يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

نظام زراعة جديد ثنائي وثلاثي الأبعاد خال من المصل يتكون من جزيئين صغيرين لزراعة خلايا ظهارية غدد الفئران البلعية

257 مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/70438

⸱

فبراير 10, 2026

 ,  , 
1Department of Ophthalmology Optometry Center, China-Japan Union Hospital of Jilin University, 2Eye Institute & Affiliated Xiamen Eye Center, School of Medicine, Xiamen University, 3Huaxia Eye Hospital of Quanzhou, 4Shen Zhen Research Institute of Xiamen University

في هذه المقالة

ملخص

تم تقديم نظام زراعة جديد خال من المصل باستخدام مزيج الجزيئات الصغيرة 2C (Y27632 و SB431542) لتوسيع خلايا الغدة الدمعية الظهارية (LGECs) بكفاءة في كل من الثقافات ثنائية وثلاثية الأبعاد، مما يتيح التحكم الدقيق في تكاثرها وتمايزه.

الملخص

يعد خلل الغدة الدموية (LG) سببا رئيسيا لمرض جفاف العين الناتج عن نقص الماء، وتظهر العلاجات القائمة على الخلايا وهندسة الأنسجة إمكانات كبيرة لهذه الحالة. ومع ذلك، فإن توفر عدد كاف من الخلايا البذرية المزروعة في ظروف خالية من المصل أعاق تطبيقها على نطاق واسع. في هذه الدراسة، طورنا نظام زراعة جديد خال من المصل باستخدام جزيئين صغيرين، Y27632 و SB431542 (2C)، لتوسيع خلايا LG الظهارية (LGECs) بكفاءة. بالنسبة للزراعة الأولية ثنائية الأبعاد للرذاذ المنخفض المحيط، تم عزل LGs من فئران عمرها 6-8 أسابيع وهضمها إنزيميا باستخدام Dispase II وCollagenase A. تم زرع تعليق الخلية الناتج في أطباق الزراعة بكثافة 7,500 خلية/سممربع وزراعة بحرارة 2C لمدة 12-14 يوما. عندما وصل التقاء الخلايا إلى 80-90٪، بدأ الزراعة الفرعية بنسبة 1:2. في الزراعة ثلاثية الأبعاد، تم إعادة تعليق 10,000 مادة P1 LGEC في 10 ميكرولتر من 2C و10 ميكرولتر من جل المصفوفة، ثم زرعت في مركز صفيحة مكونة من 24 بئرا. بعد فترة تصلب مدتها 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية، أضيف 600 ميكرولتر من 2 درجة مئوية لمواصلة الزرعة. للتمييز، تم زراعة الكرويدات ثلاثية الأبعاد ب 2C لمدة 7 أيام، تلتها إزالة 2C واستمرار الزراعة لمدة 7 أيام إضافية. أظهرت المركبات المستقيمة التي تمت زراعتها ب 2C زيادة في الانتشار، مع تعبير مرتفع لعلامات الجذع والتكاثر (Ki67، K14، P63، K5، K15 [P = 0.0011، 0.0002، 0.0012، 0.0003، 0.0014 على التوالي])، وحافظت على الشكل والقدرة على التكاثر حتى بعد عشر مرات. علاوة على ذلك، في ظروف ثلاثية الأبعاد، تكونت المركبات المنخفضة الكروية ذات خصائص الجذع/السلف، والتي تمايزت أكثر إلى هياكل غدد دقيقة تحتوي على أنواع متعددة من خلايا LG (AQP5، K19، α-SMA إيجابية) ووظائف إفرازية ناضجة بعد إزالة 2C. من المتوقع أن يوفر هذا النهج مصدرا مستقرا لخلايا البذور في هندسة الأنسجة، ويقدم نموذجا جديدا في المختبر لدراسة فسيولوجيا LG.

المقدمة

الغدة الدمعية (LG) ضرورية لإنتاج الطبقة المائية من طبقة الدموع، وهي ضرورية للحفاظ على توازن سطح العين1. خلل في LG، الناتج عن الإصابة أو الالتهاب، يؤدي إلى مرض جفاف العين الناقص المائي (ADDE). يمكن أن تؤدي هذه الحالة إلى التهاب شديد في سطح العين، وأمراض قرنية مزمنة، وفي الحالات الشديدة، فقدان الرؤية الدائم2. العلاجات الحالية لاضطراب اضطراب الشخصية تدير الأعراض بشكل أساسي، دون معالجة الخلل الأساسي في الغدد، الذي يحد من فعاليتها على المدى الطويل. يطرح تطوير علاجات مستهدفة لخلل LG عدة تحديات، منها نقص نماذج مختبرية بسيطة طويلة الأمد، مما يحد من فهم الفيزيولوجيا المرضية للغسيل ويعيق تطوير علاجات فعالة. بينما أظهرت زراعة الخلايا إمكانات في تعزيز تجديد LG، فإن قدرة الخلايا المحدودة على التمدد في المختبر وتعقيد أنظمة الزراعة الحالية يشكلان عقبات كبيرة أمام التطبيق السريري 1,3. لذلك، فإن إنشاء نظام زراعة بسيط وطويل الأمد لجرث LG البالغة أمر ضروري لتعزيز فهم فسيولوجيا وأمراض LG، بالإضافة إلى توفير مصدر موثوق لخلايا LG الجذعية/السلف لإصلاح وتجديد إصابات LG.

حققت أنظمة الزراعة المختبرية الحالية لمتجر LG تقدما كبيرا، لكنها لا تزال تواجه قيودا ملحوظة. تعتمد العديد من هذه الطرق على وسائط مكملة بالمصل، مما يسبب عدة مشاكل مثل التغير من دفعة إلى أخرى، والمكونات غير المحددة، وخطر تلوث الخلايا الليفية أو الخلايا المتوسطة الحساسية 4,5,6,7,8. علاوة على ذلك، فإن الأنظمة المعتمدة على المصل غير مناسبة لدراسة الآليات الممرضة لأمراض LG وتشكل تحديات لعلاجات زراعة الخلايابسبب مخاطر رفض المناعة المحتملة. استجابة لهذه القيود، تم تطوير عدة طرق خالية من المصل لزراعة خلايا LG الظهارية (LGECs) من الفئران والبشر على حد سواء. على سبيل المثال، استخدم Ueda وآخرون بنجاح طريقة خالية من المصل لزراعة LGECs من فئران حديثة الولادة10. ومع ذلك، كانت هذه الطريقة محدودة بسبب عدم القدرة على تمرير الخلايا عبر الزراعة الفرعية والحاجة إلى عدد كبير من الغدد الوليدية للحصول على كمية كافية من الغدد المنخفضة المحيطة. وبالمثل، طور كوبايشي وآخرون نظام زراعة خال من المصل باستخدام سم الكوليرا، لكنهم واجهوا صعوبات في الحفاظ على شكل الخلية خلال الفقرة11. تشمل التطورات الحديثة تطوير تشانغ وآخرين لنظام زراعة ثلاثي الأبعاد لخلايا LG الجذعية للفئران ونظام زراعة العضوية LG الخاص ببانييه-هيلاويه وآخرين لكل من الفئران والبشر 12,13,14,15. ومع ذلك، تعتمد هذه الأنظمة على تركيبات وسائط معقدة تحتوي على عدة جزيئات صغيرة وعوامل نمو وإضافات، مما يعقد عملية الزراعة ويحد من قابلية التوسع. تسلط هذه التحديات الضوء على الحاجة إلى نظام زراعة مبسط وفعال خال من المصل يمكن أن يسهل التوسع الفعال للمواد الغازية الأرضية المحيطة، مع الحفاظ على خصائصها التكاثرية وخصائص الجذع/السلف لتطبيقات علاجية وأبحاث إضافية.

