التصور والتحليل الكمي لتنشيط PARP1/PARP2 الناتج عن السموم الجينية في الخلايا باستخدام مراسل بروتين الاندماج الفلوري

Summary

هنا، نصف طريقة للتصور الخلوي، وتحديد المواقع تحت الخلوي، والتحليل الكمي لتركيزات البولي (ADP-ريبوز) (PAR) الغنية في الخلايا الثديية الثابتة. يتيح هذا الاختبار قياس مواقع تنشيط PARP الناتج عن تلف الحمض النووي، بما في ذلك ذلك المرتبط بإصلاح استئصال القاعدة أو إصلاح كسر السلسلة الواحدة، في أنوية الخلايا المعرضة للسم الجيني.

Abstract

بولي (ADP-ريبوز) (PAR) هو بوليمر من ADP-ريبوز تم تصنيعه بواسطة أربعة أعضاء من عائلة إنزيمات ADP-ريبوز البوليميراز—PARP1، PARP2، PARP5a، وPARP5b. ومع ذلك، فقط PARP1 وPARP2 يصنعان PAR استجابة لتكسير الحمض النووي. يعرف PAR بأنه تعديل بروتين بعد الترجمة، لكنه أيضا ثبت أنه موجود كتعديل DNA أو RNA. يتم تنظيم مستويات PAR بشكل إضافي بواسطة PARG، وهو جليكوهيدرولاز PAR الذي مع PARP1 وPARP2 ينظم مستوى الخلية الناتج عن تلف الحمض النووي PAR. يعد التخليق الديناميكي وتحلل PAR أمرا حاسما لدوره التنظيمي في إصلاح الحمض النووي، واستجابة تلف الحمض النووي، والذي يؤثر بدوره على إعادة تنظيم الكروماتين، والتكرار، والنسخ، وموت الخلايا. يمكن اعتبار تنشيط PARP1/PARP2 وتراكم PAR مواقع لإصلاح استئصال القاعدة المستمر أو إصلاح كسر الحمض النووي أحادي السلسلة؛ ومع ذلك، ترتبط العديد من منشطات PARP1/PARP2 أيضا بإجهاد التكرار وعمليات أيضية أخرى للحمض النووي. بمجرد تكوينها، تسهل سلاسل PAR تجنيد عوامل إصلاح الحمض النووي واستجابة تلف الحمض النووي (DDR) إلى مواقع تلف الحمض النووي أو الضرر الجينومي عبر مجالات ربط PAR الخاصة بها (PBDs). تتعرف عشرة PBDs مختلفة على مناطق مختلفة من جزيء PAR، بما في ذلك نمط ارتباط PAR، إصبع الزنك المرتبط ب PAR، مجال WWE، والمجال الكبير، إلى جانب PBDs الأخرى. لتسهيل التحليل الخلوي لديناميكيات PAR، استخدمنا PBDs مدمجة مع بروتين فلوري أخضر معزز (EGFP) لتحسين الكمية الخلوية لتركيزات PAR. نحن نصف اختبارا يستخدم جزءا من RNF146 يشفر مجال PBD/WWE، مرتبط ب EGFP، لتصوير وقياس تراكم PAR في مواقع الإصابة الجينومية وBER أو SSBR المستمر. نحن نصفهم الخطوات التجريبية، بما في ذلك إنتاج جزيئات الفيروسات العدسية، وتحويل خط الخلايا المستهدفة، ومعالجة الخلايا الثديية لإحداث تلف في الحمض النووي الجيني، والحصول على صور مجهرية تألقية كونفوكالية، وقياس البيانات شبه آلي.

Introduction

يصف هذا البروتوكول اختبار LivePAR، الذي يسمح بتصور وتحليل كمية لبولي (ADP-ريبوز) (PAR) في مواقع الضرر الجيني، المرتبط أساسا بإصلاح استئصال القاعدة (BER) أو إصلاح كسر السلسلة الأحادية (SSBR)، في الخلايا الثديية ^1,2,3. يعد BER مسارا حيويا لإصلاح الحمض النووي يزيل القواعد التالفة أو المعدلة من الحمض النووي (للمراجعات حول BER وPARylation، انظر 4,5,6,7). يبدأ BER بجليكوزيلياز DNA الذي يتعرف على القواعد^{المعدلة 4} ويستأصل، تاركا موقعا أبورينيك/أبيريميديني (AP)، مثل جليكوزيلياز بيورين الميثيل (MPG)، الذي يزيل القواعد المثيلة ^8,9، أو 8-أوكسوجوانين جليكوزيليز (OGG1)، الذي يستخرج 8-oxogG ^9,10. ثم يتم شق مواقع AP بواسطة النوائية الداخلية 1 (APE1)^11,12,13، مما يخلق شقا في العمود الفقري للحمض النووي. بوليميراز، وهو بوليميراز DNA β (Polβ)^14,15، يقوم بتفصيل وملأ الفجوة باستخدام الخيط السليم كقالب، وأخيرا، تقوم ليغازات DNA بإغلاق الخيط الذي تم إصلاحه^16,17، على سبيل المثال، ليغاز DNA i أو DNA ligase III.

