منصة رقمية للمسامية الكهربائية الميكروفلويدية لتحرير جينوم كريسبر منخفض الإدخال ونقل mRNA في الخلايا التائية المعلقة ونماذج الخلايا ثلاثية الأبعاد

ملخص

يصف هذا البروتوكول تعديل الجينوم المصغر لمستقبل TCRα/β بواسطة CRISPR–Cas9 في خلايا T البشرية الأولية باستخدام 'DMF-ection'، وهو منصة إلكترونية للتحميص الكهربائي الميكروفلويدية الرقمية (DMF). تمكن الطريقة من تحرير الجينات المتوازي منخفض الإدخال مع صلاحية عالية، وهي قابلة للتكيف أكثر لتوصيل mRNA إلى الكرويدات ثلاثية الأبعاد متعددة الخلايا.

الملخص

يتيح التوزيع الكهربائي للميكروفلويديك الرقمي (DMF) التلاعب الجيني الدقيق ومنخفض الحجم في الخلايا الثديية، مع تقليل مدخلات الخلايا بما يصل إلى 100 ضعف والحفاظ على البقاء. تقدم هذه الدراسة سير عمل نقل عالي الإنتاجية قائم على DMF لإزالة موقع TRAC بوساطة CRISPR في خلايا T المعلقة البشرية الأولية، وللنقل الريبي الريبي لكرويدات HEK293T ثلاثية الأبعاد. باستخدام RNA دليل كريسبر الموزعة مكانيا وتجميع الريبونوكليوبروتين (RNP) على الخراطش، تم تحقيق اضطراب فعال في مواقع TRAC في كل من مجموعات خلايا T من CD4⁺ وCD8⁺ باستخدام 10,000 خلية فقط لكل حالة، مع تجاوزت صلاحيات ما بعد التحرير 85٪. كشفت التوصيف الفيزيائي الحيوي باستخدام تحليلات التشتت المحفز بالتدفق وتايلور أن إضافات البوليمرات تستقر مركبات Cas9–sgRNA تحت ظروف مخزن التقشير الكهربائي، مما يدعم التحرير القابل للتكرار عند أحجام أقل من ميكرولتر. تم تعديل سير العمل أكثر للتطبيقات ثلاثية الأبعاد من خلال توصيل mRNA من EGFP إلى كرويدات HEK293T سليمة، مما أدى إلى فلورة قوية وموحدة مكانيا دون التأثير على نمو أو شكل الكرويد. تظهر هذه النتائج معا أن التسامح الكهربائي في DMF يمكن من تحرير الجينوم بكفاءة وتوصيل mRNA عبر كل من الخلايا المناعية المعلقة والكرويدات متعددة الخلايا. توفر هذه المنصة حلا قابلا للتوسع ومنخفض الإدخال لتطبيقات علاج خلايا CAR-T، وعلم الجينوم الوظيفي، والنماذج الخلوية ثلاثية الأبعاد المتقدمة.

المقدمة

يعد تحرير الجينات في الخلايا البشرية الأولية مركزيا بشكل متزايد لكل من تطوير العلاج والبحث الأساسي، بما في ذلك التطبيقات في الهندسة المناعية، ونمذجة الأمراض النادرة، والجينوم الوظيفي¹. على الرغم من أن التوزيع الكهربائي يتيح تحرير جينوم عالي الكفاءة، إلا أن الأنظمة التقليدية المعتمدة على الكوفيت تتطلب عادة ما يصل إلى ملايين الخلايا في كل حالة، مما يحد من استخدامها للعينات المستمدة من المرضى ومجموعات المناعة النادرة². بالإضافة إلى ذلك، هذه الأنظمة غير مناسبة للفحص واسع النطاق بسبب محدودية في النقل والأتمتة واستهلاك الكواشف³.

برز التساميح الكهربائي الميكروفلويدي كنهج واعد لتحرير الجينوم منخفض المدخلات⁴. ومع ذلك، تعتمد معظم المنصات الحالية على هياكل تدفق مستمر تتضمن معالجة سوائل معقدة، ومرونة محدودة في خلط الكواشف، ومتطلبات عالية نسبيا لكل حالة لكل حالة. على النقيض من ذلك، تتيح الميكروفلويدية الرقمية (DMF) التلاعب النشط بقطرات بحجم النانولتر المنفصلة على مصفوفة أقطاب مستوية، مما يسمح بالتحكم الدقيق في تركيب التفاعل والتوقيت وتحديد الموقع المكاني. هذا التنسيق القائم على القطرات القابل للتوصيل والتشغيل مناسب جيدا لسير العمل منخفض الحجم وعالي الإنتاجية حيث يكون الحفاظ على الخلايا الأولية والكواشف أمرا ضروريا.⁵.

أظهرت الأعمال الحديثة جدوى التوصيل داخل الخلايا المعتمد على DMF باستخدام هياكل التقشير الكهربائي ثلاثية القطرات التي تولد مجالات كهربائية محلية منخفضة التيار لتوصيل RNP وmRNA بكفاءة مع تقليل الإجهاد الحراري والكهروكيميائي ^6,7,8. استنادا إلى هذا الأساس، تم تطوير منصة الحفر الكهربائية من الجيل التالي DMF، تسمى 'DMF-ection'، والتي تضم 48 موقع تفاعل قابل للعناونة بشكل مستقل، وتوافق كامل للأتمتة، وتصنيع خرطوشات قابلة للتوسع⁹ (الشكل 1). تتكون خرطوشة DMF من لوحة PCB سفلية ولوحة علوية بلاستيكية مفصولة بحشية، يتم تجميعها عبر مشابك محاذاة في اتجاه صحيح واحد (الشكل 1A). يتم تنظيم تخطيط 48 ضلاعا في ثماني عائلات متطابقة (الشكل 1A–H)، كل منها يحتوي على ستة مواقع كهرباء قابلة للعناونة بشكل مستقل، تدعم حتى 48 حالة تحرير متوازية لكل خرطوشة (الشكل 1B). يتم وضع مكتبات RNA التوجيهية على سطح الركيزة باستخدام موزع صوتي قبل تجميع الخرطوشة. تم تأكيد دقة الترسيب الموضعية عبر جميع المواقع ال 48، مع تجمع مواقع الإسقاط ضمن انحراف أقل من المليمتر عن منتصف القطب (الشكل 1C)، مما يدعم تجميع RNP موثوق على الخرطوشة. بعد التحميل، يتم تشغيل الخلايا وقطرات الأقطاب السائلة على الخرطوشة لتشكيل هندسة التقميم الكهربائي ثلاثي القطرات (الشكل 1D). بعد التسامح الكهربائي، يتم تفريغ الخلايا في ألواح الزراعة للاسترجاع والتحليل في المراحل النهائية، بما في ذلك قياس خلوية التدفق، والتتابع، والمجهر (الشكل 1E). يتيح هذا النظام تحرير الجينوم عالي الكفاءة باستخدام خلية أقل بحوالي 100 ضعف مقارنة بالطرق التقليدية المعتمدة على الكوفيت، مما يوسع بشكل كبير الوصول إلى هندسة الجينوم في التطبيقات منخفضة الإدخال وعالية الإنتاجية.

تقيم هذه الدراسة أداء المنصة من خلال توصيل عدة شحنات حيوية جزيئية، بما في ذلك مجمعات mRNA وCRISPR–Cas9 (RNP)، مما يحقق عملية نقل فعالة وتعطيل جيني. بالإضافة إلى الخلايا التائية الأولية، يوفر DMF-ection إطارا قابلا للتعميم لتوصيل الأحماض النووية إلى هياكل متعددة الخلايا المعقدة. تفرض الكرويدات ثلاثية الأبعاد (3D) ونماذج النوع العضوي حواجز كبيرة أمام اختراق الكواشف بسبب بنيتها وهشاشتها، وغالبا ما تؤدي طرق التحليل الكهربائي التقليدية إلى تعطيل الشكل أو تولد توصيلا غير متجانس. لتقييم ما إذا كانت نفس مبادئ التقميم الكهربائي المصغرة المستخدمة في تحرير الخلايا التائية تمتد إلى الأنسجة المنظمة، تم تطبيق سير عمل DMF على الكرويدات ثلاثية الأبعاد HEK293T. أظهرت هذه التجارب أن الترطيب الكهربائي القائم على DMF يمكنه تموضع الكريات السليمة بلطف ضمن هندسة القطرات الثلاثية ودعم توصيل mRNA بشكل منتظم مع الحفاظ على البنية والنمو. على الرغم من أن هذه النتائج خارج بروتوكول الخلايا التائية الأساسي الموضح هنا، إلا أنها توضح التطبيق الأوسع للتعرض الكهربائي للديناميكية القابلة للبرمجة في أنظمة الخلايا ثلاثية الأبعاد الناشئة ذات الصلة باكتشاف الأدوية ونمذجة الأمراض.