في السنوات الأخيرة، أدى التطور السريع لإعادة البرمجة الكيميائية بجزيئات صغيرة إلى إدخال استراتيجيات جديدة للحفاظ على الخلايا البالغة الأولية وتوسيعها في المختبر16. من خلال تنظيم مسارات الإشارات داخل الخلية، والتفاعلات بين الخلايا والمصفوفة، والتصاق الخلية، تعزز الجزيئات الصغيرة بشكل كبير تكاثر الخلايا والمرونة، مما يحسن كفاءة تمدد الخلايا والتحكم في المصير17. نظرا لإنتاجها القابل للتحكم به، وانخفاض القدرة المناعية، والتكامل غير الجيني، فإن الجزيئات الصغيرة مثالية لبناء أنظمة مختبرية لتوسيع الخلايا الظهارية البالغة16. لقد ثبت أن تركيبات من جزيئات صغيرة مختلفة تحافظ بفعالية على التوسع الصناعي لأنواع مختلفة من الخلايا الأولية، بما في ذلك الخلايا الجذعية الظهارية الجلدية والقرنية والملتحمة 18,19,20. لذلك، فإن تطوير استراتيجية جزيئية صغيرة لتوسيع LGECs يظهر إمكانيات لتطبيقات مستقبلية في كل من البحث والعلاج.

تم تطوير نظام زراعة بسيط وفعال خال من المصل في هذا البروتوكول باستخدام جزيئين صغيرين، Y27632 و SB431542 (2C)، لدعم توسع LGECs. من خلال دمج مزايا هذين الجزيئيين، تم إنشاء نظام خال من المصل لكل من الثقافات ثنائية الأبعاد وثلاثية الأبعاد. أظهرت الخلايا البارزة المحيطة بالرطوبة التي زرعت ب 2C قدرة تكاثرية عالية وخصائص خلايا جذعية/سلفية، محافظة على شكل الخلايا الظهارية النموذجي بعد ما لا يقل عن 10 مرات في المختبر. في الزراعة ثلاثية الأبعاد، لم تحتفظ الخلايا الجذعية فقط بخصائص الخلايا الجذعية/السلفية، بل أظهرت أيضا القدرة على التمايز إلى هياكل إفرازية بعد إزالة 2C، مكونة هياكل غددية دقيقة ذات وظيفة إفرازية. هذا النظام الخالي من المصل مناسب للنماذج المخبرية لفسيولوجيا وأمراض LG، كما يوفر مصدرا كبيرا للخلايا لهندسة أنسجة LG والتطبيقات التجديدية. ومع ذلك، فإن البروتوكول الحالي يقدم فقط استكشافا أوليا للثقافة ثلاثية الأبعاد. ثقافة ثلاثية الأبعاد طويلة الأمد تتجاوز نطاق هذا البحث في هذه المرحلة. من المهم ملاحظة أن هذه الطريقة مصممة خصيصا للفئران البالغة من LGEC وقد لا تكون قابلة للتطبيق على أنواع أخرى دون تحسين إضافي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

أجريت جميع التجارب وفقا للوائح جمعية أبحاث الرؤية وطب العيون (ARVO) ولجنة أخلاقيات الحيوانات التجريبية في جامعة جيلين وجامعة شيامن.

ملاحظة: تم إجراء جميع إجراءات زراعة الخلايا في خزانة أمان حيوي معقمة بالأشعة فوق البنفسجية في غرفة عمليات الخلية.

1. الثقافة الأساسية للمناطق المحلية البالغة والخضراء

  1. عزل نسيج LG
    1. قم بتخدير الفئران C57BL/6J (عمرها 6-8 أسابيع) بتخدير الرحم عن طريق خلع عنق الرحم، وتعقيم منطقة الأذن (حول ال LG) بنسبة 75٪ إيثانول لتجنب التلوث.
    2. قم بعمل شق من الكابنثوس الخارجي إلى الجلد تحت الأذن لكشف LG. باستخدام ملقط ومقص ملمس ومعقم، افصل LG بعناية عن الأنسجة المحيطة (الغدد النكفية والأنسجة الضامة) تحت مجهر تشريح للحصول على LG.
    3. ضع LG في وسط جمع أنسجة مبرد مسبقا (DMEM يحتوي على 10٪ بنسلين-ستربتومايسين-أمفوتريسين) في أنبوب طرد مركزي دقيق بسعة 1.5 مل، مع إبقاء الأنسجة على الجليد لتقليل التحلل.
  2. تحضير الأنسجة
    1. انقل ال LG إلى وسط جديد لجمع الأنسجة الباردة في طبق بحجم 3.5 سم.
    2. قم بإزالة أي فراء فأر متبق، ثم قم بتقشير كبسولة النسيج الضام المحيطة ب LGs. عزل النسيج الغددي باستخدام ملقط أملس لإزالة النسيج الضام بين الفصوص الصغيرة.
      ملاحظة: تأكد من إزالة الكبسولة على سطح LG والنسيج الضام بين الفصوص بالكامل لكشف القنوات بين الفصوص الفوضية، مما يسهل اختراق محلول الهضم أثناء عملية الهضم اللاحقة.
    3. انقل النسيج إلى وسط جمع جديد واغسل لمدة 5-10 دقائق لمنع التلوث.
  3. الهضم الإنزيمي
    1. ضع LGs في أنبوب طرد مركزي دقيق بسعة 1.5 مل يحتوي على محلول هضم (وسط خال من المصل مدعوم ب 2 ملغ/مل Dispase II و2 mg/mL كولاجناز A). (الجدول التكميلي 1).
      ملاحظة: يحتاج 4 حبات LG إلى 1 مل من محلول الهضم.
    2. قم بتشريح نسيج LG بدقة باستخدام المقص المجهري إلى قطع صغيرة (حوالي 0.5-1 مم³) داخل الأنبوب.
    3. حضن أنبوب الطرد المركزي الدقيق عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 2.5-3 ساعات. كل 30-60 دقيقة، اخلط الأنسجة بلطف في محلول الهضم لضمان هضم إنزيمي شامل.
  4. عزل وحصاد ال LGECs
    1. اهز أنبوب الطرد المركزي الدقيق عدة مرات بعد انتهاء فترة الهضم. قم بعمل محلول الهضم عدة مرات لتقسيم النسيج إلى خلايا واحدة أو كتل خلوية صغيرة. راقب تحت المجهر لتأكيد تقدم الهضم.
      ملاحظة: عندما لا تبقى جسيمات مرئية في محلول الهضم وتلاحظ أعدادا كبيرة من الخلايا المفردة، بالإضافة إلى تجمعات الخلايا الشبيهة بالقنوات تحت المجهر، توقف عملية الهضم.
    2. قم بطرد مركزي للأنبوب بقوة 300 × g لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة، ثم تخلص من وسط الهضم.
    3. أعد تعليق حبيبات الخلية في 1 مل من DPBS المعقمة وقم بجهاز الطرد المركزي مرة أخرى عند 1000 x جرام لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة لإزالة أي إنزيمات هضمية متبقية.
    4. كرر الخطوة 1.4.3، أزل السوبرناتان، وأعد تعليق الحبيبات الخلوية في 500 ميكرولتر من وسط خال من المصل.
  5. بذور الغازات المنخفضة والزراعة الأولية
    1. جهز وسط الزراعة في LGEC عن طريق إضافة وسط خال من المصل بنسبة 1٪ بنسلين-ستربتوميسين و2C (10 ميكرومولار Y27632 و10 ميكرومولار SB431542). (الجدول التكميلي 1)
    2. تم زرع الخلايا في ألواح زراعة قياسية غير معالجة بسعة 24 بئر بكثافة 7.5 × 10³ خلايا/سم² باستخدام وسط 2C خال من المصل.
    3. بعد البذر، اضغط بلطف على حواف طبق الزراعة لضمان توزيع الخلايا بشكل متساو. ضع اللوح في حاضنة بدرجة حرارة 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2.
    4. غير وسيط الزراعة لأول مرة بعد 72 ساعة من الزرعة. بعد ذلك، غير الوسيط كل يومين إلى ثلاثة.
      ملاحظة: تجنب إزعاج الثقافة خلال أول 72 ساعة. في التغيير الوسطي الأول، لا تغسل الخلايا ب DPBS. فقط أزل الوسيط القديم وأضف الوسيط الطازج.

