يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

التوليد والتحليل النصي الأحادي الخلية لعضويات سرطان الخلايا الكبدية بعد العلاج الدوائي

495 مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/70511

⸱

مايو 26, 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Basic Medical Science, Guangzhou Medical University, 2Guangzhou Municipal and Guangdong Provincial Key Laboratory of Protein Modification and Degradation, Guangzhou Medical University, 3Affiliated Cancer Hospital and Institute, Guangzhou Medical University, 4The First Clinical School of Guangzhou Medical University, Guangzhou Medical University, 5Department of Obstetrics, Guangzhou Eighth People's Hospital, Guangzhou Medical University, 6Department of Pediatric Surgery, Guangzhou Institute of Pediatrics, Guangzhou Women and Children's Medical Center, Guangzhou Medical University

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

يوضح هذا البروتوكول طريقة مبسطة لتوليد عضويات سرطان الخلايا الكبدية، وتطبيق العلاج الدوائي، وإجراء تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية قبل وبعد العلاج لتوصيف التغيرات النساخة المرتبطة بالعلاج.

الملخص

يعد سرطان الخلايا الكبدية سببا رئيسيا للوفيات المرتبطة بالسرطان حول العالم، ويتميز بعدم التجانس الملحوظ داخل الورم، مما يساهم في استجابات علاجية متغيرة، وتكرار الورم، وتطور المرض. لذلك، فإن الفهم الأعمق لكيفية تغير خلايا الورم على المستوى النسخي قبل وبعد العلاج الدوائي ضروري لتحسين استراتيجيات العلاج. ومع ذلك، لا تزال سير العمل التجريبي العملي الذي يربط العلاج الدوائي القائم على العضوية مع التحليل الطبي المرجعي لخلية واحدة لاحقا محدودا. في هذه الدراسة، تم تطوير سير عمل موحد لتوليد عضويات سرطان الخلايا الكبدية، وتطبيق العلاج الدوائي المحدد، وإجراء تسلسل RNA بخلية واحدة على العينات التي تم جمعها قبل وبعد العلاج. يشمل البروتوكول إحياء وتوسيع العضوية العضوية، وتقييم جودة ما قبل العلاج، والتعرض للأدوية، وتحضير العضوية لتفكك الخلايا الواحدة، وبناء المكتبة، والتحليل المقارن الأساسي لبيانات النسخ الوحيد. يتم توفير احتياطات تقنية حيوية لتحسين قابلية التكرار وجودة العينة. يتيح هذا السير العمل توصيفا جنبا إلى جنب لتركيب الخلايا والتغيرات النسخية المرتبطة بالعلاج الدوائي في عضويات سرطان الخلايا الكبدية. البروتوكول قوي وقابل للتوسع وقابل للتكيف عبر أنظمة العضوية المختلفة، مما يوفر منصة عملية للتحقيق في تغيرات التعبير الجيني المرتبطة بالعلاج بدقة خلية واحدة.

المقدمة

سرطان الخلايا الكبدية (HCC) هو أكثر سرطان الكبد الأولي شيوعا لدى البالغين وسبب رئيسي للوفيات المرتبطة بالسرطان على مستوى العالم 1,2,3. نتيجته السريرية السيئة تعود إلى التباين الكبير داخل الأورام، مما يؤدي إلى مقاومة العلاج وتكرار المرض4. تشير دراسة حديثة إلى أن التنوع التطوري والمرونة في حالة الخلية التي تدفعها البرامج التحويلية الرئيسية مثل محور FOXM1/CEBPB تساهم في المقاومة العلاجية في HCC5. تسلط هذه النتائج الضوء على الحاجة لفهم كيفية تكيف تجمعات الخلايا الورمية وانتقالها بين الحالات تحت ضغط العلاج المستمر. ومع ذلك، فإن معظم النماذج ما قبل السريرية لا تلتقط بشكل كاف الطبيعة الديناميكية والمستمرة لهذه التحولات المرتبطة بالعلاج، مما يحد من التحقيق الميكانيكي لتكيف الورم والفشل العلاجي.

توفر الأعضاء المشتقة من المريض (PDOs) منصة مفيدة لهذا الغرض لأنها تحافظ على التغيرات الجينومية المهمة وتباين الخلايا للورم الأصلي6. يمكن الحفاظ على عضويات HCC في الزراعة طويلة الأمد مع الاحتفاظ بخصائص نسيجرئيسية 7، مما يجعلها مناسبة بشكل خاص لدراسات الاستجابة للعلاج. بالإضافة إلى ذلك، أظهرت الدراسات القائمة على الأورجينويدات جدوى استخدام عضويات سرطان الكبد في اختبار الأدوية ولالتقاط الفروق بين المرضى وداخل الورم في حساسية العلاج، مما يدعم قيمتها كنماذج ما قبل سريرية لأبحاث العلاج والاستجابة 8,9. ومع ذلك، لا تزال معظم الدراسات المعتمدة على الأدوية العضوية تعتمد بشكل أساسي على قياسات قابلية البقاء في نقطة النهاية أو تركز بشكل رئيسي على الاستجابات الظاهرية الكبيرة، مما يوفر معلومات محدودة فقط عن الاستجابات الخلوية غير المتجانسة والتغيرات النمطية المرتبطة بالعلاج. بالتوازي، يؤكد التطور السريع لاستراتيجيات علاجية قائمة على الحمض النووي الريبي لعلاج HCC الحاجة إلى أنظمة ما قبل سريرية يمكنها التنبؤ بدقة وتشريح استجابات العلاج بوضوح خلية واحدة10.