البروتوكول

تم الحصول على الخلايا التائية البشرية الأولية المستخدمة في هذا البروتوكول من موردين تجاريين بموافقة متبرع مستنيرة ووفقا للإرشادات المؤسسية والأخلاقية والتنظيمية المعمول بها. تم إجراء جميع عمليات التعامل مع المواد البيولوجية المشتقة من الإنسان وفقا لبروتوكولات السلامة البيولوجية المؤسسية. الباحثون الذين ينفذون هذا البروتوكول مسؤولون عن ضمان أن استخدامهم للخلايا البشرية الأولية يتوافق مع متطلبات لجنة المراجعة المؤسسية المحلية (IRB) أو لجنة الأخلاقيات، واللوائح المعمول بها للسلامة البيولوجية، وأي تشريعات وطنية أو إقليمية ذات صلة تحكم استخدام المواد البيولوجية البشرية. لم تكن هناك معلومات يمكن التعرف عليها من قبل المريض مرتبطة بالمادة الخلوية المستخدمة في هذه الدراسة.

1. تحضير وتنشيط الخلايا التائية البشرية الأولية

1. إذابة الخلايا التائية البشرية الأولية CD3⁺ بسرعة في حمام ماء بدرجة حرارة 37 درجة مئوية. انقل الخلايا إلى وسط خلايا T الأساسية المسخن مسبقا وجهاز الطرد المركزي عند 180 × جرام لمدة 10 دقائق. تخلص من السوبرناتينت وأعد تعليق الحبيبات في وسط جديد.
2. تحديد تركيز الخلايا وقابليتها للبقاء باستخدام عداد الخلايا الآلي.
3. أعد تعليق الخلايا عند 1 ×^{10 خلايا} /مل في وسط زراعة الخلايا التائية مع محفز محفز لتنشيط خلايا T من الجسم المضاد رباعي الذوبان CD3/CD28 (وفقا لتعليمات البائع) و200 وحدة دولية/مل IL-2. احتضن الخلايا لمدة 72 ساعة عند 37 درجة مئوية، مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
   ملاحظة: حافظ على كثافة الخلايا بين 0.5–2 × 10⁶ خلايا/مل أثناء التفعيل. قم بتنفيذ التفعيل في صفائح U-bottom 96 لتحسين الاتصال بين الخلية والمنشط وكفاءة التفعيل.

2. تحضير بقع RNA إرشادية على ركيزة DMF (رصد موزع صوتي)

1. إعادة تكوين sgRNA المحمول بالليوفيل في مياه خالية من النوكلياز إلى تركيز مخزوني يبلغ 100 ميكرومو. في أنبوب منفصل، حضر مخزونا بسعة 100 ملغ/مل من حمض البولي-إل-جلوتاميك (PGA، ملح الصوديوم، ميغاواط 15,000–50,000 دالتون) في ماء خال من النوكليز. اجمع بين sgRNA ومخزون PGA بنسبة حجم 5:4 (sgRNA: PGA) مما ينتج تركيزا نهائيا ل sgRNA يبلغ 55.6 pmol/μL وتركيز نهائي PGA يبلغ 44.4 mg/mL في مياه خالية من النوكليز. يتم استخدام دوامة لفترة وجيزة ويقوم بالطرد المركزي عند 1,000 × جرام لمدة 30 ثانية ثم ينقل إلى أحجام للاستخدام الواحد ويخزن الأليكوات غير المستخدمة عند −80 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر.
   ملاحظة: تجنب تكرار دورات التجمد والذوبان.
2. أضف خليط الدليل-PGA إلى لوحة مصدر صوتية منخفضة الحجم الميت في الآبار التي تتوافق مع تخطيط موقع التفاعل المطلوب.
3. انقل 40 نانولتر (ما يعادل 2.2 pmol sgRNA) من خليط الدليل وPGA إلى كل منطقة رصد مستهدف في ركيزة DMF باستخدام موزع صوتي معاير.
   ملاحظة: عند 55.6 بيمول / ميكرولتر، 40 نانولتر يولد 2.2 بيمول sgRNA لكل موقع (55.6 × 0.040 = 2.22 بيمول لكل مكتر). يتم إعادة تشكيل الأدلة المجففة أثناء اندماج القطرات على الخرطوشة؛ يتم تأكيد إعادة التعليق الكامل من خلال كفاءة التحرير المتسقة عبر المواقع.
4. في خزانة السلامة البيولوجية، دع القطرات المنقطة تجف تماما في الهواء عند درجة حرارة الغرفة حتى لا يبقى سائل مرئي (حوالي 5 دقائق).
   ملاحظة: لا تستخدم تدفق الهواء القسري أو الحرارة، لأن ذلك قد يؤدي إلى تحريك أو تدهور الحمض النووي الريبي الدليل.
5. قم بتجميع خرطوشة DMF.
   1. في خزانة الأمان البيولوجي، قم بمحاذاة اللوحة العلوية فوق الركيزة المرقطة عن طريق مطابقة ميزات التثبيت البلاستيكية غير المتماثلة من اللوحة العلوية مع الشقوق الموجودة في اللوح السفلي. طبق ضغطا متساو ومتزامنا على الحواف القصيرة حتى يتم الشعور بحدوث انكسار ميكانيكي واضح، مما يؤكد التفاعل الكامل لميزات القفل.
      ملاحظة: تم تصميم الخرطوشة باتجاه صحيح واحد؛ التجميع الخاطئ لن ينتج عنه الانقطاع. ثبت الركائز من الحواف دائما لتجنب التلوث أو تلف الأسطح الوظيفية وتجنب انزلاق الركائز على بعضها البعض لأن ذلك قد يخدش الطلاءات السطحية.
   2. نقطة التفتيش: تأكد من التجميع الصحيح بواسطة المفتاح الميكانيكي.
      ملاحظة: لا يوجد مؤشر كهربائي قبل التشغيل على سلامة الطلاء؛ يتم اكتشاف أي أعطال وظيفية ناتجة عن التجميع غير السليم تلقائيا والإبلاغ عنها في تقرير مراقبة الجودة بعد التشغيل.
      نقطة التوقف: خزن الخراطيش المجمعة غير المستخدمة في عبوة محكمة الإغلاق مع مجفف (عبوات جل السيليكا) في درجة حرارة الغرفة لمدة تصل إلى 48 ساعة.

3. تحضير الخلايا

1. تحضير 1 مل من مخزن النقل الكامل حديثا قبل كل استخدام عن طريق دمج مخزن التعرض الكهربائي المتوافق مع DMF مع المادة الفعالة غير الأيونية المتوافقة حيويا مع المادة الفعالة غير الأيونية المتوافقة حيويا بنسبة 20:1 (v/v) (مخزن التعرض الكهربائي: مادة فعالة للتوتر السطحي)، مما ينتج تركيزا نهائيا للمادة الفعالة السطحية 0.05٪ (v/v). اخلط بلطف وحافظ على الثلج.
   ملاحظة: مخزن النقل المتوافق مع DMF المستخدم هنا هو عازل متساوي التوتر منخفض التوصيل (التوصيلية: 3.5 مللي سيث/سم، الأسمولالية: 305 موسيلم/لتر). يجب على الباحثين الذين يستخدمون المخازن البديلة التحقق من التوافق مع تفعيل DMF وإمكانية بقاء الخلية. المادة الفعالة غير الأيونية المتوافقة حيويا تعمل على تقليل تثبيت القطرات؛ إذا لم يستخدم المادة الفعالة المقدمة، فهناك بديل مناسب.
2. اغسل الخلايا التائية المنشطة مرة واحدة باستخدام محلول النقل (الذي لا يحتوي على مادة خافضة للتوتر السطحي). يتم الطرد المركزي عند 180 × جرام لمدة 5 دقائق، ثم استنشاق الفائق الفائق، وإعادة تعليق الحبيبات الخلوية في مخزن النقل الكامل (يحتوي على مادة خافضة التوتر) عند 1.0 × 10⁷ خلايا/مل بحجم إجمالي 100 ميكرولتر لكل خرطوشة. ابق على الجليد.
3. قبل التحميل مباشرة على الخرطوشة، أضف نوكلياز Cas9 مباشرة إلى 100 ميكرولتر من تعليق خلية T وامزجه بعمل عمل مزج لطيف؛ ابق على البرد.
   ملاحظة: بالنسبة لخلايا T الأساسية، يتم تحميل Cas9 بقوة 42 pmol لكل حجم خرطوشة 100 ميكرولتر (0.42 بيومول/ميكرولتر). كل موقع للتسامية الكهربائية يعالج حوالي 1 ميكرولتر من تعليق الخلية، مما يوفر 0.42 ميكرومول Cas9 لكل تعديل. قم بتحسين هذه الجرعة عند التكيف مع أنواع الخلايا المناعية الأخرى (انظر الجدول 1).

