مقالة منهجية

بروتوكول محسن لعدوى الكانديدا ألبيكانس في شميدتي البحر الأبيض المتوسط لدراسة مسببات الفطريات والدفاع عن المضيف

DOI:

10.3791/70500

⸱

أبريل 17, 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular and Cell Biology, University of California, Merced, 2Quantitative and Systems Biology Graduate Program, University of California, Merced, 3Health Sciences Research Institute, University of California, Merced, 4Center for Cellular and Biomolecular Machines, University of California, Merced

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوفر هذا البروتوكول دليلا مفصلا ومميزا لاستخدام السطحية Schmidtea Mediterranean كنموذج لدراسة التفاعلات بين المضيف والممرض أثناء العدوى الفطرية. تعتمد الطريقة على الإجراء السابق لإصابة البلاناريين بممرض الفطر البشري كانديدا ألبيكانس، مقدمة إرشادات مفصلة لتعزيز قابلية التكرار والاتساق التجريبي.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

كانديدا ألبكانس هو ممرض فطري انتهازي شائع يستعمر معظم البشر بشكل غير أعراضي. على الرغم من أن الاضطراب عادة ما يكون حميدا، إلا أن الخلل الحيوي الناتج عن استخدام المضادات الحيوية أو ضعف المناعة أو اضطراب الحاجز الطلائي يمكن أن يسبب نمو الفطريات الزائدة والعدوى، بدءا من مرض مخاطي سطحي إلى داء الكانديديا الجهازي المهدد للحياة. هناك حاجة إلى نماذج جديدة للعدوى قبل السريرية لتشريح مرض C. albicans في الجسم الحي عبر مراحل عدوى مميزة وبنتائج مضيفة قابلة للقياس مختلفة. تم تأسيس كلب شميدتي البحر الأبيض المتوسط السطحي سابقا كمضيف لللافقاريات لدراسة تفاعلات المضيف مع الممرض أثناء عدوى C. albicans . تعتمد S. mediterranea بالكامل على آليات المناعة الفطرية المحفوظة القادرة على التغلب على العدوى بالكائنات الدقيقة الممرضة، بما في ذلك البكتيريا والفطريات. تجعل قدرة البلاناريان المذهلة على التجدد ومجموعات الخلايا الجذعية المتاحة لهذا الكائن نموذجا قابلا للتطبيق لتحليل الاستجابات المناعية المبكرة، وإصلاح الأنسجة، وإزالة مسببات الأمراض في الجسم الحي. يدعم هذا النموذج التحليل المتزامن لضراوة الفطريات واستجابات النسخ للمضيف، مما يوفر رؤى قيمة حول ديناميكيات العدوى. هنا، تم تقديم بروتوكول محدث مع تعديلات مفصلة، وإجراءات موحدة، وخطوات محسنة لإصابة S. mediterranea بعدوى C. albicans ، مصمم لتعزيز قابلية التكاثر وتمكين الدراسات المنهجية لتكوين الفطريات والدفاع عن المضيف.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

كانديدا ألبيكانس هو ممرض فطري انتهازي شائع يستعمر 50-70٪ من البشر بدون أعراض 1,2,3. عادة، يمكن أن ينمو الكنديودا ألبيكانس غير الضار تحت ظروف مثل اختلال توازن الميكروبيوت، استخدام المضادات الحيوية، تثبيط المناعة، اضطراب الحاجز الطلائي، أو وجود الأجهزة الطبية، مما يؤدي إلى أمراض تتراوح من التهابات مخاطية سطحية إلى داء المبحية الجهازيالمهدد للحياة 4,5. في الأشخاص ذوي المناعة الضعيفة – بما في ذلك المصابين بفيروس نقص المناعة البشرية/الإيدز، والمرضى الذين يخضعون للعلاج الكيميائي أو العلاجات المثبطة للمناعة، أو المصابين بأمراض مزمنة، أو في وحدات العناية المركزة – يمكن أن تتجاوز معدلات الوفيات 70٪، مما يبرز العبء الصحي العام الكبير الناتج عن داء المبيضات الغازية 6,7,8. على مستوى العالم، تؤثر العدوى الفطرية الغازية على أكثر من 6.5 مليون شخص سنويا، حيث تتجاوز تكاليف الرعاية الصحية المباشرة في الولايات المتحدة وحدها 8 مليارات دولار سنويا للعدوى المرتبطة بالكانديدا، 9.10. على الرغم من توفر العلاجات المضادة للفطريات، إلا أن معدلات المرضا والوفيات المرتبطة بعدوى كانديدا ألبيكانس بقيت إلى حد كبير دون تغيير لعقود، مما يبرز الحاجة الملحة لفهم أفضل لتفاعلات المضيف والممرض في الأمراض الفطرية.

يستخدم C. albicans مجموعة متنوعة من عوامل الضراوة التي تدعم الاستيطان والاستمرار والتسبب في الأمراض عبر مجموعة من البيئات المضيفة. تشمل هذه الالتصاقات بأنسجة المضيف، التهرب المناعي، إعادة تشكيل جدار الخلية، إفراز الإنزيمات المائية، اللدونة الشكلية (مورفولوجيا)، وتكوين الغشاء الحيوي 11,12,13,14,15,16. تسمح هذه الصفات مجتمعة لكورديودا ألبيكانس بالتكيف مع مجالات العائل المتنوعة، وتنظيم الاستجابات المناعية، ومقاومة العلاجات المضادة للفطريات 16,17,18,19,20,21. توضيح كيفية تشكيل هذه العمليات لنتائج العدوى – بما في ذلك مراضة المضيف، والوفيات، وإزالة مسببات الأمراض – أمر ضروري لتطوير استراتيجيات وقائية وعلاجية أكثر فعالية.

للتحقيق في ديناميكيات الممرض بين المضيف والمرض، أنشأنا نظاما نموذجيا يستخدم السطحية Schmidtea Mediterranean كعميل 22,23,24. يعمل هذا النموذج كمنصة متعددة الاستخدامات لدراسة استجابة المضيف متعدد الأنظمة للعدوى الفطرية، مستفيدا من طريقة عدوى تعتمد على النقع تتيح التعرض المتزامن للحيوانات لعدوى C. albicans. يقدم القسم التالي إجراءات محدثة خطوة بخطوة تحسن هذا البروتوكول، وتحسن قابلية التكرار، وتسهل التنفيذ المتسق عبر المختبرات.

البلاناريون هم لافقاريات تعيش بحرية ذات قدرة تجددية استثنائية، قادرة على تعويض الأنسجة التي فقدتها بسبب الإصابة أو العدوى بسرعة25. يفتقرون إلى جهاز مناعي متكيف ويعتمدون كليا على دفاعات فطرية محفوظة – بما في ذلك مستقبلات التعرف على الأنماط، الببتيدات المضادة للميكروبات، إفراز المخاط، والخلايا البلعمية – لإزالة مسببات الأمراض البكتيرية والفطرية خلال الأيام26، 27، 28، 29. نظرا لأن المناعة الفطرية تمثل خط الدفاع الأول عبر حقيقيات النواة ولا تزال غير مدروسة خارج أنظمة الثدييات27، فإن البلاناريين يقدمون فرصة لفحص هذه العمليات في الجسم الحي بدقة خلوية وجزيئات. تعتمد قدرتها التجديدية على الخلايا الجذعية متعددة القدرات البالغة، المعروفة باسم الخلايا الجديدة، والتي تشكل حوالي 30٪ من الخلايا البالغة وتساهم في التعافي بعد العدوى23.30. تجعل هذه الميزات من S. mediterranea نموذجا قويا لتشريح ضراوة الممرضين ودفاعهم عن المضيف على المقاييس الجينية والخلوية والأنسجة والكائنات الحية، مما يمكننا من معالجة أسئلة غالبا ما يصعب دراستها باستخدام الأنظمة الثديية التقليدية.

