Method Article

التوليد والتحليل النصي الأحادي الخلية لعضويات سرطان الخلايا الكبدية بعد العلاج الدوائي

DOI:

10.3791/70511

⸱

May 26th, 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Basic Medical Science, Guangzhou Medical University, 2Guangzhou Municipal and Guangdong Provincial Key Laboratory of Protein Modification and Degradation, Guangzhou Medical University, 3Affiliated Cancer Hospital and Institute, Guangzhou Medical University, 4The First Clinical School of Guangzhou Medical University, Guangzhou Medical University, 5Department of Obstetrics, Guangzhou Eighth People's Hospital, Guangzhou Medical University, 6Department of Pediatric Surgery, Guangzhou Institute of Pediatrics, Guangzhou Women and Children's Medical Center, Guangzhou Medical University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوضح هذا البروتوكول طريقة مبسطة لتوليد عضويات سرطان الخلايا الكبدية، وتطبيق العلاج الدوائي، وإجراء تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية قبل وبعد العلاج لتوصيف التغيرات النساخة المرتبطة بالعلاج.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعد سرطان الخلايا الكبدية سببا رئيسيا للوفيات المرتبطة بالسرطان حول العالم، ويتميز بعدم التجانس الملحوظ داخل الورم، مما يساهم في استجابات علاجية متغيرة، وتكرار الورم، وتطور المرض. لذلك، فإن الفهم الأعمق لكيفية تغير خلايا الورم على المستوى النسخي قبل وبعد العلاج الدوائي ضروري لتحسين استراتيجيات العلاج. ومع ذلك، لا تزال سير العمل التجريبي العملي الذي يربط العلاج الدوائي القائم على العضوية مع التحليل الطبي المرجعي لخلية واحدة لاحقا محدودا. في هذه الدراسة، تم تطوير سير عمل موحد لتوليد عضويات سرطان الخلايا الكبدية، وتطبيق العلاج الدوائي المحدد، وإجراء تسلسل RNA بخلية واحدة على العينات التي تم جمعها قبل وبعد العلاج. يشمل البروتوكول إحياء وتوسيع العضوية العضوية، وتقييم جودة ما قبل العلاج، والتعرض للأدوية، وتحضير العضوية لتفكك الخلايا الواحدة، وبناء المكتبة، والتحليل المقارن الأساسي لبيانات النسخ الوحيد. يتم توفير احتياطات تقنية حيوية لتحسين قابلية التكرار وجودة العينة. يتيح هذا السير العمل توصيفا جنبا إلى جنب لتركيب الخلايا والتغيرات النسخية المرتبطة بالعلاج الدوائي في عضويات سرطان الخلايا الكبدية. البروتوكول قوي وقابل للتوسع وقابل للتكيف عبر أنظمة العضوية المختلفة، مما يوفر منصة عملية للتحقيق في تغيرات التعبير الجيني المرتبطة بالعلاج بدقة خلية واحدة.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

سرطان الخلايا الكبدية (HCC) هو أكثر سرطان الكبد الأولي شيوعا لدى البالغين وسبب رئيسي للوفيات المرتبطة بالسرطان على مستوى العالم 1,2,3. نتيجته السريرية السيئة تعود إلى التباين الكبير داخل الأورام، مما يؤدي إلى مقاومة العلاج وتكرار المرض4. تشير دراسة حديثة إلى أن التنوع التطوري والمرونة في حالة الخلية التي تدفعها البرامج التحويلية الرئيسية مثل محور FOXM1/CEBPB تساهم في المقاومة العلاجية في HCC5. تسلط هذه النتائج الضوء على الحاجة لفهم كيفية تكيف تجمعات الخلايا الورمية وانتقالها بين الحالات تحت ضغط ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت مراجعة الدراسات التي استخدمت أنسجة بشرية والموافقة عليها من قبل لجان المراجعة الأخلاقية للأبحاث في جامعة قوانغتشو الطبية (رقم الموافقة. GYZL-2024-KY31). تم إجراء جميع الإجراءات المتعلقة بالعينات البشرية وفقا للإرشادات المؤسسية للأبحاث البشرية. تم الحصول على موافقة مكتوبة ومستنيرة من جميع المرضى لاستخدام عيناتهم السريرية في البحث الطبي. المواد والكواشف والمعدات المستخدمة مدرجة في جدول المواد.