المكون	التركيز النهائي لكل تعديل
Cas9	0.42 pmol في قطرة ~1 ميكرولتر
sgRNA	2.1 pmol (من نقطة 40 نانوتاترول)
PGA	مخزون 44.4 ملغ/مل في خليط البقع
المادة السطحية	0.05٪ (صوت/ضج)
مدخلات الخلايا	~10,000 خلية

الجدول 1: جدول ملخص للتركيزات النهائية في كل قطرة تحويل.

4. النقل على منصة DMF-ection

1. باستخدام ماصة متعددة القنوات، يتم توزيع 10 ميكرولتر من خليط خلية T/Cas9 في كل من منافذ تحميل الخلايا الثمانية، و10 ميكرولتر من مخزن النقل الكامل إلى 16 منفذ تحميل للأقطاب السائلة (كما هو موضح في الشكل 1).
2. اضبط الجهد إلى 500 فولت، مدة النبضة إلى 3 مللي ثانية، وعدد النبضات إلى 2. ابدأ تسلسل التربية الكهربائية وفقا لتعليمات المنصة.
   1. نقطة التفتيش: راجع تقرير مراقبة الجودة بعد الجولة مباشرة بعد التشغيل. الأعطال المتقطعة (<10٪ من المواقع) لا تتطلب تدخلا. إذا كانت الأعطال منهجية، استبدل الخرطوشة بلوحة مراقبة الجودة المرفقة، وقم بإجراء فحص صحة النظام (~2 دقيقة)، وتواصل مع الدعم الفني إذا استمرت المشاكل.

5. تفريغ واستعادة الخلايا التائية المعدلة

1. باستخدام معالج سائل، نقل الخلايا الكهربائية من كل موقع تفاعل إلى صفيحة U-bottom بسعة 96 بئر تحتوي على 150 ميكرولتر من وسط خلايا T القاعدية المسخن مسبقا مع 200 IU/mL IL-2.
2. احتضن الخلايا لمدة 72 ساعة عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO₂ للسماح بتغير تغير البروتين وتعبير المستقبلات السطحية.

6. تحليل قياس التدفق الخلوي لضربة TRAC

1. نقل الخلايا إلى صفيحة سفلية مخروطية معقمة بسعة 96 بئر لتقليل فقدان الخلايا بين الغسلات. غسل الخلايا مرتين باستخدام مخزن تدفق الخلايا الخلوي (1× PBS، 2٪ FBS، 2 mM EDTA) عن طريق الطرد المركزي عند 400 × جرام لمدة 5 دقائق وإزالة المادة الفائقة عن طريق عكس الصفيحة المخروطية القاعية بلطف. ستبقى الخلايا متجمعة في اللوحة.
2. حضر خليط رئيسي لصبغ السطح يحتوي على أجسام مضادة ل CD4 ومضاد CD8 ومضاد TCRα/β في مخزن تدفق الخلايا بتركيزات موصى بها من الشركة المصنعة. أضف 25 ميكرولتر من الخليط الرئيسي لكل بئر واحتضن لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية محمية من الضوء. اغسل مرتين ب 1× PBS (بدون FBS) عن طريق الطرد المركزي عند 400 × جرام لمدة 5 دقائق. أعد تعليق الخلايا في 100 ميكرولتر من 1× PBS يحتوي على صبغة قابلة للحياة عند 1:1,000 (v/v) وحضن الخلايا لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة محمية من الضوء.
   ملاحظة: الصفائح القاعية المخروطية فعالة في تكوين الخلايا الحبيبية؛ تأكد من أن الخلايا معلقة بشكل جيد في جميع الخطوات.
3. غسل الخلايا مرتين باستخدام مخزن تدفق الخلايا وإعادة تعليقها في 150–200 ميكرولتر لكل عينة للجمع.
4. قم بتكوين جهاز قياس الخلايا باستخدام خطوط الليزر المناسبة ومجموعات المرشحات للفلوروكروم المستخدمة (مثل الإثارة 488 نانومتر لصبغة القابلية للحياة؛ 405 نانومتر أو 488 نانومتر لعلامات السطح حسب الحاجة). اضبط الفولتية باستخدام ضوابط تعويض الصبغة الواحدة وعينة غير مصبوغة. اجمع ما لا يقل عن 5,000 حدث سينغلت حي لكل عينة. البوابة متسلسلة: الخلايا المنفردة → الخلايا الحية (صبغة العيش سالبة) → CD4⁺ أو CD8⁺ → تعبير TCRα/β.
   ملاحظة: في الظروف القياسية، يمكن أن يتراوح إجمالي الأحداث الحية المكتسبة من 5,000 إلى أكثر من 10,000 لكل عينة بعد فقدان أثناء الغسل والتلوين، نظرا لأن الخلايا قد أتيحت لها وقت للتكاثر.
5. تحديد اضطراب جينات TRAC بقياس تكرار خلايا TCRα/β-سالبة داخل مجموعات CD4⁺ وCD8⁺. أبلغ عن كفاءة الإقصاء كنسبة من خلايا TCRα/β سالبة بالنسبة لبوابة المفردة الحية لكل مجموعة فرعية.

النتائج

النتائج المتوقعة
عادة ما يؤدي التثقيف الكهربائي ل 10,000 خلية T منشطة في كل حالة إلى كفاءة >85٪ من TRAC مع صلاحية >95٪ بعد 72 ساعة من النقل. تكشف قياس التدفق الخلوي عن فقدان واضح لتلوين TCRα/β في حالة استهداف TRAC مقارنة بضوابط sgRNA غير المستهدفة (NTC) والتحكم غير المتعرض لأي مجالات كهربائية. ما لم يذكر خلاف ذلك، يمثل n عمليات DMF-ection مستقلة تجرى في أيام منفصلة. تم حساب التكرارات التقنية من نفس الشريط قبل التحليل الإحصائي ولا تساهم بشكل مستقل في n. جميع تجارب الخلايا التائية المذكورة هنا أجريت باستخدام خلايا محجوزة بالتجميد مأخوذة من متبرع سليم واحد. يتم تمييز التباين بين المتبرع باستخدام نفس المنصة بشكل إضافي⁹.

تحسين استقرار بروتين الريبونوكليوبلاتين Cas9–sgRNA تحت ظروف التقميص الكهربائي بسبب إضافات البوليمر الأنيوني
أحد متطلبات التصميم الأساسية للميكروفلويدكس الرقمية هو سطح شديد الكاره للماء، مما يسمح للقطرات بالانزلاق بحرية أثناء الرطوبة الكهربائية. بينما تعتبر هذه الخاصية ضرورية لحركة القطرات والتشغيل الدقيق، إلا أنها تخلق تحديات في تحميل المواد الكيميائية. بالنسبة لتطبيقات الفحص المصفوفة، من الضروري أن يتم إيداع مكتبات الحمولة التي يحددها المستخدم مباشرة على سطح الخرطوشة. يتيح ذلك تخطيطات الكواشف من عكس تصميم مكتبة المستخدم ويضمن أن سير العمل الرقمي للميكروفلويديك يمكنه تنفيذ تجارب مصففة بسلاسة دون نقل إضافي أو تدخل يدوي. استبدال جهاز النانو بموزع صوتي مناسب جدا لهذه المهمة، حيث يمكنه نقل أحجام نانولتر بدقة موقعية عالية عبر مصفوفات كبيرة على أسطح مختلفة. ومع ذلك، عندما تصطدم القطرات بسطح خرطوشة كارهة للماء، غالبا ما ترتد أو تتراكم أو تفشل في الانتشار بشكل منتظم، مما يؤدي إلى ترسيب واسترداد غير متسق. تظهر هذه التباعدة بشكل خاص عند أحجام القطرات المتوسطة التي تتراوح بين 40 نانولتر إلى 120 نانولتر (الشكل 2A، n = 3 لكل شرط، *** قيمة p < 0.01)، حيث يفترض أن الطاقة الحركية للقطرة عالية بما يكفي لإحداث ارتداد، لكن الالتصاق السطح غير كاف لتثبيت السائل. نتيجة لذلك، يمكن أن يكون الترسيب المباشر على الخرطوشة عند جرعات حمولة أعلى غير موثوق به دون تعديلات إضافية. للتخفيف من هذا التأثير، تم إضافة المواد الكيميائية إلى المواد البوليمرية الحيوية بولي-إل-جلوتاميك أسيد (PGA). PGA هو بولي ببتيد قابل للتحلل الحيوي ومشحون سالبا يستخدم على نطاق واسع كمثبت في التركيبات الصيدلانية، ويتميز بتوافق ممتاز مع سير عمل الخلايا الحية. يفترض أن العمود الفقري المشحون يقلل من زاوية تلامس القطرات ويعزز الانتشار بشكل أكثر انتظاما، مما يقلل من الارتداد ويحسن التصاق السطح. مع وجود PGA، كانت أحجام الفلورسين الترسبة تتدرج خطيا مع الامتصاص، وتم تقليل التباين بشكل ملحوظ عبر الخراطش. أكدت التحليلات الإحصائية أن PGA حسن بشكل كبير قابلية التكرار عند أحجام الرصد 40 و90 و120 نانولتر (***p < 0.001، ****p < 0.0001)، بينما أظهرت القطرات الصغيرة جدا (10–20 نانولتر) فرقا ضئيلا، حيث يكون الارتداد أقل وضوحا عند الطاقات الحركية المنخفضة.

