مقالة منهجية

اكتشاف الشيخوخة باستخدام الضوء المنعكس في الجزء الدهني من الأوعية الدموية العضلية

171 مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/70588

⸱

يونيو 5, 2026

 ,  ,  , 
1Department of Cell and Molecular Biology, Karolinska Institutet, 2Nordiska Kliniken Stockholm

في هذه المقالة

ملخص

يقدم هذا البروتوكول مجهر الكونفوكالي المنعكس للضوء للكشف الموضوعي والخلوي الواحد عن نشاط بيتا-جالاكتوسيداز المرتبط بالشيخوخة (SA-β-gal) في الجزء الوعائي السمكي المعزول من نسيج دهني بشري. تتوافق هذه الطريقة مع الكيمياء المناعية الخلوية، وتشمل ضوابط الرقم الهيدروجيني للتقييم الكمي، كما توفر بديلا أكثر حساسية وأقل ذاتية مقارنة بالصبغ التقليدي بحمض الحمض النووي الجنوبي (SA-β-gal).

الملخص

الشيخوخة الخلوية هي حالة ناتجة عن التوتر تتميز بتوقف دائم في دورة الخلايا وتطور ملف إفرازي مميز يؤثر على وظيفة الأنسجة ويساهم في الشيخوخة وأمراض الأيض. نشاط β-جالاكتوزيداز (SA-β-gal) المرتبط بالشيخوخة يستخدم على نطاق واسع كمؤشر على الخلايا الشيخوخة؛ ومع ذلك، غالبا ما تعتمد اختبارات SA-β-GAL التقليدية على التقييم البصري الذاتي وتوفر معلومات كمية محدودة. تظهر هذه القيود بشكل خاص في مجموعات الخلايا البشرية الأولية مثل الجزء الوعائي البثمي (SVF) المشتق من نسيج دهني، والذي يحتوي على مزيج غير متجانس من الخلايا ما قبل الدهون، والخلايا المناعية، والخلايا البطانية. هنا، نقدم نهجا محسنا للمجهر الكونفوكالي المنعكس للضوء للكشف الكمي عالي الدقة لنشاط SA-β-gal في خلايا SVF البشرية. يتيح هذا البروتوكول التحليل الموضوعي لنشاط SA-β-gal في خلية واحدة، ويسمح بالكيمياء المناعية الخلوية المتزامنة للكشف المتعدد عن علامات الشيخوخة أو النسب الإضافية، ويشمل ضوابط متطابقة مع الرقم الهيدروجيني. من خلال دمج هذه الخصائص، توفر هذه الطريقة نهجا حساسا وقابلا للتكرار وكمي لدراسة شيخوخة الخلايا في مجموعات الخلايا البشرية الأولية غير المتجانسة. يقدم بديلا محسنا للصبغ التقليدي ب SA-β-gal.

المقدمة

شيخوخة الخلايا هي استجابة متعددة الأوجه يمكن أن تنشأ من العديد من أنواع الإجهاد، بما في ذلك تلف الحمض النووي، وفقدان التيلوميرات، وتنشيط الجينات المسرطة. يؤدي ذلك إلى توقف مستقر لدورة الخلية مع زيادة مقاومة الاستماتة المبرمجة، ويرجع ذلك جزئيا إلى تحفيز بروتينات مضادة للاستماتة 1,2. تم ربط الشيخوختة بتحسين بقاء الخلايا في السياقات التي يكون فيها الحفاظ على سلامة الأنسجة أمرا ضروريا، مثل الإصلاح والصيانة3،4. بعيدا عن دوره في توازن الأنسجة، يساهم الشيخوخة أيضا في التطور الطبيعي من خلال تشكيل نمط الأجنة 5,6 وكحاجز أمام تكوين الأورام من خلال تعزيز تطهير الخلايا التالفة أو المحتملة الخبيثة 7,8,9. على الرغم من أن الشيخوخة يمكن أن تؤدي وظائف مفيدة، إلا أن العديد من الدراسات أبرزت جانبا متناقضا حيث تكتسب الخلايا الشيخوخة موقفا إفرازيا مؤيدا للالتهابات يمكن أن يزعج الأيض المحلي، ويتلف الأنسجة المحيطة، وحتى يدعم تقدم الأورام 10,11,12,13.

تم اكتشاف الشيخوخة في أنواع خلايا متنوعة عبر عدة أنسجة، وغالبا ما يرتبط بالشيخوخة أو الأمراض أو خلل الأنسجة أو السرطان. في الكبد، ثبت أن شيخوخة الخلايا النجمية الكبدية يعزز تقدم الورم من خلال تغيير التوازن الأيضي عبر العوامل المفرزة14,15. تشير الدراسات التي فحصت خزعات الكبد16 أو خزعات الكبد الكامل17 إلى أن الشيخوخة في هذه الخلايا يمكن أن تساهم في أمراض أيضية مصاحبة مثل مرض الكبد الدهني المرتبط بخلل الأيض والتهاب الكبد الدهني المرتبط بالخلل الوظيفي. علاوة على ذلك، حظيت العلاقة بين السكري من النوع الثاني والشيخوخة باهتمام كبير خلال العقد الماضي، مع أدلة تربط الشيخوخة بالمضاعفات المرتبطة بالسكري في خلايا البنكرياس β، وخلايا الكبد16، والخلايا الدهنية18، 19، 20، 21. تسلط هذه النتائج الضوء على أهمية تحديد الخلايا المتقدمة في السن بدقة في الأنسجة الأيضية، حيث يساهم تراكمها وتباينها في تقدم المرض واستهداف العلاج22.

التغيرات في الإشارات والتعبير البروتيني المرتبطة بالشيخوخة غالبا ما تكون خاصة بالخلايا والأنسجة؛ ومع ذلك، هناك عدة خصائص تميز بشكل عام الخلايا المتقدمة في السن. واحدة من أكثر العلامات استخداما هي زيادة النشاط الإنزيمي لإنزيم β-جالاكتوسيداز عند pH 6.0، ويشار إليه باسم β-جالاكتوسيدازيد مرتبط بالشيخوخة (SA-β-gal)23. β-جالاكتوسيداز هو هيدرولاز ليسوزومي موجود في جميع الخلايا وينشط عادة عند درجة حموضة حمضية (~4.5–5.0)، حيث يساهم في تحلل الركائز الجليكوزيلية. الميزة المميزة ل SA-β-gal هي الاحتفاظ بنشاط β-galactosidase تحت ظروف pH دون المثالية. في الاختبار الكلاسيكي، تحضن الخلايا مع الركيزة الصناعية 5-برومو-4-كلورو-3-إندوليل-β-دي-جالاكتوبيرانوزيد (X-غال) عند درجة حموضة 6.0، حيث يقل النشاط الإنزيمي في معظم الخلايا لكنه يبقى قابلا للكشف في الخلايا المتقدمة في السن. يؤدي ذلك إلى تكوين ترسيب أزرق غير قابل للذوبان يمكن رؤيته مجهريا24.

على الرغم من اعتماد هذا الاختبار على نطاق واسع، إلا أن اكتشاف ترسيب X-جال اعتمد تقليديا على المجهر الساطع. يعتمد اكتشاف الحقل الساطع على التعرف البصري على الترسيب الأزرق، وبالتالي له حساسية محدودة للإشارات منخفضة المستوى وحالات الشيخوخة المبكرة. على النقيض من ذلك، يلتقط التصوير بالضوء المنعكس الكثافة البصرية لترسيب X-gal، مما يتيح الكشف الكمي عبر نطاق ديناميكي أوسع. مؤخرا، تم تطوير ركائز فلوروجينية لتحسين الحساسية25. ومع ذلك، تقيس هذه الأساليب عادة نشاط β-جالاكتوزيداز في ظروف لا تحافظ على التعريف الكلاسيكي المعتمد على الرقم الهيدروجيني ل SA-β-gal. وبالتالي، قد تزيد من شدة الإشارة لكنها تقلل من الخصوصية للشيخوخة. في المقابل، فإن التعتيم الفطري لترسيب X-gal يتيح اكتشافه باستخدام تصوير الضوء المنعكس الكونفوكلي، مما يوفر قراءة أكثر حساسية وكمية مع الحفاظ على التعريف الإنزيمي الأصلي ل SA-β-gal26.

على مر السنين، تم تحديد علامات إضافية للشيخوخة، بما في ذلك زيادة التعبير عن مثبطات الكينازيم المعتمدة على السيكلين P16 وP21، بالإضافة إلى عامل النسخ P53، الذي ينظم توقف دورة الخلية وبرامج الشيخوخة الأخرى27، 28، 29، 30، 31، 32، 33. أدت هذه التطورات إلى تعريف أكثر قوة للشيخوخة، حيث تصنف الخلايا عادة بناء على وجود عدة علامات مجتمعة. لكن في الواقع، غالبا ما يتم قياس هذه العلامات باستخدام طرق مختلفة: فالعلامات النووية مثل P16 وP21 عادة ما تكتشف باستخدام تقنيات قائمة على التألق، بينما يتم تقييم نشاط SA-β-gal تقليديا بواسطة مجهر الحقل الساطع. هذا الفصل حد من القدرة على تقييم عدة خصائص شيخوخة داخل نفس الخلية. يتغلب تصوير الضوء المنعكس على هذا القيد من خلال تمكين دمج الكشف المباشر عن SA-β-gal مع العلامات المعتمدة على الفلورة ضمن سير عمل تصوير واحد، مما يسهل تقييما أكثر قوة ومعنى بيولوجيا للشيخوخة في مجموعات الخلايا غير المتجانسة.

بينما يعالج ديديك وزملاؤه عدة قيود في التصوير التقليدي بحمض الحمض النووي β الساميليك، بما في ذلك تحسين الحساسية، واستخدام ضوابط متطابقة مع الرقم الهيدروجيني لتحديد العتبة الموضوعية، والتوافق مع الكيمياء المناعية الخلوية، تم تحسين طريقتهم الكونفوكالية بالضوء المنعكس خصيصا للخلايا الدهنية الناضجةالمعزولة 26. ومع ذلك، فإن الشيخوخة في الأنسجة الدهنية لا تقتصر على الخلايا الدهنية34،35، ويمكن الحصول على رؤى إضافية من خلال فحص الجزء الوعائي البمثيري (SVF). تتكون SVF من الخلايا الدهنية السابقة، ومجموعات الخلايا البطانية والليفية، وخلايا مناعية متنوعة، وجميعها قد تمر بالشيخوخة وتساهم في إعادة تشكيل الدهون، والالتهاب، وتغير الإشارات الأيضية. لذا فإن توصيف الشيخوخة داخل هذا الحيز غير المتجانس مهم لربط العمليات الخاصة بنوع الخلية بنتائج الأنسجة والجهاز.

هنا، نوسع كشف SA-β-gal بالضوء المنعكس إلى خلايا SVF، مما يمكن تطبيقه عبر أنواع مختلفة من خلايا الأنسجة الدهنية. من خلال دمج هذا النهج مع الكيمياء المناعية الخلوية، تمكن الطريقة من التحليل المتكامل لخلية واحدة لنشاط SA-β-gal إلى جانب العلامات النسبية والوظيفية في العينات البشرية الأولية.

البروتوكول

أجريت جميع التجارب وفقا لنظام إعلان هلسنكي. تمت الموافقة على الدراسة من قبل لجنة الأخلاقيات الإقليمية في ستوكهولم، DNR 2012/50-31.

1. تحضير الخلايا

  1. استخدم خلايا الكسر الوعائية البثوية (SVF) المعزولة من نسيج دهني بشري عن طريق هضم الكولاجنازي.
    ملاحظة: تختلف نسبة الخلايا حسب حجم الخزعة وتركيب الأنسجة؛ ومع ذلك، يتم الحصول عادة على حوالي 1.0 × 106 خلايا SVF لكل 10 جرام من نسيج دهني.

2. صبغة X-gal وتحضيرات الشريحة

  1. تثبيت الخلايا في 1 مل من بارافورمالديهيد 2٪ (PFA) في أنبوب طرد مركزي دقيق بسعة 1.5 مل لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT) على جهاز هزاز.
  2. استخدم الطرد المركزي على 600 × جرام لمدة 10 دقائق ثم أزل السوبرناتانت.
  3. جهز محلول التلوين X-gal باستخدام مجموعة التلوين β-جالاكتوسيداز الخاصة بالشيخوخة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
  4. قسم محلول التلوين إلى 3 أنابيب (1 مل لكل منها) واضبط الرقم الهيدروجيني إلى 5 و6 و8 مع 1 M HCl و1 M NaOH. قس الرقم الهيدروجيني باستخدام جهاز قياس الرقم الهيدروجيني المعاير.
  5. أضف محلول X-gal إلى 0.5 × 106 خلايا للحالة واحتضن لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية بدون ثاني أكسيد الكربون.
  6. استخدم الطرد المركزي عند 600 × جرام لمدة 10 دقائق وإزالة الفائق.
  7. اغسل الخلايا ب PBS (pH 7)، واستخدم الطرد المركزي عند 600 × جرام لمدة 10 دقائق، ثم أزل السوبرناتانت.
  8. حضر محلول الأجسام المضادة الأولي (CD31 [1:200] أو تحكم IgG [1:333]) في مصل الحمار الطبيعي بنسبة 5٪ (NDS). احتضن الخلايا طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
  9. غسل الخلايا 3 مرات في PBST (0.1٪) لمدة 10 دقائق عند RT على جهاز هزاز.
  10. تحضير محلول الأجسام المضادة الثانوي (مضاد للفئران أليكسا فلور 555 [1:500]) ومادة الجلوتينين من جرثوم القمح (WGA [1:200]) في 5٪ من NDS. حضانة لمدة ساعة واحدة في RT على جهاز هزاز.
  11. استخدم الطرد المركزي عند 600 × جرام لمدة 10 دقائق وإزالة محلول صبغ الأجسام المضادة الثانوية.
  12. اغسل الخلايا 3 مرات في PBST (0.1٪) لمدة 10 دقائق على جهاز هزاز عند RT.
  13. استخدم الطرد المركزي على 600 × جرام لمدة 10 دقائق ثم أزل السوبرناتانت.
  14. أعد تعليق الخلايا في تركيب مضاد التلاشي.
  15. قم بتثبيت نظام التعليق الخلوي على شرائح المجهر.
  16. دع وسط التثبيت يتجف طوال الليل عند RT لتثبيت الخلايا.
  17. أضف 100 ميكرولتر من الجلسرول 100٪، وضع غطاء غطاء فوقه، وأغلقه بطلاء الأظافر.

3. المجهر

ملاحظة: خلايا الصور باستخدام مجهر كونفوكالي تم إعدادها لاكتشاف الضوء المنعكس. يجب جمع إشارة الضوء المنعكس عند أو بالقرب من طول موجة الإثارة باستخدام مقسم شعاع أو مرآة ثنائية اللون مقدمة من الشركة المصنعة. استخدم عدسة هدف بحجم 30× مع زيت السيليكون (الفتحة العددية 1.05) لجميع التجارب.

  1. اختر إعداد مقسم الشعاع T90/R10 داخل برنامج المجهر.
  2. استخدم إثارة 633 نانومتر واجمع الضوء المنعكس بين 635–645 نانومتر.
  3. الحصول على إشارة Hoechst باستخدام إثارة 405 نانومتر.
  4. احصل على إشارة WGA باستخدام إثارة 488 نانومتر.
  5. احصل على إشارة CD31 باستخدام إثارة 555 نانومتر.
  6. اضبط حجم خطوة Z على الحد الأمثل للنظام (0.74 ميكرومتر) وحدد مكدس Z بناء على إشارة الغشاء لالتقاط حجم الخلية الكامل.
  7. احصل على صور باستخدام إعدادات الاقتناء المتطابقة لجميع العينات. حفظ الملفات بصيغة المجهر الأصلية (مثل .oir) دون ضغط.

4. تحليل الصور

ملاحظة: حلل الصور باستخدام ImageJ و CellProfiler.

  1. تقسيم القنوات في ImageJ لتوليد مكدسات Z لكل قناة (405، 488، 555، 633).
  2. توليد إسقاطات شدة مجمعة باستخدام دالة مشروع Z وتصديرها كملفات TIFF 16-بت.
  3. استيراد الصور إلى CellProfiler (الإصدار 4.2.8) لتقسيم الخلايا تلقائيا وقياس شدة الضوء المنعكس لكل خلية (الشكل التكميلي 1 والشكل التكميلي 2).
  4. قياسات شدة التصدير إلى جدول بيانات للتحليل في المراحل النهائية.

5. تسجيل نقاط في جنوب أفريقيا β

  1. عرف عتبة الإيجابية لSA-β-gal كمتوسط شدة الضوء المنعكس لحالة pH 8 بالإضافة إلى ثلاثة انحرافات معيارية.
  2. صنف الخلايا في حالة pH 6 ذات قيم شدة أعلى من هذا الحد على أنها SA-β-gal إيجابية.

النتائج

أدى تلوين الضوء المنعكس SA-β-gal لخلايا SVF البشرية إلى إنتاج أنماط واضحة وقابلة للتكرار عبر ثلاث ظروف محكومة برقم الحموضة. تم تضمين صبغة CD31 لتحديد الخلايا البطانية داخل SVF، مما يسمح بتمييز هذه الخلايا عن مجموعات أخرى. على الرغم من وجود عدد قليل فقط من الخلايا الإيجابية ل CD31، أكد المؤشر وجود خلايا بطانة الغلاف وأظهر توافق الطريقة مع العينات الأولية غير المتجانسة.

حالة pH 5 تولد إشارة قوية في معظم الخلايا، متوافقة مع نشاط بيتا جالاكتوسيداز الداخلي العالي عند pH حمضي (الشكل 1Aإلى AC). عند درجة الحموضة 6، وهي الحالة المستخدمة لتقييم نشاط SA-β-gal، انخفضت شدة التلوين مقارنة ب pH 5، ولم تظهر إشارة فوق الخلفية سوى مجموعة فرعية من الخلايا (الشكل 1Bإلى B). هذا التحول في شدة الإشارة وترددها يتوافق مع الاعتماد المتوقع على الرقم الهيدروجيني للاختبار ويتيح تحديد الخلايا التي تحتفظ بنشاط SA-β-galactosidase تحت ظروف دون مثالية. كانت حالة pH 8 تنتج إشارة ضوء منعكس قليلة، مع وجود معظم الخلايا بالقرب من أو عند مستويات الخلفية (الشكل 1Ca–Cc). تم استخدام هذا الشرط لتحديد عتبة إيجابية SA-β-gal، المشار إليها بالخط الأحمر المنقط في الشكل 1A c,Bc,Cc.

بالنسبة للتحليل الكمي، تم تعريف عتبة نشاط SA-β-gal بأنها متوسط شدة الضوء المنعكس لحالة pH 8 بالإضافة إلى ثلاثة انحرافات معيارية. تم تصنيف الخلايا في حالة pH 6 التي تتجاوز قيم الشدة هذا الحد على أنها SA-β-gal إيجابية. يوفر هذا النهج حدا موضوعيا قائما على البيانات يأخذ في الاعتبار الإشارة الخلفية ويقلل من تصنيف الإيجابيات الكاذبة.

لتقييم حساسية الكشف والتوافق مع الكيمياء المناعية الخلوية، تمت مقارنة تصوير الضوء المنعكس والحقل الساطع عبر جميع حالات الرقم الهيدروجيني. عند pH 5 (الشكل 2Aأ–ألبي)، كشف الضوء المنعكس عن ترسيب قوي من X-غال، بينما كشف المجال الساطع فقط عن أبرز الرواسب. عند pH 6 (الشكل 2Ba–Bd)، حدد الضوء المنعكس خلايا SA-β-gal الموجبة التي لم تكن قابلة للكشف بشكل موثوق بواسطة الحقل المضيء، حيث بدت الإشارة ضعيفة أو منتشرة. عند pH 8 (الشكل 2Ca–Cd)، اكتشف الضوء المنعكس إشارة قليلة، بما يتوافق مع انخفاض النشاط الإنزيمي، بينما لم يكشف مجال السطوع عن ترسيب قابل للكشف. تشير هذه الملاحظات إلى أن تصوير الضوء المنعكس يوفر اكتشافا أفضل لترسيب X-gal، خاصة عند مستويات النشاط المتوسطة والمنخفضة.

كما تم إجراء اختبار الضوء المنعكس SA-β-gal في صفيحة بسعة 96 بئر (الشكل التكميلي 3). أدى هذا الإعداد إلى زيادة الإشارة الخلفية بسبب الانعكاس من سطح البلاستيك، مما قلل من التباين بين الخلايا الموجبة والسالبة. العيوب السطحية، مثل الخدوش، زادت من الانعكاس الخلفي (الشكل الإضافي 3، الأسهم السوداء). نتيجة لذلك، كان التحليل الكمي أقل موثوقية مقارنة بالتصوير على أغطية الزجاج. إذا كان هناك حاجة لتنسيق اللوحة، ينصح باستخدام ألواح ذات قاع زجاجي لتحقيق أفضل اكتشاف للإشارة.

معا، تظهر هذه النتائج فصلا واضحا بين حالة pH 5 الإيجابية بقوة، والإشارة الوسيطة عند pH 6، والخلفية الدنيا عند pH 8. يتوافق هذا النمط مع السلوك المتوقع للاختبار ويدعم استخدام التصوير بالضوء المنعكس للكشف عن نشاط SA-β-gal في مجموعات الخلايا الأولية غير المتجانسة.

figure-results-1
الشكل 1: كشف الضوء المنعكس المعتمد على الرقم الهيدروجيني SA-β-gal في خلايا SVF.
تكشف WGA (Aa، Ba، Ca) وتصوير الضوء المنعكس (Ab، Bb، Cb) عن ترسيب X-gal عبر حالات pH 5 و6 و8. تكون الإشارة أقوى عند pH 5، وتنخفض عند pH 6، وتكون أدنى عند pH 8. يظهر قياس شدة الضوء المنعكس (Ac, BC, Cc) توزيع نشاط β-جالاكتوسيداز تحت كل شرطة. كل نقطة تمثل خلية واحدة، والخط الأحمر المنقط يشير إلى العتبة المستخدمة لتصنيف الخلايا الموجبة SA-β-gal. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-2
الشكل 2: مقارنة بين الضوء المنعكس وكشف SA-β-gal في خلايا SVF. تظهر الصور المكبرة لخلايا SVF المصبوغة ب X-gal عند pH 5 و6 و8 تلوين WGA (Aa, Ba, Ca)، وتلوين CD31 (Ab, Bb, Cb) لتحديد الخلايا البطانية، وتصوير الضوء المنعكس (Ac, Bc, Cc) للكشف عن ترسيب X-gal، وصور الحقول الساطعة المقابلة (Ad, Bd, Cd). يكشف تصوير الضوء المنعكس عن ترسيب X-gal عبر الظروف، بينما يكشف مجال الضوء الساطع بشكل أساسي عن ترسبات ذات كثافة أعلى ويوفر اكتشافا محدودا عند مستويات الإشارة الأدنى. يلاحظ تلوين CD31 في كل من حالات pH 5 وpH 6، مما يمكن من تحديد خلايا البطانة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل الإضافي 1: نظرة عامة على خط أنابيب CellProfiler. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الشكل الإضافي 2: سير العمل لتقسيم النوى والخلايا المختلفة. صور تمثيلية ل (أ) النوى المصبوغة بهوشت و(ب) تقسيم النوى المقابل. (ج) تقسيم الخلايا بناء على صبغة الغشاء. (د) تراكب النوى وحدود الخلايا. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الشكل الإضافي 3: تصوير الضوء المنعكس SA-β-gal في صفيحة بلاستيكية قاعية بسعة 96 بئر. (أ) تلوين WGA و(ب) تصوير الضوء المنعكس لخلايا SVF المصبوغة ب X-جال في لوحة بلاستيكية قياسية ذات قاع 96 بئر. يلاحظ زيادة في الإشارة الخلفية مقارنة بالتصوير على الزجاج، مما يتوافق مع انعكاس الضوء من السطح البلاستيكي، مما يقلل من التباين للكشف عن SA-β-gal. الخدوش السطحية (الأسهم السوداء) تزيد من إشارة الخلفية (B). يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

المناقشة

يعد β-جالاكتوسيدازيد المرتبط بالشيخوخة أحد أكثر العلامات استخداما لتحديد الخلايا المتقدمة في السن؛ ومع ذلك، فإن طرق الكشف التقليدية للمجال الساطع محدودة بانخفاض الحساسية ودرجة عالية من الذاتية. يوفر التصوير بالضوء المنعكس لخلايا SVF المصبوغة ب X-gal نهجا أكثر حساسية وقابلية للتكرار لقياس نشاط SA-β-gal على مستوى الخلية الفردية، مع البقاء متوافقا مع تلوين الأجسام المضادة الفلورية. من خلال تحسين هذه الطريقة ل SVF، يمكن اكتشاف نشاط SA-β-gal جنبا إلى جنب مع علامات خاصة بالخلايا مثل CD31، مما يمكن من تحليل تجمعات الخلايا الأولية غير المتجانسة دون الحاجة إلى فرز الخلايا.

تعد هناك عدة معايير تقنية ضرورية للتنفيذ الموثوق. يعد معايرة الرقم الهيدروجيني الدقيق لمحلول التلوين X-gal ضروريا، حيث يمكن أن تغير الانحرافات الصغيرة النشاط الإنزيمي وتؤثر على اكتشاف الإشارة. يجب معايرة جهاز قياس الرقم الهيدروجيني مباشرة قبل الاستخدام باستخدام المخازم القياسية (مثل pH 4.0 وpH 7.0)، ويجب التحقق من درجة حموضة محلول التلوين بعد التحضير. بالإضافة إلى ذلك، يجب أن يلتقط اكتساب المكدس Z حجم الخلية الكامل، حيث تؤدي التغطية غير الكاملة إلى التقليل من تقدير شدة الضوء المنعكس. يجب تحسين معلمات التصوير، بما في ذلك قوة الليزر وكسب الكاشف، لتعظيم الإشارة دون تشبع والحفاظ على اتساقها عبر العينات.

مقارنة باختبارات الشيخوخة البديلة، يوفر تصوير الضوء المنعكس عدة مزايا. يعتمد اكتشاف SA-β-gal في برايت فيلد على التعرف البصري على الترسيب وبالتالي له حساسية محدودة وليس متوافقا بسهولة مع التحليل متعدد الإرسال. على النقيض من ذلك، يكشف تصوير الضوء المنعكس عن الكثافة البصرية لترسيب X-غال مع الحفاظ على التعريف الإنزيمي المعتمد على الرقم الهيدروجيني ل SA-β-gal. يتيح ذلك الكشف المتزامن عن نشاط SA-β-gal جنبا إلى جنب مع العلامات القائمة على الفلورة، مما يسمح بتقييم الشيخوخة باستخدام ميزات متعددة داخل الخلايا الفردية.

رغم هذه المزايا، فإن الطريقة لها حدود. يكشف تصوير الضوء المنعكس عن الكثافة البصرية لترسيب X-gal لكنه لا يستطيع التمييز بشكل قاطع بين هذه الإشارة وبين البنى الكثيفة داخل الخلية الأخرى، مما يجعل الظروف التي يتم التحكم بها بالرقم الهيدروجيني ضرورية. يوفر الرقم الهيدروجيني 8 أساسا للضوء المنعكس في الخلفية ويدعم التمييز بين الإشارات المحددة وغير المحددة. يتطلب هذا النهج أيضا مجهر كونفوكلي مزود بقدرات مناسبة للكشف عن الضوء المنعكس، والتي قد لا تكون متوفرة في جميع الأنظمة. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تؤثر خصائص سطح التصوير على جودة الإشارة: حيث تزيد الألواح البلاستيكية ذات الخلفية بسبب الانعكاس وتقلل التباين، بينما توفر الأسطح الزجاجية اكتشافا أكثر موثوقية.

تستند هذه الطريقة إلى أعمال ديديك وآخرين، الذين أسسوا تصوير الضوء المنعكس للكشف عن SA-β-gal في الخلايا الدهنية الناضجة، وتوسع النهج ليشمل نطاقا أوسع من أنواع الخلايا26. التطبيق على SVF المعزولة حديثا يظهر أن الكشف عن الضوء المنعكس لترسيب X-gal متوافق مع مجموعات الخلايا البشرية الأولية المتنوعة. تمكن القدرة على دمج اكتشاف SA-β-gal مع علامات النسب مثل CD31 تحليل مجموعات فرعية محددة داخل الأنسجة غير المتجانسة.

على الرغم من أن التفاوت المتوقع بين المتبرعين في العينات البشرية الأولية، إلا أن هدف هذه الدراسة هو تحديد التطبيق التقني للطريقة بدلا من توصيف التباين البيولوجي. يجب أن تتضمن التطبيقات المستقبلية عبر عدة عينات بيولوجية أو ظروف تجريبية تحليلات إحصائية مناسبة. بالإضافة إلى ذلك، فإن التحقق من صحة نماذج الحث للشيخوخة المعتمدة والتكامل مع علامات الشيخوخة المتعامدة سيعزز تفسير نشاط SA-β-gal في مجموعات الخلايا المعقدة.

الإفصاحات

يعلن المؤلفون عدم وجود تضارب مصالح.

شكر وتقدير

نشكر ليف إيدسمو وكيرا ميليكان على توفير الوصول إلى خزعات الأنسجة البشرية، ولينا أبيلسفد على المساعدة في معالجة العينات. وقد دعمت هذه الدراسة منح من مجلس البحوث السويدي (2022-01236)، وبرنامج البحث الاستراتيجي للسكري في معهد كارولينسكا (C5471162)، ومؤسسة نوفو نورديسك (C5475033)، وجائزة الباحث من مؤسسة فالي (C5471234)، ومنحة مارك لمؤسسة أسباير (C5477023)، والجمعية السويدية للسرطان (22,2420)، وبرنامج البحث الاستراتيجي للخلايا الجذعية والتجدد في معهد كارولينسكا (C5472022)، ومؤسسة كنوت وأليس فالينبرغ (2020.0118؛ 2023.0536).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
1.5 mL tubesBioSphere72.706.200Biosphere safeseal tube 1.5 mL, 250 PC
5 mL tubesEppendorf30119401Eppendorf tubes 5.0 mL microtube
96-well plateCorning4680Corning 96-well high content ccreening microplates with film bottom
CD31 primary antibodyAbcamAb9498Anti-CD31 antibody clone JC/70A
Confocal microscope with reflected light capabilitiesEvidentFV-4000
CoverslipsEprediaBB02400500A113MNZOCoverslips 24 mm x 50 mm, #1.5 thickness (0.13-0.16 mm) 
DPBSGibco14190-136DPBS, no calcium, no magnesium
Fixation bufferSigma Aldrich1.00496.5000Formaldehyde solution 4%, buffered, pH 6.9 
HClSigma-Aldrich320331-500mLHydrochloric acid (37%)
IncubatorStuartS130HHybridization oven/shaker
Microscopy slidesAvantor VWR631-1560Single-frosted slides, coloured ends
Mounting mediaInvitrogenP36984ProLong glass antifade mountant excitation/emission max 361/497 nm
Mouse IgG1 isotype controlR&D SystemsMAB002
NaOHSigma-AldrichS8045-500GSodium hydroxide ≥ 98%
Normal donkey serumJackson ImmunoResearch Labs017-000-121
pH meterMeterLabR21M002 PHM210 standard pH meter 
Pipette tips (1000 µL)Biosphere70.1186.2101250µL filtered pipette tips
Pipette tips (200 µL)Corning4823200µL filtered pipette tips
SABG KitCell signaling9860SSenescence beta-galactosidase staining kit
Secondary antibody, Alexa Fluor 555InvitrogenA31570Donkey anti-mouse IgG (H+L) highly cross-adsorbed excitation/emission max
553/568 nm
Tween-20Fisher Scientific10419000Pure, Fisher chemical
Water bathRowe ScientificSWB20DStandard water bath
WGAInvitrogenW11261Wheat Germ Agglutinin (WGA) Alexa Fluor 488 conjugate: Excitation/emission max 495/519 nm

المراجع

  1. Wang, E. Senescent human fibroblasts resist programmed cell death, and failure to suppress bcl2 is involved. Cancer Res. 55 (10), 2284-2292 (1995).
  2. Yosef, R., et al. Directed elimination of senescent cells by inhibition of BCL-W and BCL-XL. Nat Commun. 7 (1), 11190(2016).
  3. Jun, J. -I., Lau, L. F. The matricellular protein CCN1 induces fibroblast senescence and restricts fibrosis in cutaneous wound healing. Nat Cell Biol. 12 (7), 676-685 (2010).
  4. Krizhanovsky, V., et al. Senescence of activated stellate cells limits liver fibrosis. Cell. 134 (4), 657-667 (2008).
  5. Storer, M., et al. Senescence is a developmental mechanism that contributes to embryonic growth and patterning. Cell. 155 (5), 1119-1130 (2013).
  6. Muñoz-Espín, D., et al. Programmed cell senescence during mammalian embryonic development. Cell. 155 (5), 1104-1118 (2013).
  7. Eggert, T., et al. Distinct functions of senescence-associated immune responses in liver tumor surveillance and tumor progression. Cancer Cell. 30 (4), 533-547 (2016).
  8. Feldser, D. M., Greider, C. W. Short telomeres limit tumor progression in vivo by inducing senescence. Cancer Cell. 11 (5), 461-469 (2007).
  9. Xue, W., et al. Senescence and tumour clearance is triggered by p53 restoration in murine liver carcinomas. Nature. 445 (7128), 656-660 (2007).
  10. Acosta, J. C., et al. A complex secretory program orchestrated by the inflammasome controls paracrine senescence. Nat Cell Biol. 15 (8), 978-990 (2013).
  11. Coppé, J. -P., Desprez, P. -Y., Krtolica, A., Campisi, J. The senescence-associated secretory phenotype: the dark side of tumor suppression. Annu Rev Pathol Mech Dis. 5 (1), 99-118 (2010).
  12. Xu, M., et al. Targeting senescent cells enhances adipogenesis and metabolic function in old age. eLife. 4 (1), e12997(2015).
  13. Xu, M., et al. Senolytics improve physical function and increase lifespan in old age. Nat Med. 24 (8), 1246-1256 (2018).
  14. Li, F., et al. FBP1 loss disrupts liver metabolism and promotes tumorigenesis through a hepatic stellate cell senescence secretome. Nat Cell Biol. 22 (6), 728-739 (2020).
  15. Yoshimoto, S., et al. Obesity-induced gut microbial metabolite promotes liver cancer through senescence secretome. Nature. 499 (7456), 97-101 (2013).
  16. Aravinthan, A., et al. Hepatocyte senescence predicts progression in non-alcohol-related fatty liver disease. J Hepatol. 58 (3), 549-556 (2013).
  17. Baboota, R. K., et al. BMP4 and Gremlin 1 regulate hepatic cell senescence during clinical progression of NAFLD/NASH. Nat Metab. 4 (8), 1007-1021 (2022).
  18. Chen, Y. -W., Harris, R. A., Hatahet, Z., Chou, K. Ablation of XP-V gene causes adipose tissue senescence and metabolic abnormalities. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (45), E4556-E4564 (2015).
  19. Gustafson, B., Nerstedt, A., Spinelli, R., Beguinot, F., Smith, U. Type 2 diabetes, independent of obesity and age, is characterized by senescent and dysfunctional mature human adipose cells. Diabetes. 71 (11), 2372-2383 (2022).
  20. Li, Q., et al. Obesity and hyperinsulinemia drive adipocytes to activate a cell cycle program and senesce. Nat Med. 27 (11), 1941-1953 (2021).
  21. Minamino, T., et al. A crucial role for adipose tissue p53 in the regulation of insulin resistance. Nat Med. 15 (9), 1082-1087 (2009).
  22. Shi, D., et al. Photoactivatable senolysis with single-cell resolution delays aging. Nat Aging. 3 (3), 297-312 (2023).
  23. Dimri, G. P., et al. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (20), 9363-9367 (1995).
  24. Horwitz, J. P., et al. Substrates for cytochemical demonstration of enzyme activity:I. some substituted 3-indolyl-β-D-glycopyranosides1a. J Med Chem. 7 (5), 574-575 (1964).
  25. Lv, X., et al. Molecular engineering development of β-galactosidase-activatable fluorogenic probes for precise senescence tracking in cells, tissues and a mouse model of psoriasis. Sens Actuators B Chem. 444 (1), 138406(2025).
  26. Dedic, B., et al. Senescence detection using reflected light. Aging Cell. 23 (1), e14295(2024).
  27. Alcorta, D. A., et al. Involvement of the cyclin-dependent kinase inhibitor p16 (INK4a) in replicative senescence of normal human fibroblasts. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (24), 13742-13747 (1996).
  28. Hara, E., et al. Regulation of p16CDKN2 expression and its implications for cell immortalization and senescence. Mol Cell Biol. 16 (3), 859-867 (1996).
  29. Lin, A. W., et al. Premature senescence involving p53 and p16 is activated in response to constitutive MEK/MAPK mitogenic signaling. Genes Dev. 12 (19), 3008-3019 (1998).
  30. Okamoto, A., et al. Mutations and altered expression of p16INK4 in human cancer. Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (23), 11045-11049 (1994).
  31. Serrano, M., Hannon, G. J., Beach, D. A new regulatory motif in cell-cycle control causing specific inhibition of cyclin D/CDK4. Nature. 366 (6456), 704-707 (1993).
  32. Serrano, M., Lin, A. W., McCurrach, M. E., Beach, D., Lowe, S. W. Oncogenic ras provokes premature cell senescence associated with accumulation of p53 and p16INK4a. Cell. 88 (5), 593-602 (1997).
  33. Wong, H., Riabowol, K. Differential CDK-inhibitor gene expression in aging human diploid fibroblasts. Exp Gerontol. 31 (3), 311-325 (1996).
  34. Gustafson, B., Nerstedt, A., Smith, U. Reduced subcutaneous adipogenesis in human hypertrophic obesity is linked to senescent precursor cells. Nat Commun. 10 (1), 2757(2019).
  35. Barinda, A. J., et al. Endothelial progeria induces adipose tissue senescence and impairs insulin sensitivity through senescence associated secretory phenotype. Nat Commun. 11 (1), 481(2020).

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

الشيخوخة الخلويةالنسيج الدهنينشاط بيتا-جالاكتوزيداز المرتبط بالشيخوخةمجهر الضوء المنعكسالمجهر البؤريتحليل الخلية الواحدةالكيمياء النسيجية المناعية الخلويةمؤشرات السلالة الخلوية
اكتشاف الشيخوخة باستخدام الضوء المنعكس في الجزء الدهني من الأوعية الدموية العضلية
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.