استخراج الحمض النووي من عمود متوسط الإنتاج باستخدام رفوف 24 بئرا

ملخص

يصف هذا البروتوكول طريقة فعالة من حيث التكلفة لتسريع استخراج الحمض النووي من البلازميد. من خلال استخدام رفوف مطبوعة ثلاثية الأبعاد مخصصة متوافقة مع أقراص الألواح ذات الدلو المتأرجح القياسي، يمكن للباحثين معالجة ما يصل إلى 48 عمودا دورانيا مع أغطية أو حتى 116 عمودا دوارة بدون أغطية في نفس الوقت، مما يقلل بشكل كبير من وقت التعامل مقارنة بطرق الطرد المركزي الدقيق اليدوي.

الملخص

يعد استخراج أعمدة الدوران بغشاء السيليكا هو المعيار لتنقية الحمض النووي عالية الجودة، لكنه يتطلب جهدا كبيرا ويصعب التوسع يدويا بعد الدفعات الصغيرة. غالبا ما تكون الروبوتات الآلية الحالية لمناولة السوائل مكلفة جدا بالنسبة للمختبرات الصغيرة والمتوسطة. تقدم هذه الورقة نهجا مبسطا شبه آلي باستخدام رفوف مصممة خصيصا مطبوعة ثلاثية الأبعاد تناسب أقراص الألواح الطرد المركزية القياسية.

يسمح النظام المقترح بمعالجة متوازية لما يصل إلى 116 عمودا تجاريا قياسيا للدوران. تصميم الرف يستوعب تكوين "متداخل"، مما يتيح تصفية الليزات في نفس الوقت (عبر أعمدة الترشيح) وربط الحمض النووي (عبر أعمدة السيليكا) في خطوة طرد مركزي واحدة. علاوة على ذلك، يتضمن التصميم خزان نفايات مشترك، مما يلغي الحاجة إلى التخلص من التدفق من الأنابيب الفردية أثناء خطوات الغسيل.

تحقق هذه الطريقة إنتاجية ونقاء للحمض النووي مماثلين للبروتوكولات اليدوية القياسية، لكنها تقلل من إجمالي وقت المعالجة بنسبة تقارب 50–70٪ للدفعات الأكبر من 24 (60–90 دقيقة بدلا من 120–180 دقيقة). يتم تقليل الوقت الإجمالي المطلوب للخطوات مثل ترشيح الليزات، والغسل، والتخلص من النفايات بمقدار 5–10 دقائق بغض النظر عن عدد العينات المعالجة. هذا النهج المفتوح المصدر في الأجهزة يجسر الفجوة بين التحضيرات اليدوية الصغيرة والأتمتة المكلفة.

المقدمة

تم توضيح عزل الأحماض النووية باستخدام مصفوفات السيليكا لأول مرة في عام 1979 بواسطة فوغلشتاين وجيليسبي، اللذين أسسا المبدأ الأساسي لامتصاص شظايا الحمض النووي إلى مسحوق الزجاج في وجود تركيزات عالية من الأملاح الكائوتروبية، وتحديدا يوديد^{الصوديوم 1}. قدم هذا الإنجاز بديلا أكثر أمانا وكفاءة لطرق الاستخلاص السامة بالفينول-كلوروفورم وطرق الطرد المركزي الزائدة بالتدرج المفرط بكلوريد السيزيوم التي هيمنت على تلك الحقبة. لاحقا، قام بوم والمؤلفون المشاركون بتحسين هذه المنهجية بشكل كبير من خلال إدخال جوانيدينيوم ثيوسيانات (GuSCN) كعامل فوضوي أساسي². كان هذا الابتكار محوريا، حيث يعمل GuSCN في الوقت نفسه كمزيل بروتيني قوي للخلايا المتحللة وكمثبط قوي للRNases وDNases، مما يحافظ على سلامة الأحماض النووية خلال مراحل الاستخراج الأولية.

منذ بدايتها، خضعت تقنية الاستخراج ذات الطور الصلب هذه — المعروفة على نطاق واسع باسم "طريقة البوم" — لتحسينات واسعة. تم تكييفها لعزل الأحماض النووية من مصفوفات بيولوجية متزايدة التعقيد، تتراوح من البلازميد^{البكتيري 3} والحمض النووي^{الجيني 4} إلى الميتوكوندريا^{حقيقية النواة} 5 والحمض النووي الجيني عالي الوزن الجزيئي. علاوة على ذلك، تم توسيع نطاق التقنية لتشمل التطبيقات السريرية والجنائية، بما في ذلك عزل الحمض النووي الناشر الخالي من الخلايا من البلازما⁶، واستخراج الحمض النووي النباتي العنيد والحمض النووي الريبي الغني بالبوليفينولات⁷، وتنقية الأحماض النووية الفيروسية⁸. تتوفر أيضا العديد من المجموعات التجارية التي تستخدم أعمدة الدوران.