يشمل هذا السير استردادها وتوسيع عضويات سرطان الخلايا الكبدية المحجوزة بالتبريد، مع تعديلات طفيفة للاضطرابات العلاجية اللاحقة وتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية. الهدف هو توليد مزارع عضوية ذات ج....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوضح الشكل 1 تكوين وتوصيف عضويات سرطان الخلايا الكبدية (HCC). في الشكل 1A، تم استخدام أنسجة أورام مشتقة من المريض لتحديد زراعة العضوية للتحليل النسيجي ودراسات العلاج. يظهر الشكل 1B صورا ساطعة للعضويات في اليومين الأول والسادس بعد التعافي، مما يظهر البقاء والتوسع تحت ظروف الزراعة ثلاثية الأبعاد القياسية. في اليوم الأول، تظهر العضوية كهياكل صغيرة ومضغوطة، بينما في اليوم السادس، تظهر حجما أكبر وشكلا مح.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لضمان قابلية التكرار والكفاءة والتحليل عالي الجودة للنسخ أحادي الخلية، تتطلب عدة خطوات تقنية في هذا السير التحكم الدقيق. الاتساق أثناء الإحياء والتوسع لعضويات HCC المشتقة من المرضى أمر أساسي، لأن التغيرات في كثافة البذر، وتركيب مصفوفة الغشاء القاعدي، وتوقيت الزراعة يمكن أن تؤثر على شكل العضويات، والنمو، واستجابات العلاج في مراحل لاحقة13،14. بالإضافة إلى ذلك، فإن القدرة العالية على بقاء الخلايا أثناء التفكك أمر بالغ الأهمية ل scRN.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لا يوجد لدى المؤلفين تضارب مصالح للكشف عنها.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد دعمت هذه المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (82303022؛ 82122048؛ 82372714؛ 82203380)، ومؤسسة قوانغدونغ للبحوث الأساسية والتطبيقية (2023A1515011416)، ومؤسسة قوانغتشو للبحوث الأساسية والتطبيقية (2024A04J6575). تم إنشاء بعض العناصر التخطيطية باستخدام "المنزل للباحثين" (https://www.home-for-researchers.com) وتم تكييفها من قبل المؤلفين. تم إنشاء رسومات تخطيطية باستخدام Figdraw (https://www.figdraw.com) وتم تكييفها من قبل المؤلفين.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
[Leu15]-غاسترين I إنسانميركG9145
أنابيب دقيقة بسعة 1.5 ملميركAXYMCT150LC
مخزن تحليل 1X RBCثيرمو فيشر العلمي00-4333-57
قوارير التبريد الداخلية ذات الخيط بسعة 2.0 ملالعش607001
A8301 (مثبط TGFb)توكريس للعلوم الحيوية2939
الأجسام المضادة متعددة النسيلات AFPبروتين تك14550-1-AP
الأجسام المضادة المضادة للألبومين [ALB/2144]أبكامAB236492
الأجسام المضادة المضادة ل-HNF-4-ألفا [EPR16885] - درجة ChIPأبكامab181604
الأجسام المضادة المضادة للبري ألبومين [EPR3219]أبكامab92469
الأجسام المضادة المضادة لSOX9 [EPR14335-78]أبكامab185966
مكمل فيتامين B27 (503)، ناقص فيتامين أثيرمو فيشر العلمي12587010
محلول استعادة الخلايا، 100 ملكورنينغ354253المادة المستخدمة لإذابة مصفوفة الغشاء القاعدي واستعادة الأعضاء قبل إعادة الطلاء أو المعالجة النهائية
CellTiter-Glo®   اختبار قابلية البقاء للخلايا ثلاثية الأبعادبروميغاG9681
CHIR99021ميركSML1046
كروميوم نيكست GEM خلية واحدة 3 أقدام GEM، مكتبة وGEM مجموعة خرز الجل v3.110x جينومكسCG000227
مصفاة خلية كورنينغ، 40 ومو؛ m، أزرق، S، IND، 1/50كورنينغ431750
كوستار 24 بئر قاع شفاف مسطح جدا وتركيب منخفض جدا وعدة ألواح بئر ملفوفة بشكل فردي ومعقمةكورنينغ3473
مولد Cultrex BME بعامل نمو منخفض، النوع 2 PathClear (BME)ميرك3533-005-02المصفوفة خارج الخلوية تستخدم لدعم الزراعة العضوية ثلاثية الأبعاد وتكوين القبة
DMSOميركC6164المذيب المستخدم في تحضير حلول مخزون الأدوية والتحكم في المركبات
دولبيكو موديف إيجل ميديوم/إف-12 هامزثيرمو فيشر العلمي12634028DMEM/F-12 المتقدمة
E7080 (لينفاتينيب)سيليكS1164مثبط كيناز التيروزين المستخدم في علاج العضوية والاضطراب العلاجي
قيمة مصل البقر الجنيني FBSجيبكوA5256701
فورسكولينتوكريس للعلوم الحيوية1099
مكمل جلوتاماكسثيرمو فيشر العلمي35050061
مجموعة تلوين الهيماتوكسيلين وإيوسينبيوتايمC0105S
هيبيس، 1 مثيرمو فيشر العلمي15630080
المجهر الفلوري المحرك Leica DM6 Bلايكالا يوجد
ملحق N2 (1003)ثيرمو فيشر العلمي17502048
ن-أستيل سيستينميركA0737-5MG
نيكوتيناميدميركN0636
أنابيب الطرد المركزي المخروطية المعقمة من نوع Nunc 15 ملثيرمو فيشر العلمي339651
البنسلين/الستربتوميسين (10,000 U/mL)ثيرمو فيشر العلمي15140122
محلول ملحي مخزن بالفوسفاتسيرة جينومGNM20012المخزن المؤقت المستخدم لغسل الأعضاء وتحضير العينات للمعالجة النهائية
EGF البشري المؤتلفبيبروتيكAF-100-15
FGF10 البشري المؤتلفبيبروتيك100-26
HGF الإنسان المؤترخبيبروتيك100-39
نوجين البشري المؤتلفبيبروتيك120-10 درجة مئوية
مثبط رو كيناز Y-27632 ثنائي الهيدروكلوريدميركY0503مثبط الصخور المستخدم لتعزيز بقاء الأعضاءات بعد الذوبان أو الزوال
وسط مشروط ب R-spodin1(بروتييه وآخرون)لا يوجدإفراز خطوط الخلايا
صبغة تريبان بلو، 0.4٪ مغشية مفلترة، محضرة بمحلول ملحي 0.85٪جيبكو15250061
إنزيم TrypLE Express (1x)، بدون فينول ريدثيرمو فيشر العلمي12604013بديل التربسين
وسط مكيف ب Wnt-3a(بروتييه وآخرون)لا يوجدإفراز خطوط الخلايا

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Hepatocellular Carcinoma OrganoidsSingle Cell RNA SequencingDrug Treatment ResponseOrganoid Drug ScreeningOrganoid DissociationCell Viability AssayOrganoid Morphology AnalysisGene Expression ProfilingTumor HeterogeneityPathway Enrichment Analysis

Related Articles