يتيح تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية (scRNA-seq) توصيفا عالي الدقة للتركيب الخلوي والحالات النسخية داخل النماذج العضوية11. عند تطبيقه على الأعضاء التي تم جمعها قبل وبعد العلاج، يمكن أن يكشف scRNA-seq عن تغيرات في التعبير الجيني، وتغيرات في تجمعات الخلايا، واستجابات غير متجانسة لا يتم التقاطها من خلال الاختبارات الجماعية. لذا يمثل هذا النهج استراتيجية عملية وقوية للتحقيق في إعادة تشكيل النسخ المرتبطة بالعلاج في عضويات HCC. ومع ذلك، لا يزال هناك سير عمل عملي وقابل للتكرار يدمج زراعة الخلايا العضوية في HCC، وعلاج الأدوية، وتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية قبل وبعد العلاج. يكون هذا السير أكثر فعالية عندما يتم الحفاظ على سلامة الأعضاء أثناء التعرض للدواء ويتم استرداد عدد كاف من الخلايا الحية لتحديد الخلايا الأحادية في المراحل النهائية. وكما هو الحال مع الأساليب الأخرى القائمة على العضوية العضوية، تشمل القيود المهمة عدم التمثيل الكامل لمكونات السترومال والأوعية الدموية والمناعة في البيئة الدقيقة للورم، بالإضافة إلى احتمال التحيز الانتقائي أثناء الزراعة المخبرية المطولة.

تم وصف سير عمل تجريبي متكامل لتوليد عضويات HCC، وتطبيق علاج دوائي محدد، ومعالجة عينات العضوية لتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية قبل وبعد العلاج. يشمل هذا السير إحياء وتوسيع العضوية العضوية، وتقييم جودة قبل العلاج، والتعرض المراقب للأدوية، وتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية في المراحل النهائية للعينات المتطابقة. يوفر هذا النهج إطارا عمليا للمقارنة، عند دقة الخلية الواحدة، التغيرات المرتبطة بالعلاج في تركيب الخلايا وبرامج التعبير الجيني في عضويات HCC.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تمت مراجعة الدراسات التي استخدمت أنسجة بشرية والموافقة عليها من قبل لجان المراجعة الأخلاقية للأبحاث في جامعة قوانغتشو الطبية (رقم الموافقة. GYZL-2024-KY31). تم إجراء جميع الإجراءات المتعلقة بالعينات البشرية وفقا للإرشادات المؤسسية للأبحاث البشرية. تم الحصول على موافقة مكتوبة ومستنيرة من جميع المرضى لاستخدام عيناتهم السريرية في البحث الطبي. المواد والكواشف والمعدات المستخدمة مدرجة في جدول المواد.

يشمل هذا السير استردادها وتوسيع عضويات سرطان الخلايا الكبدية المحجوزة بالتبريد، مع تعديلات طفيفة للاضطرابات العلاجية اللاحقة وتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية. الهدف هو توليد مزارع عضوية ذات جودة واتساق كافيين لتجارب علاج المخدرات اللاحقة12.