بعد ذلك، تم تقييم إضافة إضافات بوليمرية مستخدمة في سير عمل DMF لتأثيرها على سلوك الريبونوكليوبروتين Cas9–sgRNA (RNP) تحت ظروف المخزن المنخفض الحجم المستخدمة في التقميم الكهربائي. ولهذا الغرض، تم استخدام تقنية تحليل التشتت الناجم عن التدفق (FIDA). تم اختيار FIDA لأنه يوفر قياسا دقيقا لطور الحلول، لنصف قطر الهيدروديناميكا والألفة الارتباطية، مما يسمح بقياس تفاعلات البروتين مع الأحماض النووية تحت نفس ظروف العزل المستخدمة في بيئة تجريبية. أظهرت FIDA أن sgRNA الحر أظهر نصف قطر هيدروديناميكي (Rh) 3.45 ± 0.26 نانومتر، وهو ما يتوافق مع نوع صغير من RNA أحادي السلسلة. المعايرة مع Cas9 أنتجت مركب RNP مستقر ب Rh 15.32 ± 0.46 نانومتر وألفة ارتباط تحت النانوية (KD = 0.70 ± 0.14 نانومتر) (الشكل 2).

لتقييم تأثير تثبيت البوليمر، أضيف حمض بولي-إل-جلوتاميك (PGA) إلى الحمض النووي الريبي الموجه قبل تكوين RNP. أدى وجود PGA إلى تقليل التقارب الظاهر بين Cas9 و sgRNA (K_D = 67.7 ± 9.5 نانومتر) وخفض حجم المركب إلى حوالي 10 نانومتر (الشكل 2A في اللوحة اليمنى). على الرغم من أن انخفاض الألفة يشير إلى مركبات أقل ارتباطا، إلا أن_Rh الأصغر والأكثر انتظاما أشار إلى أن PGA يمنع تكوين تجمعات RNP كبيرة الحجم (الشكل 2B).

بعد ذلك، تم تقييم استقرار RNP تحت ظروف التسامح الكهربائي باستخدام تحليل تشتت تايلور (الشكل 2C). بدون بوليمر، أنتجت خلطات Cas9–sgRNA نماذج تايلورغرام واسعة وغير مناسبة تدل على التجمع (الشكل 2B). على النقيض من ذلك، أدى إضافة 0.0025 ملغ/ملليتر PGA إلى إنتاج ملفات توزيع أحادية محددة جيدا (R² = 0.999) مع R_h ~ 9.6 نانومتر. تظهر هذه النتائج أن PGA يمنع التجميع ويحسن توحيد RNP، مما يدعم التسامح الكهربائي القابل لإعادة الإنتاج على نطاق النانولتر. يوفر هذا الاستقرار مبررا ميكانيكيا لكفاءة التحرير العالية التي لوحظت في تجارب الخلايا التائية اللاحقة.

كفاءة التحرير المعتمدة على الجرعة في الخلايا التائية الأولية

على الرغم من أن تجارب FIDA أشارت إلى أن PGA يقلل من كفاءة تجميع RNP، إلا أن نتائج التحرير الوظيفي افترضت أنها أقل تأثرا، حيث يتم عادة إجراء التقميم الكهربائي باستخدام RNA مرشد زائد مقارنة ب Cas9. لذلك تم تقييم حجم الإدخال بين PGA–RNP لتأثيره على كفاءة الإخراج في الخلايا التائية البشرية الأولية في موقع TRAC (الشكل 2D). عبر أربع خراطيش، كانت كفاءة التحرير عالية باستمرار (>75–80٪) عند مدخلات RNP تبلغ 40 نانولتر (2.1 بيومول للولادة)، 20 نانولتر (1.05 بيكومول)، و10 نانولتر (0.53 بيومول مول)، مع تباين طفيف بين مجموعات CD4⁺ وCD8⁺ . حتى عند 5 نانولتر (0.26 بيومول)، ظل التعديل قويا، رغم لوحظ انخفاض طفيف مقارنة بالجرعات الأعلى. عند أدنى جرعة تم اختبارها (2.5 نانولتر، 0.13 بيكومول)، انخفضت كفاءة التعديل بشكل كبير، واستقرت بالقرب من ~60٪ من TRAC KO. أكدت أدوات التحكم خصوصية التحرير: حيث أظهرت آبار عدم التساقط الكهربائية (0V) والتحكم خارج الخرطوشة (OCC) فقط في الخلفية. التردد المرتفع لل TCR السلبي الذي لوحظ في مجموعة CD8⁺ خارج الخرطوشة (OCC) يعكس على الأرجح انخفاض معدل TCR الأساسي الخاص بالمتبرع بعد التفعيل، بغض النظر عن التوزيع الكهربائي أو تعديل الجينات، حيث لم تتعرض هذه الخلايا للخرطوشة. تظهر هذه النتائج معا أن DMF-ection يمكن التحرير الفعال بوساطة كريسبر عند مدخلات RNP على نطاق النانولتر. ومن المهم أن التحرير كان مشابها بين خلايا T CD4⁺ وCD8⁺ ، مما أبرز تطبيق المنصة عبر مجموعات الخلايا التائية واقترح أن استخدام RNP يمكن تقليله بأكثر من مرتبة دون التأثير على كفاءة الإقصاء.

الاضطراب الجيني الفعال في خلايا التوترا الأولية CD4⁺ وCD8⁺ باستخدام تقنية DMF-ection المصغرة
للتحقق من صحة أداء سير عمل DMF-ection بشكل أعمق، تم تقييم إزالة موقع TRAC بوساطة CRISPR–Cas9 في خلايا CD4⁺ وCD8⁺ T البشرية الأولية باستخدام 10,000 خلية نشطة فقط لكل حالة. تم تضمين ثلاث مجموعات تجريبية: حالة توجيه استهداف TRAC (TRAC KO)، وحالة التحكم غير المستهدفة (NTC) لأخذ التأثيرات غير المحددة لتوصيل RNP، ومجموعة تحكم خارج الخرطوشة (OCC) لتحديد تعبير TCRα/β الأساسي في الخلايا غير المعالجة وغير المعالجة. تم تطبيق استراتيجية بوابات قياسية لتحديد المجموعات الحية، تلتها مجموعات CD4⁺ وCD8⁺ وتعبير TCRα/β (الشكل 3A). تم تحقيق اضطراب جيني عالي الكفاءة لموقع TRAC في كلا المجموعتين الفرعيتين من الخلايا التائية عبر 40 عملية تقسيم كهربائي مستقلة. في خلايا CD4⁺ التائية، بلغت كفاءة إزالة TRAC 88.4 ± 4.9٪، مقارنة ب 3.2 ± 4.7٪ في NTC و9.8 ± 5.1٪ في حالات OCC. لوحظت نتيجة مماثلة في خلايا T في CD8⁺، حيث وصل TRAC KO إلى 89.8 ± 4.2٪، مقابل 4.2 ± 7.4٪ (NTC) و20.2 ± 4.9٪ (OCC) (الشكل 3B، اليسار). والأهم من ذلك، أن التعرض الكهربائي لم ينتج سمية خلوية كبيرة عبر الظروف. تجاوزت قابلية الحياة 96٪ في جميع المجموعات، دون وجود فرق كبير بين حالات TRAC KO (97.1 ± 1٪)، NTC (96.8 ± 1٪)، وOCC (97 ± 1٪) (الشكل 3B، يمين). تظهر هذه البيانات معا أن التخمير الكهربائي DMF يتيح تعطيلا قويا وعالي الكفاءة ل TRAC مع الحفاظ على القدرة الخلوية عبر عدة عمليات مستقلة. تم الحصول على الخلايا التائية البشرية الأولية من مصادر تجارية بموافقة متبرع مستنيرة ووفقا للإرشادات الأخلاقية المؤسسية والبائعة.

