإنزيم (ELISA) التنافسية المخصصة للكورتيكوستيرون في الفئران والجرذان، وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. تم تطبيع مستويات الكورتيكوسترون إلى بروتين كلي، كما تم وصفهسابقا 32.

المناعة
تم إجراء التألق المناعي على كل من أقسام الغدة الكظرية المدمجة في البارافين والخلايا المزروعة التي نمت على أغطية زجاجية معالجة مسبقا مطلية ب Poly-L-lysine. لجميع العينات، تم إجراء الحجب باستخدام مصل الماعز الطبيعي (NGS) بنسبة 5٪ في PBS، وتم صبغ النوى بمادة DAPI (4′، 6-دياميدينو-2-فينيل إندول، 1:1000). تم غسل الزلاجات والغطاء ثلاث مرات لمدة 5 دقائق لكل منها بنسبة 0.1٪ من Tween-20 في PBS بين خطوات الحضانة. بعد التلوين، تم تركيب العينات باستخدام Antifade Mountant وتخزينها في الظلام حتى التصوير. مقاطع الأنسجة: تم إزالة البارافين من أجزاء الغدة الكظرية من البارافين في الزيلين، ثم شطفها عبر سلسلة إيثانول متدرجة (100٪، 95٪، 70٪)، وأخيرا شطفها ب PBS. تم إجراء استرجاع المستضدات في مخزن Tris-EDTA (قاعدة Tris 10mM، 1 mM EDTA، 0.05٪ Tween-20، pH 9.0) عن طريق التسخين عند 95 °م لمدة 20 دقيقة. بعد التبريد إلى درجة حرارة الغرفة، تم غسل المقاطع ب PBS وحجبها ب 5٪ NGS في PBS لمدة ساعة واحدة. تم حضنة الأقسام طوال الليل عند 4 درجات مئوية مع الأجسام المضادة الأولية التالية المخففة بنسبة 1:100 في 5٪ NGS في PBS: الفأر مضاد Dab2، مضاد للدجاجة GFP، ومضاد للأرانب RFP. تم استخدام الأجسام المضادة الثانوية التالية (1:300): أليكسا فلور 594 مضاد للفئران IgG، أليكسا فلور 594 مضاد للدجاج IgY، وأليكسا فلور 647 مضاد للأرانب IgG.

الخلايا المزروعة: تم إجراء الفلورية المناعية على الغطاء بعد أربعة أيام من الطبق. تم تثبيت الخلايا ببارافورمالديهيد 4٪ (PFA) المسخن مسبقا عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة وغسلها ثلاث مرات في PBS. تم إجراء الحجب باستخدام 5٪ NGS في PBS لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. تم حضنة الغطاء خلال الليل عند 4 درجات مئوية باستخدام فأر مضاد Dab2 (1:100 في 5٪ NGS/PBS)، تلاها أليكسا فلور 488 مضاد للفأر (1:500).

التقاط الصور: تم التقاط صور الحقول المضيئة والفلورية (mGFP وmTomato) للخلايا المزروعة باستخدام نظام المجهر. تم التقاط فلورة mGFP باستخدام مجموعة مرشح للفلورة الخضراء (الإثارة: 470 نانومتر، الانبعاث: 525 نانوموتر)، وتم التقاط فلورة الطماطم باستخدام مجموعة مرشح للفلورة الحمراء (الإثارة: 585 نانومتر، الانبعاث: 624 نانوم).