1. تأسيس وتوسيع العضوية المشتقة من مرضى HCC

  1. إذابة واستعادة العضويات المحفوظة بالتجميد
    1. التحضير قبل الإذابة
      1. سخن حمام الماء مسبقا إلى 37 درجة مئوية. قم بتسوية صفيحة ذات 24 بئر في حاضنة بدرجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة ساعة على الأقل قبل التقديم.
      2. جهز وسط زراعة عضوي كامل مسبقا واحتفظ بمستخلص الغشاء القاعدي (BME) على الثلج حتى الاستخدام. يتم توفير تركيب وسط الزراعة العضوية بالكامل في الجدول التكميلي 1.
    2. ذوبان الأورغانويدات
      1. قم بإزالة الكرويفيالات التي تحتوي على عضويات HCC المجمدة من تخزين النيتروجين السائل وضعها فورا في حمام ماء بزاوية 37 درجة مئوية.
      2. حرك القارورة بلطف وأوقف الذوبان عندما يبقى فقط بلورة ثلجية صغيرة.
    3. إزالة الواقي بالتجميد
      1. قم بعمل الماصة بلطف على التعليق المذاب مرة واحدة لإعادة تعليق المحتويات.
      2. انقل التعليق إلى أنبوب مخروطي بحجم 15 مل يحتوي على 3–5 مل من وسط زراعة العضوية الكامل.
      3. الطرد المركزي عند 300 × جرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. استنشق السوبرنت بعناية وتخلص منها دون إزعاج الحبيبة.
  2. تضمين وإعادة طلاء الأورغانويدات
    1. تحضير خليط الاسترداد
      1. أعد تعليق الحبيبة العضوية في وسط زراعة عضوي كامل. يتم توفير تركيب وسط الزراعة العضوية بالكامل في الجدول التكميلي 1.
      2. اخلط بلطف مع حجم مماثل من مادة BME الباردة جدا لإنتاج خليط التقديم.
        ملاحظة: حافظ على الخليط على الثلج لمنع البلمرة المبكرة.
    2. صفائح القباب العضوية
      1. توزيع 50 ميكرولتر من خليط المصفوفة العضوية في كل بئر من صفيحة 24 بئر مدفأة مسبقا.
      2. احتضن عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة للسماح بتصلب المصفوفة.
      3. أضف 500 ميكرولتر من وسط الزراعة العضوية الكامل مع 20 ميكرومولار Y-27632 لكل بئر على طول جدار البئر.
        ملاحظة: حدد استخدام Y-27632 في أول يومين إلى ثلاثة بعد الذوبان أو المرور. تأكد من بقاء كل قبة مضغوطة ومثبتة في قاع البئر، دون أن تنتشر للخارج.
  3. زراعة الأورغانويد والتوسع
    1. ظروف زراعة التعافي
      1. حافظ على العضويات عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
      2. استخدم وسط يحتوي على 20 ميكرومولار Y-27632 خلال أول 2–3 أيام بعد الإذابة.
    2. استبدال الوسط
      1. استبدل وسيط الزراعة كل 3-4 أيام باستخدام الشفط اللطيف.
      2. أضف وسط جديد على طول جدار كل بئر لتجنب تعطيل قباب المصفوفة.
      3. حافظ على نفس جدول استبدال الوسط عبر جميع الآبار ضمن نفس التجربة.
    3. مراقبة النمو
      1. راقب استعادة وتمدد الأورجينويد باستخدام مجهر ذو المجال الساطع مع إعدادات تصوير متسقة.
      2. سجل صورا تمثيلية في نقاط زمنية محددة أثناء التعافي والتوسع.
      3. تأكيد الاسترداد الناجح عندما تبقى معظم الهياكل سليمة، وتظهر العضويات شكلا دائريا إلى بيضاويا مع حدود ناعمة، ويلاحظ توسع تدريجي مع مرور الوقت، وتوجد حطام أو هياكل منهارة قليلة.
      4. استبعد الآبار التي تحتوي على أقل من 10 عضويات سليمة من التحليل الكمي اللاحق.
    4. معايير التمرير والتوسع
      1. تلاحظ عضويات المرور بعد التمدد المستقر.
      2. تأكيد التوسع المستقر من خلال زيادة قابلة للتكرار في حجم الأعضاء أو المساحة الكلية مع الحفاظ على الشكل.
      3. استخدم معايير متسقة لفترات التصوير والتكبير والشمول عبر التجارب.
      4. توليد منحنيات نمو تمثيلية بناء على مساحة أو أعداد العضوية لتأكيد الاستقرار.
    5. معايير التجارب اللاحقة
      1. استخدم خطوط عضوية تظهر نموا ثلاثي الأبعاد مستقرا، ولا تظهر أي تلوث أو انهيار واسع، وتوفر إنتاجا كافيا للظروف التجريبية المتوازية.
      2. حافظ على الزراعة لمدة لا تقل عن 7–10 أيام بعد الذوبان أو حتى اكتمال التعافي ودورة تمدد واحدة.
      3. تقدم فقط خطوط العضوية التي تظهر مورفولوجيا متسقة عبر آبار مكررة.