بالإضافة إلى ذلك،يدعم حجم البلانارينز الصغير (عادة بضعة مليمترات)، وتكلفته المنخفضة، وسهولة صيانتهم، تجارب واسعة النطاق مع تجنب القيود المالية والأخلاقية والتنظيمية المتأصلة في نماذج الفقاريات. مثل C. albicans، يتميز S. mediterranea بقدرة جينومية على التحكم، مع جينوم متسلسل ومشروح بالكامل، ويدعم تقنيات جزيئية وخلوية متقدمة – بما في ذلك التحليل الجزئي والنسيج، والكيمياء المناعية عالية الدقة والنسيج، وتداخل RNA القوي (RNAi)32,33,34,35,36,37,38. تمكن هذه الأدوات من التحليل المتوازي لاستجابات المضيف والممرض أثناء العدوى.

تم استخدام عدة نماذج بديلة قبل سريرية لدراسة العدوى الفطرية. توفر المضيفات اللافقارية مثل جاليريا ميلونيلا (عثة الشمع)، Caenorhabditis elegans (الدودة المستديرة)، وذبابة الفاكهة (ذبابة الفاكهة)، بالإضافة إلى الفقاريات دانيو ريريو (سمك الزرد)، كل منها يوفر مزايا تجريبية مميزة لكنه يعاني من قيود ملحوظة. غالبا ما تعتمد هذه الأنظمة على البقاء كنقطة نهاية أساسية لأن العدوى تسبب موت العائل بسرعة، مما يمنع التقييم التفصيلي للمراضة، والتعافي، والاستجابات متعددة الأنظمة – وهي ميزات يلتقطها النموذج السطحي بسهولة.

نماذج الثدييات مثل Mus musculus (فأر)، Rattus norvegicus (الجرذ)، Oryctolagus cuniculus (أرنب)، وCavia porcellus (خنزير غينيا) تعيد بشكل أوثق فسيولوجيا الإنسان لكنها محدودة بالتكاليف العالية، وصغر حجم المجموعات، والمتطلبات الأخلاقية والتنظيمية، وتحدي التمييز بين الاستجابات المناعية الفطرية والتكيفية. علاوة على ذلك، ركزت عقود من أبحاث مسببات الفطريات في الفئران بشكل رئيسي على العدوى الجهازية في المراحل المتأخرة 39,40,41,42,43، وغالبا ما تتجاهل الأحداث المبكرة مثل اضطراب الحاجز الظهاري والنمو المخاطي الزائد – وهي أكثر الطرق شيوعا لبدء المرض الفطري لدى البشر 44,45,46.

لذلك، فإن دراسة التفاعلات بين المضيف والممرض أمر ضروري لفهم العمليات البيولوجية التي تكمن وراء ضراوة الفطريات، ودفاع المضيف، وتطور المرض. تمثل العدوى الفطرية الغازية تهديدا عالميا متصاعدا، حيث تظهر عدة أنواع الآن مقاومة لجميع فئات الأدوية المضادة للفطريات الرئيسية. يقدر أن أكثر من مليار شخص يتأثرون بالعدوى الفطرية، وعوامل مثل تغير المناخ، والاستخدام الواسع لمضادات الميكروبات، وتزايد عدد الأفراد ذوي المناعة الضعيفة تسرع من ظهور مسببات الأمراض المقاومة للفطريات 47,48,49,50. فهم كيفية استعمار الفطريات الممرضة وتفاعلها مع مضيفيها أمر بالغ الأهمية لتطوير استراتيجيات وقائية وعلاجية جديدة.

فيما يلي يصف بروتوكول العدوى الجهازية المعدل والموحى لتفاعلات S. mediterranea-C. albicans، مصمم لتعزيز قابلية التكاثر وتمكين التحقيق المنهجي في مسببات الفطريات وآليات الدفاع عن المضيف. تم اتباع البروتوكول الأصلي في المنشورات السابقة22، 23، 24. يلخص الجدول 1 التحديثات الرئيسية المدمجة في هذا الإصدار المعدل، بما في ذلك تحسينات إجراءات التطعيم الفطري، تقليل حجم الآبار، تحديد معايير إدراج الحيوانات، تحديد الجرعات المعدية والقاتلة، وتوصيات محدثة لتربية الحيوانات. يوفر هذا السير توجيهات مفصلة لزراعة C. albicans، وإصابة البلاناريات من خلال التعرض للنقع، وتقييم ضراوة الفطريات واستجابات المضيف باستخدام قراءات نوعية وكمية تحت ظروف الأعراض والجرعات القاتلة (الشكل 1). تتضمن الإجراءات المحسنة المعروضة هنا متغيرات تم تحديدها تجريبيا كمحددات رئيسية لديناميكيات العدوى ونتائج المضيف، مما يحسن قابلية التكرار وتمكين التقييم المنهجي لتفاعلات المضيف والممرض.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يبني هذا البروتوكول على الطرق السابقة 22,23,24 ويضع إجراءات واضحة وموحدة لتعزيز قابلية التكرار وتمكين التحقيق المنهجي في مسببات الفطريات واستجابات المضيف في جنوب البحر الأبيض المتوسط. تشمل التحسينات الرئيسية للبروتوكول معايير محددة مسبقا لإدراج الحيوانات واستبعادها، وتحضير ميكروبي موحد، وتقييم شامل لنقاط نهاية المضيف.

يجب تنفيذ جميع الإجراءات باستخدام تقنيات السلامة البيولوجية المعقمة والمعقمة من المستوى الثاني المناسبة. يجب ارتداء معدات الحماية الشخصية القياسية للمختبرات (PPE)، بما في ذلك القفازات، ومعطف المختبر، والأحذية المغلقة للأصابع، في جميع الأوقات. تم إجراء الإجراءات المتعلقة ب S. Mediterranean السطحي وفقا للإرشادات المؤسسية للاستخدام الأخلاقي لللافقاريات.

يتم تلخيص جميع تحسينات البروتوكول في الجدول 1. جميع المواد الكيميائية، والمعدات الحيوية، والوسائط والمخازن، ووصفات الصبغ المناعي مدرجة في جدول المواد والجدول 2.
ملاحظة: يجب إجراء جميع الإجراءات المتعلقة بنموذج الحيوانات اللافقارية S. mediterranea لضمان أعلى معايير رفاهية الحيوان. يجب أن يتم إسكان S. Mediterranean في ظروف مثلى تحاكي المواطن الطبيعية. يجب تصميم التجارب لتقليل الألم أو الضيق المحتمل لضمان المعاملة الأخلاقية طوال فترة الدراسة.