البرمجيات والتحليل الإحصائي
تم إنشاء ملخصات بصرية، ومخططات مخططة، وأشكال باستخدام Adobe Illustrator 2023 (Adobe Inc., https://www.adobe.com/products/illustrator.html) وBioRender (https://www.biorender.com)، وتم الوصول إليه في مايو 2025. تم تحليل البيانات باستخدام GraphPad Prism الإصدار 10.0. متوفر على: https://www.graphpad.com. أجريت جميع التجارب على الأقل ثلاث مرات ومتكررة بشكل مستقل لضمان قابلية تكرار النتائج. للمقارنات بين مجموعتين، تم استخدام اختبار t الخاص بالطلاب (مزدوج أو غير مقران، حسب الحاجة). للمقارنات التي تشمل ثلاث مجموعات أو أكثر، تم إجراء تحليل التباين (ANOVA) يليه اختبار ما بعد الحدث المناسب لتحديد الفروق ذات الدلالة بين المجموعات. تعرض النتائج كمتوسط ± SD. تم اعتبار قيمة p أقل من 0.05 ذات دلالة إحصائية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تأسيس وتوصيف زراعة الخلايا الكظرية الأولية الغنية بالمناطق
تم تأسيس زراعة خلايا الغدة الكظرية الأولية بنجاح من OF، وتم إثراؤها لخلايا zG، ومن IF تم إثراؤها لخلايا zF. تظهر الصور التمثيلية للخلايا المزروعة في الشكل 2A (OF–zG) والشكل 2B (IF–zF). لتقييم إثراء خلايا zG وخلايا غير zG في هذه المزارع، تم استخدام نموذج الفأر ASCre/+:: ROSAmTmG/+ (الشكل 2C). في هذه ا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذه الدراسة، تم تقديم بروتوكول محسن يولد زراعة خلايا الغدة الكظرية الأولية للفئران مغنية بخلايا zG (OF) وzF (IF)، والتي تعيد بأمانة الهوية الزونية والوظيفة المجنونة لكل منطقة. يجب أن يتيح هذا البروتوكول من تحقيق مفصل في بيولوجيا الخلايا والجزيئيات لقشرة الغدة الكظرية في سياق خاص بالمنطقة، مما يدعم دراسة البروتينات ومسارات الإشارات والآليات المشاركة في تطور قشرة الغدة الكظرية وتمايزها ووظيفتها وتجديدها، مع تقليل التداخل من أقسام الأنسجة الأخرى، خاصة في الجزء الخارجي. تم اشتقاق زراعات خ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون أنه لا توجد مصالح مالية متنافسة تتعلق بهذه الدراسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد تم دعم هذا العمل من قبل FAPESP (مؤسسة أبحاث ساو باولو، البرازيل)، رقم المشروع 2024/14165–6 (BEPE – JLK)، FAPESP: 2020/02988–7 (C.F.P.L)، ودعم من 2R01DK123694 (إلى DTB) وتمويل من قسم الغدد الصماء في مستشفى بوسطن للأطفال (DTB).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
Conical Tube (50 mL )Corning (Corning, NY, USA)352070Sterile
0.22 µm Syringe FilterMilliporeSigma (Burlington, MA, USA)SLGV033RSDigestion solution filtration
10 mL Disposable SyringeBD Plastipak (Franklin Lakes, NJ, USA)300912Sterile
5 mL Serological PipetteCorning (Corning, NY, USA)4487Sterile
10 mL Serological PipetteCorning (Corning, NY, USA)4488Sterile
Filtered Pipette Tips (P200)Axygen (Union City, CA, USA)TF-200-R-SSterile
Filtered Pipette Tips (P1000)Axygen (Union City, CA, USA)TF-1000-R-SSterile
P60 Culture DishCorning (Corning, NY, USA)430166Tissue culture treated
48-well PlateCorning (Corning, NY, USA)3527Tissue culture treated
Sterile Filter PaperN/AN/AFat removal and dissection support
DMEM/F-12 MediumGibco, Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)113200331:1 formulation
Fetal Bovine Serum (FBS)Gibco, Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)10082147Heat-inactivated
ITS SupplementGibco, Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)41400045100X
GlutaMAX SupplementGibco, Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)35050061100X
Penicillin-Streptomycin (100X)Gibco, Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)15140122Antibiotic
PBS 1XGibco, Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)10010023pH 7.4
Collagenase Type IGibco, Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)17100-017Tissue digestion
DNase ISigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)DN25-1Tissue digestion
Angiotensin II (Ang II)Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)A9525Hormone stimulation