2. الزراعة الفرعية للمناطق المنخفضة المحيطة

ملاحظة: الزراعة الفرعية عندما يصل التقاء الخلايا إلى 80-90٪، والذي يحدث عادة بعد حوالي 14 يوما من الزراعة الأولية.

  1. أزل وسط الزراعة وغسل الخلايا بلطف مرتين باستخدام DPBS معقم.
  2. أضف 250 ميكرولتر من 0.25٪ تريبسين-إيدتا وحضن على حرارة 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربونلمدة 10-15 دقيقة. بمجرد أن تنفصل الوصلات الضيقة وتتجمع الخلايا للأعلى، أضف كمية متساوية من محلول مثبط التريبسين المحدد لإنهاء الهضم.
    ملاحظة: إذا لوحظت خلايا مسطحة وكبيرة ملتصقة أثناء الزراعة الأولية، عالج الزراعة ب 0.25٪ من تريبسين-إيدتا لمدة 5 دقائق لإزالة هذه الخلايا غير المتجانسة. ثم عالج الزراعة مرة أخرى ب 0.25٪ من تريبسين-إيدتا لمدة 5 دقائق إضافية لهضم أكثر والحصول على عدد أنقى من التريبسين-إيدتا للمرور اللاحق.
  3. اخلط تعليق الخلية عن طريق التوصيل بأنبوب ماصة بسعة 1 مل، ثم انقله إلى أنبوب طرد مركزي وطرد مركزي بسعة 1.5 مل على 1000 × جرام لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة. تخلص من السوبرناتانت.
  4. اغسل الخلايا بأجهزة DPBS معقمة وجهاز طرد مركزي مرة أخرى لجمع ال LGECs.
  5. أعد تعليق ال LGECs في وسط زراعة 2 درجة مئوية والبذور بنسبة 1:2 للزراعة الفرعية. اخلط الخلايا بلطف عن طريق هز لوحة الزراعة وحضن الخلايا عند حرارة 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2.
    ملاحظة: الزراعة الفرعية بنسبة 1:2 تعني أنه بمجرد وصول التقاء الخلايا إلى 80-90٪، يتم هضم ال LGECs من لوح بئر واحد وتوزيعها بالتساوي في لوحين جديدين للبئر.
  6. غير الوسط في اليوم الثالث بعد البذر، ثم غير الوسط كل يومين إلى ثلاثة أيام، حسب حالة الخلية.
  7. راقب شكل الخلايا يوميا تحت مجهر تباين الطور المقلوب ووثق بالصور الفوتوغرافية.

3. الثقافة ثلاثية الأبعاد (ثلاثية الأبعاد) للمناطق المنخفضة

ملاحظة: تجربة الزراعة ثلاثية الأبعاد تستخدم ال LGECs من P1. عندما تصل الترسام المنخفض P1 إلى 80-90٪ بعد 7 أيام من الزراعة مع 2C، تستخدم للزراعة ثلاثية الأبعاد.

  1. خطوات التحضير
    1. نقل جل المصفوفة (الجدول التكميلي 1) من الفريزر بدرجة -20 °C إلى ثلاجة بحرارة 4 °C لإذابة النوم طوال الليل.
    2. ضع رؤوس الماصات المطلوبة في الفريزر بدرجة حرارة -20 درجة مئوية لضمان التبريد المسبق المناسب.
    3. قم بتسخين لوحة الزراعة المكونة من 24 بئر مسبقا بوضعها في حاضنة 37 درجة مئوية و5٪ ثاني أكسيد الكربون 2 لمدة ساعتين قبل بدء الزراعة ثلاثية الأبعاد.
    4. جهز صندوق ثلج وضع عدة أنابيب طرد مركزي دقيق بسعة 1.5 مل فيه للتبريد المسبق. قم بتعقيم صندوق الثلاجات في خزانة السلامة البيولوجية قبل الاستخدام.
  2. ثقافة ثلاثية الأبعاد للمناطق المنخفضة الخضراء
    1. احصل على وحدات LGEC من P1، كما هو موضح في الخطوات 2.1 إلى 2.4.
    2. أعد تعليق حبيبات الخلية في وسط زراعة 2C، واضبط كثافة الخلايا إلى 1 × 10⁴ خلايا لكل 10 ميكرولتر.
    3. خذ جل المصفوفة المذابة من ثلاجة 4 °م وأطراف الماصة المبردة مسبقا من الفريزر -20 °م، وضعها في صندوق الثلاجات داخل خزانة السلامة البيولوجية.
    4. قم بإزالة لوحة الزراعة المسخنة مسبقا ذات 24 بئر من الحاضنة وضعها في خزانة السلامة البيولوجية.
    5. أضف حجما مناسبا من تعليق الخلية، ممزوجا مع جل المصفوفة بنسبة 1:1، باستخدام رؤوس الماصة المبردة مسبقا. اخلط بلطف لضمان توزيع متجانس.
    6. بيبت 20 ميكرولتر من الخليط من الخطوة 3.2.5 بحذر في مركز كل بئر من لوح 24 بئر المسخن مسبقا.
    7. اقلب اللوحة وحضنها في حاضنة بدرجة حرارة 37 درجة مئوية وتحتوي على 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 30 دقيقة للسماح للجل المصفوفة بالتصلب.
    8. بمجرد أن يتصلب جل المصفوفة من الجيلام، أضف 600 ميكرولتر من وسط الزراعة 2C إلى كل بئر.
    9. حضن لوحة الزراعة في حاضنة بدرجة حرارة 37 درجة مئوية وتحتوي على 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 14 يوما. غير الوسط في اليوم الثالث بعد الزرع وكل يومين إلى ثلاثة أيام بعد ذلك، حسب حالة الخلية.
    10. راقب تكوين الكرويدات ثلاثية الأبعاد يوميا تحت مجهر تباين الطور المقلوب والتقط صورا للتوثيق.
  3. تمييز الكرويدات ثلاثية الأبعاد LGEC
    1. زراعة كرويدات LGEC ثلاثية الأبعاد كما هو موضح في الخطوة 3.2.
    2. بعد 7 أيام من الزراعة، أزل وسط الزراعة 2C واغسل الخلايا بلطف مرتين باستخدام DPBS لإزالة بقايا 2C. انتبه لعدم إزعاج جل المصفوفة.
    3. أضف وسط خال من المصل بدون 2C (Null) واستمر في الزراعة لمدة 7 أيام إضافية لتحفيز التمايز.
    4. غير الوسيط كل يومين إلى ثلاثة أيام خلال فترة الزرعة.
    5. راقب التغيرات الشكلية للكرويدات ثلاثية الأبعاد المستحثة يوميا تحت مجهر تباين الطور المقلوب والتقاط الصور للتوثيق.