1. زراعة الفطريات

  1. معلومات عن سلالة C. albicans
    1. تم استخدام السلالة القياسية SN25051 في المختبر من C. albicans كسلالة برية لجميع التجارب، وهي متاحة للجمهور في مركز الوراثة الفطرية (http://www.fgsc.net/). تم اشتقاق SN250 من العزل السريري SC5314، الذي تم جمعه أصلا من مزرعة دم لمريض مصاب بداء الكانديدياالمنتشر 52.
    2. سلالات C. albicans تحافظ على مخزون 25٪ من الجلسرون عند −80°C.
  2. زراعة سلالات C. albicans للعدوى
    1. خطوط من مخزون التبريد
      1. باستخدام أداة تطبيق معقمة، قم بوضع السلالة المطلوبة من مخزون −80°C على صفائح أجار مستخلص الخميرة (YPD) (1٪ مستخلص خميرة، 2٪ بيبتون، 2٪ جلوكوز؛ pH 6.8).
      2. حضن بشكل ثابت عند 30°C لمدة 72 ساعة.
  3. تحضير الثقافات الليلية
    1. تلقيح مستعمرة واحدة في 4 مل من سائل YPD في أنابيب زراعة زجاجية بوروسيليكات معقمة (18 مم × 150 مم) باستخدام عصا تطبيق معقمة.
    2. تضمين أنبوب تحكم سلبي يحتوي على YPD غير ملقح تحت نفس الظروف.
    3. غط الأنابيب بشكل فضفاض للسماح بالتهوية وحضانة الأنابيب طوال الليل (16 ساعة) عند 30 درجة مئوية مع هز عند 220 دورة في الدقيقة (مداري) في حاضنة اهتزاز.
      ملاحظة: إذا حدث نمو ميكروبي في المنطقة السلبية، أوقف التجربة وأعد البدء باستخدام وسائط جديدة وتقنية تعقيم.
  4. حصاد وغسل الخلايا
    1. باستخدام تقنية المعهر، نقل المزارع إلى أنابيب الطرد المركزي الموسومة بسعة 15 مل.
    2. زراعة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند ~3,000 × جرام لإزالة الحبيبات.
    3. أزل السوبرنيتانت بحذر دون إزعاج الكريات.
    4. أعد تعليق الحبيبات في ماء بلاناري (راجع الجدول 2 للتركيب) بحجم يساوي حجم YPD المستخدم.
    5. اخلط جيدا عن طريق الدوامة.
    6. كرر الخطوات 1.4.2-1.4.4 مرتين إضافيتين لإزالة وسائط النمو تماما.
    7. بعد الغسل النهائي، أعد تعليق حبيبة الخلية في ماء بلاناري نقي عن طريق الدوامة.
  5. قياس تركيز الخلايا في C. albicans
    1. التخفيف لقياس التوزيع الزائد
      1. جهز ثلاثة أنابيب طرد مركزية دقيقة معقمة بسعة 1.7 مل مع تخفيف بنسبة 1:20 (50 ميكرولتر ثقافة + 950 ميكرولتر ماء مستوي) أو عامل تخفيف بديل مختار. اخلط جيدا.
      2. جهز أنبوبا فارغا يحتوي على 1000 ميكرولتر ماء سطحي.
    2. القياس الطيفي الضوئي
      1. اضبط مقياس الطيف الفوتومي لقياس الكثافة البصرية عند 600 نانومتر (OD600).
      2. قم بفرغ مقياس الطيف بالماء السطحي.
      3. قسOD 600 لكل عينة مخففة وسجل قيم.
      4. متوسط القراءات الثلاث واضرب في عامل التخفيف لتحديد مقدارOD 600 لثقافة المخزون. حول OD600 إلى تركيز الخلايا.
        ملاحظة: يجب تحديد عامل تحويل الكثافة البصرية تجريبيا لكل مقياس طيفي. استنادا إلى الأجهزة المحددة المستخدمة، فإن OD600 من 1 يعادل تقريبا 2 ×10خلايا ألبيكانس 7 C. albicans /mL 53.
  6. تحديد تركيزات اللقاح التجريبية
    1. جهز تركيز اللقاح المطلوب لكل حالة تجريبية.
      ملاحظة: قم بإجراء ثلاث نسخ بيولوجية على الأقل لتحديد الجرعة الفعالة لمستعمرة البلاناريين، خصوصا لنقاط النهاية المعدية أو القاتلة. يتم توفير حساب تمثيلي لتحضير تركيزات اللقاح المعدية والقاتلة في الملف التكميلي 1.

2. أنواع البلانارية وصيانتها

  1. أنواع البلاناريين وصيانتها
    1. استخدم خط الاستنساخ اللاجنسي CIW4 من S . Mediterranean السطحي في جميع التجارب.
    2. الحفاظ على مستعمرات البلانارية في حاويات بلاستيكية شفافة من نوع الغذاء تحتوي على 1,500–2,000 مل من 1× ماء البلاناريان.
    3. احتفظ بالحاويات في الظلام عند 20 درجة مئوية مع إغلاق الأغطية بشكل فضفاض للسماح بتبادل الغاز.
    4. لا تعالج المنشطات بالمضادات الحيوية.
  2. صيانة المستعمرة وتغذية المستعمرة
    1. أطعم المستعمرات هريس كبد البقر المصفاة الطازج مرة واحدة في الأسبوع.
    2. نظف الحاويات مرتين في الأسبوع.
    3. حافظ على كثافة البلاناريين عند 200–400 حيوان في الحاوية. تظهر الأعمال السابقة إجراءات مفصلة حول تحضير المستعمرة والصيانة طويلة الأمد31.
  3. التكييف قبل التجربة
    1. قبل الإصابة التجريبية، يتم تجويع البلاناريين لمدة 7–12 يوما لتوحيد الظروف الأيضية والحجم.
    2. استخدم مجموعات من 5–10 حيوانات لكل بئر لكل حالة تجريبية. ضمان عدد متساو من الحيوانات عبر جميع الظروف، بما في ذلك الضوابط الإيجابية والسلبية.
  4. اختيار حجم الحيوانات
    1. اختر البلاناريات بطول تقارب 5 مم، أي ~5 × 10 5خلايا مضيفة لكل حيوان54.
    2. تجنب استخدام البلاناريات الصغيرة التي تقل عن 5 ملم، لأن الحيوانات بهذا الحجم قد تشمل أفرادا يعانون من بلاستيمات أو نمو غير مكتمل قد ينتج عنه نتائج غير متسقة.
    3. تجنب استخدام البلاناريات التي يزيد حجمها عن 5 مم، لأن الحيوانات الأكبر أقل ملاءمة للتلوين المناعي بالفلورة.
    4. استخدم البلاناريات بطول حوالي 5 مم عند تحديد حالات الجرعة المعدية (ID50) والجرعة القاتلة (LD50).
      ملاحظة: لتسهيل اختيار الحجم المتسق، اطبع شبكة مرجعية بمقاس 5 مم × 5 مم وضعها داخل غلاف بلاستيكي تحت الحاوية الشفافة المسطحة. تأكد من أن البلاناريين ممتدون بالكامل قبل قياس الطول.
  5. معايير الصحة والشمول
    1. خطوة حاسمة: فحص جميع البلاناريات تحت المجهر المجسم قبل الاستخدام.
    2. استبعد الحيوانات التي تعرضت لأضرار أو إصابة ظاهرة، بما في ذلك الحالات التالية:
      1. وجود البلاستيمات (الأنسجة التي تفتقر إلى التصبغ) أو تطور تصبغي غير مكتمل.
      2. تصبغ غير طبيعي، مثل المناطق الداكنة بشكل ملحوظ.
      3. نسيج مفقود أو تالف.
      4. آفات أو ندوب.
      5. جروح مفتوحة.
      6. تشوهات أو تشوهات شكلية.
      7. أي حالة مزمنة أو غير ملتئمة.
    3. استبعد الحيوانات التي لديها اضطرابات في النمو.
      1. مناطق الرأس أو الذيل المتفرعة أو المكررة.
      2. شكل الجسم المشوه أو غير المتماثل.
      3. عدد غير صحيح من المستقبلات الضوئية (زوج ثنائي واحد فقط مقبول).
      4. البلعوم في وضع غير طبيعي.
      5. خلل في الأدبية يؤدي إلى ضعف الحركة أو سلوك الانزلاق غير المنتظم.
    4. ادرج فقط الحيوانات التي يبلغ طولها حوالي 5 مم، ومكتملة النمو، وخالية من الإصابات أو التشوهات الظاهرة.
  6. تحضير الطبق
    1. انقل البلاناريات الصحية التي تستوفي جميع معايير الإدراج إلى 2 مل من مياه البلاناريين الطازجة لكل بئر في صفيحة بوليسترين ذات 6 آبار غير معالجة بزراعة الأنسجة.
      ملاحظة: نقل الحيوانات قبل يوم واحد من العدوى للسماح بالتكيف مع البيئة الجديدة وكثافة السكان.
    2. تعيين الآبار للظروف التجريبية التالية:
      1. الضوابط السلبية: حيوانات غير مصابة أو معالجة تجريبية.
      2. الضوابط الإيجابية: الحيوانات المصابة بنوع C. albicans البري.
    3. قم بإزالة واستبدال كل المياه ب 2 مل من مياه البلاناريان العذبة لضمان التساوي عبر الآبار.