Adrenocorticotropic Hormone (ACTH)Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)A0298Hormone stimulation
ForskolinSigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)F6886cAMP stimulation
Potassium Chloride (KCl)Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)P9541Aldosterone stimulation
Sodium Chloride (NaCl)Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)S7653Vehicle control
Small Surgical ScissorsFine Science Tools (Foster City, CA, USA)14060-09Dissection
Scalpel with Disposable BladeFine Science Tools (Foster City, CA, USA)10003-12Microdissection
Fine ForcepsFine Science Tools (Foster City, CA, USA)11252-00Dissection
Curved ForcepsFine Science Tools (Foster City, CA, USA)11251-10Dissection
Laminar Flow HoodThermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)N/ASterile tissue processing
IncubatorThermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)N/ACell culture
CentrifugeEppendorf (Hamburg, Germany)N/ACell pelleting
Neubauer Counting ChamberHausser Scientific (Horsham, PA, USA)1490Cell counting
RIPA Lysis and Extraction BufferThermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)89901Protein extraction
Halt Protease Inhibitor CocktailThermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)87786Protein extraction
Fisherbrand Model 120 Sonic DismembratorThermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)FB120Sonication
RIA SystemTecan (Männedorf, Switzerland)MG13051Hormone quantification
Cobra II Auto-Gamma CounterBerthold Technologies (Bad Wildbad, Germany)N/ARadioactivity measurement
Corticosterone ELISA Kit (96-well)Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)55-CORMS-E01Hormone measurement
ProLong Gold Antifade MountantThermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)P36930Mounting medium
Mouse anti-Dab2BD Biosciences (San Jose, CA, USA)610464Primary antibody
Chicken anti-GFPAves Labs (Tigard, OR, USA)GFP-1020Primary antibody
Rabbit anti-RFPRockland Immunochemicals (Limerick, PA, USA)600-401-379Primary antibody
Alexa Fluor 594 Goat anti-MouseInvitrogen (Carlsbad, CA, USA)A-11005Secondary antibody
Alexa Fluor 594 Goat anti-ChickenInvitrogen (Carlsbad, CA, USA)A-11042Secondary antibody
Alexa Fluor 647 Goat anti-RabbitInvitrogen (Carlsbad, CA, USA)A-21244Secondary antibody
Alexa Fluor 488 Goat anti-MouseThermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)A-11001Secondary antibody
EVOS Microscope SystemThermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)N/AImaging
TRI ReagentSigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)T9424RNA extraction
Direct-zol RNA KitZymo Research (Irvine, CA, USA)R2050RNA purification
NanoDrop ND-1000Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)ND-1000RNA quantification
TaqMan Universal PCR Master MixApplied Biosystems (Foster City, CA, USA)4304437qPCR
QuantStudio 6 Flex ThermocyclerLife Technologies (Carlsbad, CA, USA)N/AqPCR

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zelander, T. The ultrastructure of the adrenal cortex of the mouse. Z. Zellforsch. Mikrosk. Anat. 46 (6), 710-716 (1957).
  2. Nishimoto, K., et al. Adrenocortical zonation in humans under normal and pathological conditions. J. Clin. Endocrinol. Metab. 95 (5), 2296-2305 (2010).
  3. Freedman, B. D., et al. Adrenocortical zonation results from lineage conversion of differentiated zona glomerulosa cells. Dev. Cell. 26 (6), 666-673 (2013).
  4. Leng, S., Carlone, D. L., Guagliardo, N. A., Barrett, P. Q., Breault, D. T. Rosette morphology in zona glomerulosa formation and function. Mol. Cell. Endocrinol. 530, 111287(2021).
  5. Gwynne, J. T., Strauss, J. F. The role of lipoproteins in steroidogenesis and cholesterol metabolism in steroidogenic glands. Endocr. Rev. 3 (3), 299-329 (1982).