4. تضمين وتقسيم الأجزاء المجمدة للكرويدات ثلاثية الأبعاد LGEC المتمايزة

ملاحظة: يتم تحفيز تمايز الكرويدات ثلاثية الأبعاد كما هو موضح في القسم 3.3. بعد 7 أيام من التمايز، اتبع الخطوات أدناه لتضمين درجة حرارة القطع المثلى (OCT) وتجميد الكرويدات ثلاثية الأبعاد المتمايزة.

  1. استنشق وسط الزراعة على حواف البئر. اغسل الكرويدات المتمايزة بلطف ثلاث مرات باستخدام DPBS معقم.
  2. أضف 1 مل من 4٪ بارافورمالديهايد (PFA) إلى البئر في خزانة أمان حيوي أو غطاء أبخرة وثبت الكرويدات في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.
  3. اغسل الكرويدات بلطف ثلاث مرات باستخدام DPBS معقم، كل غسول يستغرق 10 دقائق لإزالة المثبت.
  4. استخدم ملعقة لكشط الهيكل الهلامي ثلاثي الأبعاد على شكل قبة كروية ثلاثية الأبعاد ونقله إلى أنبوب طرد مركزي دقيق بسعة 5 مل يحتوي على محلول السكروز 20٪.
  5. حضن الأنبوب طوال الليل عند درجة حرارة 4 درجات مئوية حتى تستقر بنية القبة في أسفل الأنبوب.
  6. أزل هيكل القبة من محلول السكروز، وأزل بحذر أي بقايا من السكروز، وادمجها في مركب OCT. جمد في النيتروجين السائل وخزن عند -80 درجة مئوية.
  7. قبل التلوين، جهز مقاطع بسماكة 10 ميكرومتر باستخدام ميكروتوم تجميد.

5. كشف وظيفة الإفرازات للكرويدات ثلاثية الأبعاد LGEC المتمايزة

  1. جمع عينات
    1. تحفيز تمايز الكرويدات ثلاثية الأبعاد كما هو موضح في القسم 3.3.
    2. بعد 7 أيام من التمايز، أزل وسط الزراعة وغسل الكرويدات ثلاثية الأبعاد ثلاث مرات باستخدام DPBS.
    3. أضف 500 ميكرولتر من وسط خال من المصل بدون 2 درجة مئوية وحضن عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربونلمدة ساعتين.
    4. اجمع وسط الزراعة وانقله إلى أنبوب طرد مركزي دقيق بسعة 1.5 مل كعينة أساسية لقياس تركيز اللاكتوفرين (LTF) قبل تحفيز البيلوكاربين.
    5. اغسل الكرويدات ثلاثية الأبعاد بلطف ثلاث مرات باستخدام DPBS معقم.
    6. أضف 500 ميكرولتر من وسط خال من المصل يحتوي على 1 ميكروغرام/مل بيلوكاربين وحضن الكرويدات ثلاثية الأبعاد عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربونلمدة 24 ساعة.
    7. بعد الحضانة، اجمع وسط الزراعة في أنبوب طرد مركزي دقيق بسعة 1.5 مل (لقياس تركيز LTF بعد تحفيز البيلوكاربين).
    8. قام بأخذ عينات وسط الزراعة بالطرد المركزي عند 4 درجات مئوية عند 1000 × جرام لمدة 20 دقيقة. اجمع المادة الفائقة وخزنها عند -80 درجة مئوية لاستخدامها لاحقا.
  2. تخفيف العينة
    1. استرجع العينات من الفريزر بدرجة حرارة -80 درجة مئوية ودعها تذوب تماما عند درجة حرارة الغرفة.
    2. خذ 5 ميكرولتر من العينة وقم بتخفيفها ب 495 ميكرولتر من محلول تخفيف العينة من مجموعة اختبار التوربنت المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) لتحضير تخفيف بمقدار 100 مرة.
  3. تحضير المواد الكيميائية
    1. أحضر جميع كواشف مجموعة ELISA إلى درجة حرارة الغرفة قبل 20 دقيقة من الاستخدام.
    2. تحضير مخزن الغسيل: احسب الكمية المطلوبة بناء على عدد العينات، وتخفيف مخزن الغسيل المركز بالماء المقطر (1:24).
    3. تحضير الحل التشغيلي القياسي:
      1. الطرد المركزي القياسي المجهول بالليوفيل عند 10,000 × جرام لمدة دقيقة واحدة. أضف 1 مل من مادة Reference Standard ومخفف العينة، واتركها واقفة لمدة 10 دقائق، ثم اقلبها بلطف عدة مرات.
      2. بعد أن يذوب تماما، اخلط جيدا مع ماصية. تنتج هذه الإعادة التكوين حلا عمليا بمقدار 2000 بيغا/مل.
    4. قم بتخفيفات تسلسلية وفقا لتعليمات المجموعة لتحضير تدرج التركيز القياسي التالي: 2000، 1000، 500، 250، 125، 62.5، 31.25، 0 بيغل/مل.
    5. جهز محلول الأجسام المضادة للكشف البيوتينيلاتي الفعال:
      1. احسب الحجم المطلوب للاختبار (50 ميكرولتر/بئر). قم بطرد الأجسام المضادة المركزة للكشف البيوتينيلية عند 800 × جرام لمدة دقيقة واحدة، ثم تخفيف الجسم المضاد المركز للكشف البيوتينيلاتي بمقدار 50× إلى محلول فعال بنسبة 1× باستخدام مخفف الأجسام المضادة للكشف البيوتينيل.
      2. جهز المحلول قبل الاستخدام مباشرة، لإنتاج كمية أكبر قليلا من الكمية المحسوبة، وعادة ما تضيف 100-200 ميكرولتر أكثر من الحاجة.
    6. تحضير محلول بيروكسيداز الفجل الحار (HRP) المتصل العامل العام:
      1. احسب الحجم المطلوب للتجربة (50 ميكرولتر/بئر). قم بعمل طرد مركزي للموزع المركزي عند 800 × جرام لمدة دقيقة واحدة، ثم تخفيفه إلى تركيز عمل 1x باستخدام مخفف الارتباط المرتبط من HRP.
      2. جهز المحلول قبل الاستخدام مباشرة، لإنتاج كمية أكبر قليلا من الكمية المحسوبة، وعادة ما تضيف 100-200 ميكرولتر أكثر من الحاجة.
  4. إجراء اختبار ELISA
    1. حدد الآبار للمعيار المخفف، والفراغ، والعينات، مع 3 نسخ لكل منها. أضف 25 ميكرولتر من محلول العمل القياسي، أو محلول عينة فارغ، أو محلول مخفف إلى الآبار المقابلة. غط اللوحة بمادة الختم المرفقة في المجموعة وحضن على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة.
      ملاحظة: يجب إضافة المحاليل إلى أسفل بئر لوحة ELISA الصغيرة. تجنب لمس الجدار الداخلي والتسبب في رغوة قدر الإمكان.
    2. قم بتفريغ السائل من الآبار دون غسيل. أضف فورا 50 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة للكشف البيوتينيلي العامل في كل بئر. غط الطبق بمادة ختم جديدة واحتضن عند 37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة.
    3. قم بتفريغ السائل من الآبار وإضافة 350 ميكرولتر من محلول الغسيل المحضر إلى كل بئر. انقع لمدة دقيقة واحدة، ثم استنشق أو أخرج السائل من كل بئر وجففه بورق ماص نظيف. كرر هذه الخطوة 3 مرات.
      ملاحظة: لا تدع الآبار تجف أثناء عملية الغسيل.
    4. أضف 50 ميكرولتر من محلول العمل المرافق المحضر لمعدل ضربات القلب إلى كل بئر. غط الطبق بمادة ختم جديدة واحتضن على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
    5. قم بتفريغ السائل من الآبار وكرر عملية الغسل خمس مرات باستخدام مخزن الغسيل كما هو موضح في الخطوة 5.4.3.
    6. أضف 50 ميكرولتر من مادة الركيزة إلى كل بئر. غط الطبق بمادة سدادة جديدة واحتضن الطبق عند 37 درجة مئوية في الظلام لمدة 15 دقيقة.
    7. أضف 25 ميكرولتر من محلول التوقف إلى كل بئر لإنهاء التفاعل. تأكد من إضافة محلول التوقف بنفس ترتيب محلول الركيزة.
    8. تحديد الكثافة البصرية (قيمة OD) لكل بئر فورا عند 450 نانومتر باستخدام قارئ الميكرولوتين.