تعتمد الآلية الفيزيائية الكيميائية وراء هذه العملية على اضطراب بنية الماء بواسطة الأيونات الفوضوية. في وجود قوة أيونية عالية ودرجة حموضة منخفضة، تزال الأغلفة الترطيب المحيطة بالعمود الفقري لفوسفات حمض النووي وسطح السيليكا (الجفاف). يسهل ذلك تكوين جسور كاتيون—عادة ما يتم توسطها بواسطة Na⁺ أو الكاتيونات الكائوتروبية—بين مجموعات السيلانول سالبة الشحنة على سطح السيليكا ومجموعات الفوسفات في الحمض النووي النووي. يتم تحقيق الانتقائية فيما يتعلق بنوع حمض النووي (DNA مقابل RNA) وطول الشظايا من خلال التعديل الدقيق لكيمياء المخزن الاحتياطي. على سبيل المثال، تركيزات الملح المحددة ومستويات الحموضة يمكن أن تفضل ارتباط الخيوط الجينومية الطويلة على الأوليجونوكليوتيدات القصيرة، أو تميز بين RNA والحمض النووي. بالإضافة إلى ذلك، غالبا ما تستخدم الإصدارات الحديثة من هذه التقنية أسطح السيليكا المعدلة لتعزيز إيزوثيرم الامتصاص التفاضلي لأنواع معينة من الأحماض النووية.

يمر سير العمل القانوني لتنقية الأحماض النووية القائمة على السيليكا بأربع مراحل مميزة: (1) التحلل، حيث يتم توحيد المادة البيولوجية الابتدائية وتفكيك البنى الخلوية، غالبا باستخدام ظروف قلوية أو منظفات (SDS/Triton); (2) التوضيح، حيث تزال الحطام الخلوي، والبروتينات المتراكبة، والبوليساكاريدات لمنع انسداد الأعمدة؛ (3) الربط، حيث يتم ضبط المادة الفائقة بأملاح الكائوتروبية والإيثانول لتعزيز الامتصاص إلى غشية السيليكا؛ و(4) الغسيل، حيث تغسل الأحماض النووية المرتبطة بالغشاء باستخدام مخازل كحولية لإزالة الأملاح والمثبطات المتبقية قبل الخروج في محلول أيوني منخفض القوة.

بينما تكون كيمياء هذه العملية قوية، يظل التعامل الميكانيكي مع أعمدة الدوران الفردية عنق زجاجة كبير في سير العمل متوسط الإنتاجية (24–100 عينة)، مما يخلق فجوة بين المعالجة اليدوية وأنظمة معالجة السوائل الآلية المكلفة. تشمل الأساليب الحالية لتبسيط استخراج الأحماض النووية اليدوي القائم على الأعمدة مشعبات الفراغ ومحطات العمل الروبوتية للتنقية الآلية 9,10,11,12.

عادة ما تتوفر مشعبات التفريغ إما بتكوين وصول عشوائي مزود بمحول سدادة لوئر من 20–24 للأعمدة الطرد المركزي، أو بتصميم مخصص للاستخدام مع ألواح 96 بئرا. تسرع مشعبات الفراغ المهيأة ل 20–24 عينة خطوة غسل الأعمدة أثناء تنقية الحمض النووي مقارنة بالطرد المركزي، لأنها تلغي الحاجة لإزالة الأعمدة من الدوار. على الرغم من أن هذه الطريقة مريحة، قد يحدث تلوث متبادل لأن طرف تصريف العمود يلامس فتحة لوير في مشعب الفراغ. إذا دخل الحمض النووي من عمود إلى فتحة لوير، يمكن نقله إلى عمود عينة آخر أثناء الاستخدام التالي للمشعب. لمنع التلوث، يوصي المصنعون بملحقات إضافية^10،13؛ ومع ذلك، تعقد هذه الأنظمة تجميع إعداد الاستخراج وغالبا ما يتم حذفها.

تتميز مشعبات الفراغ المصممة لصيغة 96 بئر ببناء مختلف وهي ليست مخصصة لأعمدة الطرد المركزي الدقيق بل لألواح استخراج الحمض النووي المتوافقة بسعة 96 بئر، حيث تحتوي الآبار على غشاء سيليكا. في هذه الحالة، يتم استخراج الحمض النووي باستخدام مجموعات عزل DNA بصيغة 96 بئر معبأة مسبقا¹⁴. تقدم هذه المجموعات إنتاجية عالية لكنها محدودة التطبيق، حيث أن معالجة أقل من 96 عينة غالبا ما تكون غير عملية.