  6. Zhu, Y., Zhang, X., Hu, C. Structure of rosettes in the zona glomerulosa of human adrenal cortex. J. Anat. 243 (4), 684-689 (2023).
  7. Leng, S., et al. β-Catenin and FGFR2 regulate postnatal rosette-based adrenocortical morphogenesis. Nat. Commun. 11 (1), 1680(2020).
  8. Rainey, W. E. Adrenal zonation: clues from 11β-hydroxylase and aldosterone synthase. Mol. Cell. Endocrinol. 151 (1-2), 151-160 (1999).
  9. Rebuffé-Scrive, M., Krotkiewski, M., Elfversson, J., Björntorp, P. Muscle and adipose tissue morphology and metabolism in Cushing’s syndrome. J. Clin. Endocrinol. Metab. 67 (6), 1122-1128 (1988).
  10. Luo, X., Ikeda, Y., Parker, K. L. A cell-specific nuclear receptor is essential for adrenal and gonadal development and sexual differentiation. Cel. l. 77 (4), 481-490 (1994).
  11. Huang, C. C. J., Miyagawa, S., Matsumaru, D., Parker, K. L., Yao, H. H. C. Progenitor cell expansion and organ size of mouse adrenal is regulated by Sonic Hedgehog. Endocrinology. 151 (3), 1119-1128 (2010).
  12. King, P., Paul, A., Laufer, E. Shh signaling regulates adrenocortical development and identifies progenitors of steroidogenic lineages. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A, 106 (50), 21185-21190 (2009).
  13. Ching, S., Vilain, E. Targeted disruption of Sonic Hedgehog in the mouse adrenal leads to adrenocortical hypoplasia. Genesis. 47 (9), 628-637 (2009).
  14. Kim, A. C., et al. Targeted disruption of β-catenin in Sf1-expressing cells impairs development and maintenance of the adrenal cortex. Development. 135 (15), 2593-2602 (2008).
  15. Berthon, A., et al. Constitutive β-catenin activation induces adrenal hyperplasia and promotes adrenal cancer development. Hum. Mol. Genet. 19 (8), 1561-1576 (2010).
  16. Basham, K. J., et al. A ZNRF3-dependent Wnt/β-catenin signaling gradient is required for adrenal homeostasis. Genes Dev. 33 (3-4), 209-220 (2019).
  17. Finco, I., Lerario, A. M., Hammer, G. D. Sonic Hedgehog and WNT signaling promote adrenal gland regeneration in male mice. Endocrinology. 159 (2), 579-596 (2018).
  18. Heikkilä, M., et al. Wnt-4 deficiency alters mouse adrenal cortex function, reducing aldosterone production. Endocrinology. 143 (11), 4358-4365 (2002).
  19. Drelon, C., et al. PKA inhibits WNT signalling in adrenal cortex zonation and prevents malignant tumour development. Nat. Commun. 7 (1), 12751(2016).
  20. Heaton, J. H., et al. Progression to adrenocortical tumorigenesis in mice and humans through insulin-like growth factor 2 and β-catenin. Am. J. Pathol. 181 (3), 1017-1033 (2012).
  21. Borges, K. S., et al. Wnt/β-catenin activation cooperates with loss of p53 to cause adrenocortical carcinoma in mice. Oncogene. 39 (30), 5282-5291 (2020).
  22. Borges, K. S., et al. Non-canonical Wnt signaling triggered by WNT2B drives adrenal aldosterone production. bioRxiv. , (2024).
  23. Sasano, H. Cell proliferation and apoptosis in normal and pathologic human adrenal. Mod. Pathol. 8 (1), 11-17 (1995).
  24. Chang, S. P., Morrison, H. D., Nilsson, F., Kenyon, C. J., West, J. D., et al. Cell proliferation, movement, and differentiation during maintenance of the adult mouse adrenal cortex. PLoS One. 8 (12), e81865(2013).