6. عزل الحمض النووي الريبي

  1. جمع عينات
    1. بالنسبة لأنسجة LG
      1. عزل نسيج LG خارج الحجاج من الفئران البالغة كما هو موضح في القسم 1.1.2-1.1.2.
      2. اغمر نسيج LG المعزول حديثا في PBS لغسل أي دم.
      3. قم بمسح رطوبة سطح LG بورق الترشيح وضع النسيج في أنبوب طرد مركزي دقيق بسعة 1.5 مل يحتوي على 1 مل من كاشف استخراج RNA (الجدول التكميلي 1)، مع الحفاظ على الأنبوب على الثلج.
        ملاحظة: قم بخطوات الطحن قبل استخراج الحمض النووي الريبي لضمان تحلل كامل للنسيج.
      4. أضف خرزتين نظيفتين لطحن الفولاذ إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق، ثم ضع الأنبوب في مطحنة منخفضة الحرارة عالية السرعة مبردة مسبقا.
      5. اضبط معايير الطاحنة: التردد 70 هرتز، وقت الطحن 45 ثانية، وقت الإيقاف 15 ثانية، وكرر العملية لمدة 10 دورات. شد مقبض غطاء المطحنة وابدأ في الطحن.
      6. ضع الأنبوب على الثلج أو خزنه عند -80 درجة مئوية لاستخراج الحمض النووي الريبي بعد الانتهاء من عملية الطحن.
    2. بالنسبة للمناطق المحلية المحيطة
      1. قم بإزالة وسط الزراعة وغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام DPBS معقم عندما تصل القارئات إلى 80-90٪.
      2. أضف 600 ميكرولتر من مادة استخراج الحمض النووي الريبي إلى كل بئر (لصفيحة تضم 24 بئرا) وحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 5-10 دقائق.
      3. استخدم ماصة بحجم 1 مل لإعادة تركيب محلول كاشف استخراج الحمض النووي الريبي المتكرر في كل بئر لضمان تحلل الخلية الكامل.
      4. انقل المحلول إلى أنبوب طرد مركزي دقيق بسعة 1.5 مل.
      5. ضع الأنبوب على الثلج أو خزنه عند -80 درجة مئوية لاستخراج الحمض النووي الريبي لاحقا.
    3. للكرويدات ثلاثية الأبعاد LGEC
      1. اجمع كرويدات LGEC ثلاثية الأبعاد غير متمايزة ومميزة لمدة 14 يوما كما هو موضح في الخطوات 3.2-3.3. أضف 1 مل من محلول الهضم (وسط خال من المصل يحتوي على 1 ملغ/مل Dispase II) إلى كل بئر، لضمان تغطية هيكل القبة الهلامية ثلاثية الأبعاد على شكل مصفوفة كروية بالكامل. حضن عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربونلمدة 30 دقيقة.
      2. انقل محلول الهضم الذي يحتوي على الكرويدات ثلاثية الأبعاد إلى أنبوب طرد مركزي دقيق بسعة 1.5 مل باستخدام ماصة بسعة 1 مل. الطرد المركزي عند 1000 × جرام لمدة 3 دقائق لجمع الرصاصة الكروئية.
      3. اغسل الحبيبة ب 1 مل من DPBS وجهاز طرد مركزي على حرارة 1000 × جرام لمدة 3 دقائق لجمع الحبيبات مرة أخرى.
      4. أضف 600 ميكرولتر من مادة استخراج RNA (لكل 20 ميكرولتر من جل المصفوفة) وحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 5-10 دقائق.
      5. اخلط جيدا باستخدام ماصة بحجم 1 مل لضمان تحلل الكروي ثلاثي الأبعاد بشكل كامل.
      6. ضع الأنبوب على الثلج أو خزنه عند -80 درجة مئوية لاستخراج الحمض النووي الريبي لاحقا.
  2. استخراج الحمض النووي الريبي
    ملاحظة: ارتد معدات الحماية الشخصية المناسبة (معطف مختبر، قفازات، قناع) وقم بجميع الإجراءات التي تتضمن الكلوروفورم والإيزوبروبانول في غطاء بخار. التخلص من تدفقات النفايات الكيميائية في حاويات مخصصة للنفايات الخطرة الموسومة بإنتاج النفايات الخطرة، وفقا لبروتوكولات التخلص من النفايات المؤسسية.
    1. أضف الكلوروفورم (1/5 حجم من كاشف استخراج RNA) إلى أنبوب الطرد المركزي الذي يحتوي عينة RNA في مادة استخراج RNA (من الخطوة 6.1).
      ملاحظة: قم بإجراء العملية في غطاء بخار.
    2. اخلط جيدا باستخدام دوامة وحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق حتى فصل الطور.
    3. الطرد المركزي عند 14,000 × جرام لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: بعد الطرد المركزي، ينفصل السائل إلى ثلاث طبقات، مع وجود الحمض النووي الريبي في الطور المائي العلوي الشفاف.
    4. جهز أنبوب طرد مركزي جديد بسعة 1.5 مل خال من RNase وأضف الأيزوبروبانول (نصف حجم مادة استخراج RNA) في غطاء بخار.
    5. قم بإدخال الطور المائي العلوي الشفاف (نصف حجم مادة استخراج RNA) بعناية داخل الأنبوب الجديد الخالي من الRNase.
      ملاحظة: كن حذرا من تجنب تلويث الطبقة الوسطى عند التلوث.
    6. اقلب الأنبوب عدة مرات ليخلط ويحتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. ثم أعيد استخدام الطرد المركزي بقوة 14,000 × g لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    7. تخلص من المادة الفائقة وأضف 500 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 75٪ لغسل الحبيبات عن طريق قلب الأنبوب. الطرد المركزي مرة أخرى عند 14,000 × g لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    8. كرر الخطوة 6.2.7. تخلص من المادة الفائقة وقم بإجراء عملية طرد مركزي سريعة لإزالة أي سائل متبق.
    9. ضع الأنبوب على الثلج داخل غطاء البخار، افتح الغطاء، واتركه يجف في الهواء لمدة 10-20 دقيقة حتى تصبح الحبيبات البيضاء شبه شفافة.
    10. أضف 20 ميكرولتر من الماء الخالي من الرينازيم لإذابة الحبيبة. قياس تركيز ونقاء الحمض النووي الريبي باستخدام مقياس طيفي.
      ملاحظة: إذا كان تركيز RNA مرتفعا جدا، قم بتخفيفه بكمية مناسبة من الماء الخالي من RNase.
    11. ضع محلول RNA على الثلج أو خزنه عند -80 درجة مئوية لعملية النسخ العكسي اللاحقة.

7. RT-PCR الكمي (qRT-PCR)

  1. النسخ العكسي
    1. أضف المكونات التالية بالتسلسل إلى أنبوب تفاعل PCR وفقا لتعليمات الشركة المصنعة: 800 نانوغرام من إجمالي RNA (احسب الحجم بناء على تركيزه)، 4 ميكرولتر من 5x All-in-One SuperMix ل q-PCR، 1 ميكرولتر من مزيل gDNA، وماء خال من RNase ليصل الحجم الكلي إلى 20 ميكرولتر.
    2. اخلط المكونات بلطف. اضبط جهاز PCR على الشروط التالية: 55 درجة مئوية لمدة 6 دقائق، 80 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة، ثم 12 درجة مئوية إلى أجل غير مسمى.
    3. تخزين cDNA عند -20 درجة مئوية أو احتفظ به على التجميد لعملية qRT-PCR بعد اكتمال تفاعل النسخ العكسي.
  2. qRT-PCR
    1. جهز محلول qRT-PCR المسبق لاستهداف الجينات المختلفة كما يلي: 5 ميكرولتر من 2x من Green qPCR SuperMix، 0.2 ميكرولتر من البرايمر الأمامي (10 ميكرومول)، 0.2 ميكرولتر من البرايمر العكسي (10 ميكرومول)، و3.6 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكليز. اخلط بلطف وضعه على الثلج.
    2. أضف 9 ميكرولتر من الخلطة المسبق qRT-PCR (المحضرة في الخطوة 7.2.1) و1 ميكرولتر من cDNA (تم تحضيره في الخطوة 7.1) إلى أنابيب qRT-PCR وفقا لتصميم التجربة.
    3. قم بعمل الطرد المركزي للأنابيب على حرارة 1000 × جرام في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقتين.
    4. ضع الأنابيب في جهاز PCR الكمي الفلوري للكشف.
      ملاحظة: استخدم طريقة من ثلاث خطوات مع البرنامج التالي وفقا لتعليمات الشركة المصنعة: 94 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 94 درجة مئوية لمدة 5 ثوان، 60 درجة مئوية لمدة 15 ثانية، و72 درجة مئوية لمدة 10 ثوان. ابدأ بالركوب من الخطوة الثانية لمدة 40-45 دورة.
    5. إجراء التحليل الكمي باستخدام طريقة التصوير المقطعي المقارن (2-ΔΔCt).
      ملاحظة: يجب تكرار كل مجموعة بيانات ثلاث مرات مستقلة على الأقل لضمان موثوقية النتائج.

8. التلوين بفلورة المناعة

ملاحظة: يتم إجراء التلوين بفلورية المناعة على اللواء الغازي المرتكب في صفائح 24 بئر بمعدلات التقاء 70-80٪ أو على المقاطع المجمدة من هياكل LGEC ثلاثية الأبعاد متمايزة.

  1. بالنسبة للمناطق المحلية المحيطة
    1. أزل وسط الزراعة من الآبار واغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام PBS.
    2. أضف 500 ميكرولتر من 4٪ PFA إلى كل بئر في خزانة السلامة البيولوجية أو غطاء الأبخرة وحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة لتثبيت الخلايا.
    3. اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام PBS، كل غسول يستغرق 5 دقائق.
    4. أضف 500 ميكرولتر من ترايتون X-100 بنسبة 0.2٪ لتغطية الخلايا وحضن الغرفة في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة لنفخ غشاء الخلية.
    5. اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام PBS، كل غسول يستغرق 10 دقائق.
    6. قم بإزالة PBS واستخدم مؤشر كيمياء مناعة لرسم دائرة حول كل بئر من صفيحة 24 بئرا. أضف 50 ميكرولتر من 2٪ BSA لكل بئر لتغطية الخلايا. حضن في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة للحضن.
    7. أزل BSA وأضف 50 ميكرولتر من الجسم المضاد الأولي المخفف (الجدول التكميلي 1) لتغطية ال LGECs. حضن عند 4 درجات مئوية لمدة 16-18 ساعة.
    8. قم بإزالة الجسم المضاد الأساسي وكرر الخطوة 8.1.5.
    9. أضف 50 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية الفلورية إلى كل بئر لتغطية LGECs. حضن في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة ساعة واحدة.
    10. كرر الخطوة 8.1.5، وتجنب التعرض للضوء.
    11. أضف 50 ميكرولتر من محلول 4',6-دياميدينو-2-فينيل إندول (DAPI) لتغطية ال LGECs ومراقبة التلوين تحت مجهر فلوري.
  2. للكرويدات ثلاثية الأبعاد LGEC
    1. جهز الأقسام الكروية المجمدة ثلاثية الأبعاد LGEC كما هو موضح في الخطوة 4. قم بإجراء التلوين الفلوري المناعي كما هو موضح في الخطوات 8.1.2-8.1.11.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

إنشاء نظام زراعة LGEC خال من المصل باستخدام 2C
كان الهدف في هذا البروتوكول هو إنشاء نظام زراعة أبسط وأكثر كفاءة لتوسيع ال LGECs الأولية للفئران. بعد فحص مكثف، تم تطوير تركيبة خالية من المصل 2C، تتكون فقط من Y27632 وY27632 و SB431542، بنجاح، مما مكن من التوسع طويل الأمد للمواد المنخفضة في المختبر. بعد هضم إنزيمات مختلطة، بدأت الخلايا المنخفضة المبكرة في الالتصاق وتكوين نسخ خلاية متعددة بعد 3 أيام من الزراعة مع 2C (البيانات غير موضحة). تعد الأيام الثلاثة الأولى...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

كما هو موضح في المقدمة، تم تطوير عدة أنظمة زراعة خالية من المصل لخلايا LG في السنوات الأخيرة 10,11,12,13. ومع ذلك، فإن العديد من هذه الطرق لها حدود، بما في ذلك ضعف تكاثر الخلايا وعدم القدرة على تحقيق توسع واسع النطاق في المختبرات10,11. علاوة على ذلك، اعتمدت أنظمة الزراعة الحديثة الخالية من المص...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يعلن المؤلفون عدم وجود مصالح متنافسة.

شكر وتقدير

وقد دعمت هذه المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (82471048، 82271045)؛ برنامج شنتشن للعلوم والتكنولوجيا (JCYJ20240813145510014)؛ مشروع المواهب الصحية الخاص لأبحاث الصحة في مقاطعة جيلين (2023SCZ63، 2024SCZ53، 2025SCZ65)؛ ومشروع خطة تطوير العلوم والتكنولوجيا لمقاطعة جيلين (YDZJ202601ZYTS389).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
 -20° ثلاجة C فائقة الحرارة منخفضةهاير
 -80° ثلاجة C فائقة الحرارة منخفضةهاير
0.25٪ تريبسين-إيدتاجيبكو25200056
أنبوب طرد مركزي دقيق بسعة 1.5 مل  كيرغنKG2211خالي من الرناز
طبق زراعة الخلايا بحجم 35 ممLABSELECT12111
4 & deg; ثلاجة Cهاير
4٪ بارافورمالديهايد (PFA)سيرفيسبيوG1101
4',6-دياميدينو-2-فينيليندويل (DAPI)ييسن708939ES03المتجر عند -20 ودرجة مئوية؛ C، المخزون عند 1 ملغ/مل، 500x، تخفيف إلى 1x مع 1x PBS
أنبوب طرد مركزي بسعة 5 مل  ACMECAC17457
أنبوب طرد مركزي 50 مل  LABSELECTCT-002-50-SS
الأجسام المضادة المضادة للعضلات الملساء المضادة لألفا الأرنبأبكامAB5694تخفيفه باستخدام مخزن تخفيف الأجسام المضادة عند 1:100 دقيقة 
الأجسام المضادة للأرنب المضادة AQP5  ABclonalA9927تخفيفه باستخدام مخزن تخفيف الأجسام المضادة عند 1:100 دقيقة 
الأجسام المضادة للأرنب مضاد السيتوكيراتين 14أبكامab181595تخفيفه باستخدام مخزن تخفيف الأجسام المضادة عند 1:200 دقيقة؛
مضاد السيتوكيراتين 19  الأجسام المضادة للأرنبأبكامAB52625قم بتخفيف الأجسام المضادة عند 1:400 وثانية؛
الأجسام المضادة للأرنب Anti-Ki67أبكامab16667تخفيفه باستخدام مخزن تخفيف الأجسام المضادة عند 1:200 دقيقة؛
خزانة السلامة الحيويةستيريل غارد
ألبومين مصل البقر (BSA) ييسن36101ES60المتجر في 4° C
فئران C57BL/6Jمركز الحيوانات المختبرية في جامعة شيامن
لوحة زراعة الخلاياLABSELECT1131224-بئر
حاضنة الخلاياإبندورف
الطرد المركزيإبندورف
الكلوروفورمهوشي10006818تحذير، إجراء عمليات في غطاء بخاري
CO2  حاضنة درجة حرارة ثابتةإبندورف
كولاجناز أروش10103586001المتجر عند -20 ودرجة مئوية؛ C، المخزون عند 200 ملغ/مل، 100 مرة
محلول مثبط التربسين المحدد (DTI)جيبكوR007100
مجموعة DermaLife K Keratinocyte Medium Complete (وسط خال من المصل) خط الحياةLL-0007متجر في الساعة 4 & deg; C
دي-هانكسبايوشاربBL559A يستخدم لتخفيف Dispase II
ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO)سيغماD4540يستخدم لتخفيف Y27632 و SB431542
ديسباسي IIسيغماD4693المتجر عند -20 ودرجة مئوية؛ C، المخزون عند 200 ملغ/مل، 100 مرة
DMEM الأساسي (1X)جيبكوC11995500BT
الأجسام المضادة الثانوية شديدة الامتصاص المتقاطع من نوع Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)، أليكسا فلور 488إنفيتروجينA-21206التخفيف باستخدام مخزن تخفيف الأجسام المضادة عند 1:300
محلول ملحي مخزن بالفوسفات من دولبيكو (DPBS)سيرفيسبيوG4200
الإيثانول المطلقهوشي10009218تحذير، استخدم لتحضير مخففات أخرى من الإيثانول 
الميكروتوم المجمدلايكا
مطحنة عالية السرعة منخفضة الحرارةسيرفيسبيو
مجهر الفلورة المقلوبلايكا
المجهر المقلوبأوليمبوس
إيزوبروبانول هوشي80109270
المجهر الكونفوكال بالليزر FV3000أوليمبوس
جهاز الطرد المركزي عالي السرعة منخفض الحرارةإبندورف
مجموعة اختبار التوربنت المناعي المرتبط بالإنزيم LTF (ELISA) علم اللابE-MSEL-M0047المتجر عند -20 ودرجة مئوية؛ C
جل المصفوفة (ماتريجيل)82703موجينجيلأليكوت والمخزن عند -20 ° C
المايكربابتورإبندورف
قارئ الميكروبليتثيرمو فيشر العلمي
مياه خالية من النوكليازبايوشاربBL510B
مركب OCTسيجن4586
PBS، 1×؛ (pH7.4)سيرفيسبيوG4202
مضخم PCRبيو-راد
البنسلين-ستريبتوميسينبايوشاربBL505A
البنسلين-ستريبتومايسين-الأمفوتيرسينبايوشاربBL142A
مجموعة PerfectStart Green لجهاز qPCR SuperMixترانس جين بيوتيكAQ601-01-V2المتجر عند -20 ودرجة مئوية؛ C
جامعة PerfectStart RT& مجموعة qPCRترانس جين بيوتيكAUQ-01المتجر عند -20 ودرجة مئوية؛ C
بيلوكاربين علاء الدينP424663المتجر عند -20 ودرجة مئوية؛ C، 2500x
Primer AQP5  التسلسل:
الأمام CATGAACCCAGCCGATC
TT
الخلفية: CTTGCTCCCATCAT
CC		سانغون بيوتيك
برايمر K14  التسلسل:
الأمامي:CCCACCTTCATCTTCC
CAATT
الخلف: AAGCCTGAGCAGCATGTAGCAG		سانغون بيوتيك
برايمر K15  التسلسل:
الأمام GAGGTGGCGTCTAACACA
GA
الخلفية:TCTGAGCCTCCATCTCAC
AG		سانغون بيوتيك
مقدمة K19  التسلسل:
الأمام: ATTACTGCCCTGAGGAGC
CA
الخلفية: TTCAGCTCCTCAATCCGA
GC		سانغون بيوتيك
برايمر K5  التسلسل:
الأمام: CTCAGAGCTGAGGAACAT
GC
الخلف: AGCTCCGCATCAAAGA
AT		سانغون بيوتيك
Primer Ki67  التسلسل:
الأمامي:ACCATCATTGACCGCTCC
TT
الخلف: TTGACCTTCCCATCAGG
GT		سانغون بيوتيك
Primer LTF  التسلسل:
الأمامي:CAGGAGCCAACAAATGTG
CC
الخلفية:TTGTACTGGTCCCTCTCG
GC		سانغون بيوتيك
برايمر P63  تسلسل:
الأمامي:ATGTCACCGAGGTTGTG
AAA
الخلف: GAATTCAGTGCCAACCTGTG		سانغون بيوتيك
برايمر SOX10  التسلسل:
الأمامي:ATCAGCCACGAGGTAATG
TCCAAC
الخلفية:ACTGCCCAGCCGTAGCC		سانغون بيوتيك
برايمر α-SMA  التسلسل:
الأمامي:CTCCCTGGAGAAGAGCTA
CG
الخلفية:CGCTGACTCCATCCCAAT
GA		سانغون بيوتيك
جهاز PCR الكمي الفلوري في الوقت الحقيقيروش
كاشف استخراج RNA الكلي لعزل RNAفازيمR401-01تحذير، إجراء عمليات في غطاء بخاري
SB431542 أبيكسبيوA8249المتجر عند -20 ودرجة مئوية؛ C، الأصل بطول 20 مللي موتر، 2000x
مقياس الطيف الفوتومتري نانو دروب 1000ثيرمو فيشر العلميقياس تركيز الحمض النووي الريبي
سكروزماكلينS818046أذابها بالماء المقطر
ترايتون X-100سولاربيولوجياT8200
نظام تنقية المياه فائق النقاءميليبور
مخزن تخفيف الأجسام المضادة العالميإبيزيمPS119متجر في الساعة 4 & deg; C
Y27632 أبيكسبيوB1293المتجر عند -20 ودرجة مئوية؛ C، الأصل بطول 20 مللي موتر، 2000x

المراجع

  1. Veernala, I., et al. Lacrimal gland regeneration: the unmet challenges and promise for dry eye therapy. Ocul Surf. 25, 129-141 (2022).
  2. Chen, X., Li, S., Zhang, Y., Ye, L. Progress and prospects in the treatment of lacrimal gland dysfunction diseases: from traditional treatment methods to stem cell and organoid therapies. Stem Cells Int. 2025, 6334284(2025).
  3. Hirayama, M., Kawakita, T., Tsubota, K., Shimmura, S. Challenges and strategies for regenerating the lacrimal gland. Ocul Surf. 14 (2), 135-143 (2016).
  4. Ackermann, P., et al. Isolation and investigation of presumptive murine lacrimal gland stem cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (8), 4350-4363 (2015).
  5. Gromova, A., et al. Lacrimal gland repair using progenitor cells. Stem Cells Transl Med. 6 (1), 88-98 (2017).
  6. Millar, T. J., Herok, G., Koutavas, H., Martin, D. K., Anderton, P. J. Immunohistochemical and histochemical characterisation of epithelial cells of rabbit lacrimal glands in tissue sections and cell cultures. Tissue Cell. 28 (3), 301-312 (1996).
  7. Oliver, C. Isolation and maintenance of differentiated exocrine gland acinar cells in vitro. In Vitro. 16 (4), 297-305 (1980).
  8. Hann, L. E., Tatro, J. B., Sullivan, D. A. Morphology and function of lacrimal gland acinar cells in primary culture. Invest Ophthalmol Vis Sci. 30 (1), 145-158 (1989).
  9. Yoshida, K., et al. Serum-free medium enhances the immunosuppressive and antifibrotic abilities of mesenchymal stem cells utilized in experimental renal fibrosis. Stem Cells Transl Med. 7 (12), 893-905 (2018).
  10. Ueda, Y., et al. Purification and characterization of mouse lacrimal gland epithelial cells and reconstruction of an acinar-like structure in three-dimensional culture. Invest Ophthalmol Vis Sci. 50 (5), 1978-1987 (2009).
  11. Kobayashi, S., et al. Characterization of cultivated murine lacrimal gland epithelial cells. Mol Vis. 18, 1271-1277 (2012).
  12. Xiao, S., Zhang, Y. Establishment of long-term serum-free culture for lacrimal gland stem cells aiming at lacrimal gland repair. Stem Cell Res Ther. 11 (1), 20(2020).
  13. Bannier-Hélaouët, M., et al. Exploring the human lacrimal gland using organoids and single-cell sequencing. Cell Stem Cell. 28 (7), 1221-1232.e7 (2021).
  14. Bannier-Hélaouët, M., et al. Establishment, maintenance, differentiation, genetic manipulation, and transplantation of mouse and human lacrimal gland organoids. J Vis Exp. (192), e65040(2023).
  15. Chen, H., Huang, P., Zhang, Y. Three-dimensional, serum-free culture system for lacrimal gland stem cells. J Vis Exp. (184), e63585(2022).
  16. Wang, J., Sun, S., Deng, H. Chemical reprogramming for cell fate manipulation: methods, applications, and perspectives. Cell Stem Cell. 30 (9), 1130-1147 (2023).
  17. Rehman, A., et al. Role of small molecules as drug candidates for reprogramming somatic cells into induced pluripotent stem cells: a comprehensive review. Comput Biol Med. 177, 108661(2024).
  18. Zhang, C., et al. Long-term in vitro expansion of epithelial stem cells enabled by pharmacological inhibition of pak1-rock-myosin II and TGF-β signaling. Cell Rep. 25 (3), 598-610.e5 (2018).
  19. An, X., et al. Novel cell culture paradigm prolongs mouse corneal epithelial cell proliferative activity in vitro and in vivo. Front Cell Dev Biol. 9, 675998(2021).
  20. Xu, L., et al. A cocktail of small molecules maintains the stemness and differentiation potential of conjunctival epithelial cells. Ocul Surf. 30, 107-118 (2023).
  21. Zeng, B., et al. Distinctive small molecules blend: promotes lacrimal gland epithelial cell proliferation in vitro and accelerates lacrimal gland injury repair in vivo. Ocul Surf. 34, 283-295 (2024).
  22. Zhou, Q., et al. inhibitor Y-27632 increases the cloning efficiency of limbal stem/progenitor cells by improving their adherence and ROS-scavenging capacity. Tissue Eng Part C Methods. 19 (7), 531-537 (2013).
  23. Reynolds, S. D., et al. Airway progenitor clone formation is enhanced by Y-27632-dependent changes in the transcriptome. Am J Respir Cell Mol Biol. 55 (3), 323-336 (2016).
  24. Bai, H., Gao, Y., Hoyle, D. L., Cheng, T., Wang, Z. Z. Suppression of transforming growth factor-β signaling delays cellular senescence and preserves the function of endothelial cells derived from human pluripotent stem cells. Stem Cells Transl Med. 6 (2), 589-600 (2017).
  25. Natarajan, E., et al. A keratinocyte hypermotility/growth-arrest response involving laminin 5 and p16INK4a activated in wound healing and senescence. Am J Pathol. 168 (6), 1821-1837 (2006).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

الفيديو قريباً
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.