التعامل مع HEK293T الكرويدات باستخدام الميادين الدقيقة الرقمية
بعد ذلك، تم تقييم سير العمل الرقمي للاحتراق الكهربائي الميكروفلويدية للتطبيقات ذات البنى ثلاثية الأبعاد متعددة الخلايا. تكونت الكريات HEK293T المجوفة عن طريق زرع حوالي 100 خلية في كل بئر في صفائح دقيقة منخفضة الارتباط وزراعتها لمدة 24 ساعة للسماح بتكوين الكرويدات (الشكل 4A). تم جمع الكرويدات المشكلة، وإعادة تعليقها، وتحميلها على الخرطوشة الرقمية الميكروفلويدية للاحتراق الكهربائي. بعد العلاج، تم تفريغ الكرويدات في صفيحة بسعة 96 بئرا للتصوير اللاحق وتحليل النمو.

لتحقيق متوسط استرداد كروي واحد في كل بئر بعد التثقيف الكهربائي، تم تحميل عدد زائد من الكرويدات عمدا على الخرطوشة لتعويض فقدان المواد أثناء التعامل والنقل. تم إعادة تعليق حوالي 192 كرويا في 100 ميكرولتر من مخزن الحفر الكهربائي وتحميلها على الخرطوشة. تلقت كل عائلة تفاعل ~9.3 ميكرولتر من التعليق، وهو ما يعادل ~18 كرويا، مع قطرات فردية تحتوي على ~1 ميكرولتر (1–2 كروي لكل قطرة). نظرا لأن حوالي نصف الكرويدات بقيت في منفذ التحميل أثناء تشغيل الخرطوشة، فقد أدت استراتيجية التحميل هذه إلى متوسط ~1 كروي لكل موقع كهرباء ثلاثي قطرات.

أظهر تحليل استعادة الكريات أن 0–1 كروية يتم تفريغها عادة في كل بئر بعد التثقيف الكهربائي، وهو ما يعادل حوالي 4–6 كرويدات تم استعادتها لكل عائلة تفاعل (الشكل 4B اللوحة اليسرى). هذا الاسترداد أقل من الحد الأقصى النظري ويعكس الخسائر التي تحدث أثناء الغسيل، وسحب السوبرناتانت، واحتفاظ الكرويدات في منفذ التحميل. تعزى هذه الخسائر إلى قطر الكروي الصغير (~100 ميكرومتر) وصعوبة الحفاظ على توزيع منتظم للهياكل غير الخلوية الأحادية داخل التعليق. نتيجة لذلك، تبقى بعض الكرويدات موزعة بشكل غير متساو أو تفشل في دخول منطقة القطرات الثلاثية. أدى تحميل عدد زائد من الكرويدات إلى ضمان وجود كروي واحد على الأقل في معظم مواقع التسامح الكهربائي، مما أتاح تحليلا متسقا في المراحل النهائية كما يتضح من التصوير المجهر للكروي المصبوغ ب DAPI في خرطوشة الميكروفلويدكس (الشكل 4B، اللوحة اليمنى). قد يقلل تحسين العمليات الإضافي من عدد الكرويدات المطلوبة لتحقيق استرداد متكافئ. على الرغم من هذه الخسائر في التحكم، أتاح سير العمل تمكن من تحديد مواقع الكرويدات السليمة بلطف ضمن هندسة الحفر الكهربائية ثلاثية القطرات.

توصيل وقابلية الاستمرار في الحمض النووي المغناطيسي للرنا في الكرويدات HEK293T
لوحظ توصيل فعال لmRNA ل EGFP إلى الكرويدات HEK293T بعد التوزيع الكهربائي (50 نانوغرام من mRNA GFP لكل كروي). المجهر الفلوري الذي أجري بعد 24 ساعة من التقشير الكهربائي كشف عن تعبير قوي ومنتظم مكانيا في GFP عبر الكرويدات الكهربائية، بينما لم يلاحظ أي فلورة قابلة للكشف في ظروف التحكم ب 0 فولت أو خارج الخرطوشة (الشكل 4C، اللوحة اليسرى). أكد التحليل الكمي لمتوسط شدة الفلورة المطبعة (MFI) لكل منطقة كروية نجاح النقل تحت مجموعتي معلمات التوازن الكهربائي المختبرتين (الشكل 4C، اللوحة الوسطى). على وجه التحديد، أظهرت الكرويدات التي تم إخراجها كهربائيا عند 500 فولت، 2 مللي ثانية، نبضتين MFI بلغت 6.96 × ^10-5 ± 3.50 × ^10-5، بينما أظهرت تلك التي تم إضافتها عند 375 فولت، 6 مللي ثانية، نبضة واحدة MFI 5.05 × ^10-5 ± 3.29 × ^10-5. لم يتم اكتشاف أي فلورة قابلة للقياس في ظروف التحكم (0 ± 0). أنتجت كلتا الحالتين التقميم الكهربائي فلورة أعلى بشكل ملحوظ مقارنة بالضوابط (p < 0.05)، دون وجود فرق ذو دلالة إحصائية بين معلمات النبضة. لتقييم ما إذا كان التقشير الكهربائي قد أثر سلبا على نمو الكروي أو السلامة الهيكلية، تم قياس أقطار الكرويدات يوميا على مدى 5 أيام بعد العلاج. أظهرت الكرويدات الكهربائية حركية نمو مماثلة للضوابط غير المعالجة، مما يشير إلى أن نقل mRNA لم يؤثر على بقاء الكروي أو القدرة على التكاثر (الشكل 4C، اللوحة اليمنى). تظهر هذه النتائج معا أن التوزيع الكهربائي الرقمي للميكروفلويديك يمكن من توصيل mRNA بكفاءة إلى الكرويدات متعددة الخلايا السليمة مع الحفاظ على السلامة الهيكلية والنمو، مما يدعم إمكانية توسيع هذه المنصة لتشمل نماذج خلوية ثلاثية الأبعاد.

تعرض البيانات كمتوسط ± انحراف معياري. تم تحديد الدلالة الإحصائية باستخدام تحليل النوفاع الأصغر أحادي الاتجاه مع تصحيح توكي اللاحق للمقارنات المتعددة، مع عتبة دلالة p < 0.05. تمثل N قيم نسخا بيولوجية مستقلة (مانحين منفصلين أو عمليات خرطوشة مستقلة) كما هو محدد في الشكل.