تعد محطات العمل الروبوتية الآلية لاستخراج الأحماض النووية بلا شك الطريقة الأكثر ملاءمة لتنقية الحمض النووي، لأنها تتطلب تدخلا بسيطا من المشغلين، مما يوفر وقت الباحث ويقلل من العوامل العشوائية مثل التلوث. للأسف، معظم محطات الاستخراج تفتقر إلى الشمولية وتعمل حصريا باستخدام مجموعات مخصصة. تستخدم هذه المحطات بشكل أساسي في مختبرات التشخيص، لكنها ليست فعالة من حيث التكلفة لمعظم المختبرات الأكاديمية الصغيرة والمتوسطة.

لذا، هناك فجوة في الممارسة المخبرية لطرق استخراج الحمض النووي متوسطة الإنتاجية القادرة على معالجة ما بين 12 و96 عينة في أقل من ساعة واحدة. نقدم رف يحتوي على 24 بئرا يسمح بالعزل اليدوي لما يصل إلى 48 عينة باستخدام أعمدة دوران مغطاة وحتى 116 عينة باستخدام أعمدة دوران غير مغطاة. يستخدم جهاز طرد مركزي مزود بدوار صفائح دلو متحرك وجهاز طرد مركزي دقيق بزاوية ثابتة كمعدات إضافية. يتم تقديم إجراء تنقية الحمض النووي بالبلازميدات كمثال على استخدام رفوف ب 24 بئرا، حيث يتضمن عزل الحمض النووي بالبلازميد خطوة توضيحية لإزالة الحطام الخلوي المتحلل، مما يجعل العملية صعبة الأتمتة. ومع ذلك، يمكن استخدام هذه الرفوف في أي طريقة لاستخراج الأحماض النووية القائمة على الأعمدة.

البروتوكول

1. تحضير معدات مطبوعة ثلاثية الأبعاد

1. اطبع الرف باستخدام طابعة ثلاثية الأبعاد بخيط مدمج مع فوهة 0.4 مم. استخدم خيط PLA أو PETG أو ABS العام مع حشوة 100٪. اضبط ارتفاع الطبقة إلى 0.1 مم وفعل تنعيم السطح. قم بضبط إعدادات الطباعة لضمان مقاومة الماء والثبات الميكانيكي.
   ملاحظة: ملفات STL لمكونات الرفوف متوفرة في الملف الإضافي 1. اتبع معايير الطباعة المحددة لخزان القاعدة. اختبر الخزان قبل الاستخدام بملئه بنسبة 70٪ من الإيثانول واستخدام الطرد المركزي لفترات متزايدة (1، 2، 5، 10، و30 دقيقة) للتأكد من عدم وجود تسرب أو ضرر هيكلي.
2. قم بلصق مكونات الخزان الأساسي معا لتشكيل وحدة محكمة الإغلاق.

2. الزراعة البكتيرية والتحلل

1. قم بتلقيح محولات الإشريكية القولونية إلى 3–5 مل من وسط LB يحتوي على مضادات حيوية مناسبة. الحضانة طوال الليل (12–16 ساعة) عند 37 درجة مئوية مع الرج.
2. احصد الخلايا بالطرد المركزي عند 2000 × جرام لمدة 10 دقائق. تخلص من السوبرناتانت.
   ملاحظة: يمكن تخزين حبيبات الخلايا عند −20 درجة مئوية قبل المعالجة.
3. أضف 250 ميكرولتر من مخزن إعادة التعليق (Buffer P1 مع RNase A) إلى الكريهة. أعد تعليقها تماما عن طريق الدوامة أو التوصيل بالماصة.
4. أضف 250 ميكرولتر من مخزن التحليل (Buffer P2). اخلط بعكس الأنبوب بلطف 4–6 مرات.
   ملاحظة: تجنب الخلط القوي لمنع قص الحمض النووي الجيني.
5. أضف 350 ميكرولتر من مخزن التعادلية (مخزن N3). قم بالمزج فورا جيدا عن طريق الانقلاب.
   ملاحظة: يجب أن يتكون ترسيب أبيض، مما يدل على نجاح التعادل.