2. تحضير الأورجينويدات للاضطراب العلاجي

  1. تقييم جودة ما قبل العلاج
    1. التقييم القائم على الشكل
      1. تأكد من أن العضويات مستديرة إلى بيضاوية في الشكل.
      2. تأكد من أن العضويات تظهر حدودا ناعمة ومحددة جيدا.
      3. تأكد من وجود حطام خلوي بسيط داخل القبة.
      4. استبعد الثقافات التي تعاني من تجزئة واسعة، أو تلومن داكن، أو انهيار واسع، أو تلوث واضح.
    2. تقييم حالة التوسع
      1. استخدم فقط الزراعة العضوية التي اكتملت التعافي ودخلت في مرحلة التوسع المستقر.
      2. أكد التكبير التدريجي مع مرور الوقت.
      3. تأكد من الشكل المتسق عبر الآبار المتكررة.
  2. إعادة طلاء الأعضاء لعلاج المخدرات
    1. استعادة العضويات من المصفوفة
      1. قم بإذابة القباب العضوية على الجليد باستخدام 1 مل من محلول استعادة الخلايا البارد المثلج لكل بئر لمدة 15–20 دقيقة.
      2. قم بعمل المزهرة بلطف كل 5 دقائق أثناء الحضانة.
      3. قم بجهاز الطرد المركزي في نظام التعليق المستخرج عند 300 × جرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
      4. أعد تعليق الحبيبة في وسط زراعة العضوية الكامل.
    2. التوحيد القياسي قبل إعادة الطلاء
      1. توحيد عبء العضوية الابتدائية عبر الآبار قبل العلاج بالإدواء.
      2. تحديد عدد الخلايا الصالح بعد الانفصال الجزئي عندما يكون ذلك ممكنا.
      3. تطبيع العينات إلى نفس عدد الخلايا المدخلة لكل بئر.
      4. تضم تقريبا 1000–5000 خلية صالحة لكل بئر في صيغة 24 بئرا.
      5. إذا لم يتم العد المباشر للخلايا، فيتم التطبيع بضمان وجود عدد مماثل من الأعضاء السليمة شكليا لكل بئر وتوزيع حجم مماثل عبر المجموعات.
      6. سجل العدد العضوي الأولي والشكل الأساسي لكل منها قبل العلاج بفترة طويلة.
      7. استخدم معايير الإدراج واستراتيجية الطلاء المتطابقة في جميع الآبار ضمن نفس التجربة.
    3. إعادة الطلاء لعلاج المخدرات
      1. امزج العضويات المستخرجة مع مصفوفة أغشية القاعدة الباردة كالثلج بتركيز نهائي بين 30٪–50٪.
      2. قم بتوزيع 50 ميكرولتر من القباب في كل بئر من صفيحة تحتوي على 24 بئرا.
      3. حضن عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة للسماح بالبلمرة.
      4. أضف 500 ميكرولتر من الزراعة العضوية الكاملة لكل بئر على طول جدار البئر.
        ملاحظة: تأكد من بقاء كل قبة مضغوطة ومثبتة في قاع البئر، دون أن تنتشر للخارج. استخدم نفس حجم القبة وتركيز المصفوفة عبر جميع الآبار ضمن نفس التجربة.
  3. التعافي قبل علاج المخدرات
    1. التعافي بعد إعادة الطلاء
      1. اسمح للعضويات بالتعافي طوال الليل تحت ظروف الزراعة القياسية.
      2. ابدأ العلاج فقط بعد إعادة تثبيت الشكل السليم داخل القباب المعاد تطليقها.
    2. معايير الدخول للعلاج بالمخدرات
      1. ابدأ العلاج بالأدوية فقط عندما تبقى الأعضاء سليمة بعد إعادة الطلاء، ولا يوجد انهيار واسع أو حطام زائد، ويكون عبء العضوية متقاربا عبر الآبار.
      2. سجل صور الحقل الساطع الأساسية لجميع المجموعات التجريبية قبل العلاج.
      3. حافظ على نفس عبء العضوية الابتدائية، ووقت التعافي بعد إعادة الطبق، ووقت بدء العلاج في جميع الآبار المراقبة والمعالجة.
  4. اعتبارات السلامة
    1. قم بجميع الإجراءات المتعلقة بعضويات مشتقة من الإنسان باستخدام معدات الحماية الشخصية المناسبة وممارسات السلامة البيولوجية.
    2. تعامل مع مواد التفكك الإنزيمي بعناية لتجنب التعرض للجلد أو العين.
    3. التخلص من النفايات البيولوجية السائلة والصلبة وفقا للوائح السلامة البيولوجية المؤسسية.

3. العلاج الدوائي لعضويات HCC

  1. تحضير وعلاج الأدوية
    1. تحضير الأدوية
      1. حضر محلول لينفاتينيب في DMSO وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
      2. قم بتخفيف محلول المخزون في وسط زراعة مسخن مسبقا قبل الاستخدام مباشرة إلى تركيز العمل المحدد مسبقا.
      3. حافظ على تركيز DMSO النهائي المتطابق في جميع الآبار (≤ 0.1٪).
      4. جهز كمية كافية لضمان حجم المعالجة النهائي المتساوي في كل بئر.
    2. علاج المخدرات
      1. أضف وسط يحتوي على اللينفاتينيب (20 ميكرومتر) على طول جدار كل بئر لتجنب إزعاج قباب المصفوفة.
      2. أضف وحدة تحكم في المركبة بنفس تركيز DMSO النهائي.
      3. حضن الأعضاء تحت ظروف الزراعة القياسية لفترة العلاج المحددة مسبقا.
      4. استبدال الوسط الموجود على الأدوية كل 48–72 ساعة لفترات العلاج التي تزيد عن 72 ساعة.
      5. استخدم نفس جدول استبدال الوسط عبر جميع الآبار داخل التجربة.
      6. سجل صور المجال الساطع الأساسية قبل العلاج.
      7. التقاط الصور على فترات محددة أثناء العلاج باستخدام إعدادات المجهر المتطابقة، والتكبير، ومواقع الحقل.
  2. تقييم استجابة العلاج
    1. التقييم القائم على الشكل
      1. قيم استجابة العلاج باستخدام القراءات القائمة على الصور التالية: منحنى نمو مساحة العضويات، متوسط قطر العضويات، وعدد الأعضاء الناجين.
      2. استخدم إعدادات التعريض المتطابقة، والتكبير، وعتبات التحليل لجميع الصور.
      3. قياس منحنى نمو مساحة العضوية بحساب إجمالي مساحة العضوية لكل بئر أو حقل في كل نقطة زمنية وإعادة التطبيع إلى خط الأساس.
      4. قياس متوسط قطر العضوية بتحديد قطر الأعضاء السليمة الفردية وحساب القيمة المتوسطة لكل بئر.
      5. تحديد عدد الأعضاء الباقية من خلال عد الأعضاء السليمة القابلة للتعرف عليها شكليا واستبعاد الحطام والشظايا المنهارة.
    2. قياس الجدوى الاختياري
      1. قم بإجراء اختبار قابلية الحيوية ثلاثي الأبعاد للوهج عند نقطة المعالجة النهائية إذا كان هناك حاجة لتقييم إضافي لفعالية الكتلة الكبيرة.
      2. اتبع تعليمات الشركة المصنعة لتنفيذ الاختبار.
  3. تحليل البيانات
    1. رسم منحنيات نمو مساحة العضوية مع مرور الوقت.
    2. قارن متوسط قطر العضوية بين المجموعات المعالجة بالمركبات والمجموعات المعالجة باللينفاتينيب.
    3. قارن بين أعداد الأعضاء الباقية بين مجموعات العلاج.
    4. تطبيق جداول التقاط الصور المتطابقة، ومعايير إدراج العضويات، ومعايير التحليل على جميع المجموعات لضمان قابلية التكرار.