3. إعداد العدوى

  1. جهز اللقاح (انظر الملف التكميلي 1 لحساب العينة)
    1. باستخدام تقنية المطهر، قم بإزالة كل الماء من لوحة الستة آبار بلطف عن طريق إمالة اللوح نحو المستخدم.
    2. أضف الحجم المحسوب من الماء السطحي إلى كل بئر.
      ملاحظة: تقدم بئر تلو الآخر لمنع جفاف الحيوانات.
    3. أضف الحجم المحسوب لزراعة C. albicans إلى كل بئر.
      ملاحظة: تجنب تعريض الحيوانات للهواء لفترات طويلة، لأن التجفيف قد يسبب توترا ويغير نتائج العدوى.
  2. ظروف حضانة الصفائح التجريبية
    1. ضع اللوحة المقطرة ذات الستة آبار المحصنة في مكان مظلم وثابت في درجة حرارة الغرفة.
    2. حافظ على صفائح تجريبية في منطقة منفصلة عن مستعمرات البلاناريين غير المصابة لمنع التلوث المتبادل.
    3. سجل تاريخ ووقت التطعيم (المعين كوقت 0 ساعة).
      ملاحظة: تجنب المناطق ذات الحركة العالية أو المعرضة للاهتزازات (مثل الأدراج، أسطح الأجهزة، أو المقاعد المزدحمة)، لأن الحركة قد تجهد الحيوانات وتسبب نتائج مربكة.
    4. احتضن البلاناريات مع C. albicans لمدة تصل إلى 72 ساعة، حسب النقطة النهائية المطلوبة.
  3. إعادة تعليق الخلايا الفطرية
    1. في كل نقطة زمنية، أعد تعليق خلايا C. albicans المستقرة بلطف دون إزعاج البلاناريين.
      ملاحظة: الوقت (ساعات [ساعة] أو أيام [د] بعد العدوى) يشير إلى الوقت المنقضي منذ التعرض الأولي (الوقت 0).
    2. بعد 24 ساعة من الإصابة (HPI)
      1. باستخدام ماصة نقل معقمة بسعة 3 مل، أمال اللوح قليلا نحو المستخدم.
      2. استنشق ماء البلاناريا وقم بتصرفه بلطف في منطقة خالية من الحيوانات لخلط طبقة الفطريات المتراكبة.
      3. كرر هذه الخطوة 5–10 مرات لكل بئر لتفكيك الطبقة الفطرية الراسخة، وتجنب الاتصال المباشر مع البلاناريين.
      4. راقب ترسب الفطريات على خلفية داكنة للحصول على أفضل رؤية قبل وبعد خطوات الإعادة.
      5. أعد تعليق آبار التحكم غير المصابة تحت نفس الظروف.
    3. عند 48 حصانا في البوصة
      1. كرر إجراء إعادة التعليق المذكور أعلاه.
      2. قم بجميع خطوات إعادة التعليق خلال ± ساعة واحدة من النقطة الزمنية المحددة.
  4. نهاية التعريض (72 حصان لكل بوصة)
    1. عند 72 حصان في البوصة، انقل البلاناريات بلطف إلى صفيحة جديدة مكونة من 6 آبار تحتوي على 2 مل من مياه البلاناريين العذبة لكل بئر.
    2. تقليل نقل الزراعة الفطرية باستخدام أصغر حجم ممكن من السائل.
    3. بمجرد نقل الحيوانات، قم بإزالة كل الماء واستبدله بمياه عريشة عذبة.
      ملاحظة: تعامل مع الحيوانات وأي شظايا نسيج بلطف لتجنب الإصابة الميكانيكية أو الضغط الإضافي.

4. تقييم نقطة النهاية للمضيف

  1. تسجيل نتائج المضيف
    1. ابدأ تقييم نتائج المضيف بعد يوم واحد من العدوى (DPI) واستمر يوميا حتى نقطة التجربة المرغوبة.
    2. قم بقياس ضرر المضيف باستخدام نظام التقييم المعياري من 0 إلى 3 (الشكل 2).
      الدرجة 0: لا تغيير عن الضوابط غير المصابين (بصحة جيدة، بدون أعراض).
      النتيجة 1: أعراض خفيفة.
      النتيجة 2: أعراض شديدة.
      النتيجة 3: الموت.
  2. معايير تقييم أعراض المضيف
    1. الدرجة 0 (بدون أعراض):
      1. حدد الحيوانات التي تظهر شكلا طبيعيا، وتصبغا، وسلوكا، واستجابة طبيعية دون تغييرات ملحوظة مقارنة بالحيوانات غير المصابة.
    2. النتيجة 1 (خفيفة):
      امنح درجة خفيفة عندما يلاحظ أحد الأعراض التالية مقارنة بالعناصر الضابطة التي لا تظهر عليها أعراض.
      1. انخفاض سرعة الحركة أو سلوك انزلاقي غير طبيعي.
      2. فقدان جزئي أو كامل للاستجابة الضوئية.
      3. انقباضات جسدية مستمرة أو متكررة.
      4. صبغة غير طبيعية أو غير منتظمة (مناطق أفتح أو أغمق).
      5. تراجع نسيج الرأس أو الذيل.
    3. النتيجة 2 (شديدة):
      امنح درجة شديدة عندما تظهر واحدة أو أكثر من الأعراض التالية بينما تبقى الحيوانات على قيد الحياة.
      1. غشاب العين أو فقدان إحدى العينين أو كلتيهما.
      2. فقدان كامل للرأس أو تلف ملحوظ في الأنسجة الأمامية.
      3. فقدان كبير للأنسجة في منطقة ما قبل البلعوم.
      4. التجزئة إلى مناطق متعددة من الجسم (الرأسية، البلعومية، أو الأجزاء الخلفية).
      5. جروح مفتوحة مع أو بدون إفراز مخاطي أو تسرب داخلي.
      6. تحلل جزئي للأنسجة يؤدي إلى فقدان السلامة الهيكلية.
      7. وضعية الجسم "على شكل C"، الشلل، أو ضعف شديد في الحركة.
    4. النتيجة 3 (الموت):
      حدد حالات الوفاة بناء على واحد أو أكثر من المعايير التالية.
      1. تحلل كامل للأنسجة أو الحيوان بالكامل.
      2. فقدان كامل للاستجابة للمحفزات.
      3. فشل في التعافي أو التجدد.
        ملاحظة: يوفر الشكل 2 صورا تمثيلية وميزات تعريفية لكل درجة لضمان اتساق تصنيف النمط الظاهري للمضيف.