3. تجميع وحدة الترشيح

1. ضع أعمدة ربط الحمض النووي في طبقة حامل الأعمدة في الرف.
2. ضع أغطية الأعمدة في فتحات مخصصة لتثبيتها أثناء الطرد المركزي.
3. ضع أعمدة التوضيح/التصفية في طبقة عمود المرشح مباشرة فوق أعمدة الربط.
   ملاحظة: إذا لم تكن أعمدة المرشح متوفرة، قم بطرد المركزي بعمل الليزات في أنابيب دقيقة وانقل المادة الفائقة إلى أعمدة الربط.

4. إزالة الليسات وارتباط الحمض النووي

1. انقل المحايد من الخطوة 2.5 إلى أعمدة الترشيح.
2. ضع الرف المجمع في دوار صفائح دلو متأرجح.
   تحذير: تأكد من التوازن الصحيح باستخدام رف وزن موازن بنفس الكتلة ونفس التكوين.
3. الطرد المركزي بحرارة 2000 × جرام لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة.
4. أزل الرف من جهاز الطرد المركزي.
5. قم بإزالة وتخلص من طبقة عمود الفلتر.

5. الغسيل

1. تخلص من التدفق من الخزان إلى حاوية نفايات. أعد تجميع الرف بأعمدة ربط.
2. أضف 500–700 ميكرولتر من مخزن الغسيل إلى كل عمود ربط باستخدام ماصحة متعددة القنوات.
3. الطرد المركزي عند 2000 × جرام لمدة دقيقة واحدة.
4. تخلص من التدفق من الخزان.
5. كرر عملية الغسل بإضافة حاجز غسيل لكل عمود والطرد المركزي عند 2000 × جرام لمدة دقيقة واحدة.
   ملاحظة: يمكن تخزين الأعمدة في درجة حرارة الغرفة أو 4 درجات مئوية بعد الغسيل.

6. التجفيف والاستنتاج

1. أزل أعمدة الربط من الرف وانقلها إلى أنابيب تجميع بسعة 2 مل.
2. استخدم الطرد المركزي على >10,000 × جرام لمدة دقيقة واحدة لتجفيف الغشاء.
3. نقل الأعمدة إلى أنابيب نظيفة بسعة 1.5 مل.
4. أضف 50 ميكرولتر من محلول التسيح أو الماء مباشرة إلى الغشاء. حضن لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة.
5. الطرد المركزي عند >10,000 × جرام لمدة دقيقة واحدة لاستخراج الحمض النووي.

7. اختياري: الترسيب المشترك مع ثاني أكسيد التيتانيوم

1. امزج حاجز التحلل مع مسحوق ثاني أكسيد التيتانيوم بنسبة حجم إلى كتلة 2:1.
2. أضف 250 ميكرولتر من تعليق ثاني أكسيد التيتانيوم إلى الليزات. امزج عن طريق الانعكاس.
3. أضف 350 ميكرولتر من مخزن التعادل، وامزج جيدا.
4. الطرد المركزي عند 2000 × جرام لمدة دقيقة واحدة.
5. اجمع المادة الفائقة دون إزعاج الترسبة.
6. انقل المادة الفائقة إلى عمود الربط.

النتائج

تنويعات الرفوف
طورنا أربع نسخ من الرفوف المناسبة لمجموعة واسعة من نماذج الطرد المركزي، مما يسمح باستخدام الموارد المتاحة في بيئات مختبرية مختلفة وتلبية تفضيلات المستخدمين. جميع الرفوف تتميز بنظام 24 بئرا، ولكن حسب الإصدار، تتضمن مواقع جلوس إضافية للأعمدة. الأبعاد التفصيلية والتوافق موفقان في الملف التكميلي 2. تم توفير صورة عالية الدقة للرف المجمع في الشكل التكميلي S1.

النسخة الأساسية من الرف (الشكل 1) هي التكوين الأكثر إنتاجية. يتكون من أربعة أجزاء وله أبعاد 88 × 130 × 77 مم. يسمح باستخدام ما يصل إلى 48 عمودا في نفس الوقت عند استخدام أعمدة ذات حروف كبيرة، أو حتى 116 عمودا عند استخدام أعمدة بدون حروف كبيرة. تم تصميم مكونات الرف لتسهيل الاستخدام ولتقليل التأثيرات غير المرغوبة أثناء الطرد المركزي. توضع أعمدة الدوران في طبقة الأعمدة، والتي تحتوي على أخاديد لإدخال الأغطية؛ يمكن لهذه الأخاديد نفسها أيضا استيعاب أعمدة بدون أغطية. طبقة الأعمدة تقع على الخزان. فتحة تصريف الأعمدة موضوعة فوق فتحة الخزان، مما يساعد على تقليل الرش بين الأعمدة المجاورة. يصرف السائل من خلال فتحة في أسفل فتحة القطع إلى الخزان. سعة الخزان حوالي 100 مل، وتستوعب درجتين للغسل مع حمل عمودي عالي. يمكن وضع طبقة عمود المرشح فوق طبقة العمود عند الحاجة، مع وضع أعمدة المرشح فوق أعمدة الربط. يغلق الغطاء الطبقة التي تحتوي على أعمدة المرشح أو الربط، مما يحد من تدفق الهواء أثناء دوران الطرد المركزي. النسخة الأساسية من الرف متوافقة مع دوارات الدلو A-2-DWP (مثل Eppendorf 5804)، أو دوار 1770 (مثل HETTICH Rotina 380)، أو أنظمة مكافئة.