4. تحضير الأعضاء لتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية

  1. اختيار واستعادة العضوية
    1. تقييم ما قبل الانفصال
      1. اختر الآبار العضوية التي تظهر مورفولوجيا ثلاثية الأبعاد سليمة دون انهيار واسع النطاق، وتحتوي على مواد كافية لالتقاط خلية واحدة في الأسفل النطاقي، ولا تظهر تلوثا واضحا.
      2. اجمع الأعضاء في نقاط زمنية تجريبية مطابقة عبر عينات ضابطة ومعالجة.
      3. حافظ على كثافة الطلاء المتطابقة، وجدول العلاج، وظروف استبدال الوسط عبر العينات.
      4. سجل صور الحقل الساطع لكل اختيار قبل فترة طويلة من التفكك باستخدام إعدادات المجهر المتطابقة، والتكبير، ومعايير اختيار الحقل.
    2. إزالة المصفوفة
      1. الثقافة الشهية بالكامل من كل بئر.
      2. اغسل كل بئر مرتين باستخدام PBS البارد جدا لإزالة الوسط المتبقي والحطام.
      3. أضف 1 مل من محلول استعادة الخلايا الباردة جدا إلى كل بئر.
      4. احتضن على الجليد لمدة 20–30 دقيقة.
      5. قم بعمل المصفوفات بلطف كل 5-7 دقائق أثناء الحضانة لتسهيل ذوبان المصفوفة.
      6. نقل المادة المذابة إلى أنابيب مبردة مسبقا باستخدام رأس ماصة عريض أو مقطوع لتقليل إجهاد القص.
      7. الانتقال إلى التفكك الإنزيمي فقط بعد أن تذوب المصفوفة إلى حد كبير ويبقى بقايا هلامية مرئية قليلة.
  2. التفكك الإنزيمي وتحضير التعليق أحادي الخلية
    1. الانفصال الإنزيمي
      1. قم بالطرد المركزي بجهاز التعليق العضوي المستعاد عند 300 × جرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
      2. أزل السوبرناتينت بعناية دون إزعاج الحبيبة.
      3. أعد تعليق الحبيبة في 1 مل من إنزيم تفكك الخلايا المؤتلف.
      4. حضانه عند 37 درجة مئوية لمدة 5–10 دقائق.
      5. استخدم البيبيت بلطف من 8 إلى 10 مرات كل 2-3 دقائق باستخدام رأس عريض القطر P1000 لتعزيز الانفصال عن الواقع.
      6. توقف الهضم عندما تنتشر معظم شظايا العضوية في خلايا واحدة ولا تبقى سوى مجموعات صغيرة متبقية.
      7. تجنب الهضم المطول لمنع انخفاض صلاحية الخلايا، والتعابير النمطية المرتبطة بالتوتر، وزيادة تلوث الحمض النووي الريبي المحيط.
    2. التبريد والترشيح
      1. أضف 4 مل من مصل PBS البارد المثلج الذي يحتوي على 2٪ مصل أبقار جنيني لإيقاف الهضم.
      2. قم بترشيح نظام التعليق عبر مصفاة خلايا بحجم 40 ميكرومتر.
      3. اغسل مرة واحدة باستخدام PBS لإزالة الإنزيم المتبقي والتجمعات والحطام.
      4. قم بتحليل خلايا الدم الحمراء إذا كان هناك تلوث في كريات الدم الحمراء، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
    3. تحضير الخلايا ومراقبة الجودة
      1. عد الخلايا باستخدام استبعاد تريبان بلو.
      2. حدد صلاحية الخلايا قبل تجهيز المكتبة.
      3. استخدم فقط عينات ذات صلاحية ≥ 85٪.
      4. اضبط تركيز الخلية النهائي إلى 700–1,200 خلية/ميكرولتر.
      5. استبعد العينات التي تحتوي على حطام مفرط، أو كثرة الخلايا الميتة، أو التجمعات الواضحة الكبيرة، أو التفكك غير الكامل.
      6. كرر الترشيح قبل التحميل إذا كانت هناك تجمعات.
      7. التحكم في العملية والعينات المعالجة تحت ظروف متطابقة، بما في ذلك إنزيم التفكك، وقت الهضم، تكرار التوصيل بالماصات، طريقة الترشيح، تركيز الخلية، واستراتيجية التحميل.
  3. تحضير وتسلسل مكتبة الخلايا الأحادية
    1. التقاط الخلية الواحدة وتحضير المكتبة
      1. قم بتحميل نظام التعليق أحادي الخلية المحضر على منصة التقاط خلية واحدة تعتمد على القطرات وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
      2. قم بإجراء النسخ العكسي، وتضخيم الحمض النووي المعتمد (cDNA)، وبناء المكتبة باستخدام سير العمل الثلاثي الخلية الواحدة المقابل.
    2. معلمات التسلسل
      1. مكتبات التسلسل على عمق لا يقل عن 50,000 قراءة لكل خلية.
      2. خلايا تحميل لتحقيق استعادة حوالي 6,000–10,000 خلية في كل مكتبة.
      3. سجل كيمياء التسلسل، وبنية القراءة، وإعدادات الأجهزة.
  4. معايير الجودة للتحليل اللاحق
    1. تأكد من أن التحضير النهائي يتمتع بحيوية عالية للخلايا، وأقل من الحطام، وحمل تجميع منخفض.
    2. تأكيد ملاءمة التحليل النصي الخلوي اللاحق لتنوع الخلايا وانتقالات الحالة الخلوية.

5. المعالجة الأساسية والتحكم في جودة بيانات تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية

  1. المعالجة الأولية
    1. توليد مصفوفة العد
      1. معالجة بيانات التسلسل الخام باستخدام خط الأنابيب الموصى به للمنصة المختارة.
      2. أنشئ مصفوفة عد جين بخلية.
      3. إصدار برنامج التسجيل، بناء الجينوم المرجعي، وإصدار التعليقات النصية.
    2. تقييم الجودة الأولي على مستوى المكتبة
      1. تلخص مقاييس التسلسل لكل مكتبة، بما في ذلك إجمالي القراءات، العدد المقدر للخلايا المسترجعة، الجينات الوسيطة لكل خلية، متوسط الميكروفونات المتقطعة لكل خلية، والتشبع التسلسلي (إذا كان ذلك ينطبق).
      2. استخدم نفس إعدادات الجينوم المرجعي وإعدادات التعليقات عبر جميع العينات.
  2. مراقبة الجودة على مستوى الخلية
    1. ترشيح الخلايا منخفضة الجودة
      1. قيم لكل خلية عدد الجينات المكتشفة، وإجمالي عدد الوحدات الموحدة الميتوكوندرية، ونسبة النسخ الميتوكوندرية، وأدلة وجود الدوبلتات أو التعدديات.
      2. استبعد الخلايا ذات عدد جيني منخفض جدا، أو عدد وحدات الوحدة المتعددة السطحية منخفض جدا، أو كسور نسخ ميتوكوندرية مرتفعة بشكل غير طبيعي.
      3. حدد عتبات التصفية بناء على توزيع مجموعة البيانات.
      4. تطبيق عتبات متطابقة عبر مجموعات العلاج المتطابقة.
    2. إزالة الدوبليت المحتملة
      1. حدد الدوبلتات المحتملة باستخدام طريقة حسابية مناسبة.
      2. إزالة الدوبلتات باستخدام سير عمل اكتشاف متوافق مع المنصة.
      3. طبق نفس استراتيجية اكتشاف المزدوج على جميع العينات.
  3. التطبيع، التجميع، والتعليق
    1. تطبيع البيانات
      1. تطبيع مصفوفة العد المصفاة باستخدام سير عمل RNA-seq أحادي الخلية القياسي.
      2. تطبيق إجراءات تطبيع متطابقة على جميع العينات.
    2. تقليل الأبعاد والتجميع
      1. قم بإجراء تقليل الأبعاد.
      2. إجراء تجميع غير مراقب لتحديد التجمعات النسخوة الرئيسية.
      3. تصور حالات الخلايا باستخدام طريقة تضمين منخفضة الأبعاد مثل UMAP.
    3. تحديد جين العلامة
      1. تحديد جينات العلامات باستخدام تحليل التعبير التفريقي بين العناصر.
      2. تعيين التفسير البيولوجي لحالات الخلايا الظهارية الرئيسية بناء على تعبير العلامة.
  4. التحليل المقارن لحالات العلاج
    1. دمج البيانات الوصفية
      1. ضع كل خلية علامة على حالة العلاج، وخط العضوية المشتق من المريض، ودفعة المعالجة.
      2. حافظ على هيكل بيانات وصفية متسقة عبر جميع العينات.
    2. تحليل التغيرات المرتبطة بالعلاج
      1. قارن بين العينات الضابطة والعينات المعالجة.
      2. تحديد إعادة تشكيل النسخ المرتبطة بالعلاج.
      3. تحديد التحولات في تركيب حالة الخلية.
      4. تحديد مجموعات الخلايا المرشحة المرتبطة بالتكيف العلاجي.
      5. تفسير النتائج مع قراءات الصرفية وإمكانية الاستخدام.
  5. تحليل البيانات الناتج
    1. إنشاء مصفوفة عد جين بخلايا مضبوطة الجودة.
    2. توليد تصورات منخفضة الأبعاد لمجموعات سكانية متميزة من الناحية النسخية.
    3. تحديد جينات العلامات للعناقيد الرئيسية.
    4. الحفاظ على الاتساق عبر جميع العينات في الجينوم المرجعي، وسير عمل المعالجة المسبقة، ومعايير التصفية، واستراتيجية التجميع، ومعايير التعليق.
    5. وثق أي انحرافات خاصة بالعينة عن سير العمل القياسي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

يوضح الشكل 1 تكوين وتوصيف عضويات سرطان الخلايا الكبدية (HCC). في الشكل 1A، تم استخدام أنسجة أورام مشتقة من المريض لتحديد زراعة العضوية للتحليل النسيجي ودراسات العلاج. يظهر الشكل 1B صورا ساطعة للعضويات في اليومين الأول والسادس بعد التعافي، مما يظهر البقاء والتوسع تحت ظروف الزراعة ثلاثية الأبعاد القياسية. في اليوم الأول، تظهر العضوية كهياكل صغيرة ومضغوطة، بينما في اليوم السادس، تظهر حجما أكبر وشكلا مح...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

لضمان قابلية التكرار والكفاءة والتحليل عالي الجودة للنسخ أحادي الخلية، تتطلب عدة خطوات تقنية في هذا السير التحكم الدقيق. الاتساق أثناء الإحياء والتوسع لعضويات HCC المشتقة من المرضى أمر أساسي، لأن التغيرات في كثافة البذر، وتركيب مصفوفة الغشاء القاعدي، وتوقيت الزراعة يمكن أن تؤثر على شكل العضويات، والنمو، واستجابات العلاج في مراحل لاحقة13،14. بالإضافة إلى ذلك، فإن القدرة العالية على بقاء الخلايا أثناء التفكك أمر بالغ الأهمية ل scRN...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

لا يوجد لدى المؤلفين تضارب مصالح للكشف عنها.

شكر وتقدير

وقد دعمت هذه المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (82303022؛ 82122048؛ 82372714؛ 82203380)، ومؤسسة قوانغدونغ للبحوث الأساسية والتطبيقية (2023A1515011416)، ومؤسسة قوانغتشو للبحوث الأساسية والتطبيقية (2024A04J6575). تم إنشاء بعض العناصر التخطيطية باستخدام "المنزل للباحثين" (https://www.home-for-researchers.com) وتم تكييفها من قبل المؤلفين. تم إنشاء رسومات تخطيطية باستخدام Figdraw (https://www.figdraw.com) وتم تكييفها من قبل المؤلفين.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
[Leu15]-غاسترين I إنسانميركG9145
أنابيب دقيقة بسعة 1.5 ملميركAXYMCT150LC
مخزن تحليل 1X RBCثيرمو فيشر العلمي00-4333-57
قوارير التبريد الداخلية ذات الخيط بسعة 2.0 ملالعش607001
A8301 (مثبط TGFb)توكريس للعلوم الحيوية2939
الأجسام المضادة متعددة النسيلات AFPبروتين تك14550-1-AP
الأجسام المضادة المضادة للألبومين [ALB/2144]أبكامAB236492
الأجسام المضادة المضادة ل-HNF-4-ألفا [EPR16885] - درجة ChIPأبكامab181604
الأجسام المضادة المضادة للبري ألبومين [EPR3219]أبكامab92469
الأجسام المضادة المضادة لSOX9 [EPR14335-78]أبكامab185966
مكمل فيتامين B27 (503)، ناقص فيتامين أثيرمو فيشر العلمي12587010
محلول استعادة الخلايا، 100 ملكورنينغ354253المادة المستخدمة لإذابة مصفوفة الغشاء القاعدي واستعادة الأعضاء قبل إعادة الطلاء أو المعالجة النهائية
CellTiter-Glo®   اختبار قابلية البقاء للخلايا ثلاثية الأبعادبروميغاG9681
CHIR99021ميركSML1046
كروميوم نيكست GEM خلية واحدة 3 أقدام GEM، مكتبة وGEM مجموعة خرز الجل v3.110x جينومكسCG000227
مصفاة خلية كورنينغ، 40 ومو؛ m، أزرق، S، IND، 1/50كورنينغ431750
كوستار 24 بئر قاع شفاف مسطح جدا وتركيب منخفض جدا وعدة ألواح بئر ملفوفة بشكل فردي ومعقمةكورنينغ3473
مولد Cultrex BME بعامل نمو منخفض، النوع 2 PathClear (BME)ميرك3533-005-02المصفوفة خارج الخلوية تستخدم لدعم الزراعة العضوية ثلاثية الأبعاد وتكوين القبة
DMSOميركC6164المذيب المستخدم في تحضير حلول مخزون الأدوية والتحكم في المركبات
دولبيكو موديف إيجل ميديوم/إف-12 هامزثيرمو فيشر العلمي12634028DMEM/F-12 المتقدمة
E7080 (لينفاتينيب)سيليكS1164مثبط كيناز التيروزين المستخدم في علاج العضوية والاضطراب العلاجي
قيمة مصل البقر الجنيني FBSجيبكوA5256701
فورسكولينتوكريس للعلوم الحيوية1099
مكمل جلوتاماكسثيرمو فيشر العلمي35050061
مجموعة تلوين الهيماتوكسيلين وإيوسينبيوتايمC0105S
هيبيس، 1 مثيرمو فيشر العلمي15630080
المجهر الفلوري المحرك Leica DM6 Bلايكالا يوجد
ملحق N2 (1003)ثيرمو فيشر العلمي17502048
ن-أستيل سيستينميركA0737-5MG
نيكوتيناميدميركN0636
أنابيب الطرد المركزي المخروطية المعقمة من نوع Nunc 15 ملثيرمو فيشر العلمي339651
البنسلين/الستربتوميسين (10,000 U/mL)ثيرمو فيشر العلمي15140122
محلول ملحي مخزن بالفوسفاتسيرة جينومGNM20012المخزن المؤقت المستخدم لغسل الأعضاء وتحضير العينات للمعالجة النهائية
EGF البشري المؤتلفبيبروتيكAF-100-15
FGF10 البشري المؤتلفبيبروتيك100-26
HGF الإنسان المؤترخبيبروتيك100-39
نوجين البشري المؤتلفبيبروتيك120-10 درجة مئوية
مثبط رو كيناز Y-27632 ثنائي الهيدروكلوريدميركY0503مثبط الصخور المستخدم لتعزيز بقاء الأعضاءات بعد الذوبان أو الزوال
وسط مشروط ب R-spodin1(بروتييه وآخرون)لا يوجدإفراز خطوط الخلايا
صبغة تريبان بلو، 0.4٪ مغشية مفلترة، محضرة بمحلول ملحي 0.85٪جيبكو15250061
إنزيم TrypLE Express (1x)، بدون فينول ريدثيرمو فيشر العلمي12604013بديل التربسين
وسط مكيف ب Wnt-3a(بروتييه وآخرون)لا يوجدإفراز خطوط الخلايا