5. تحديد بقاء المضيف بعد التعرض للفطريات

  1. عند 3 نقاط في البوصة الدقيقة، انقل البلاناريين بلطف إلى صفيحة جديدة مكونة من 6 آبار تحتوي على 2 مل من مياه البلاناريا العذبة لكل بئر، لتجنب نقل الزراعة الفطرية المتبقية.
  2. راقب الحيوانات باستخدام المجهر الضوئي (≥ هدف 10x).
  3. سجل نتائج المضيف باستخدام ورقة التقييم الموحدة المقدمة في الملف التكميلي 2.
  4. تحديد الحيوانات الحية
    1. حدد الحيوانات الحية بناء على واحد أو أكثر من المعايير التالية.
      1. ضوئي سلبي.
      2. الاستجابة لاضطراب ماصة النقل اللطيف.
      3. هيكل الجسم سليم.
      4. تثبيت مستقر على اللوحة.
  5. تحديد الحيوانات الميتة
    1. حدد الحيوانات الميتة بناء على واحد أو أكثر من المعايير التالية.
      1. تحلل أو تفكك كامل (حطام متبقي فقط).
      2. الجسم شفاف أو ممزق.
      3. غياب الحركة أو الاستجابة للمحفزات.
      4. فشل التجدد (غياب تكوين بلاستما).
  6. إزالة الحيوانات الميتة
    1. إزالة الحيوانات الميتة والحطام فقط بعد تأكيد عدم صلاحيتها تحت المجهر.
    2. خطوة حاسمة: إزالة الحيوانات الميتة فورا لمنع التلوث المتبادل أو تغيير قياسات البقاء.
    3. إذا بقي الحطام أو الفطريات، انقل الحيوانات الناجية مرة أخرى إلى صفيحة جديدة تحتوي على ماء بلاناري نظيف لمنع إعادة البذر أو تكوين الأغشية الحيوية.
      ملاحظة: ضع ألواح ذات 6 آبار فوق خلفية داكنة أثناء الفحص البصري لتحسين التباين وتسهيل تقييم النمط الظاهري.

6. تقييم عبء الفطريات

  1. قياس وحدة تشكيل المستعمرة (CFU)
    1. في نقاط العدوى المطلوبة، اجمع البلاناريين (5–10 حيوانات لكل حالة يوميا). يشمل ضوابط غير مصابة/تجريبية مطابقة وضوابط مصابة من النوع البري.
    2. اشطف الآبار بلطف مرتين بمقدار 2 مل من ماء البلاناريين الطازج لإزالة خلايا C. albicans الخلفية.
    3. انقل الأنابيب المستوية إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيق المعقمة والمعنونة بحجم 1.7 مل أو 5.0 مل وإزالة كل المياه المتبقية.
    4. أضف 300 ميكرولتر من الماء العذب البلاناري إلى كل أنبوب.
    5. توحيد الحيوانات باستخدام مدقة معقمة حتى لا يتبقى أي شظايا كبيرة (حوالي 30–45 ثانية).
    6. قم بتخفيفات متسلسلة للمتجانس (مثل 1:10، 1:100، 1:100).
    7. طبق من 100 إلى 200 ميكرولتر من كل تخفيف على صفائح الأجار YPD مع 50 ميكروغرام/مل لكل من الأمبيسيلين، الريفامبيسين، الستربتومايسين، والنيوميسين. قم بالتوزيع بشكل متساو باستخدام خرز زجاجي معقم أو موزع خلايا معقمة.
    8. اترك الصفائح تبقى منتصبة على سطح الطاولة لمدة 5–10 دقائق بعد الطلاء للسماح بامتصاص السائل إلى الأجار.
    9. جهز أطباق ثلاثية لكل تخفيف وحالة حالة.
    10. حضانة الصفائح عند 30 درجة مئوية لمدة 48 ساعة.
    11. احسب وحدات التخفيفات وضربها في عامل التخفيف.
    12. تطبيع قيم CFU إلى عدد البلاناريين لحساب متوسط CFU لكل بلاناري لكل شرط. على سبيل المثال، إذا لوحظت 100 مستعمرة عند تخفيف بنسبة 10× من متجانس مكون من 5 حيوانات، فإن القيمة المحسوبة هي 200 وحدة CFU لكل حيوان.

7. صبغة مضادة للكانديدا بالتوهج المناعي

  1. اعتبارات عامة للصبغ
    1. قم بجميع الخطوات بتأرجح مداري لطيف (100–140 دورة في الدقيقة) في درجة حرارة الغرفة ما لم يذكر خلاف ذلك. راجع الملف التكميلي 1 لتفاصيل الأجسام المضادة ومصادر الكواشف.
      تحذير: الفورمالديهايد، وكبريتات الصوديوم الدودسيل (SDS)، وبيروكسيد الهيدروجين هي مواد كيميائية خطرة ويجب التعامل معها وفقا للوائح السلامة المؤسسية. الفورمالديهايد سام ويصنف كمسرطن؛ SDS مصدر إزعاج؛ وبيروكسيد الهيدروجين مؤكسد قوي قد يسبب الحروق. ارتد معدات الحماية الشخصية المناسبة (معطف مختبر، قفازات نيتريل، أحذية مغلقة الأصابع، ونظارات أمان). قم بإجراء إجراءات تتضمن كواشف متطايرة في غطاء أبخرة كيميائي معتمد والتخلص من النفايات وفقا لإرشادات الصحة والسلامة البيئية المؤسسية.
  2. جمع عينات
    1. اجمع الحيوانات من كل حالة ونقطة زمنية تجريبية.
    2. انقل الحيوانات إلى قوارير وميض موسومة بحجم 20 مل تحتوي على 2 مل من الماء السطحي.
    3. أزل كل السائل، اشطف مرة واحدة ب 2 مل من ماء البلاناريان الطازج، ثم كل سائل مرة أخرى.
  3. التثبيت والنفاذية
    1. التضحية بالحيوانات التي تحتوي على 7.5٪ من N-أستيل سيستين (NAC) في 1× PBS لمدة 3 دقائق.
    2. قم بإزالة المحلول وتثبيت الحيوانات في فورمالديهايد 4٪ مع 0.3٪ PBSTx لمدة 15 دقيقة.
    3. اغسل عينات مرتين باستخدام 1× PBS.
    4. نفخ عينات في 1٪ SDS لمدة 15 دقيقة.
    5. اغسل العينات ثلاث مرات باستخدام 1× PBS.
  4. التبييض
    1. يتم أخذ عينات من المبيض في بيروكسيد هيدروجين بنسبة 6٪ في 1× PBS تحت ضوء LED ساطع لمدة 4–12 ساعة.
      ملاحظة: إذا لم يكن بالإمكان البدء في التبييض فورا، خزن عينات ثابتة في 1× PBS على درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد أو جفف العينات في 100٪ ميثانول للتخزين طويل الأمد.
  5. الحجب وحضانة الأجسام المضادة
    1. نقل الحيوانات إلى ألواح بسعة 24 بئرا تحتوي على 1× PBS.
    2. حجب الارتباط غير النوعي في 2.5٪ من PBS-TB (PBS يحتوي على Triton X-100 وألبومين مصل البقر) لمدة 4 ساعات في درجة حرارة الغرفة أو 8 ساعات عند 4 درجات مئوية.
    3. حضن عينات بالجسم المضاد الأساسي المضاد للكانديدا (1:500 في PBS-TB) لمدة 4 ساعات في درجة حرارة الغرفة أو 8 ساعات عند 4 درجات مئوية.
    4. إزالة الأجسام المضادة الأولية وغسل عينات ثماني مرات كل 20 دقيقة مع 0.3٪ PBSTx (إجمالي ~2.5 ساعة).
    5. حضن العينات باستخدام الجسم المضاد الثانوي المضاد للأرانب المقترن بأليكسا-568 (1:800 في PBS-TB) لمدة 4 ساعات في درجة حرارة الغرفة أو 8 ساعات عند 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: حماية العينات من الضوء لمنع التبييض الضوئي. يمكن إعادة استخدام محاليل الأجسام المضادة.
    6. أزل الأجسام المضادة الثانوية واغسل العينات ثماني مرات كل 20 دقيقة مع 0.3٪ PBSTx.
  6. تركيب الشريحة الاختياري
    1. ضع الحيوانات على شريحة مجهرية بحيث تكون جميع الحيوانات موجهة للأمام للأعلى.
    2. أزل الماء الزائد باستخدام ماصة نقل.
    3. امتصاص السائل المتبقي من الحواف بحذر باستخدام حافة منشفة ورقية.
    4. أضف 150–175 ميكرولتر من وسط تثبيت جيلفاتول (الجدول 2 للتكوين) بشكل انخفاضي حتى تغطى الحيوانات بالكامل.
    5. ضع غطاء غطاء بعناية فوق العينة، مع تجنب فقاعات الهواء.
    6. اترك جيلفاتول ليتصلب لمدة ساعتين على الأقل قبل التصوير.
    7. ضع الزحاليق في مكان بارد ومظلم للحفاظ عليها على المدى الطويل.
  7. التصوير
    1. عينات الصور باستخدام الإثارة الصفراء-الخضراء (~578 نانومتر) وملاحظة الانبعاث البرتقالي-الأحمر (~603 نانومتر).
    2. استخدم عدسة موضوعية 2x لتصور أنماط تلوين الحيوانات بالكامل.