نسخة الرف الصغير (الشكل 2) مناسبة لمجموعة واسعة من دوارات دلو الطرد المركزي. يتكون من ثلاثة أجزاء وله أبعاد دنيا 82.5 × 128 × 58 مم (مع طبقة عمود المرشح). يسمح باستخدام ما يصل إلى 48 عمودا مع أغطية أو حتى 90 عمودا بدون أغطية. هندسة هذا الإصدار مشابهة لهندسة الرف الأساسي، لكن الصفوف الخارجية لمواقع الأعمدة تزال وتستبدل بأخاديد لأغطية الأعمدة. تختلف سعة الخزان حسب النسخة المطبوعة. أصغر خزان (20 ملم) يتسع لخطوة غسل واحدة لحوالي 30 عمودا؛ تسمح الخزانات الأكبر بمعدل نقل أعلى. طبقة عمود المرشح لها حواف مستديرة للسماح بحركة دلو الدوار في أجهزة الطرد المركزي الصغيرة. نسخة الرف الصغير متوافقة مع أقراص UC-124 (مثل Accumax iFuge UC02) أو أنظمة ما يعادلها. عند استخدامه بدون طبقة عمود المرشح، يكون الرف متوافقا مع دوارات الدلو A-2-MTP (مثل Eppendorf 5430) أو نظيراتها المشابهة.

النسخة بدون خزان (مكشوفة) (الشكل 3) مناسبة للمستخدمين ذوي الخبرة المحدودة في الطباعة ثلاثية الأبعاد، حيث يتم استبدال الخزان بحاوية خارجية مثل صندوق الطباعة الماصة. تتكون هذه النسخة من ثلاثة أجزاء وقياسها 79 × 115 × 61.5 مم. يسمح باستخدام ما يصل إلى 48 عمودا مع أغطية أو حتى 78 عمودا بدون أغطية. الهندسة مشابهة للإصدارات السابقة لكنها تفتقر إلى خزان مدمج. بدلا من ذلك، يستخدم حاوية مناسبة لجمع النفايات. طبقات الأعمدة والمرشح تحتوي على أماكن جلوس أقل، وطبقة المرشح تشمل مقاعد مخروطية لتجنب التداخل مع حركة الدوار. تم تصميم القاعدة لتناسب الحاويات القياسية ويمكن تثبيتها باستخدام فواصل جانبية. تعتمد التوافق على الحاوية المختارة لكنها تشمل دوارات دلو A-2-DWP (مثل Eppendorf 5804)، ودوارات 1770 (مثل HETTICH Rotina 380)، وأقراص دلو UC-124 (مثل Accumax iFuge UC02).

نسخة رف الغطاء (الشكل 4) هي أبسط تكوين وتستخدم مع ألواح بئر عميقة بسعة 5 مل أو 10 مل بعمق 24 بئر. يتكون من مكون واحد بأبعاد 73 × 109 × 4 مم ويسمح باستخدام ما يصل إلى 48 عمودا. هذا الإصدار متوافق مع أي دوار طرد مركزي يدعم تنسيق اللوحة المقابل.

العائد والنقاء
تم إجراء استخراج الحمض النووي على مزارع الإشريكية القولونية باستخدام كل من بروتوكول الطرد المركزي الدقيق اليدوي القياسي والطريقة المعتمدة على الرف. أظهر التحليل الطيفي الضوئي أن جودة الحمض النووي المستخرج باستخدام الرفوف كانت مماثلة لتلك التي تم الحصول عليها بالطريقة القياسية. تراوحت نسب A260/A280 النموذجية بين 1.8 و1.9 لكلا الطريقتين. أظهر إجمالي عائد البلازميدات (μg) عدم وجود فرق كبير بين الطريقة التقليدية والاستخراج باستخدام تكوينات الرفوف (الشكل 5)؛ يتم توفير البيانات الخام في الملف التكميلي 2. كما تم الحفاظ على شكل البلازميدات، مع توزيعات مماثلة للأشكال المسترخية، الخطية، والفائقة الملفوفة (الشكل 6).