المراجع

  1. Villanueva, A. Hepatocellular carcinoma. N Engl J Med. 380 (15), 1450-1462 (2019).
  2. Bray, F., et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin. 68 (6), 394-424 (2018).
  3. Sung, H., et al. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin. 71 (3), 209-249 (2021).
  4. Safri, F., et al. Heterogeneity of hepatocellular carcinoma: from mechanisms to clinical implications. Cancer Gene Ther. 31 (8), 1105-1112 (2024).
  5. Zhang, X. F., et al. Targeting cell-state plasticity driven by FOXM1/CEBPB axis disrupts developmental heterogeneity and therapeutic resistance in hepatocellular carcinoma. J Hepatol. 84 (2), 370-384 (2026).
  6. Thorel, L., et al. Patient-derived tumor organoids: a new avenue for preclinical research and precision medicine in oncology. Exp Mol Med. 56 (7), 1531-1551 (2024).
  7. Liu, Y., et al. A decade of liver organoids: advances in disease modeling. Clin Mol Hepatol. 29 (3), 643-669 (2023).
  8. Li, L., et al. Human primary liver cancer organoids reveal intratumor and interpatient drug response heterogeneity. JCI Insight. 4 (2), e121490 (2019).
  9. Yang, H., et al. Pharmacogenomic profiling of intra-tumor heterogeneity using a large organoid biobank of liver cancer. Cancer Cell. 42 (4), 535-551.e8 (2024).
  10. Xing, L., et al. RNA-based therapies in hepatocellular carcinoma: state of the art and clinical perspectives. Hepatoma Res. 10, 24 (2024).
  11. Aissa, A. F., et al. Single-cell transcriptional changes associated with drug tolerance and response to combination therapies in cancer. Nat Commun. 12 (1), 1628 (2021).
  12. Zhang, C. Y., et al. Development and optimization of a human hepatocellular carcinoma patient-derived organoid model for potential target identification and drug discovery. J Vis Exp. (198), e65785 (2023).
  13. Wang, Q., et al. Breakthroughs and challenges of organoid models for assessing cancer immunotherapy: a cutting-edge tool for advancing personalised treatments. Cell Death Discov. 11 (1), 222 (2025).
  14. Yang, C., et al. Modeling methods of different tumor organoids and their application in tumor drug resistance research. Cancer Drug Resist. 8, 32 (2025).
  15. Denisenko, E., et al. Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus RNA-seq workflows. Genome Biol. 21 (1), 130 (2020).
  16. Yip, S., et al. Give them vasculature and immune cells: how to fill the gap of organoids. Cells Tissues Organs. 212 (5), 369-382 (2023).
  17. Zhou, C., et al. Standardization of organoid culture in cancer research. Cancer Med. 12 (13), 14375-14386 (2023).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخليةالاستجابة للعلاج الدوائيفحص الأدوية باستخدام العضوانياتتفكيك العضوانياتمقايسة حيوية الخلاياتحليل مورفولوجيا العضوانياتتوصيف التعبير الجينيالتغاير الورميتحليل إثراء المسارات
التوليد والتحليل النصي الأحادي الخلية لعضويات سرطان الخلايا الكبدية بعد العلاج الدوائي
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.