8. استكشاف الأخطاء

  1. إذا كانت نتائج العدوى غير متسقة، قم بإجراء منحنى تعرية الجرعة باستخدام النوع البري SN250 أو سلالة أساسية أخرى بزيادات من 5–10 × 107 خلايا/مل.
  2. قم بإجراء ثلاث نسخ بيولوجية على الأقل تحتوي على 5–10 حيوانات في كل مجموعة.
  3. تضمين مجموعات ضابطة سلبية وإيجابية لتحديد المشكلات المحتملة مثل التلوث المتبادل، فشل تقنية المعقم، مشاكل قابلية الإجهاد، أو ضعف صحة الحيوانات الأساسية.
  4. بعد إكمال تجربة تعرير الجرعة، يقوم الجمع بتكرار لتحديد متوسط البقاء لكل مجموعة.
  5. تحليل فروق البقاء باستخدام تحليل الترتيب اللوغاريتمي لمانتل–كوكس الزوجي.
  6. استخدم تحليل البقاء على قيد الحياة بنظام كابلان–ماير لتقييم الفروق في زمن الموت بين السلالات أو العلاجات.
  7. بالنسبة للحالات تحت القاتلة أو الجرعة المعدية، حلل نتائج المضيف الأعراضية (مثل الأنماط الظاهرية الخفيفة أو الشديدة أو استعمار الفطريات) بدلا من البقاء على قيد الحياة.
  8. قارن استجابات المضيف عبر مجموعات الجرعات لتحديد نطاق الجرعات المعدية أو القاتلة المناسب للتجارب اللاحقة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تقديم بروتوكول محدث لإصابة العلويات المستوية ب C. albicans (الشكل 1) وقياس نتائج العائل بشكل منهجي (الشكل 2). يدعم هذا السير العملي المحسن تقييما قويا لمعايير العدوى المتعددة، بما في ذلك المراضة (شدة المرض الأعراضي)، والبقاء (الفتك)، وعبء الفطريات (CFUs)، والديناميكيات المكانية والزمانية لاستعمار مسببات الأمراض (التلطين المناعي الفلوري). على عكس معظم نماذج عدوى اللافقاريات، التي تقدم بشكل أساسي قراءات ثنائية بين الحي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

إن تغيير الجرعة المعدية من النوع البري C. albicans ينتج فروقا قابلة للتكرار تعتمد على الجرعة في المراضة في S. mediterranea، مما يبرز حساسية النموذج للتقييم الكمي لضراوة الفطريات. يحدد هذا البروتوكول استراتيجيات لتحديد الجرعات المعدية والقاتلة الأساسية داخل مستعمرات البلاناريين التي تديرها المختبرات ويعرض معايير لتأكيد نجاح العدوى الجهازية عبر النقع، مع دمج تقييم صحة المضيف مع قياسات عبء الفطريات باستخدام قياس الكمية وصبغ المناعة.

من خلال التح...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

سي. جي. إن. هو أحد مؤسسي شركة BioSynesis, Inc.، وهي شركة تطور التشخيصات والعلاجات لعدوى الأغشية الحيوية. جميع المؤلفين الآخرين يعلنون عدم وجود مصالح متنافسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يشكر المؤلفون جميع أعضاء مختبرات نوبيل وأوفييدو وهيرنداي على مناقشاتهم العميقة حول نموذج عدوى S. mediterranea-C. albicans، ويشكرون إيدلويس فيستر على إدارة المختبر وصيانة البلانار. وقد دعم هذا العمل من قبل المعهد الوطني للصحة (NIH) وجوائز المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة (NIGMS) R35GM156045 و R35GM124594 لجمعية C.J.N.، و R35GM158501 R01GM132753 إلى N.J.O. وقد دعمت عائلة كامانغار هذا العمل أيضا من خلال كرسي موقود ل C.J.N. وقد دعمت المؤسسة الوطنية للعلوم والتكنولوجيا (CREST) من مركز الآلات الخلوية والجزيئية الحيوية (CCBM) ومركز التميز البحثي في العلوم والتكنولوجيا (CREST) تحت الجوائز NSF-HRD-1547848 وNSF-EES-2112675.