اللاعبون الرئيسيون في BER وSSBR هم البوليميراز 1 و2 (PARP1/PARP2)18,19,20، وهي إنزيمات تكتشف بسرعة انكسار خيوط الحمض النووي أثناء BER أو SSBR. عند اكتشاف هذه الانقطاعات، يحفز PARP1/PARP2 إضافة بوليمرات ADP-ريبوز إلى نفسه وبروتينات أخرى — وهي عملية تسمى PARylation (للمراجعة، انظر⁶) — عن طريق تحلل NAD⁺. ينشئ هذا هيكلا بروتينيا ديناميكيا (PAR) يستعين بعوامل إصلاح الحمض النووي الأخرى إلى موقع التلف، مما يعزز دقة إصلاح الحمض النووي. لإدارة هذا الهيكل الديناميكي من PAR، تساهم عدة بروتينات في التحلل المائي وإزالة سلاسل PAR، بما في ذلك الهيدرولاز المستقبل ADP الريبوزي 3 (ARH3)، والهيدرولاز الجليكوزيل الطرفي ADP-ريبوز 1 (TARG1)، وهيدرولاز أحادي ADP ريبوزيل 1/2 (MacroD1/2)، وبولي (ADP-ريبوز) جليكوهيدرولاز (PARG)6,21,22,23,24,25,26 . ومع ذلك، فإن PARG مسؤول بشكل أساسي عن هذه العملية^ويلعب دورا حاسما في استجابة تلف الحمض النووي (DDR)^28,29.

لذلك يرتبط PARG بشكل حاسم بوظيفة PARP1 وPARP2. بينما ينشئ PARP1 وPARP2 بوليمرات PAR، يعمل PARG كإنزيم "تنظيف"، حيث يحلل هذه البوليمرات ويعكس فعليا عملية PARylation^30,31. هذه العملية ضرورية لإكمال كل من BER وSSBR وللسماح بإعادة تدوير PARP1/PARP2 للاستجابة لتلف الحمض النووي الجديد. وبالتالي، تعمل PARP1 وPARP2 والتقسيم وPARG بطريقة منسقة، لضمان إصلاح الحمض النووي الفعال والقابل للعكس من خلال BER وSSBR ^4,6.

يمكن أن يتأثر مدى التقسيم الباريلي بعوامل متعددة ويلعب دورا أساسيا في الاستجابة العامة لتلف الحمض النووي³². تشمل هذه العوامل التعرض للسموم الجينية التي تضيف ملاحقا إلى قواعد الحمض النووي، مثل N-ميثيل-N'-نيترو-نيترو-نيترو-جوانيدين (MNNG)، ميثيل ميثانيسلفونات (MMS)، بيروكسيد الهيدروجين (H₂O₂)، أو تيرت-بيوتيل هيدروكسيد (tBuOOH). علاوة على ذلك، يمكن أن يتأثر مدى الباريليشن بجزيئات تعدل عملية الباريليشن، مثل ديهيدرونيكوتيناميد ريبوزيد (NRH)، وهو مقدمة ل NAD⁺، والذي يعزز تنشيط PARP عن طريق زيادة مستويات NAD⁺، أو FK866، وهو مثبط ل NAMPT، والذي يمكن أن يقلل من مستويات NAD⁺ وينظم تنشيط PARP سلبا³. أخيرا، يمكن أن تغير الطفرات الجينية أو تثبيط الإنزيمات الصغيرة مثل PARP1/PARP2 أو PARG أو بروتينات إصلاح الحمض النووي الأخرى (مثل عيوب في BER أو عوامل إعادة التركيب المتماثل مثل BRCA1/BRCA2) تنشيط PARP 33,34,35,36.