الشكل 1. بنية وسير عمل منصة التوزيع الكهربائي DMF. (أ) صورة لخرطوشة DMF. (B) مخطط مشروح لتصميم الخرطوشة المجمع 48 plex (الصورة المركزية)، يظهر تنظيم (A–H) لثماني عائلات متطابقة، كل منها يحتوي على ستة مواقع للتسامح الكهربائي القابلة للعنونة بشكل مستقل، مع منافذ تحميل الأقطاب السائلة، ومنافذ تحميل الخلايا، والأنود، والكاثود، ومناطق النقاط النانوية موسومة (الصورة اليسرى). يتم تمييز الميزات الرئيسية، بما في ذلك منافذ التحميل، منافذ التفريغ، ونقاط التجميع. يتم تجميع الخرطوشة عن طريق تركيب اللوحين بزاوية صحيحة واحدة حتى يتم الشعور بوجود تشابك ميكانيكي مميز. الصورة اليمنى: خريطة توزيع معالج السائل تظهر مواقع ملونة لمنافذ التحميل (أحمر)، منافذ التفريغ (وردي)، ورصد المناطق المستهدفة (أزرق). (ج) اليسار: صورة تظهر دقة الموضع لتوزيع الصوت عبر جميع المواقع ال 48 (n = 48)، مع رسم مواقع السقوط بالنسبة لنقطة منتصف القطب (مم). يؤكد التجميع الضيق دقة الترسيب تحت المليمتر. على اليمين: صور تمثيلية تظهر بقعة مركزة بشكل صحيح قبل إعادة الترطيب بواسطة قطرة الخلية (الأعلى) وأثناء إعادة الترطيب، حيث يتم نقل القطرة ذهابا وإيابا حيث يوجد الدليل لإعادة تعليقها (الأسفل، السهم الأحمر). (د) صورة علوية لمناطق التسامح الكهربائي المنفصلة، تظهر الحركة التدريجية للقطرات من (1) إعادة ترطيب الحمولة عن طريق تحريك القطرة ذهابا وإيابا فوق الدليل الريبي الموزع، (2) الحركة إلى موقع التسامية الكهربائية، بين الأنود والكاثود، حيث تتصل قطرة الخلية بقطرتي القطب السائل المجاورتين ويتم نبضها، و(3) انتقال الثلاثي الكامل إلى منفذ التفريغ قبل استرجاعها بواسطة معالج السائل. (ه) مخطط سير العمل من البداية إلى النهاية. يتم وضع RNA الدليل على ركيزة الخرطوشة باستخدام موزع صوتي. يتم تجهيز الخلايا والحمولة وتحميلها على الخرطوشة باستخدام معالج سوائل آلي. يتم إجراء التربية الكهربائية على منصة DMF. يتم تفريغ الخلايا في صفيحة بسعة 96 بئر وتنقل إلى الحاضنة لاستعادتها. يتم إجراء التحليل اللاحق باستخدام قياس التدفق الخلوي، أو المجهر، أو تسلسل الجيل القادم، أو قراءات مناسبة أخرى. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 2. تأثير مكملات البوليمر على الترسيب وتجميع RNP. (A) مكملات البوليمر تحسن جودة الترسيب الصوتي. امتصاص الفلورسينات بعد الترسيب وإعادة التكوين عبر أربع خراطيش مستقلة، مع أو بدون حمض بولي-إل-جلوتاميك. تم تقليل التباين عند الأحجام المتوسطة (40–120 نانولتر) في وجود PGA. 
(B) تأثير PGA على تجميع Cas9–sgRNA. منحنيات ارتباط الألفة في FIDA تقيس نصف قطر الهيدروديناميكا (Rh) في غياب (اللوحة اليسرى) أو وجودها (اللوحة اليمنى) ل PGA. أظهر sgRNA الحر Rh 3.45 ± 0.26 نانومتر، بينما أسفر معايرة Cas9 عن حجم مركب RNP يبلغ 15.32 ± 0.46 نانومتر (Kd = 0.70 ± 0.14 نانومتر). أدى إضافة PGA إلى تقليل حجم المركب وأضعف الألفة المرتبطة بطريقة تعتمد على التركيز. مع إضافة 0.005 ملغ/ملليتر PGA، أظهر sgRNA الحر Rh 4.31 ± 0.07 نانومتر، بينما أسفر معايرة Cas9 عن حجم مركب RNP يبلغ 10.21 ± 0.38 نانومتر (K_d = 67.7 ± 9.5 نانومتر). أجريت التجارب في مخزن اختبار منخفض التوصيلية مع نسبة 0.05٪ من الفرورونيك F-68. تم اكتشاف الفلورة عند 480 نانومتر باستخدام وحدة LED المدمجة. تم استخدام شعيرات شعرية مغطاة بشكل دائم (Ø 75 ميكرومتر، L = 100 سم) في جميع التجارب. لاختبار تأثير البوليمرات البوليمية متعددة الأيونات على تجميع RNP، أضيف PGA إلى خلطات التحليل بتركيزات 0.0025 ملغ/مل و0.005 ملغ/مل. تم اختيار هذه الشروط لنمذجة النطاق المستخدم في الميكروفلويدكس الرقمي، وتخفيف الرطوبة الكهربائية ومخازن التقطيع الكهربائي. لتحليل الارتباط المباشر، تم استخدام sgRNA الموسوم ب FAM بحجم 10 نانوميل ويستهدف موقع TRAC كمؤشر فلوري. تم تعديل تركيزات متزايدة من نوكلياز Cas9 (حتى 500 نانومال) مقابل المؤشر في اختبار CapMix لتوليد ملفات تشتت لتكوين المعقدات. أجريت جميع التجارب عند 25 درجة مئوية، حيث استهلك كل نقطة بيانات 40 نانولتر من المؤشر و~12 ميكرولتر من التحليل (Cas9). أجريت التجارب بالتسلسل التالي: (1) الغسل بحمض الفوسفوريك بنسبة 0.1٪ عند 3,500 مللي بار لمدة 30 ثانية؛ (2) التنظيف باستخدام مخزن الاختبار عند 3,500 مللي بار لمدة 30 ثانية؛ (3) ملء الشعيرات الدموية بالمحلل عند 3,500 ملي بار لمدة 20 ثانية؛ (4) حقن المؤشر عند 50 مللي بار لمدة 10 ثوان؛ (5) التعبئة والقياس باستخدام أنالايت عند 400 مللي بار لمدة 180 ثانية. تم حساب أنصاف الهيدروديناميكا باستخدام عرض القمة المستخرج عند نصف الحد الأقصى لارتفاع القمة، وثوابت التفكك (K_D) تم تحديدها بواسطة ملاءمة الانحدار غير الخطي لنموذج ارتباط 1:1. (C) تأثير PGA على استقرار RNP. ملفات تشتت تايلور لمجمعات Cas9–sgRNA مع وبدون PGA، أجريت باستخدام 500 نانومال من نوكلياز Cas9 و50 نانومال sgRNA موسوم ب FAM. في غياب PGA، لم يلاحظ أي مركب مستقر، كما يتضح من زيادة تكوين التجمعات الكبيرة مع إشارة متناقصة من المجمع مع مرور الوقت (على اليسار). إضافة 0.0025 ملغ/ملليتر PGA أدت إلى تايلورغرام محدد جيدا أحادي التشتت مع تجميع بسيط يقيس R_h ~ 9.6 نانومتر (R² = 0.999، يمين). تم تقييم الاستقرار المركب تحت ظروف التقشير الكهربائي القياسية (500 نانوميل Cas9 + 50 نانوميل sgRNA) مع أو بدون 0.0025 ملغ/مل PGA. تم خلط العينات مسبقا والحفاظ على درجة حرارة 4 درجات مئوية في صينية العينات المدخلة بينما أجريت الحقن على فترات 10 دقائق على مدى عدة ساعات. أجريت التجارب بالتسلسل التالي: (1) الغسل بحمض الفوسفوريك بنسبة 0.1٪ عند 3,500 مللي بار لمدة 30 ثانية؛ (2) التنظيف باستخدام مخزن الاختبار عند 3,500 مللي بار لمدة 30 ثانية؛ (3) ملء الشعيرات الدموية بالمحلل (مخزن الاختبار) عند 3,500 ملي بار لمدة 20 ثانية؛ (4) حقن المؤشر عند 50 مللي بار لمدة 10 ثوان؛ (5) التعبئة والقياس باستخدام أنالايت عند 400 مللي بار لمدة 180 ثانية. تم إظهار تكوين المعقد غير المستقر من خلال تكوين تجمعات كبيرة (أشواك في تايلورغرام) وتناقص الإشارة. تم تحديد المركبات المستقرة من خلال تايلورغرامات أحادية التشتت الملاءمة جيدا (R² > 0.99)، وR_h تم استخراج القيم من الملفات الجانبية المثبتة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 3. كفاءة وفعالية إخراج TCR ألفا/بيتا في الخلايا التائية البشرية الأولية. (أ) استراتيجية بوابات التدفق الخلوي التمثيلية للمجموعات الحية، ومجموعات خلايا T في CD4⁺ وCD8⁺، وتعبير TCRα/β في حالات التحكم (sgRNA غير المستهدف) والتجريبية (TRAC sgRNA). تم تحديد الخلايا بشكل متسلسل على مجموعات FSC/SSC، والأحادية، وقابلية البقاء، وCD4⁺ أو CD8⁺ قبل تقييم تعبير TCRα/β السطحي. (B) اليسار: كفاءة الإيقاف TCRα/β في مجموعات خلايا T في CD4⁺ وCD8⁺ عبر ثلاث حالات: TRAC KO، التحكم غير المستهدف (NTC)، والتحكم خارج الخرطوشة (OCC). CD4⁺: TRAC KO = 88.4 ± 4.9٪ (n = 40)، NTC = 3.2 ± 4.7٪ (n = 24)، OCC = 9.8 ± 5.1٪ (n = 18). CD8⁺: TRAC KO = 89.8 ± 4.2٪ (n = 40)، NTC = 4.2 ± 7.4٪ (n = 24)، OCC = 20.2 ± 4.9٪ (n = 18). يمين: قابلية البقاء بعد التسامح الكهربائي عبر جميع الحالات، مغلقة على الطبقات الصغيرة. الصلاحية: TRAC KO = 97.1 ± 1٪ (n = 40)، NTC = 96.8 ± 1٪ (n = 24)، OCC = 97 ± 1٪ (n = 18). تظهر نقاط البيانات الفردية بمتوسط وSD. n يمثل التسامح الكهربائي المستقل عبر عدة خراطيش وأيام. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 4. توصيل mRNA بكفاءة إلى HEK293T الكرويدات باستخدام DMF-ection. (أ) مخطط سير العمل الذي يصف عملية تكوين الكرويدات وإجراء تحويل الكروي. يتم تحميل مئة HEK293T خلية في كل بئر في صفيحة دقيقة كروية متخصصة ويتم زراعتها لمدة 24 ساعة لتشكيل كريات قطرها 100 ميكرومتر. يتم تفريغ الكرويدات (192) وإعادة تعليقها في 100 ميكرولتر من مخزن النقل النفقي. يتم تحميل هذا التعليق، مع الحمولة المناسبة، على خرطوشة DMF-ection المرقطة بالتوجيه بسعة 9.3 ميكرولتر لكل عائلة. بمجرد حدوث التثقيف الكهربائي، يتم تفريغ العينات إلى صفيحة بئر 96 لتحليل المراحل التالية. (ب) اليسار: عدد الكرويدات التي يتم تفريغها لكل عائلة على خرطوشة DMF-ection مقارنة بأدوات التحكم اليدوية خارج الخرطوشة. الوسط: صورة فلورية للتراي-دروب، حيث يحدد مربع أحمر أكبر الثلاثي-درب، والبيضاوي الأحمر يدور حول الكرويد. يمين: صورة فلورية تظهر منفذ تحميل مع كرويدات محملة (دوائر زرقاء). (ج) اللوحة اليسرى: صور الحقل الساطع للكرويدات HEK293T السليمة قبل التسامح الكهربائي وصور فلورية للكرويدات بعد 24 ساعة من احتسابية الحمض النووي الريبي المغناطيسي لEGFP ، مقارنة بالتحكم 0 فولت وخارج الخرطوشة. (د) اللوحة العلوية: قياس متوسط شدة الفلورة المعدل إلى مساحة الكروية لحالتين للتشعب الكهربائي (500 فولت، 2 مللي ثانية، 2 نبضة؛ 375 فولت، 6 مللي ثانية، نبضة واحدة). لا يوجد فرق كبير بين الظروف الكهربائية، لكن جميع الظروف الكهربائية تختلف بشكل كبير عن التحكم ب 0 فولت وخارج الخرطوشة (500 فولت 2 مللي ثانية 2 نبضة: 6.955 × ^10-5 ± 3.502 × ^10-5، 375 فولت 6 مللي ثانية 1 نبضة: 5.045 × ^10-5 ± 3.294 × ^10-5، 0 فولت: 0 ± 0، التحكم خارج الخرطوشة: 0 ± 0 (*p < 0.05). تمت معالجة الصور باستخدام حزمة معالجة الصور رقم¹⁰ من فيجي. (500 فولت، 2 مللي ثانية، 2 نبضة: n = 6؛ 375 فولت، 6 مللي ثانية، نبضة واحدة: n = 4؛ التحكم خارج الخرطوشة: n = 3; تحكم 0 فولت: n = 3). (د) اللوح السفلي: قطر الكروي بعد التساقط الكهربائي على مدار 5 أيام عبر الظروف. تم قياس القطر باستخدام FIJI من صور انقباض الطور الملتقطة بتكبير 20x باستخدام مجهر مقلوب. (500 فولت، 2 مللي ثانية، 2 نبضة: n = 6؛ 375 فولت، 6 مللي ثانية، نبضة واحدة: n = 4؛ التحكم في الخرطوشة خارج الجهاز: n = 3؛ تحكم 0 فولت: n = 3). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

المناقشة

يصف هذا البروتوكول سير عمل إلكتروني رقمي مصغر للتسخين الميكروفلويدكي يتيح التوصيل الفعال داخل الخلايا إلى الخلايا التائية البشرية الأولية باستخدام قطرات بحجم النانولتر. ميزة مركزية لهذه الطريقة هي القدرة على إجراء تحرير الجينوم باستخدام 10,000 خلية فقط في كل تفاعل، مما يقلل بشكل كبير من متطلبات المواد مقارنة بالتقميم الكهربائي التقليدي. تدعم بنية القطرات الأتمتة، مما يضمن معالجة الكواشف القابلة لإعادة الإنتاج وتجميع التفاعل عبر مواقع متوازية متعددة.

في دراسات سابقة، أظهر المقارنة المباشرة لمنصة DMF-ection مقابل نظام مستخدم على نطاق واسع أن النووية التقليدية تنتج أقل من 2٪ خلايا تائية إيجابية ل GFP عند 10,000 خلية في كل تعديل، بينما حققت منصة DMF-ection كفاءة نقل >90٪ تحت نفس ظروف الإدخال المنخفضة. لشاشة مرتبة تضم 192 حالة، تطلبت منصة DMF خلايا أقل بمقدار 25 ضعفا وحوالي 50 ضعفا أقل من Cas9 لكل حالة مقارنة بالطرق^{التقليدية 9}. تسلط هذه المقارنات الضوء على المزايا المادية لعملية التقميص الكهربائية المصغرة DMF في تطبيقات الإدخال المنخفض والفحص

الخطوات الحرجة وحل المشكلات
هناك عدة خطوات ضرورية للنجاح. تضمن المعايرة الدقيقة لمتعامل السائل الصوتي ترسيب دقيق للحمض النووي الريبي التوجيهي على ركيزة الخرطوشة، وهو أمر ضروري لتجميع RNP متسق. إذا كان النزيف غير متسق أو لم تلتصق القطرات بالركيزة، تحقق من تضمين PGA في خليط الدليل والحمض النووي الريبي عند التركيز الصحيح (5 ملغ/مل نهائي) وأن موزع الصوت معاير ليتناسب مع هندسة لوحة المصدر المحددة. الرصد غير المتسق عند أحجام متوسطة (40–120 نانولتر) يحدث غالبا بسبب ارتداد القطرات على السطح الكاره للماء؛ زيادة تركيز PGA قليلا أو تقليل ارتفاع التوزيع يمكن أن يحل هذه المشكلة.

الحفاظ على تركيز الخلية الصحيح قبل التحميل أمر مهم، لأن الانحرافات في الكثافة قد تعيق تكوين القطرات وتقلل من كفاءة التحرير. إذا انخفضت كفاءة التحرير إلى أقل من 75٪، تحقق أولا من أن تنشيط الخلايا التائية كان كافيا (تأكد من زيادة تنظيم CD25 وCD69 بواسطة قياس التدفق الخلوي قبل التعرض الكهربائي)، وتأكد من أن Cas9 و sgRNA تم دمجهما مباشرة قبل التحميل وليس مسبقا.

تلعب الإضافات البوليمرية دورا مهما في تثبيت مركبات Cas9–sgRNA تحت ظروف العزل الكهربائي¹¹. على الرغم من أن PGA يقلل من الألفة الاسمية، إلا أن تأثيره المثبت يحسن قابلية التكرار ويمنع التجمع عند أحجام النانولتر. يمثل هذا معاملة قابلة للتعديل للباحثين الذين يقيمون سير العمل مع مركبات بروتين ورنا أخرى.

استكشاف الأخطاء
فشل جسر القطرات
راجع تقرير مراقبة الجودة الآلي بعد كل تجربة. غياب التيار المكتشف يشير إلى فشل في الجسر، إما بسبب نقص القطرات أو فشل في الاندماج، ويتم الإبلاغ عنه تلقائيا من قبل النظام. لا يمكن استعادة المواقع المتأثرة خلال نفس الجولة. إذا كانت الأعطال متقطعة (<10٪)، فلا حاجة لأي إجراء؛ توزيع النسخ على عدة خراطيش لتقليل التأثير. إذا كانت الأعطال منهجية، قم بتشغيل لوحة مراقبة الجودة وفحص صحة النظام وتواصل مع الدعم الفني إذا استمرت المشاكل.

عدم انتظام في نزعة sgRNA
بعد الصرف، تأكد بصريا من وجود جميع القطرات المتوقعة، مركزة ضمن حدود الأقطاب، وخالية من قطرات الأقمار الصناعية. أدرج PGA في خليط الحمض النووي الريبي الموجه لمنع التتفرق المتعدد التشتت. للقطرات المفقودة، تحقق من تقرير تشغيل الموزع وأعد الصرف إذا لزم الأمر. في حالة ضعف تكوين الغضروف الهلالي، حافظ على حد أدنى 5 ميكرولتر لكل بئر، وقم بتدوير الصفيحة لفترة وجيزة، ثم طرق بلطف على سطح مستو. اعمل على الثلج وعزل الصفائح عندما لا تستخدم لمنع التبخر.

انخفاض كفاءة التحرير
إذا لوحظ انخفاض في كفاءة التحرير، قم باستكشاف الأخطاء بالترتيب التالي: (1) التحقق من شروط التسليم باستخدام mRNA ل EGFP قبل المضي قدما في RNP؛ (2) تأكيد تطابق تيار مراقبة الجودة المقاس القيم المتوقعة؛ (3) تعديل كثافة الخلايا، الحمض النووي النووي الريبي الموجه، وتركيز Cas9؛ (4) تأكيد صلاحية الخلايا العالية مباشرة قبل التحميل؛ (5) التحقق من سلامة الكواشف وظروف التخزين؛ (6) تأكيد أن طريقة القراءة مناسبة لكثافة الخلية والهدف المعني.

تكييف المنصة لتناسب أنواع ونماذج خلايا بديلة
بالنسبة لأنواع الخلايا المناعية الأولية الأخرى، مثل خلايا NK أو الخلايا التائية التنظيمية، ستتطلب معايير التقميم الكهربائي تحسينا. حجم الخلية هو عامل مهم محدد عتبة المجال الكهربائي المطلوبة لنفاذية الغشاء: الخلايا الصغيرة تحتاج إلى شدة مجال أعلى، بينما الخلايا الأكبر تنفث عند جهود أقل — وهي علاقة موثقة جيدا في الفيزياء الحيوية للاحتراق الكهربائي. كنقطة انطلاق لأنواع الخلايا الأصغر من خلايا CD3⁺ T المنشطة، حافظ على الجهد أو زيادته قليلا (500–550 فولت) مع الحفاظ على مدة النبضة قصيرة (2–3 مللي ثانية) لتجنب الإجهاد الحراري الزائد. بالنسبة للخلايا الأكبر، قم بتقليل الجهد إلى 350–400 فولت، وتعديل مدة النبضة دون تجاوز 10 مللي ثانية. بالإضافة إلى ذلك، يعد التحسين الدقيق على مستوى المتبرع ممارسة شائعة في التسامح الكهربائي، وقد لا تترجم المعايير التي تم التحقق منها في الخلايا المانحة السليمة مباشرة إلى مواد مريضة أو مشتقة من المريض. غالبا ما تظهر الخلايا الناتجة عن المتبرعين المصابين بالأورام الدموية أو العدوى المزمنة أو نقص المناعة خصائص حيوية متغيرة، ويجب إعادة تقييم كفاءة التحرير وقابلية البقاء لكل متبرع جديد، خاصة عند العمل مع عينات غير صحية أو سريرية. يجب تقييم صلاحية الخلايا بعد 24 ساعة و72 ساعة بعد التسامية الكهربائية وتعديل المعايير بشكل تكراري. قد تحتاج جرعة Cas9 أيضا إلى زيادة بنسبة 1.5–2× مقارنة ببروتوكول الخلايا التائية إذا تم تقليل كفاءة توصيل RNP.

بالنسبة للنماذج ثلاثية الأبعاد الأكبر أو الأكثر كثافة مثل العضويات التي يزيد قطرها عن 200 ميكرومتر، قد يتطلب الحشوة في الخرطوشة تعديلا لاستيعاب حجم هيكل أكبر وحواجز الانتشار. يجب على المستخدمين الذين يحاولون مثل هذه التطبيقات التفكير في تفكيك طبقات الخلايا الخارجية مسبقا لتحسين اختراق الكواشف أو تطبيق عدة حالات نبضية بالتتابع. يرجى التواصل مع المؤلف المقابل للحصول على إرشادات حول تكييف هندسة القطرات ومعلمات النبضة للهياكل التي تتجاوز قطر الكروي 100 ميكرومتر الموثق هنا.

الصلة الانتقالية
إمكانات هذا السير الانتقالية تتجاوز مجرد القضاء البسيط. تم تطبيق المنصة على تركيب إصلاح موجه بالتماثل لتركيب GFP بسعة 4 كيلوبايت وCAR مضاد HER2 وظيفي عند موقع TRAC في الخلايا التائية الأولية، بالإضافة إلى شاشة CRISPR مصفوفة مكونة من 45 هدفا تحدد منظمات جديدة لاستنفاد خلايا CD4⁺^{T 9}. توضح هذه التطبيقات مسارا من تحسين مستوى البروتوكول إلى اكتشاف وظيفي في نماذج الخلايا الأولية ذات الصلة سريريا. ومع ذلك، لا تزال هناك قيود مهمة: لم يتم تقييم نتائج وظيفية مثل معدلات اضطراب الأليليات بسبب التسلسل، وإفراز السيتوكينات، والزرع في الجسم الحي في البروتوكول الحالي، وتمثل الخطوات التالية اللازمة للترجمة العلاجية. بالإضافة إلى ذلك، بينما تدعم المنصة 48 تفاعلا متوازيا لكل خرطوشة، سيكون من الضروري التوازي متعدد الخراطيش للشاشات الأكبر.

القيود
كما هو الحال مع أي منصة مصغرة، يجب الاعتراف ببعض القيود العملية. يجب تكييف النمط الظاهري في الأسفل على نطاق التفاعل الصغير؛ قد يتطلب جمع التدفق الخلوي خطوات تركيز إضافية أو تجميع آبار مكررة لتحقيق عدد كاف من الأحداث. قد تتطلب إعدادات التقميم الكهربائي في المنصة أيضا تحسينا لأنواع الخلايا ذات الحساسية العالية للمجالات الكهربائية، ويجب على المستخدمين اعتبار المعاملات المنشورة نقاط انطلاق بدلا من القيم الثابتة بشكل عام. وأخيرا، لم يتم إجراء تلوين قابلية الحياة رسميا في نقاط زمنية ممتدة بعد التسامح الكهربائي لسير العمل الكروي المعروض هنا؛ تم استخدام تتبع النمو القائم على القطر كمقياس بديل لسلامة الهيكل ويمثل اتجاها مهما للتوصيف المستقبلي.

بشكل عام، يوفر DMF-ection، وهو طريقة نقل غير فيروسية، نهجا قويا ومرنا لتحرير الجينوم وتوصيل mRNA في البيئات ذات المدخلات المنخفضة وعالية الإنتاجية. توافقها مع الخلايا التائية الأولية، والنماذج ثلاثية الأبعاد المنظمة، والتعامل الآلي مع السوائل توسع الفرص في هندسة علاج الخلايا، وفحص كريسبر متعدد الشروط، والجينوميات الوظيفية المصغرة.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
12 Channel VOYAGER Adjustable Tip Spacing Pipette	Integra	4732	Instrumentation
1x PBS	Gibco		Flow Buffer
96 Well Plate, Sphera Low-Attachment Surface	Thermo Fisher	174927	Spheroid protocol
96-well conical-bottom plate	Sarstedt	82.1583.001	Spheroid protocol
Alexa Fluor 647 anti-human CD4 Antibody	Biolegend	357421	1 in 200, Clone A161A1
Attune Flow Cytometer	ThermoFisher		Instrumentation
DMEM Media	Gibco	10564011	Media Supplement- Spheroid culture
DMF compatible buffer	DropGenie		Transfection
DropGenie Transfection System	DropGenie		Instrumentation
Echo Acoustic Dispenser 650 Series	Beckman Coulter Life Scienes
Echo Qualified 384-well Low Dead Volume	Beckman Coulter Life Scienes
EDTA	Invitrogen		Flow Buffer
EGFP mRNA	Trilink	L-7201
EVOS Fluorescent Microscope	ThermoFisher		Instrumentation
Fetal Bovine Serum	Gibco	16000044	Media Supplement- Spheroid culture
Fida 1 instrument and Fida Neo 480 nm detector	Fida Biosystems ApS		Instrumentation
Ghost Dye Violet 510	Cytek Biosciences	13-0870
HEK293T Cells	ATCC		Spheroid protocol
Human IL-2 Recombinant Protein,	Peprotech	200-02 50ug	T cell media supplement
Human Primary Pan CD3+ T Cells	All Cells		Peripheral Blood, Cryopreserved, pan CD3+ Helper T Cells, Negatively Selected
Immunocult CD3/CD28 Activator	StemCell Technologies	10970	T Cell Activation media
Immunocult Expansion Media	StemCell Technologies	10981	T Cell Activation media
Incucyte Live Cell Analysis System	Sartorius		Instrumentation
INTEGRA ASSIST PLUS pipetting robot	Integra	4505, 4-Position Portrait Deck (PN 4521),	Instrumentation
non targeting synthetic guide RNA	Synthego		5’ GCACTACCAGAGCTAACTCA 3'
NucleoCounter NC-202	Chemometec
PE anti-human TCR α/β Recombinant Antibody	Biolegend	380805	1 in 200, Clone QA20B12
PE-Cy 7 Anti-Human CD8	BD Pharmingen	557750	1 in 200, Clone RPA-T8
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140122	Media Supplement- Spheroid culture
Poly-L-glutamic Acid (PGA)	Sigma Aldrich	P4761-100MG	Use a at 100mg/ml
Prism version 8.0.0	GraphPad Software, Inc.		Software
sNLS-SpCas9-sNLS Nuclease	IDT	10017687
Spheroid Microplate	Corning	3830	Spheroid protocol
Surfactant F	DropGenie		Transfection- use at 1:20 in DMF compatible buffer to make compete Transfection buffer
TRAC synthetic guide RNA	Synthego		5’ AGAGTCTCTCAGCTGGTACA 3'
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Gibco	25-300-062	Spheroid protocol