  25. Mitani, F. Functional zonation of the rat adrenal cortex: the development and maintenance. Proc. Jpn. Acad. Ser. B, 90 (5), 163-183 (2014).
  26. Dinh, H. A., Volkert, M., Secener, A. K., Scholl, U. I., Stölting, G. T- and L-type calcium channels maintain calcium oscillations in the murine zona glomerulosa. Hypertension. 81 (4), 811-822 (2024).
  27. Penton, D., et al. Task3 potassium channel gene invalidation causes low renin and salt-sensitive arterial hypertension. Endocrinology. 153 (10), 4740-4748 (2012).
  28. Mattos, G. E., Lotfi, C. F. P. Differences between the growth regulatory pathways in primary rat adrenal cells and mouse tumor cell line. Mol. Cell. Endocrinol. 245 (1-2), 31-42 (2005).
  29. Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
  30. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCT method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  31. Berber, M., et al. Rho/ROCK signaling and α-catenin mediate β-catenin-driven hyperplasia in the adrenal cortex via adherens junctions. J. Clin. Invest. , (2026).
  32. Smith, T. T. G., et al. Forced treadmill running reduces systemic inflammation yet worsens upper limb discomfort in a rat model of work-related musculoskeletal disorders. BMC Musculoskelet. Disord. 21 (1), 57(2020).
  33. Kremer, J. L., et al. Extracellular matrix protein signatures of the outer and inner zones of the rat adrenal cortex. J. Proteome Res. 23 (8), 3418-3432 (2024).
  34. Pignatti, E., Leng, S., Carlone, D. L., Breault, D. T. Regulation of zonation and homeostasis in the adrenal cortex. Mol. Cell. Endocrinol. 441, 146-155 (2017).
  35. Pignatti, E., et al. Beta-catenin causes adrenal hyperplasia by blocking zonal transdifferentiation. Cell Rep. 31 (3), 107524(2020).
  36. Romero, D. G., et al. Disabled-2 is expressed in the adrenal zona glomerulosa and is involved in aldosterone secretion. Endocrinology. 148 (6), 2644-2652 (2007).
  37. Sahut-Barnola, I., Lefrancois-Martinez, A. M., Jean, C., Veyssiere, G., Martinez, A. Adrenal tumorigenesis targeted by the corticotropin-regulated promoter of the aldo-keto reductase AKR1B7 gene in transgenic mice. Endocr. Res. 26 (4), 885-898 (2000).
  38. Vidal, V., et al. The adrenal capsule is a signaling center controlling cell renewal and zonation through Rspo3. Genes Dev. 30 (12), 1389-1394 (2016).
  39. Dörner, J., et al. GLI1+ progenitor cells in the adrenal capsule of the adult mouse give rise to heterotopic gonadal-like tissue. Mol. Cell. Endocrinol. 441, 164-175 (2017).
  40. Guo, Y., et al. 3D culture system for human adrenal glands that uses a sequential processing medium to facilitate cortical-medullary cell development. Clin. Lab. 70 (12), (2024).
  41. Friedrich, L., Schuster, M., Rubin de Celis, M. F., Berger, I., Bornstein, S. R., et al. Isolation and in vitro cultivation of adrenal cells from mice. STAR Protoc. 2 (4), 100999(2021).
  42. Mattos, G. E., Jacysyn, J. F., Amarante-Mendes, G. P., Lotfi, C. F. P. Comparative effect of FGF2, synthetic peptides 1–28 N-POMC and ACTH on proliferation in rat adrenal cell primary cultures. Cell Tissue Res. 345 (3), 343-356 (2011).
  43. Gazdar, A. F., et al. Establishment and characterization of a human adrenocortical carcinoma cell line that expresses multiple pathways of steroid biosynthesis. Cancer Res. 50 (17), 5488-5496 (1990).
  44. Wang, T., Rainey, W. E. Human adrenocortical carcinoma cell lines. Mol. Cell. Endocrinol. 351 (1), 58-65 (2012).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Wnt Beta Catenin

مقالات ذات صلة