يستخدم اختبار LivePAR جزءا من بروتين إصبع البنصر 146 (RNF146) يشفر مجال WWE (الأحماض الأمينية 100–182)، مرتبط ببروتين فلوري أخضر معزز (EGFP)³. مجال WWE هو مجال كروي سمي نسبة إلى البقايا المحفوظة تريبتوفان (W) وجلوتامات (E) في موقع ارتباطه³⁷. ترتبط مجالات WWE ب iso-ADP-ribose، أصغر وحدة هيكلية داخلية ضمن سلاسل PAR^38,39. RNF146 هو ليغاز يوبيكويتين E3 يتعرف على إيزو-ADP-ريبوز^38,40 ويقال إنه يستهدف البروتينات المشاركة في BER (XRCC1، DNA ligas III، وPARP1) لتحلل البروتيازومي⁴¹. ربط هذا المجال ب EGFP يتيح رؤية واكتشاف مواقع الباريليشن الناتجة عن السم الجيني في خلايا الثدييات. في هذا البروتوكول، نصف توليد خطوط خلايا مستقرة تعبر عن مراسل LivePAR (الشكل 1A)، وتحفيز تلف الحمض النووي لتنشيط PARP1/PARP2، وإنتاج PAR، وجمع وتحليل بيانات المجهر الفلوري الكونفوكلي (الشكل 1).

يوفر بلازميد pMD2.g(VSVG) بروتين الجليكوبروتين الفيروسي (VSVG)، الذي يوسع نطاق الخلايا التي يمكن للفيروس إصابتها مقارنة ببروتين الغلاف اللينتيفيروس الأصلي. يوفر بلازميد pRSV-REV العنصر التنظيمي (REV)، وهو منشط حيوي يرتبط بالحمض النووي الريبي الفيروسي وينشط نسخ جينات الفيروس؛ وهو ضروري لتكاثر الفيروسات بكفاءة. يوفر بلازميد pMDLg/pRRE عدة مكونات داخلية رئيسية في التغليف، وهي GAG، الذي يشفر بروتينات المصفوفة (MA)، والكبسيد (CA)، والنوكليوكابسيد (NC)، وpol، الذي يشفد الإنزيمات اللازمة لتكاثر الفيروسات ودمجه في جينوم الخلية المضيفة، والعنصر التنظيمي للحمض النووي الريبي (RRE)، وهو عنصر RNA يعزز كفاءة ترجمة الحمض النووي الفيروسي وتغليف الحمض النووي الجيني. يحتوي بلازميد pLV-EF1A-LivePAR-Hygro (الشكل 1A) على ترميز cDNA لبروتين الفلورة الخضراء المحسنة (EGFP) الذي يندمج مع الطرف C لمجال WWE ل RNF146 (الأحماض الأمينية 100–182)، وهو مجال بروتين يرتبط بسلاسل البولي (ADP-ريبوز)، كما يشفر الناقل أيضا شريط مقاومة للهجرومايسين. يتم عزل الفيروس من الفائق لزراعة الخلايا ويمكن تخزينه عند -80 درجة مئوية أو استخدامه فورا للنقل (الشكل 1B).

Protocol

1. إنتاج اللينتيفيروس

ملاحظة: يستخدم هذا البروتوكول نظام تغليف لينتيفيروس من الجيل الثالث^42,43 لتوليد خلايا تعبر عن تقرير PAR مشفر وراثيا. تنتج جسيمات الفيروسات اللينتي في خلايا 293FT باستخدام نظام رباعي البلازميدات يتكون من مكونات الغلاف والتنظيم والتغليف، إلى جانب بنية pLV-EF1A-LivePAR-Hygro التي تشفر مجال WWE موسوم ب EGFP من RNF146، والذي يرتبط بسلاسل البولي (ADP-ريبوز). يستخدم الفيروس الناتج لتوليد خطوط خلايا مستقرة لرؤية وقياس تراكم PAR.

1. زراعة خلايا 293FT منخفضة المرور في DMEM تحتوي على 10٪ FBS و1٪ Pen/Strep في جو رطب عند 37 درجة مئوية و5٪ ثاني أكسيد الكربون_2. تأكد من أن خلايا 293قدم لم تكن في الزراعة لأكثر من 3 أسابيع.
   ملاحظة: نستخدم بشكل روتيني خلايا بحجم 293 قدم تتراوح أرقام الممرات بين 3 و10. تم تحويل خلايا 293FT وتخليدها بواسطة مستضد T الكبير SV40. تتمتع هذه الخلايا بكفاءة عالية في النقل الجيني، وهو أمر ضروري لإنتاج البروتينات المؤتلفة ودراسات التعبير الجيني. يستجيبون جيدا لكل من النقل المعتمد على الدهون وطرق نقل الفيروسات.
2. الطبق 1.7 × 10⁵ خلايا بحجم 293 قدم على طبق زراعة الأنسجة بحجم 60 مم في حجم نهائي 5.5 مل من وسط الزراعة في اليوم الأول. أعد الخلايا إلى الحاضنة لمدة 24 ساعة.
3. في اليوم الثاني (يوم النقل)، أضف 375 ميكرولتر من وسط DMEM الخالي من FBS وPen/Strep إلى أنبوب طرد مركزي دقيق معقم بسعة 1.5 مل. ثم أضف 10 ميكروغرام من كاشف النقل القائم على الدهون، و4 ميكروغرام من بلازميد pLV-EF1A-LivePAR-Hygro، و2 ميكروغرام من بلازميد pMD2.g(VSVG)، و2 ميكروغرام من بلازميد pRSV-REV، و2 ميكروغرام من بلازميد pMDLg/pRRE. اضغط بلطف على أنبوب الطرد المركزي الدقيق لخلط الوسط، ومادة التحويل الثانوي، وحمض البلازميد النووي (تجنب الدوامة). حضن لمدة 15–30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة للسماح بتكوين مركب الحمض النووي / الكاشف الناقل.
4. أضف خليط البلازميد/كاشف النقل إلى الطبق الذي يحتوي على خلايا 293FT ليتم نقلها دون إزالة الوسط بشكل إسقاطي. أعد الخلايا إلى الحاضنة لمدة 48 ساعة.
   ملاحظة: تسمح هذه الفترة بإنتاج وإطلاقات جزيئات الفيروسات العدسية في وسط النمو.
5. في اليوم الرابع، اجمع وسائط الزراعة من الخلايا التي تم تحويلها بحجم 293 قدم لعزل جزيئات اللينتيفيروس. قم بالترشيح عبر فلتر معقم بحجم 0.45 ميكرومتر لفصل حطام الخلية عن جزيئات الفيروسات العدسية.
6. حدد عيار اللينتيفيروس باستخدام المواد المتوفرة (اختياري).
   ملاحظة: تعطي هذه الطريقة عادة ما 10⁵ إلى^{10 6} وحدات معدية لكل مل (IFU/mL)، مما يرتبط بتعددية تقريبية للعدوى (MOI) ~5 عند استخدامها كما هو موضح في خطوة النقل أدناه.
7. يتم تقسيم الوسائط التي تحتوي على جزيئات اللينتيفيروس إلى أربعة مبردات معقمة (1.0 مل لكل أنبوب) وتخزن عند -80 درجة مئوية.

2. النقل

ملاحظة: يوضح هذا القسم بروتوكول نقل الفيروسات العدسية المستخدم لإدخال جين منقل إلى خطوط الخلايا (الشكل 1B). لقد كان فعالا باستمرار في مختبرنا 1,3,33,37,44,45.

1. زراعة خط خلوي مفضل (عدد مرور منخفض) في وسط مناسب في جو رطب عند 37 درجة مئوية و5٪ ثاني أكسيد الكربون_2.
   ملاحظة: ابدأ بمرور مبكر لنوع الخلية المطلوب. يجب إذابة قارورة جديدة من الخلايا وتمريرها مرة واحدة على الأقل قبل الزرع للتحويل.
2. في اليوم الأول، × البذور 1^{10 5}–1.5 × 10⁵ خلايا في كل بئر، على كل بئر من صفيحة ذات 6 آبار في وسط نمو بحجم 2 مل. أعد الخلايا إلى الحاضنة لمدة 24 ساعة.
3. في اليوم الثاني (يوم التحويل)، تأكد من أن تكون الخلايا متقاربة بين 20٪ و40٪. أضف 1 مل من الفيروس، و1 مل من وسط النمو، و2 ميكرولتر من البوليبرين (مخزون 2 ملغ/مل) إلى أنبوب مخروطي بحجم 15 مل وامزجه بلطف عن طريق الانعكاس (تجنب الدوامات).
   ملاحظة: يستخدم البوليبرين أثناء نقل الفيروس لتجنب التنافر الكهروستاتيكي بين جزيئات الفيروس وغشاء الخلية. وبما أن البوليبرين مشحون إيجابيا، فإنه يتفاعل مع الجليكوبروتينات الفيروسية سالبة الشحنة، مما يعادل شحنتها. علاوة على ذلك، يرتبط البوليبرين بالجليكوزامينوجليكانات في وسط زراعة الخلايا، مما يمنع تفاعلها مع الفيروس. لذلك، يعزز البوليبرين بشكل كبير كفاءة التحويل.
4. أزل وسط النمو من صفيحة الستة آبار وأضف خليط الفيروس/الوسط/البوليبرين إلى كل بئر. ضع الخلايا التي تحتوي على خليط النقل في حاضنة تحتوي على غلاف جوي رطب عند 32 ^درجة مئوية و5٪ ثاني أكسيد الكربون_لمدة 16–18 ساعة.
   ملاحظة: حضانة الخلايا عند درجة حرارة 32 درجة مئوية خلال الليل أثناء نقل الفيروسات العدسية هو ممارسة شائعة، وإن لم تكن ضرورية، تزيد بشكل كبير من فعالية العدوى الفيروسية. خفض درجة الحرارة يبطئ عملية الأيض الخلوي، مما يقلل من الدفاعات الخلوية ويزيد من قابلية الإصابة بالعدوى الفيروسية.
5. في اليوم الثالث، استبدل وسائط الخلايا المنقولة بالفيروس بوسائط جديدة ونقلها إلى حاضنة بدرجة حرارة 37 درجة مئوية. احتضن لمدة 48 ساعة.
   ملاحظة: هذان اليومان كافيان للخلايا لإنتاج الجين المعدل RNF146(100–182)-EGFP وتصبح مقاومة للهيغروميسين.
6. لتطوير خطوط الخلايا المستقرة متعددة النسيلات الناتجة التي تعبر عن الجين المعدل RNF146(100–182)-EGFP، ابدأ بعد يومين من الحضانة اختيار الهيغروميسين كما هو موضح في الخطوة 2.5.
   1. بدلا من ذلك، توسيع هذه المجموعة من الخلايا المحولة في غياب الهيغرومايسين واستخدامها في تحليل PAR خلال الأيام العشرة إلى الأربعة عشر القادمة (النقل العابر)، كما هو موضح سابقا^{في 1}.
7. انقل الخلايا إلى صفيحة بحجم 100 مم بمجرد نموها في وجود الهيغروميسين وتتوسع بقدر ما يحتاج.
8. جهز مخزونات التجميد للخلايا المحولة للاستخدام المستقبلي.
9. التحقق من تعبير الجين المعدل RNF146(100–182)-EGFP باستخدام المجهر الكونفوكلي كما هو موضح في القسم 3. سيتم التعبير عن الجين المعدل RNF146(100–182)-EGFP في جميع أنحاء الخلية.
10. تحقق من تعبير الجين المعدل RNF146(100–182)-EGFP عن طريق الكشف المناعي، كما هو موضح في مكان آخر ^1,37.

3. المجهر الكونفوكالي والتحليل

ملاحظة: يوضح هذا القسم من البروتوكول تحضير الخلايا المكشوفة، وزرع الخلايا المعبرة عن LivePAR، والتعرض للعلاجات (tBuOOH، MNNG، PARGi، PARPi، و/أو NRH)، وتحضير الخلايا الثابتة على شرائح المجهر للتصوير الكونفوكالي وتحليل بؤرة PAR (الشكل 1C). كما يصف استخدام برنامج ImageJ وماكرو مخصص لقياس تركيز PAR شبه الآلي. يمكن استخدام هذا البروتوكول لدراسة تأثير عوامل مختلفة (مثل الجزيئات الصغيرة، وضربات بروتينات BER) على التحليل المعتمد على تلف الحمض النووي، وقد تم تطبيقه بنجاح في مختبرنا ^34,37.

1. تحضير الغطاء
   1. انقع 20 × 20 مم في الديثيل الإيثر لمدة 20 دقيقة في وعاء زجاجي داخل غطاء أبخرة.
      ملاحظة: استخدم غطاء أبخرة عند العمل مع الإيثر ثنائي الإيثيل بسبب قابليته للاشتعال والمخاطر المحتملة.
   2. قم بإزالة الإيثر الثنائي إيثيل وغسل الغطاء بتركيزات متناقصة من الإيثانول [100٪، 70٪، 50٪، ثم 0٪ (ddH₂O)].
   3. أزل الماء ونقع الغطاء لمدة 20 دقيقة في 1 نيتروفن HCl مع تحريك لطيف.
   4. أزل HCl واغسل الغطاء 3 مرات باستخدام ddH₂0.
   5. تخزين الغطاء في 70٪ إيثانول عند 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.
2. طلاء الخلايا
   1. ضع طبقتين من الغطاء المعقم بحجم 20 × 20 مم في طبق زراعة خلايا بحجم 60 مم بجانب بعضهما البعض. حضر أكبر عدد ممكن من الأطباق المطلوبة للتجربة. تأكد من تبخر كل الإيثانول قبل إضافة أي خلايا إلى الطبق الذي يحتوي على الأغطية. اغسل أي بقايا إيثانول بإضافة PBS معقم إلى الطبق لمدة 10–15 دقيقة؛ قم بإزالة PBS قبل زرع الخلايا.
   2. 200,000 خلية معبرة عن LivePAR لكل طبق زراعة خلية. دع الخلايا 24–36 ساعة تلتصق بالكافيرزليب، وتكييف الوسط، وتبدأ في التكاثر (النمو).
3. استحث بؤر PAR
   1. تعرض الخلايا المعبرة عن LivePAR ل 100 ميكرومولار NRH، و10 ميكرومولار PARGi، و10 ميكرومولار MNNG أو 40 ميكرومولار tBuOOH. بالإضافة إلى ذلك، لاختبار تكوين PAR المعتمد على PARP1/PARP2، تم تثبيط PARP1/PARP2 بإضافة 10 ميكرومولار PARPi. أضف المركبات مباشرة إلى الوسط الذي يحتوي على الخلايا على الأغطية وقم بتدوير الوسط بلطف في أطباق زراعة الخلايا لتوزيع المركبات. حضن الصحون بحجم 60 مم على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 60–90 دقيقة.
      ملاحظة: يستخدم NRH لضمان توفر مستويات كافية من NAD⁺ الخلوي لتحقيق تحليل PARylation ^33,46,47 المثالي بوساطة PARP1/PARP2. يستخدم PARGi لمنع تفكيك سلاسل PAR التي يتم توليفها بواسطة PARP1/PARP2 بواسطة PARG. يستخدم MNNG أو tBuOOH لتحفيز تعديلات قواعد الحمض النووي لبدء BER، مما يؤدي إلى تنشيط PARP1/PARP2. يستخدم PARPi للتأكد من أن الإشارة (البؤريس) تنتج عن تفعيل PARP1/PARP2.
4. تثبيت الخلايا وتركيب الغطاء
   1. أزل الوسط واغسل ب PBS.
      ملاحظة: الغسل مرة أو مرتين باستخدام PBS مهم، لأن الوسط المستخدم لزراعة الخلايا يحتوي على تركيز عال من بروتينات المصل. الغسل باستخدام PBS يزيل أيضا أي بقايا من MNNG أو tBuOOH لا تزال موجودة في الوسائط.
   2. بادئة في فورمالديهايد بنسبة 4٪ في PBS لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام PBS.
   3. الإصلاح بإضافة 3 مل من الميثانول البارد (-20 ^درجة مئوية): الأسيتون (7:3) إلى الخلايا. ضع الصحون على درجة حرارة -20 ^{درجة مئوية} لمدة 9 دقائق.
   4. إزالة الميثانول: الأسيتون. اغسل ثلاث مرات باستخدام PBS.
   5. مداومة 15 ميكرولتر من وسط مضاد للتلاشي يحتوي على DAPI على شرائح الزجاج. ثبت الغطاء بلطف في مكان الوسط المثبت بحيث تكون الخلايا متجهة للداخل، لتقليل الفقاعات.
   6. قم بتوسط، وتثبيت، وإغلاق جانبي الغطاء على الشريحة الزجاجية عن طريق تطبيق كمية صغيرة من مينا الطلاء العلوي الشفاف على جانبي الغطاء الداخلي. ضع الشرائح في الظلام لتجف طبقة الطلاء العلوي من الظفر (~10 دقائق). خزن الشرائح في الظلام عند 4 درجات مئوية حتى تكون جاهزة للتصوير.
5. الخلايا التصويرية
   1. صور جميع الشرائح على الأقل 10 مرات بتكبير 63× باستخدام مجهر كونفوكلي. اكتشف بؤر PAR باستخدام ليزر 488 نانومتر والتلوين النووي (DAPI) باستخدام ليزر 405 نانومتر (على سبيل المثال، انظر الشكل 2).
6. تحليل الصور الكونفوكلية
   1. أنشئ ملف نصي يحتوي على النص التالي واسمه "LivePAR_Macro". يسهل هذا الماكرو القياس "التلقائي" لتركيزات PAR في نوى الخلايا المعبرة عن LivePAR:
      macro "التلوين الإيجابي DAPI [1]" {
      tit=getTitle();
      run("تكرار...", "title=DAPI duplicate");
      selectWindow("DAPI")
      run("8-بت");
      run("قنوات منقسمة")
      selectWindow("C2-"+"DAPI");
      close();
      selectWindow("C1-"+"DAPI");
      run("ضباب غاوسي...", "سيغما=3");
      setAutoThreshold("الافتراضي");
      run("Make Binary");
      run("Inverse")
      اركض ("املأ الثقوب")
      run("حوض الماء")
      run("تحليل الجسيمات...", "الحجم=50.00-الدائرية اللانهائية=0.00-1.00 show=مخططات إضافة استبعاد تضمين in_situ");
      إعادة الاسم ("DAPI_"+tit)؛
      selectWindow("DAPI_"+tit);
      close();
      }
      macro "PAR [2]" {
      setBatchMode (صحيح)؛
      run("8-بت");
      t=getTitle();
      run("تكرار...", "title=GB1 duplicate");
      run("تكرار...", "title=GB20 duplicate");
      selectWindow("GB20")
      run("ضباب غاوسي...", "نصف القطر = 20 مكدس");
      selectWindow ("GB1");
      run ("ضباب غاوسي...", "نصف القطر = 1 stack");
      imageCalculator("طرح إنشاء مكدس"، "GB1"، "GB20");
      selectWindow ("GB1");
      close();
      selectWindow("GB20");
      close();
      selectWindow("نتيجة GB1");
      إعادة الاسم ("Blank_GB1-GB20_"+t)؛
      العنوان = getTitle();
      run("قنوات منقسمة")
      selectWindow("C1-"+title)؛
      close();
      selectWindow("C2-"+title)؛
      يمكن تغيير قيمة setThreshold(90,255) //قيمة 90 لمراعاة التغيرات التجريبية
      run("تحليل الجسيمات...", "الحجم = 0.00-200 الدائرية = 0.00-1.00 عرض = تلخيص الأقنعة");
      قريب ("C2-"+عنوان)؛
      selectWindow("قناع C2-"+title);
      إغلاق ();
      setBatchMode (خطأ);
      }
   2. قم بتحميل وتثبيت ImageJ على الكمبيوتر (https://imagej.net/ij/download.html).
   3. افتح ImageJ وثبت الماكرو (ملف نصي: LivePAR_Macro) بالنقر على الإضافات | ماكروز | ثبت.
   4. افتح جميع ملفات الكونفوكال في ImageJ وحفظها ك *.tif ملفات للحفاظ على الملفات الأصلية.
   5. افتح مستند جدول بيانات واحفظه ك [date]_[Cell Line]_Foci تحليل.
   6. حلل ملف *.tif تلو الآخر. اضغط 1 للعثور على النوى؛ عند فتح نافذة بعنوان مدير ROI ، اختر جميع الإدخالات في النافذة واضغط إضافة لتغطية منطقة النوى فوق الصورة الأصلية. احذف النوى التي تم تحديدها بشكل خاطئ. ارسم النواة باستخدام أداة الاختيار الحر واضغط 2 لقياس بؤرة PAR.
      ملاحظة: لا تدرج النوى التي ليست داخل الإطار بالكامل.
   7. اختر كل نواة في مدير العائد على الاستثمار واحدة تلو الأخرى واضغط على 2. سيظهر عد يشير إلى عدد البؤر داخل النواة المختارة. بمجرد تقييم البؤر في جميع أنوية الملف، انسخ والصق المعلومات في مستند الجدول المفتوح.
   8. كرر الخطوات 3.6.6 و3.6.7 مع جميع ملفات *.tif.
   9. ارسم بؤر PAR لكل نواة في البرنامج المختار (على سبيل المثال، انظر الشكل 3).

Results

يمكن توليد الخلايا التي تعبر عن مسبار LivePAR عن طريق إنتاج فيروس لينتي يشفر بروتين اندماج RNF146(100-182)-EGFP (الشكل 1A). يمكن تقييم الخلايا بعد التعبير العابر لمدة تصل إلى أسبوعين بعد النقل أو كخطوط خلاوية مستقرة بعد الانتقاء في الهيغروميسين (الشكل 1B)¹. بعد معالجة السم الجيني، يمكن رؤية بؤر PAR الناتجة عن تلف الحمض النووي داخل النواة، وبعد تثبيتها، يمكن تصويرها بواسطة مجهر فلوري كونفوكالي (

Discussion

تم تطوير اختبار LivePAR للكشف عن مواقع تلف الحمض النووي الجيني النووي حيث يقوم PARP1/PARP2 بتخليق سلاسل PAR بنشاط. لتحقيق ذلك، تم دمج جزء من RNF146 يشفر مجال WWE (الأحماض الأمينية 100–182) مع EGFP ^1,2,3,37. مجسات PAR إضافية وصفناها تشفر EGFP الملتحمة مع بقايا الأحماض الأمينية من 1 إلى 166 من DTX4، وبقايا الأحماض الأمينية من 22 إلى 112 من PARP11، والأحماض الأمين...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
<قوي>كواشف، مواد كيميائية، وببتيدات
0.45 وميكرو؛ m مرشحات دورابور ستيريفليب	سيغما-ألدرتش	كات# SE1M003M00
أغطية المجهر 20 × 20 مم	ثيرمو فيشر العلمي	القط# 22-170-371
الأسيتون	ثيرمو فيشر العلمي	القط# A18-1
أطباق زراعة الخلايا، 100 مم	VWR	التصنيف# 25382-166
أطباق زراعة الخلايا، 60 مم	فيشر ساينتيفك	كات# 430166
ألواح زراعة الخلايا، 6-بئر	VWR	التصنيف# 62406-161
الكريوفيالات، 2 مل	VWR	التصنيف# 89499-722
الإيثر ثنائي إيثيل	ثيرمو فيشر العلمي	القط# 60-29-7
ثنائي ميثيل كبريتات	ثيرمو فيشر العلمي	كات# BP231-1
فلاتر معقمة قابلة للاستخدام مرة واحدة، 0.45 وميكرو؛ m	سيغما-ألدرتش	كات# SE1M003M00
DMEM	كورنينغ	Cat# 15-017-CV
إيثانول، 200 درجة	مختبرات ديكون	Cat# 2701
شرائح المجهر الزجاجي	ثيرمو فيشر العلمي	القط# 12-544-4
مصل البقر الجيني المعطل بالحرارة	أتلانتا بيولوجيكس	Cat# S11150
حمض الهيدروكلوريك	ثيرمو فيشر العلمي	Cat# A144-212
هيغروميسين	ثيرمو فيشر العلمي	كات# 10687010
مناديل كيم الكبيرة	كيمبرلي-كلارك	القط# 34256
مجموعة لينتي-إكس جوستيكس بلس	تاكارا	الرقم المصنف #631280
الميثانول	ثيرمو فيشر العلمي	Cat# A452SK-4
منغ	مولبورت	كات# N493990
NRH (1-[(2R,3R,4S,5R)-3,4-ديهيدروكسي-5-(هيدروكسي ميثيل) رباعي هيدروفوران-2-yl]-4H-بيريدين-3-كربوكساميد)	ماري ميغو أو  شركة نوكيم ساينسز إنك
مثبط PARG (PDD00017273)	سيغما-ألدرتش	كات# SML1781
مثبط PARPi (فيليباريب، ABT-888)	ميدكيم إكسبريس	كات# HY-10129
البنسلين/الستربتوميسين	جيبكو	القط# 15140-122
بوليبرين	سيغما-ألدرتش	كات# TR-1003-G
tBuOOH	ثيرمو فيشر العلمي	كات# 180345000
TransIT-x2 (كاشف الترانسفيكشن)	ميروس	كات# MIR-6006
ترايتون-X100	VWR	القط# 0694
تريبسين-إيدتا	ثيرمو فيشر العلمي	Cat# 25200-056
فيكتاكيلد (H-1000) وسيط تثبيت مضاد للتلاشي	ثيرمو فيشر العلمي	كات# NC1695563
Cell Lines
293-FT	ثيرمو فيشر العلمي	Cat# R70007
(مشتقة من خلايا كلوية جنينية بشرية تحولت باستخدام مستضد SV40 T الكبير)	ثيرمو فيشر العلمي	Cat# R70007
LN428	هدية سخية من	لا يوجد
(خط خلايا ورم الأرومة الدبقية البشرية)	الدكتور إيان بولاك (جامعة بيتسبرغ)	لا يوجد
RPE-1	ATCC	كات# CRL-4000
(خلايا ظهارية لصبغة الشبكية البشرية الخالية من hTERT)	ATCC	كات# CRL-4000
U2OS	ATCC	كات# HTB-96
(خط خلايا الساركوما العظمية البشرية)	ATCC	كات# HTB-96
الحمض النووي المؤتلف
pMDLg/pRRE	مخزون المختبر# 253	أدجين، كات# 12251
pRSV-Rev	مخزون المختبر# 254	أدجين، كات# 12253
pMD2.G	مخزون المختبر# 252	أدجين، كات# 12259
pLV-EF1A-LivePAR-Hygro (LivePAR هو مجال WWE ل RNF146، بقايا الأحماض الأمينية 100-182، ملتصقة ب EGFP؛ يحتوي على شريط مقاومة للهجرومايسين)	مخزون المختبر # 1727	أدجين، كات# 176063
البرمجيات والخوارزميات
Adobe Illustrator (لتحضير الأشكال)	أنظمة أدوبي	الإصدار 2024
منشور جراف باد	جراف باد	الإصدار 10.5.0  (ماك أو إس إكس)
ImageJ	المعاهد الوطنية للصحة	https://imagej.net/ij/download.html