لم يكن للممولين أي دور في تصميم الدراسة، أو جمع البيانات وتحليلها، أو تفسيرها، أو كتابة المخطوطة، أو قرار نشر النتائج. تعترف N.M.S. باستخدام ChatGPT للمساعدة في تحرير المخطوطة (التحقق من الإملاء، والقواعد، والتنسيق، وبنية الجمل).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
أنابيب الطرد المركزي الدقيق سعة 1.7 ملVWR/جينمات490004-436-BOXOF500واضح، صندوق من 500 قطعة
قوارير ساينتيلون بسعة 20 ملفيشر ساينتيفك12-100-006زجاجات زجاجية شفافة لتلوين المناعة
ألواح البوليسترين غير المعالجة ذات 24 بئرفيشر ساينتيفك08-772-51المناعة
أنابيب الطرد المركزي الدقيق بحجم 5.0 مل  إبندورف/سيغما ألدريتشEP0030119487-200EAواضح، صندوق من 200 قطعة
ألواح البوليسترين غير المعالجة ذات 6 آبارفيشر ساينتيفك08-772-49اختبارات العدوى
أغارVWR89405-066الدرجة البكتيرية لوسط YPD
عصي التطبيقصيد حراري/بيوريتان22-029-491C. albicans الزراعة
بيورياندرBioRender Inc.لا يوجدبرنامج تصميم الأشكال المستخدم لإنشاء الرسوم التخطيطية
كلوريد الكالسيوم (CaCl2)سيغما-ألدرتشC5080-500Gماء بلاناري/1x مونتجو&يومل; أملاح C
كانديدا ألبيكانس الأجسام المضادة متعددة النسيرات المضادة للأرنب، IgGثيرمو فيشرPA1-27158المناعة
أنابيب الطرد المركزيVWR89039-664C. albicans الحصاد
أنابيب الزراعة زجاج بوروسيليكات 18x150ممVWR47729-583C. albicans الزراعة
الكوفيتفيشر ساينتيفك14-955-127لقياس الكثافة الضوئية للثقافات
ديكستروز (D-جلوكوز)فيشر ساينتيفكD16-3وسيط YPD
الجلسرولفيشر ساينتيفكG33-4درجة علم الأحياء الجزيئي لإضافة مكمل لتخزين C. albicans 
أداة الرسوم البيانية وتصور البياناتGraphPad/Prismبرنامج إحصائي وأداة التمثيل البصري. Verison 10.6.1.
أداة الرسم البيانيRبرنامج إحصائي. Verison 4.4.3.
هزاز الحاضنةإبندورفEPM1282-0004-1EAنيو برونزويك إنوفا 44/44R فور<إم> C. albicans الزراعة
كلوريد المغنيسيوم (MgCl2)سيغماM8266-100Gللماء السطحي   (1x Montjuï؛ أملاح C)
كبريتات المغنيسيوم (MgSO4)سيغما-ألدرتشM7506-500Gللماء السطحي   (1x Montjuï؛ أملاح C)
شرائح المجهرVWR16004-368
المجهر متعدد التقريبنيكوننيكون AZ100 
N-أسيتيل-إل-سيستينسيغما ألدريتشA7250-50Gالمادة المخاطية والكاشف التضحية  التثبيت
بارامالديهايد، محلول بنسبة 16٪، درجة علم الأحياء الجزيئيعلوم المجهر الإلكتروني15710الكاشف الثابت
محرك بلايت بيسل اللاسلكيفيشر ساينتيفك12-141-361التجانس السطحي
الببتون، درجة بكتيريةHIMEDIA/VWR89129-480وسيط YPD
المدقاتفيشر ساينتيفك12-141-368حبيبات قابلة للتخلص من RNase لتوحيد البلاناريين
أطباق بيتري، 100 × 15 ممVWR25384-342
البولي (كحول الفينيل)سيغما-ألدرتشP-8136 لجيلفتول
كلوريد البوتاسيوم (KCl)سيغما لايف ساينسP9541-500Gمتوسط/مائي السطحي  (1x Montjuï؛ أملاح C)
مضاد الأجسام المضادة الثانوي لمضاد الأرنب الماعز، IgG، أليكسا فلور 568فيشر ساينتيفكA-11011المناعة
SN250مركز مخزون علم الوراثة الفطريةسلالة وايلدتايب C. albicans (https://www.fgsc.net/)
أزيد الصوديومفيشر ساينتيفكS227-100لجيلفتول
بيكربونات الصوديوم (NaHCO3)سيغما-ألدرتشS5761-1KGمتوسط/مائي السطحي  (1x Montjuï؛ أملاح C)
كلوريد الصوديوم (NaCl)سيغما لايف ساينسS3014-500Gمتوسط/مائي السطحي  (1x Montjuï؛ أملاح C)
مقياس الطيف الفوتونيأجيلينت26354مايكروبلايت BioTek Epoch 2 لقياس الكثافة البصرية
الحاضنة الثابتةفيشر ساينتيفك15-015-2634C. albicans culturing
ماصات النقلفيشر ساينتيفك13-711-9CMبيبيت متدرجة معقمة قابلة للتخلص مرة واحدة للبلاناريين المنتقلين
قاعدة تريسسيغما-ألدرتش252859لجيلفتول
مستخلص الخميرةثيرمو فيشر212750وسيط YPD