تحليل التلوث المتبادل
لتقييم التلوث المتبادل المحتمل، أجريت تجربة على رقعة الشطرنج. تم تحميل الأعمدة بالتناوب بمحلول بروميد إيثيديوم عالي التركيز (محاكاة DNA عالي التيتر) والماء. بعد الطرد المركزي عند 2000 × جرام، تم حصر توزيع الصبغة في منطقة النفايات مباشرة تحت الأعمدة المحملة، ولم يتم اكتشاف أي إشارة مرئية في الآبار المجاورة أو على أطراف الأعمدة المجاورة (الشكل 7). تشير هذه الملاحظات إلى أن تصميم الرف يقلل من احتمالية الرش والنقل عبر الأعمدة تحت الظروف المجربة.

لتقييم التلوث بشكل أعمق، تم إجراء PCR في الوقت الحقيقي باستخدام مكبر كملوث (انظر الملف التكميلي 2). تم اكتشاف التضخيم فقط في الإشارات من الأعمدة التي أضيف إليها المضخم (الشكل 8). تحت الظروف المجربة، لم يتم اكتشاف أي تلوث متبادل؛ ومع ذلك، قد يختلف الأداء حسب سير العمل ونوع العينة.

الشكل 1: النسخة الأساسية من مخطط تجميع الرف. عرض CAD متفجر يظهر (A) غطاء الكلب، (B) طبقة عمود المرشح، (C) طبقة حامل الأعمود، و(D) خزان القاعدة. يتكون الرف من أربعة أجزاء بأبعاد 88 × 130 × 77 مم ويسمح باستخدام ما يصل إلى 48 عمودا مع أغطية أو حتى 116 عمودا بدون أغطية. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 2: نسخة مصغرة من مخطط تجميع الرفوف. عرض CAD متفجر يظهر (A) طبقة عمود المرشح، (B) طبقة حامل الأعمود، و(C) الخزان الأساسي. هذا الإصدار مشابه هندسيا للنسخة الأساسية، لكن يتم إزالة صفي مقاعد الأعمدة الجانبيين واستبدالهما بأخاديد لأغطية الأعمدة. يتكون من ثلاثة أجزاء، وله أبعاد دنيا 82.5 × 128 × 58 مم (مع طبقة عمود المرشح)، ويسمح باستخدام ما يصل إلى 48 عمودا مع أغطية أو حتى 90 عمودا بدون أغطية. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 3: نسخة بدون خزان (غير مغطاة) من مخطط تجميع الرفوف. عرض CAD متفجر يظهر (A) طبقة عمود الفلتر، (B) طبقة حامل العمود، (C) الأساس، و(D) صندوق رأس الماصة. تستبدل هذه النسخة الخزان المدمج بحاوية خارجية مثل صندوق رؤوس الماصة. يتكون من ثلاثة أجزاء، وله أبعاد 79 × 115 × 61.5 مم، ويسمح باستخدام ما يصل إلى 48 عمودا مع أغطية أو حتى 78 عمودا بدون أغطية. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 4: نسخة الغطاء من رفوف 24 بئر. العرض العلوي (اليسار) والأسفل (اليمين). هذه هي أبسط نسخة رف، تستخدم مع ألواح بعمق 5 أو 10 مل بعمق 24 بئئر. يتكون من جزء واحد بأبعاد 73 × 109 × 4 مم ويسمح باستخدام ما يصل إلى 48 عمودا مع أو بدون أغطية. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 5: مقارنة بين عائد الحمض النووي ونقائه. التحليل الطيفي الفوتومتري لعائد البلازميدات (ميكروغرام/مل). لم يلاحظ فرق ذو دلالة إحصائية في إجمالي عائد البلازميدات بين الطريقة التقليدية والاستخراج باستخدام تكوينات الرفوف. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 6: مقارنة جودة الحمض النووي. تم تصور أشكال الحمض النووي بواسطة الرحلان الكهربائي بجل الأجاروز. الأشكال المرخية والخطية والفائقة الملفوفة من الحمض النووي متشابهة بين الاستخلاص اليدوي القياسي والاستخراج المعتمد على الرفوف. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 7: تقييم التلوث المتبادل. عرض لخزان النفايات بعد الطرد المركزي، يظهر برك نفايات منفصلة دون تداخل. تم تحميل الأعمدة بمحلول بروميد إيثيديوم عالي التركيز (محاكاة حمض نووي عالي التيتر) وماء. لم يلاحظ أي صبغة في آبار "المياه" المجاورة أو على أطراف الأعمدة المجاورة بعد الطرد المركزي، مما يشير إلى انخفاض الرش وانتقال الأعمدة العرضية تحت الظروف المجربة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 8: تحليل التلوث المتبادل باستخدام PCR الكمي. تظهر منحنيات التضخيم للعينات التي تحتوي على عامل ملوث باللون الأحمر، بينما تظهر العينات التي تحتوي فقط على الماء باللون الأخضر. تم اكتشاف التضخيم فقط في العينات التي تحتوي على عامل الملوث. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الملف الإضافي 1: ملفات نماذج ثلاثية الأبعاد لتصاميم الرفوف. تحتوي مجموعة الملفات هذه على ملفات STL لجميع تكوينات الرفوف، بما في ذلك نسخة الرف الأساسية، ونسخة الرف المصغر (مع عدة نسخ من ارتفاع الخزان)، والنسخة بدون خزان، ونسخة رف المكثف. يتم توفير مكونات فردية (مثل خزان الأساس، طبقة حامل الأعمدة، طبقة عمود المرشح، والغطاء) للطباعة ثلاثية الأبعاد. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الملف التكميلي 2: البيانات والأساليب الداعمة. تحتوي هذه المجموعة على جدول توافق أجهزة الطرد المركزي، وإجراء اختبار التلوث المتبادل التفصيلي، ومجموعات بيانات عائد الحمض النووي الخام، وملفات إخراج أجهزة PCR المرتبطة بتحليل التلوث. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الشكل الإضافي S1: نسخة الرف الأساسية (مجمعة بالكامل). صورة عالية الدقة لتكوين الرف الأساسي المجمع بالكامل، توضح البنية العامة وترتيب المكونات. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

المناقشة

يعالج هذا البروتوكول "فجوة الإنتاجية" في العديد من مختبرات علم الأحياء الجزيئي. بينما تكون ألواح المرشح ذات 96 بئر أسرع، إلا أنها قد تظهر قدرات ارتباط أقل أو تركيزات نهائية أقل مقارنة بأعمدة الدوران الفردية¹⁴. من خلال تكييف أعمدة الدوران القياسية مع صيغة دوار الصفائح، تجمع هذه الطريقة بين العائد العالي للأعمدة وسرعة سير العمل القائم على اللوحة.

تكون الرفوف أكثر فائدة عند معالجة أكثر من 12 عينة. الابتكار الرئيسي في البروتوكول هو استخدام رفوف بسعة 24 بئرا، التي تسهل وتسرع استخراج الحمض النووي القائم على الأعمدة من خلال استخدام خزان مشترك للتخلص من المحاليل الفائقة والغسيل. عند استخدام الرفوف، الوقت المطلوب لأداء هذه الخطوات ل 14–116 عينة مماثل للوقت المطلوب ل 2–12 عينات. علاوة على ذلك، يقل جهد المشغل، حيث يتم تقليل الخطوات المتكررة مثل إزالة الأنابيب الفردية، نقل الأعمدة، التخلص من محاليل الغسيل، وفتح الأغطية. نظرا لأن مكونات المجموعة الأصلية (المحاليل وأعمدة الدوران) تبقى دون تغيير، يتوقع جودة DNA مماثلة وتدعمها النتائج المقدمة.

الطباعة ثلاثية الأبعاد لرفوف 24 بئر ممكنة مع المعدات القياسية لكنها قد تتطلب خبرة في النسخ الأساسية والصغيرة. النسخ بدون خزان ورافعة الغطاء أبسط ويمكن إنتاجها بخبرة طباعة محدودة. اعتبار رئيسي في نمذجة الترسيب المنصهرة هو تكوين الفجوات الدقيقة بين الطبقات، والتي قد تؤثر على مقاومة الماء تحت الطرد المركزي. أظهرت الاختبارات أن الحشو بنسبة 100٪، وسماكة جدار الخزان 7 مم، وارتفاع طبقة 0.1 مم توفر مقاومة كافية للماء. تسخين سرير الطباعة وتطبيق تنعيم السطح حسن أداء الختم بشكل أكبر. على النقيض من ذلك، لم تكن طرق الختم بعد الطباعة باستخدام راتنجات الإيبوكسي أو المذيبات العضوية فعالة، حيث أدى التشوه أثناء الطرد المركزي إلى التشقق والتسرب. كما أن سمك الجدران غير الكاف قد يؤدي إلى فشل هيكلي وفقدان مقاومة الماء، مما قد يؤدي إلى اختلال في توازن الطرد المركزي. لذلك، يوصى بإجراء اختبار ما قبل الاستخدام للمكونات المطبوعة.

الإصدارات ذات الأربعة رفوف مناسبة لمجموعة واسعة من أجهزة الطرد المركزي المزودة بدوارات دلو، مما يسمح للمستخدمين باختيار التكوين الذي يتناسب مع معداتهم ومتطلبات النقل بشكل أفضل. النسخة الأساسية ذات الرف توفر أعلى معدل نقل لكنها تتطلب أجهزة طرد مركزي أكبر وجودة طباعة أعلى. النسخة الصغيرة تقلل من متطلبات حجم الطرد المركزي لكنها تقلل أيضا من معدل الإنتاجية. النسخة بدون خزان تبسط التصنيع وتتوافق مع الحاويات المتوفرة عادة مثل صناديق رؤوس الماصات، رغم أن التوافق يعتمد على هندسة الحاويات. نسخة cap-rack هي أبسط تكوين لكنها لا يمكن استخدامها مع أعمدة المرشح.

قد تكون أعمدة المرشح التي لا ترتبط بالأحماض النووية أقل توفرا من أعمدة الربط القياسية⁹. في غيابها، قد تكون هناك حاجة إلى خطوات توضيح إضافية، مما يزيد من وقت المعالجة الكلي. بدلا من ذلك، يمكن استخدام رؤوس ماصة الفلتر (1000 ميكرولتر) أو بروتوكول ثاني أكسيد التيتانيوم.

تعمل رفوف الاستخراج كملحق ميكانيكي لسير عمل استخراج الحمض النووي القياسي⁹ ولا تغير تركيبة المخزن أو كيمياء العمود (باستثناء متغير ثاني أكسيد التيتانيوم). وبناء عليه، لا يتوقع تأثير كبير على جودة الحمض النووي، وهو ما يتوافق مع الرحلان الكهربائي بجل الأجاروز ومقارنات النتائج التي تظهر أشكال وكميات البلازميدات المتشابهة مقارنة بالطريقة القياسية.

على الرغم من أن استخدام خزان نفايات مشترك يشكل خطرا محتملا للتلوث المتبادل، إلا أن ذلك لم يلاحظ في الظروف التي تم اختبارها. ميزة تصميم رئيسية هي هندسة "المدخنة" لمخارج الأعمدة، التي تحافظ على الفصل بين أطراف الأعمدة وسطح سائل النفايات. للحفاظ على هذا الفصل، يجب عدم امتلاء الخزان بشكل مفرط، وينصح بتفريغه بعد كل تدفق كامل.

أحد قيود الطريقة هو السرعة القصوى لدوارات الدلو المتأرجحة (عادة 2000 × جرام). رغم أنها كافية لخطوات الربط والغسيل، إلا أن هذه السرعة ليست كافية لتجفيف الغشاء بالكامل. لذلك، هناك حاجة إلى خطوة طرد مركزية نهائية عالية السرعة في جهاز طرد مركزي دقيق بزاوية ثابتة. على الرغم من هذه الخطوة الإضافية، لا تزال التوفير الإجمالي للوقت كبيرا للدفعات التي تتجاوز 24 عينات.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
3D Printer Filament	NIT، روسيا	-	يوصى باستخدام PETG أو PLA
Buffer N3	Qiagen، هولندا	19064
Buffer P1	Qiagen، هولندا	19051
Buffer P2	Qiagen، هولندا	19052
Creality Ender-3 S1 Pro	Creality، الصين
Elution Buffer	Qiagen، هولندا	19086
Eppendorf Centrifuge 5702	Eppendorf، ألمانيا	22626001	روتور زاوية ثابتة
Eppendorf Centrifuge 5804 R	Eppendorf، ألمانيا	22625080	لوحة دوران براميل
Ethidium Bromide	Biolabmix، روسيا	EtBr-10
Frit of 1000 μL Filter Pipette Tip	GenFollower، الصين	E-FTB1000	جزء من Filter Columns
Miniprep Without Filter Barrier Spin Column	JVLAB، الصين	-	جزء من Filter Columns
Phenol Red	Lenreactiv، روسيا	200125
PrusaSlicer	Prusa Research، جمهورية التشيك
QIAprep 2.0 Spin Miniprep Columns	Qiagen، هولندا	27115
RNase A	Qiagen، هولندا	19101
Wash Buffer	Qiagen، هولندا	19065