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Delavy, M., et al. Unveiling Candida albicans intestinal carriage in healthy volunteers: the role of micro- and mycobiota, diet, host genetics and immune response. Gut Microbes. 15 (2), 2287618(2023).
  2. Bays, D. J., Savage, H. P. Candida albicans gastrointestinal colonization resistance: a host-microbiome balancing act. Infect Immun. 93 (9), e0061024(2025).
  3. Nash, A. K., et al. The gut mycobiome of the Human Microbiome Project healthy cohort. Microbiome. 5 (1), 153(2017).
  4. Fróis-Martins, R., Lagler, J., LeibundGut-Landmann, S. Candida albicans virulence traits in commensalism and disease. Curr Clin Microbiol Rep. 11 (4), 231-240 (2024).
  5. Kumamoto, C. A., Gresnigt, M. S., Hube, B. The gut, the bad and the harmless: Candida albicans as a commensal and opportunistic pathogen in the intestine. Curr Opin Microbiol. 56, 7-15 (2020).
  6. Fisher, M. C., et al. Tackling the emerging threat of antifungal resistance to human health. Nat Rev Microbiol. 20 (9), 557-571 (2022).
  7. Gow, N. A. R., et al. The importance of antimicrobial resistance in medical mycology. Nat Commun. 13 (1), 5352(2022).
  8. Lockhart, S. R., Chowdhary, A., Gold, J. A. W. The rapid emergence of antifungal-resistant human-pathogenic fungi. Nat Rev Microbiol. 21 (12), 818-832 (2023).
  9. Denning, D. W. Global incidence and mortality of severe fungal disease. Lancet Infect Dis. 24 (7), e428-e438 (2024).
  10. Benedict, K., Jackson, B. R., Chiller, T., Beer, K. D. Estimation of direct healthcare costs of fungal diseases in the United States. Clin Infect Dis. 68 (11), 1791-1797 (2019).
  11. Gulati, M., Nobile, C. J. Candida albicans biofilms: development, regulation, and molecular mechanisms. Microbes Infect. 18 (5), 310-321 (2016).
  12. Nobile, C. J., Johnson, A. D. Candida albicans biofilms and human disease. Annu Rev Microbiol. 69 (1), 71-92 (2015).
  13. Höfs, S., Mogavero, S., Hube, B. Interaction of Candida albicans with host cells: virulence factors, host defense, escape strategies, and the microbiota. J Microbiol. 54 (3), 149-169 (2016).
  14. Talapko, J., et al. Candida albicans—the virulence factors and clinical manifestations of infection. J Fungi. 7 (2), 79(2021).
  15. Lopes, J. P., Lionakis, M. S. Pathogenesis and virulence of Candida albicans. Virulence. 13 (1), 89-121 (2022).
  16. Gaffar, N. R., Valand, N., Venkatraman Girija, U. Candidiasis: insights into virulence factors, complement evasion and antifungal drug resistance. Microorganisms. 13 (2), 272(2025).
  17. Xie, J., et al. White-opaque switching in natural MTLa/α isolates of Candida albicans: evolutionary implications for roles in host adaptation, pathogenesis, and sex. PLoS Biol. 11 (3), e1001525(2013).
  18. Costa-de-Oliveira, S., Rodrigues, A. G. Candida albicans antifungal resistance and tolerance in bloodstream infections: the triad yeast-host-antifungal. Microorganisms. 8 (2), 154(2020).
  19. Whaley, S. G., et al. Azole antifungal resistance in Candida albicans and emerging non-albicans Candida species. Front Microbiol. 7, 2173(2017).
  20. Marichal, P., et al. Contribution of mutations in the cytochrome P450 14α-demethylase to azole resistance in Candida albicans. Microbiology. 145 (10), 2701-2713 (1999).
  21. Lee, Y., Robbins, N., Cowen, L. E. Molecular mechanisms governing antifungal drug resistance. npj Antimicrob Resist. 1 (1), 5(2023).
  22. Maciel, E. I., Jiang, C., Barghouth, P. G., Nobile, C. J., Oviedo, N. J. The planarian Schmidtea mediterranea is a new model to study host-pathogen interactions during fungal infections. Dev Comp Immunol. 93, 18-27 (2019).
  23. Maciel, E. I., Valle Arevalo, A., Ziman, B., Nobile, C. J., Oviedo, N. J. Epithelial infection with Candida albicans elicits a multi-system response in planarians. Front Microbiol. 11, 629526(2021).
  24. Maciel, E. I., Valle Arevalo, A., Nobile, C. J., Oviedo, N. J. A planarian model system to study host-pathogen interactions. Methods Mol Biol. 2680, 231-244 (2023).
  25. Sánchez Alvarado, A. Planarian regeneration: its end is its beginning. Cell. 124 (2), 241-245 (2006).
  26. Sluys, R., Riutort, M. Planarian diversity and phylogeny. Methods Mol Biol. 1774, 1-56 (2018).
  27. Riera Romo, M., Pérez-Martínez, D., Castillo Ferrer, C. Innate immunity in vertebrates: an overview. Immunology. 148 (2), 125-139 (2016).
  28. Peiris, T. H., Hoyer, K. K., Oviedo, N. J. Innate immune system and tissue regeneration in planarians: an area ripe for exploration. Semin Immunol. 26 (4), 295-302 (2014).
  29. Kangale, L. J., Raoult, D., Fournier, P. E., Abnave, P., Ghigo, E. Planarians as an emerging model organism for investigating innate immune mechanisms. Front Cell Infect Microbiol. 11, 619081(2021).
  30. Karami, A., Tebyanian, H., Goodarzi, V., Shiri, S. Planarians: an in vivo model for regenerative medicine. Int J Stem Cells. 8 (2), 128-133 (2015).
  31. Oviedo, N. J., Nicolas, C. L., Adams, D. S., Levin, M. Establishing and maintaining a colony of planarians. Cold Spring Harb Protoc. 2008 (10), (2008).
  32. Ivanković, M., et al. A comparative analysis of planarian genomes reveals regulatory conservation in the face of rapid structural divergence. Nat Commun. 15, 8215(2024).
  33. Fincher, C. T., Wurtzel, O., De Hoog, T., Kravarik, K. M., Reddien, P. W. Cell type transcriptome atlas for the planarian Schmidtea mediterranea. Science. 360 (6391), eaaq1736(2018).
  34. Shibata, N., Agata, K. RNA interference in planarians: feeding and injection of synthetic dsRNA. Methods Mol Biol. 1774, 455-466 (2018).
  35. Rouhana, L., et al. RNA interference by feeding in vitro-synthesized double-stranded RNA to planarians: methodology and dynamics. Dev Dyn. 242 (6), 718-730 (2013).
  36. Winsor, L., Sluys, R. Basic histological techniques for planarians. Methods Mol Biol. 1774, 285-351 (2018).
  37. Lu, J., et al. 3D reconstruction of neuronal allometry and neuromuscular projections in asexual planarians using expansion tiling light sheet microscopy. eLife. 13, e101103(2025).
  38. Rink, J. C., Vu, H. T. K., Alvarado, A. S. The maintenance and regeneration of the planarian excretory system are regulated by EGFR signaling. Development. 138 (17), 3769-3780 (2011).
  39. Fajardo, P., Cuenda, A., Sanz-Ezquerro, J. J. A mouse model of candidiasis. Methods Mol Biol. 2321, 63-74 (2021).
  40. Singh, S., Singh, S., Kumar, A. Systemic Candida albicans infection in mice causes endogenous endophthalmitis via breaching the outer blood-retinal barrier. Microbiol Spectr. 10 (4), e01658-e01722 (2022).
  41. Spellberg, B., Ibrahim, A. S., Edwards, J. E., Filler, S. G. Mice with disseminated candidiasis die of progressive sepsis. J Infect Dis. 192 (2), 336-343 (2005).
  42. Andes, D. Use of an animal model of disseminated candidiasis in the evaluation of antifungal therapy. Methods Mol Biol. 118, 111-128 (2005).
  43. Spellberg, B., et al. Parenchymal organ, and not splenic, immunity correlates with host survival during disseminated candidiasis. Infect Immun. 71 (10), 5756-5764 (2003).
  44. Clinical overview of invasive candidiasis. , Centers for Disease Control and Prevention. Available at: https://www.cdc.gov/candidiasis/hcp/clinical-overview/index.html (2024).
  45. Kobayashi, G. S. Medical microbiology. , NCBI Bookshelf. Available at: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK8103/ (1996).
  46. Pappas, P. G., Lionakis, M. S., Arendrup, M. C., Ostrosky-Zeichner, L., Kullberg, B. J. Invasive candidiasis. Nat Rev Dis Primers. 4 (1), 18026(2018).
  47. Van Rhijn, N., Rhodes, J. Evolution of antifungal resistance in the environment. Nat Microbiol. 10 (8), 1804-1815 (2025).
  48. Brown, G. D., et al. The pathobiology of human fungal infections. Nat Rev Microbiol. 22 (11), 687-704 (2024).
  49. Osset-Trénor, P., Pascual-Ahuir, A., Proft, M. Fungal drug response and antimicrobial resistance. J Fungi. 9 (5), 565(2023).
  50. Yan, Z. Z., et al. Environmental microbiome, human fungal pathogens, and antimicrobial resistance. Trends Microbiol. 33 (1), 112-129 (2025).
  51. Homann, O. R., Dea, J., Noble, S. M., Johnson, A. D. A phenotypic profile of the Candida albicans regulatory network. PLoS Genet. 5 (12), e1000783(2009).
  52. Noble, S. M., French, S., Kohn, L. A., Chen, V., Johnson, A. D. Systematic screens of a Candida albicans homozygous deletion library decouple morphogenetic switching and pathogenicity. Nat Genet. 42 (7), 590-598 (2010).
  53. Gulati, M., et al. In Vitro Culturing and Screening of Candida albicans Biofilms. Current Protocols in Microbiology. 50 (1), e60(2018).
  54. Takeda, H., Nishimura, K., Agata, K. Planarians Maintain a Constant Ratio of Different Cell Types During Changes in Body Size by Using the Stem Cell System. Zoological Science. 26 (12), 805-813 (2009).
  55. Roberts-Galbraith, R. H. RNAi screening to assess tissue regeneration in planarians. Methods Mol Biol. 2450, 509-527 (2022).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة