تجميع واستخدام نظام نمو جينوتوبيوتيك نباتي لدراسات تفاعل النبات مع الميكروبات في الحبوب

ملخص

يصف هذا البروتوكول تجميع واستخدام نظام نمو نباتي جديد صمم لاستيعاب الحبوب وتم التحقق منه في القمح والذرة. يتيح هذا النظام الغنوتوبيوتيك النباتي من التجارب المسيطر عليها بين النباتات والميكروبات من خلال توفير ظروف نمو معقمة، وإدارة ري، وتوافق مع ركائز متنوعة قائمة على التربة.

الملخص

يتطلب تطوير تعديلات زراعية قائمة على الميكروبات تعمل بشكل متسق في الميدان فهم الآليات الجزيئية لتفاعلات النبات والميكروبات. تتطلب دراسة هذه الآليات الأساسية للتفاعل القدرة على زراعة النباتات تحت ظروف بيئية خاضعة للرقابة البيئية والجنوتوبيوتية (أي أن جميع الكائنات الدقيقة التي تتفاعل مع النبات معروفة، سواء كانت خالية من الجراثيم أو مجتمعات ميكروبية محددة أو مجتمعات طبيعية). الأنظمة الجنوتوبولوجية النباتية المتوفرة حاليا غير مناسبة لدراسة النباتات الكبيرة ذات الصلة الزراعية، مثل الحبوب. علاوة على ذلك، تفتقر معظم هذه الأنظمة إلى القدرة على إدارة الري. هنا، نقدم نظام GNOVA، وهو نظام جنوتوبيوتيك جديد مصمم لاستيعاب نباتات الحبوب التي لديها القدرة على إدارة الري. هذا النظام الجديد هو منصة سهلة الوصول تتكون من قاعدة مطبوعة ثلاثية الأبعاد ومواد متاحة تجاريا. يوفر هذا البروتوكول دليلا خطوة بخطوة لتجميع النظام وإعداد التجربة. علاوة على ذلك، نقدم مقارنة أداء بين GNOVA ونظام كيس جنوتوبيوتيك. مددت GNOVA نمو النبات من أسبوعين في نظام الأكياس إلى 17 أسبوعا للقمح و4 أسابيع للذرة. كما ارتفع معدل إنبات كلا المحصولين ضمن GNOVA من 66٪ إلى 100٪ للقمح ومن 75٪ إلى 100٪ للذرة. القمح المزروع داخل GNOVA طور محاثا غير موجودة في النباتات ذات العمر ضمن نظام الأكياس. كان وزن الذرة الطازجة المزروعة في GNOVA أعلى بنسبة 594٪ من نظام الأكياس. بالإضافة إلى ذلك، كان ارتفاع البراعم وطول جذور الذرة أكبر بنسبة 89٪ و57٪ داخل نظام GNOVA مقارنة بالأكياس على التوالي. يوسع نظام GNOVA صندوق الأدوات المتاح للعلماء لاستكشاف تفاعلات النبات والميكروبيوم إلى ما بعد مرحلة الشتلات في الحبوب من خلال توفير مساحة نمو أكبر وإدارة للري.

المقدمة

حظيت العلاجات الزراعية القائمة على الميكروبات باهتمام كبير خلال العقود القليلة الماضية بسبب قدرتها على تحسين إنتاجية المحاصيل من خلال تعزيز نمو النبات ومرونته ضد الضغوط البيئية. وفي الوقت نفسه، لا تزال آليات عمل هذه المنشطات الحيوية غير مفهومة جيدا، مما قد يساهم في نتائجها غير المتسقة عبر التربة والمواقع والظروف البيئية ^1,2. يتطلب تعزيز فعالية العلاجات القائمة على الميكروبات الحالية وتطوير تقنيات جديدة فهما أعمق للآليات الجزيئية لتفاعل النبات والميكروبات ^3,4. ومع ذلك، لا يزال تشريح هذه الآليات تحديا بسبب تعقيد المجتمعات الميكروبية الطبيعية ^5,6. لتحديد المؤثرات الميكروبية والتفاعلات التي تدفع فوائد النبات، يمكننا تقليل تعقيد الأنظمة الطبيعية من خلال استخدام مجتمعات ميكروبية صناعية (SynComs) ضمن أنظمة النمو التي تسمح بالتحكم في الظروف البيئية والمجتمع الميكروبي. علم الأحياء الغنوتوية، دراسة العوائل المرتبطة بالمجتمعات الميكروبية المحددة⁷، تتيح للباحثين مقارنة العوائل الخالية من الجراثيم مع تلك التي تم استعمارها مع مجتمعات ميكروبية معروفة لربط وظيفة الميكروبات بالنمط الظاهري^{للنبات 8}.

تم بناء أنظمة الغنوتوبيوتيك المبكرة باستخدام أنابيب اختبار زجاجية^{9، 10، 11، 12} والجرار¹³. منذ ذلك الحين، شهدنا توسعا سريعا في أنظمة جديدة تم تطويرها لدراسة النباتات بشكل جنوتوبيولوجي. تشمل الأنظمة الأكثر شيوعا اليوم استخدام أطباق بتري¹⁴، أنابيب الاختبار^{15، 16}، البرطمانات الزجاجية¹⁷، صناديق الماجنتا¹⁸، الأكياس المختومة¹⁹، الزراعة المائية²⁰، فلو بوت وجنوتوبوت²¹، أنظمة الميكروفلويدكس²²، وEcoFABs²³. على الرغم من هذا التقدم، فإن معظم الأنظمة إما محسنة لتصوير²² أو مجموعة الإفرازات^17,20 أو مصممة لأنواع النماذج الصغيرة 14,18,21. العديد منها أنظمة مغلقة تحد من التحكم في الري ومدة التجارب. تشكل هذه القيود تحديات لدراسة المحاصيل الزراعية الأكبر مثل الحبوب، التي تتطلب مساحة إضافية، وتدفق هواء، وإدارة مياه.

إدراكا للحاجة إلى نظام يمكنه استيعاب النباتات الأكبر والدراسات الأطول، تم تطوير EcoFAB 3.0 مؤخرا لتوسيع الزراعة الجنوتوبولوجية لتشمل النباتات الأكبر²⁴. يوفر EcoFAB 3.0 حجم أكبر للجذور ومساحة الرأس، مما يدعم نمو سورغم ثنائي اللون حتى 4 أسابيع، ويسمح بجمع الإفرازات وتصوير الجذور²⁴ أسبوعا. على الرغم من أن هذا النظام الجديد يعد مثالا واعدا على توسيع أنظمة الجنوتوبيوتيك لتشمل المحاصيل الزراعية، إلا أنه لا يزال هناك حاجة إلى منصة سهلة الوصول ومتعددة الاستخدامات يمكن اعتمادها بسهولة عبر المختبرات وتتوافق مع مجموعة واسعة من سير العمل التجريبي. لهذا السبب، طورنا نظام GNOVA (نظام GNotobiotic لتطبيقات النباتات متعددة الاستخدامات)، وهو نظام مصمم لاستيعاب محاصيل الحبوب تحت ظروف الجنوتوبيوتيك. هنا، نقدم بروتوكولا مفصلا لتجميع وتشغيل GNOVA ونعرض أدائه مقارنة بنظام أكياس جنوتوبيوتيك المستخدم بشكل روتيني في مختبرنا. مع تطوير هذا النظام الجديد، حسننا القدرة على زراعة القمح والذرة في ظروف معقمة من خلال توفير مساحة نمو أكبر وري مدمج مقارنة بالأنظمة المغلقة السابقة. أداء GNOVA مشابه لأداء EcoFAB 3.0، مما يوسع مجموعة الأدوات لتشريح تفاعلات النباتات والميكروبيوم في محاصيل الحبوب غير النموذجية. علاوة على ذلك، تعزز مرونة وقدرة التكيف على الجنوتوبيوتيك النباتي من خلال تصميم GNOVA البسيط، واستخدام المواد التجارية المتاحة، وملفات الكائنات ثلاثية الأبعاد المتاحة، مما يسمح للباحثين بتغيير المواد والتصميم لتعديل احتياجاتهم البحثية والميزانية.

البروتوكول

ملاحظة: يمكن العثور على ملفات الطباعة ثلاثية الأبعاد للقاعدة في المواد الإضافية وهي متاحة للجمهور في Dryad (https://doi.org/10.5061/dryad.f7m0cfzbc). من أجل السرعة وكفاءة التكلفة، نوصي بالطباعة بالجملة لدى مزودي خدمات الطباعة ثلاثية الأبعاد التجارية المحلية.

1. تجميع النظام الجنوتوبيوتيك

1. ابدأ تجميع الوعاء (قم بإجراء مرة واحدة قبل الاستخدام التجريبي المتكرر).
   1. أغلق قاع الوعاء بوضع دائرة شبكة سلكية من الفولاذ المقاوم للصدأ فوق أحد طرفي أنبوب البولي كربونات وتثبيت الدائرة باستخدام مشبك الخرطوم (الشكل 1A).
   2. حفر فتحات الري عن طريق إنشاء فتحة ري بقطر 1/4 بوصة (6.35 مم) على بعد 1.5 سم من الحافة العلوية للطرف المفتوح لأنبوب البولي كربونات. احفر فتحتين بقطر 1/8 بوصة (3.18 مم) على بعد 3 سم من الفتحة الأولى، مع وجود فتحة واحدة على بعد 1 سم من الحافة والأخرى 2 سم من الفتحة العلوية.
      ملاحظة: إذا لزم الأمر، يمكن إضافة خطوط أنابيب إضافية حول الحافة العلوية للوعاء باتباع نفس الخطوات.
   3. قم بتركيب أنابيب الري عن طريق إدخال جزء قصير من أنابيب السيليكون عبر فتحة 1/4 بوصة.
   4. ثبت الأنبوب عن طريق تمرير رباط البلاستيك عبر فتحتين بحجم 1/8 بوصة (الشكل 1B). أدخل اللوير الذكري لتركيب 1 في أنبوب السيليكون الممتد خارج الوعاء (الشكل 1C).
      ملاحظة: يجب أن يكون شوكة الخرطوم في الوصلة 1 مكشوفا.
   5. جهز براميل الحقنة عن طريق ملء برميل الحقنة الفارغ بصوف زجاجي وإغلاق الطرف بقطعة صغيرة من ورق الألمنيوم (الشكل 1C).
   6. قم بتثبيت قطعة قصيرة من أنبوب السيليكون على نهاية قفل اللور في ماسورة الحقنة (الشكل 1C).
   7. جهز برميلين متطابقين للحقنة. قم بتثبيت أحد براميل الحقن المحضرة على شريط الخرطوم المكشوف عند تركيب 1 على الأنبوب الممتد خارج الوعاء (الشكل 1D).
   8. الإيقاف المؤقت: يمكن تخزين الأواني المجمعة للاستخدام التجريبي لاحقا.

الشكل 1: مجموعة الأصيص. أ) أسفل الوعاء مغلق بشبكة سلكية ومشبك خرطوم. (ب) منفذ الري في الحافة العليا للوعاء. (ج) ينتهي خط الري بشريط خرطوم مكشوف من الوصلة 1 مع برميل حقنة محضر. (د) وعاء مجمع مع خط ري مغلق يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

2. تحضير الوعاء للتجربة (قم به قبل كل تجربة جديدة)
   1. بطن أسفل الوعاء بدائرتين مقطوعات مسبقا من الألياف الزجاجية (الشكل 2A).
   2. جهز ركيزة التربة بخلط جزأين من الطين مع جزء واحد من الرمل. أضف 840 مل من الركيزة إلى الأصيص.
   3. غط الأواني بغطاء بلاستيكي وثبته بالشريط اللاصق (الشكل 2B).
   4. الأواني المليئة بالأوتوكلاف على دورة جافة عند درجة حرارة 121 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. اتركه ليبرد طوال الليل مع أغطية بلاستيكية على الأوعية. أعد المعقم على دورة جافة عند 121 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. اتركها تبرد تماما. حافظ على تغطية الأواني بغطاء بلاستيكي.
      ملاحظة: يمكن استخدام ركائز تربة أخرى، لكن يجب تحسين الكمية المطلوبة لكل وعاء مسبقا. كما تم اختبار GNOVA بسعة 800 مل من الطين 100٪ ولتر واحد من الرمل 100٪. قد تتطلب ركائز التربة الأخرى دورات أكثر من الأوتوكلاف أو إعدادات مختلفة للتعقيم الكامل.
      تحذير: يجب توخي الحذر عند إزالة الأواني من جهاز الأوتوكلاف، لأن المادة ستكون ساخنة وقد ترتخي مشابك الخرطوم. تأكد من أن مشابك الخرطوم محكمة الإحكام بعد التبريد قبل رفع الأوعية.
   5. أدخل أواني مبردة في القاعدة المطبوعة ثلاثية الأبعاد. ضع الوعاء المملوء بالتربة داخل القاعدة المطبوعة ثلاثية الأبعاد. أمسك الوعاء من القاعدة، وليس بالأعمدة المفتوحة، لأنها الجزء الأكثر هشاشة.
   6. مرر أنبوب الري عبر أحد الفتحات السفلية للقاعدة المطبوعة ثلاثية الأبعاد (الشكل 2C).
      ملاحظة: لا تقم بتعقيم قاعدة الدعم المطبوعة ثلاثية الأبعاد، لأن ذلك قد يذيب القطعة. قد تحتاج التجارب التي تتطلب درجات حرارة تزيد عن 60 درجة مئوية إلى خيط بديل مقاوم للحرارة (انظر جدول المواد).
   7. حافظ على الأواني في درجة حرارة الغرفة بعد التعقيم المستخدم، ولا تزيل الغطاء البلاستيكي أو الحقنة المحضرة حتى الإعداد النهائي للتجربة.

الشكل 2: رسم توضيحي للوعاء المعد. (أ) قاع الوعاء مبطن بلفافة أنابيب من الألياف الزجاجية. (ب) يغلق سطح القدر بغطاء بلاستيكي. (ج) وعاء فارغ مثبت داخل التصميم النهائي للقاعدة المطبوعة ثلاثية الأبعاد. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

3. تحضير الأسطوانة الزجاجية (يتم تنفيذها قبل كل تجربة جديدة)
   1. غط أحد طرفي الأسطوانة الزجاجية بفلتر DW4 مقطوع مسبقا وثبته باستخدام شريط الفينيل (الشكل 3A).
   2. قم بتدوير الأسطوانة الزجاجية لتواجه الطرف الآخر المفتوح وثبت حلقة قطنية داخل الأنبوب على بعد 14 سم من الحافة. ثبت خاتم القطن باستخدام شريط جراحي (الشكل 3B).
   3. أغلق الطرف السفلي للأسطوانة بلفافة تعقيم باستخدام رباطين مطاطيين (الشكل 3B).
   4. قم بتعقيم الأسطوانات الزجاجية المحضرة على دورة جافة عند 121 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة قبل الاستخدام. بعد التعقيم، خزن الأسطوانات الزجاجية المعقمة في درجة حرارة الغرفة حتى الحاجة دون الحاجة لإزالة الغلاف.

الشكل 3: مجموعة أسطوانة زجاجية. (أ) الطرف العلوي للأسطوانة الزجاجية مغلق بوسائط مرشح DW4 وشريط فينيل. (ب) الطرف السفلي للأسطوانة الزجاجية مزود بحلقة قطنية ومغلق بلفافة تعقيم وأربطة مطاطية. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

4. تحضير مرشح الري (يتم قبل كل حدث ري، باستثناء الخطوات 1.4.4–1.4.6، والتي يجب أن تتم مرة واحدة فقط)
   1. قم بتجميع حامل المرشح بوضع غشاء مرشح PES (الشكل 4A.4) بين حامل المرشح (الشكل 4A.5) وقرص الفلتر (الشكل 4A.3).
   2. وجه الجانب الأملس من غشاء المرشح نحو اتجاه التدفق، مع التأكد من أنه يواجه أعلى حامل المرشح (الشكل 4A.1).
   3. ثبت حلقة O (الشكل 4A.2) في أعلى حامل الفلتر (الشكل 4A.1). ثبت غطاء الفلتر على حامل الفلتر. فقط بشدة اليد.
   4. قم بتوصيل الموصلات. أدخل الذكر المخصص للتركيب 2 في المنفذ العلوي لحامل الفلتر.
   5. قم بتثبيت قطعة قصيرة من أنبوب السيليكون على طرف خرطوم الشوكة على الفلتر (الشكل 4B). أدخل اللوير الذكري من الوصلة 1 في نهاية ماسورة الحقنة الأخرى المحضرة من الخطوة 1.1.6 (الشكل 4B).
   6. وصل الفلتر إلى وصلة الشوكة في الأنبوب الموجود على ماسورة الحقنة المحضرة.
   7. استخدم الفلاتر المجمعة على دورة جافة على درجة حرارة 121 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. شد الفلاتر بعد أن تبرد وقبل الاستخدام.
      ملاحظة: ينصح بتحضير جميع الفلاتر اللازمة وتعقيم العينات في صندوق مغلق من البولي بروبيلين. بمجرد تعقيم الفلاتر، يمكن الحفاظ على التعقيم عند درجة حرارة الغرفة حتى يتم استخدام الحقنة الجاهزة طالما لم تزال الحقنة الجاهزة.

الشكل 4: مجموعة حامل الفلتر. (أ) جزء حامل الفلتر المفكك: 1. غطاء حامل الفلتر، 2. حلقة O، 3. قرص الفلتر، 4. غشية الفلتر، و5. حامل الفلتر. (ب) حامل فلتر مجمع مع ماسورة حقنة محضرة مقابلة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

2. إعداد التجربة

1. جهز وتعقيم المحاليل والمواد قبل يوم واحد على الأقل من بدء التجربة.
   1. حضر وسطاء نمو نباتات موراشيغي وسكوغ بحجم 0.5X وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. وسط المعقم على دورة سائلة عند 121 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
   2. استخدم جهاز التعقيم في جهاز التعبئة المفكك على دورة جافة عند 121 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. استخدم جهاز المعقم 1 لتر من الماء منزوع الأيونات على دورة سائلة عند درجة حرارة 121 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
   3. طبق زجاجي من الأوتوكلاف، كؤوس 500 مل، مصافي شاي، وملاقط على دورة جافة عند 121 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة يوميا مسبقا.
      ملاحظة: ما لم يذكر خلاف ذلك، يجب تنفيذ الخطوات التالية في غطاء تدفق طبقي باستخدام تقنية المعقم.
2. تعقيم البذور على السطح.
   ملاحظة: بروتوكول تعقيم بذور السطح يعتمد على نوع النبات المستخدم. تم اختبار النظام الجنوتوبيوتيك على كل من القمح والذرة باستخدام بروتوكولات تعقيم البذور التالية.
   تحذير: ارتد معطف مختبر وقفازات ونظارات واقية عند التعامل مع المبيض وهيبوكلوريت الصوديوم، لأن هذه المواد الكيميائية قد تكون مهيجات أو تآكلية للجلد والعينين. الإيثانول قابل للاشتعال؛ لا تستخدم اللهب القريب من اللهب المفتوح.
   1. تعقيم بذور القمح²⁵
      1. املأ كوبتين ب 150 مل من الإيثانول بنسبة 95٪ V/V، وكأس واحد ب 150 مل من مبيض المنزل غير المخفف، وكوبين ب 150 مل من الماء.
      2. ضع بذور القمح في مصفاة الشاي. حرك مصفاة الشاي بلطف مع البذور في أحد الكؤوس مع 95٪ من الإيثانول بنسبة v/v لمدة دقيقة واحدة.
      3. انقل البذور إلى مصفاة شاي جديدة. حرك مصفاة الشاي بلطف مع البذور في المبيض لمدة 10 دقائق.
      4. انقل البذور إلى مصفاة شاي جديدة. حرك مصفاة الشاي بلطف مع بذور في الكأس الآخر مع 95٪ من الإيثانول v/v.
      5. حرك مصفاة الشاي بلطف مع البذور في ماء معقم منزوع الأيونات لمدة 30 ثانية. حرك مصفاة الشاي بلطف مع البذور في الكأس الآخر باستخدام ماء معقم منزوع الأيونات لمدة دقيقتين. ضع البذور المعقمة في طبق بتري معقم فارغ.
   2. تعقيم بذور الذرة²⁶
      1. ضع بذور الذرة في أنبوب مخروطي بحجم 50 مل. املأ الأنبوب المخروطي ب 70٪ فولت/فولت إيثانول. اقلب الأنبوب المخروطي بلطف لمدة 3 دقائق.
      2. قم بصب 70٪ إيثانول واملأ الأنبوب المخروطي بالبذور بهيبوكلوريت الصوديوم 2٪ v/v. اقلب الأنبوب المخروطي بلطف لمدة 3 دقائق.
      3. قم بغسل هيبوكلوريت الصوديوم بنسبة 2٪ وشطف البذور بماء منزوع الأيونات المعقم. قم بغسل الماء واشطف البذور بالماء أربع مرات. ضع بذور الذرة في طبق بتري معقم.
3. أضف اللقاح الميكروبي إلى الوسط عند الحاجة.
   ملاحظة: لم يتم تطبيق أي لقاح ميكروبي أثناء اختبار التحسين والتعقيم لنظام الجنوتوبيوتيك.
4. قم بتجميع موزعات الزجاجات العلوية وربطها بزجاجات الوسائط.
   ملاحظة: بما أن هذا نظام مفتوح، نوصي بأن يكون لديك حاوية لجمع وسائط التدفق. وجدنا أن استخدام صينية الخبز يعمل جيدا ويسمح بالحركة بسهولة، لكنه يتطلب تفريغها بشكل متكرر.
5. أزل الغطاء البلاستيكي من القدر وصب 378 مل من الوسط في الوعاء.
   ملاحظة: هذا يعادل حوالي 70٪ من مساحة المسام المملوءة بالماء (WFPS)، والتي يجب تعديلها عند استخدام ركائز تربة أخرى. استخدم 360 مل للطين و358 مل للرمل.
   1. ازرع البذور المعقمة إلى العمق المناسب باستخدام ملقط معقم.
   2. ازرع القمح على عمق نصف بوصة والذرة على عمق بوصة واحدة. بدلا من ذلك، ازرع شتلات معقمة نبتة مسبقا في GNOVA. استخدم بذور إنبات مسبقا لاختبار نمو الذرة.
   3. استبدل الغطاء البلاستيكي فوق الأصيص.

3. التجميع النهائي والتشغيل التجريبي

1. انقل الوعاء وأسطوانة الزجاج إلى غرفة نمو. أمسك الأسطوانة الزجاجية بحيث يكون القاع مواجها للأسفل بالقرب من الوعاء.
2. أزل الغطاء البلاستيكي بسرعة من القدر ولف التعقيم من الأسطوانة الزجاجية. أنزل الأسطوانة الزجاجية إلى الأعلى، وضعها على حافة القاعدة المطبوعة ثلاثية الأبعاد.
   ملاحظة: يمكن أيضا وضع لهب (مثل موقد بنسن المحمول) بجانب الوعاء أثناء التجميع النهائي لنظام النمو لتقليل خطر التلوث.
   تحذير: تأكد من عدم وجود مواد قابلة للاشتعال أخرى بالقرب من العمل مع لهب مفتوح. انتبه لموقع اللهب بالنسبة لجسمك لتجنب إصابة الحروق.
3. ازرع النباتات بين 4 و17 أسبوعا، حسب نوع النباتات، وباستخدام ظروف نمو خاصة بالنوع.
4. يزرع القمح عند درجات حرارة نهاري/ليلية 22 °م/16 درجة مئوية والذرة عند 27 °م/23 °م. فترة الضوء لكلا الجهازين هي 12 ساعة فقط تحت أضواء الفلورسنت.

4. الري

1. قم بتثبيت أنبوب سيليكون طويل على موزع الزجاجة السطحية.
2. حافظ على التعقيم أثناء الري باستخدام لهب محمول. إذا لم يكن اللهب المحمول خيارا، قم بالري باستخدام المبيض للحفاظ على التعقيم.
3. الري باستخدام لهب محمول.
   تحذير: اعمل بحذر حول اللهب المفتوح لمنع الإصابات الجسدية وأضرار المنشأة.
   1. ضع اللهب بالقرب من خط الري. أزل برميل الحقنة من خط الري وحامل الفلتر. حافظ على جميع نهايات الأنابيب داخل منطقة اللهب.
   2. ثبت حامل الفلتر على خط الري. اربط فوهتي الحقنة ببعضهما البعض. قم بتوصيل قطعة الأنبوب الطويلة الأخرى في موزع الزجاجة العلوي بالمنفذ السفلي لحامل الفلتر.
   3. وزع 150 مل من وسائط موراشيغ وسكوغ 0.5X. افصل بين فوهتي الحقنة.
   4. افصل أنبوب السيليكون عن حامل الفلتر واستبدله بفوهة حقنة واحدة.
4. الري باستخدام 10٪ مبيض
   ملاحظة: نوصي باستخدام هذه الاستراتيجية في الري في تجارب كبيرة (رقم 50 >) لزيادة الإنتاجية أثناء الري.
   تحذير: ارتد معطف مختبر وقفازات ونظارات واقية عند استخدام المبيض.
   1. قم بتوزيع محلول مبيض بنسبة 10٪ في كوبتين بلاستيكيين صغيرتين وضعهما بالقرب من خط الري. أزل برميل الحقنة من خط الري وحامل الفلتر.
   2. اغمر جميع نهايات الأنابيب في محلول مبيض بنسبة 10٪ حتى الحاجة. تخلص من محلول المبيض الزائد. قم بتثبيت حامل الفلتر على خط الري في الأصيص.
   3. قم بتوصيل قطعة الأنبوب الطويلة الأخرى من الموزع العلوي للزجاجة إلى المنفذ السفلي لحامل الفلتر.
   4. وزع 150 مل من وسائط موراشيغ وسكوغ 0.5X. افصل أنبوب السيليكون عن حامل الفلتر.
      ملاحظة: حجم الري هو 120 مل للرمل و360 مل للطين.
   5. استبدل الفلتر في خط الري ببرميل حقنة بعد هز المبيض الزائد.
      ملاحظة: إذا تغير حجم الري، ضع في الاعتبار حوالي 20 مل من الوسط لتحضير خط الري.
5. اشك الأواني مرة في الأسبوع. ضبط حجم وتكرار الري بناء على هدف التجربة وطبقة التربة المستخدمة. إذا تم استخدام 100٪ رمل، زد وتيرة الري إلى مرتين في الأسبوع.

5. الحصاد

ملاحظة: تم اتباع بروتوكول الحصاد هذا أثناء اختبار وتحسين نظام الجنوتوبيوتيك. يجب تعديل بروتوكول الحصاد ليتناسب مع أهداف البحث المحددة وحجم العينات التي يتم معالجتها.

1. جهز وتعقيم جميع المحاليل والمواد قبل يوم واحد على الأقل من الحصاد.
   1. جهاز تعقيم 4 لتر من الماء منزول الأيونات و500 مل من 0.145 مليون ميل NaCl، في دورة سائلة عند 121 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة يوميا مقدما.
   2. استخدم مقص وملاقط على دورة جافة عند 121 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة يوميا مسبقا.
      ملاحظة: ما لم يذكر خلاف ذلك، يجب تنفيذ الخطوات التالية في غطاء تدفق طبقي باستخدام تقنية المعقم. إذا لم تكن التعقيم ضرورية لجمع العينات، يمكن تنفيذ كل هذه الخطوات خارج غطاء التدفق الطبقي.
2. انقل أنظمة الجنوتوبيوتيك من غرفة النمو إلى المختبر وضعها بالقرب من غطاء التدفق الطبقي.
3. قم بإزالة الأسطوانة الزجاجية من الوعاء وضع الوعاء بسرعة في غطاء التدفق الطبقي. أخرج الوعاء من القاعدة المطبوعة ثلاثية الأبعاد.
4. أمسك النبات عند القاعدة وافرغ ركيزة التربة في وعاء. اهز بلطف كتل كبيرة من ركيزة التربة عن الجذور.
   ملاحظة: يمكن جمع عينات ركائز التربة ومعالجتها وفقا لهدف البحث المحدد في هذه المرحلة من الحصاد. البروتوكول الموضح باختصار هنا استخدم لاختبار تعقيم التربة.
5. حصاد التربة للبكتيريا في التربة عد²⁷ باستخدام التخفيف التسلسلي في صفيحة واحدة²⁸.
   1. املأ آبار صفيحة بئر 96 بسعة 270 ميكرولتر من 0.145 مليون جرام NaCl. اترك الصف الأول فارغا. أضف 1 جرام من ركيزة التربة إلى أنبوب مخروطي بحجم 15 مل يحتوي على 9 مل من 0.145 مليون NaCl.
   2. الدوامة عند أقصى سرعة لمدة 5 دقائق. نقل 30 ميكرولتر من العينة إلى بئر فارغ من صفيحة 96 بئر.
   3. تحضير سبع تخفيفات تسلسلية لكل عينة عن طريق توصيل 30 ميكرولتر من كل عينة إلى البئر أدناه الذي يحتوي على 270 ميكرولتر من محلول NaCl.
   4. اخلط جيدا عن طريق التوصيل بالماصات صعودا وهبوطا بين كل عملية نقل.
   5. تحضير رصد التخفيف التسلسلي للوحة واحدة لكل عينة عن طريق طلاء 10 ميكرولتر من كل تخفيف تسلسلي على صفيحة R2A واحدة.
   6. أمال الألواح لتوزيع القطرات. حضن الصحون في درجة حرارة الغرفة.
   7. عد وحدات تكوين المستعمرة (CFU) وحساب CFU/g من التربة.
6. افصل البراعم عن الجذور باستخدام مقص معقم. سجل وزن طلقة طازج.
7. نظف الجذور بهزها بلطف في كأس بماء منزوع الأيون. جفف الجذور وسجل وزنا جديدا.
   ملاحظة: يمكن جمع المواد فوق وتحت الأرض في هذه المرحلة ومعالجتها وفقا للمنهجية الأنسب للتحليل السفلي المعني.

النتائج

طورنا نظام GNOVA، وهو نظام جنوتوبيوتيك نباتي جديد، يتيح البيئة المعقمة والمتحكم بها اللازمة لفحص تفاعلات النبات والميكروبات. يوفر هذا النظام الجديد مساحة عمودية للبراعم 24.4 بوصة (62 سم) ووعاء بسعة 1.3 لتر متوافق مع عدة ركائز تربة. النظام المجمع بالكامل يبلغ ارتفاعه حوالي 3 أقدام (92.4 سم) وعرضه 4.57 بوصة (11.6 سم) (الشكل 5A–C). مقارنة بالأنظمة الأخرى، لديها أعلى قدرة عمودية لنمو البراعم وثاني أكبر غرفة جذور (الجدول التكميلي 1). يتطلب GNOVA فقط 0.0135 متر^مربع من مساحة السطح في غرفة النمو، مما يجعل هذا النظام مضغوطا وقابلا للمناورة. يمكن استخدام هذا النظام في غرف نمو قابلة للوصول إلى الداخل بمسافة رأسية تبلغ 1.22 متر. جميع مكونات هذا النظام، باستثناء القاعدة المطبوعة ثلاثية الأبعاد، قابلة للعمل بالأوكلافات ومتوافقة مع أجهزة الأوتوكلاف التي تمتد بأبعاد 24 بوصة × 24 بوصة × 36 بوصة (العرض × الطول × الارتفاع؛ 61 سم × 61 سم × 91 سم). هذا يبسط الإعداد التجريبي من خلال تجاوز التعقيم اليدوي للأجزاء الفردية. بالإضافة إلى ذلك، معظم مكونات هذا النظام قابلة لإعادة الاستخدام، مما يحافظ على تكلفة الاستخدام لكل تجربة عند حوالي 6 دولارات أمريكية بعد تكلفة الإعداد الأولية البالغة 54 دولارا للوحدة (الجدول التكميلي 2). تم تحديد الظروف البيئية داخل GNOVA من خلال تتبع درجة الحرارة والرطوبة النسبية للنظام مع نبات ذرة عمره أسبوع لمدة ثلاثة أيام. كانت درجة الحرارة داخل GNOVA في المتوسط أعلى ب+1.3 درجة مئوية من غرفة النمو (الشكل التكميلي 1). كانت الفروقات في درجات الحرارة داخل النظام والحجرة أكبر خلال دورة الضوء (متوسط +2.5 درجة مئوية) مقارنة بدورة الظلام (متوسط +0.4 درجة مئوية). بلغت الرطوبة النسبية داخل GNOVA في المتوسط 63٪، مقارنة ب 34٪ في غرفة النمو.

الشكل 5: تصاميم نظام GNOVA. (أ) نموذج ثلاثي الأبعاد للتصميم النهائي لقاعدة الدعم (ب) مقطع عرضي لنموذج ثلاثي الأبعاد لقاعدة الدعم (ج) مقطع عرضي لنموذج ثلاثي الأبعاد من GNOVA المجمع بالكامل يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

لضمان التعقيم داخل النظام، أجرينا تجربة لمدة أربعة أسابيع للأنظمة غير المروية والمروية بدون نباتات. تم تحديد التلوث على الأسطوانة الزجاجية عن طريق أخذ عينات فوق وتحت حلقة القطن من خلال الطلاء المباشر. لم يلاحظ أي نمو ميكروبي قابل للكشف فوق ثلاث مستعمرات (أي مستعمرة واحدة لكل ثلث مساحة السطح المأخوذة) فوق حلقة القطن لكل من العينات غير المروية (n=4) والمشروة (n=6) (الشكل التكميلي 2A). تحت حلقة القطن، لوحظ نمو في نسخة غير مروية واحدة، بينما لم يلاحظ نمو في الأنظمة المروية (الشكل التكميلي 2B). يشير هذا إلى انخفاض احتمال التلوث من الأسطوانة الزجاجية، حيث كان النمو الميكروبي موجودا فقط في نسخ محدودة أسفل حلقة القطن، التي لا تلامس النبات. تم تقييم تلوث التربة من خلال رصد التخفيفات المتسلسلة على ألواح R2A (الشكل التكميلي 2C). لم يتم اكتشاف نمو ميكروبي كبير في أي من الحالتين، باستثناء نسخة واحدة مروية مع عدد وحدات غير قابل للتطهير لتكوين مستعمرات من التخفيف التسلسلي (أي < 30 مستعمرة). بالإضافة إلى اختبارات التعقيم، أجرينا مقارنة أداء بين القمح والذرة المزروعة داخل GNOVA مع بروتوكول النمو الجنوتوبيوتيكي القياسي لمدة أسبوعين في نظام كيس¹⁹. لفهم تأثير الحجم الصغير وقلة الري على أداء النبات، قمنا بتمديد فترات النمو في الكيس لتتناسب مع تلك الموجودة ضمن GNOVA. على الرغم من أن محتوى مياه التربة الأولي المستخدم أثناء إعداد كلا النظامين تم توطيبه، إلا أن GNOVA تلقت تسميدا أسبوعيا، بينما لم تتلق الأكياس تسميدا. لكل المقارنات، نستخدم نظام الأكياس كمرجع، حيث كان هذا هو إعداد الجنوتوبيوتيك الأولي في مختبرنا. وصل كل من القمح والذرة إلى 100٪ إنبات ضمن GNOVA، بينما في نظام الأكياس، حقق القمح 67٪ فقط (n = 3) والذرة 75٪ (n = 8) (الشكل 6).

الشكل 6: إنبات القمح (n = 3) والذرة (n = 8) ضمن نظام GNOVA (البنفسجي) ونظام الأكياس (الأخضر). يتم تمثيل نتيجة الإنبات لكل نسخة بنقاط على المحور y إما كنوع عدم إنبات أو إنبات لكل نظام غنوتوبيوتيك. تمثل الأشرطة معدل الإنبات (٪) لكل نوع نباتي ضمن أنظمة مختلفة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

كما أجري اختبار نمو للقمح والذرة لتحديد أقصى فترة نمو قابلة للحياة وأداء النبات ضمن GNOVA. على الرغم من أن بروتوكول الكيس القياسي لدينا يتطلب فقط أسبوعين من النمو، إلا أننا مددنا فترة النمو داخل الأكياس لأكثر من أسبوعين لمقارنة أفضل بين النظامين. بعد أسبوعين، وصل القمح المزروع ضمن GNOVA (n=3) إلى مرحلة نمو زادوك (GS) 13 (الشكل 7A)، بينما ظل في الكيس عند GS11. في الأسبوع الخامس، وصلت المصانع إلى GS21 ضمن أنظمة GNOVA كما يتضح من ظهور المحراث (الشكل 7B). على النقيض من ذلك، كانت الحراثة غائبة عن أنظمة الأكياس، وبقيت المصانع في GS13. أدى هذا التوقف في النمو وغياب التغيرات الفينولوجية في نظام الأكياس إلى إنهاء النباتات في هذا النظام في الأسبوع السادس. استمرت نباتات القمح في النمو لمدة خمسة أسابيع أخرى ضمن GNOVA، حيث لوحظ زيادة في عدد الأوراق والكتلة الحيوية (الشكل 7C). على الرغم من أن الكتلة الحيوية للقمح زادت بصريا بعد 12 أسبوعا من النمو ضمن GNOVA، إلا أن النباتات بدأت تظهر أوراقا أكثر كلوروثية، وتم ملء حجم الأسطوانة الزجاجية بالكتلة الحيوية النباتية (الشكل 7D). تم زراعة القمح لمدة أسبوعين آخرين بعد ذلك (الشكل 7E,F). ومع ذلك، لم يكن هناك زيادة بصرية في الكتلة الحيوية، لذا تم إنهاء اختبار النمو عند 17 أسبوعا من النمو. كما تم تقييم نمو الذرة ضمن GNOVA لمدة أربعة أسابيع ومقارنتها بالذرة المزروعة في أكياس (الشكل 8A,B). في هذه التجربة، تم تعقيم بذور الذرة وإنبتها مسبقا قبل الزراعة داخل نظام GNOVA أو نظام الأكياس. كان وزن البراعم الطازجة وجذور الذرة مختلفا بشكل ملحوظ بين النظامين (اختبار t لعينتين، قيمة p < 0.05، الجدول التكميلي 3). كانت الذرة المزروعة في GNOVA لها براعم وجذور طازجة تزن في المتوسط 11.2 جرام و5.7 جرام على التوالي (الشكل 8C,D). على النقيض من ذلك، كانت البراعم وجذور الذرة المزروعة داخل الكيس ذات وزن طازج يبلغ 1.29 جرام و1.15 جرام على التوالي. بشكل عام، زادت الكتلة الحيوية الطازجة للذرة المزروعة داخل GNOVA بنسبة 593٪ مقارنة بالذرة المزروعة في نظام الأكياس. علاوة على ذلك، كان طول البراعم والجذر أكبر بشكل ملحوظ داخل GNOVA مقارنة بالأكياس بنسبة 89٪ و57٪ على التوالي (الشكل 8E,F).

الشكل 7: نمو القمح ضمن النموذج الأولي ل GNOVA. (أ) القمح في أسبوعين في مرحلة نمو زادوك (GS) 13. (ب) مقارنة القمح بعد خمسة أسابيع من النمو في كيس وGNOVA. الحراثين موجودون ضمن GNOVA (GS21) وغائبون في الحقيبة (GS13). (ج) زيادة الكتلة الحيوية للقمح عند 10 أسابيع من النمو. (د) زيادة الكتلة الحيوية للقمح عند 13 أسبوعا من النمو مع ظهور أوراق كلوروثية. (ه) زيادة إضافية في الكتلة الحيوية للقمح عند 15 أسبوعا من النمو. و) الكتلة الحيوية للقمح تشغل معظم حجم النمو المتاح بعد 17 أسبوعا من النمو. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 8: نمو الذرة داخل النموذج الأولي GNOVA (البنفسجي) مقارنة بنظام الأكياس (الأخضر). تشير الأشرطة إلى متوسط القيم ± الخطأ المعياري (n=4) (أ) الذرة المزروعة لمدة أربعة أسابيع في نظام GNOVA ونظام الأكياس. (ب) مقارنة حجم النباتات المحصودة المزروعة في نظام GNOVA والأكياس. (ج) وزن شوت طازج (متوسط±SE). (د) وزن جذر طازج (متوسط±جنوب شرق). (ه) طول الطلقة (متوسط±جنوب شرق). و) طول الجذور (متوسط±جنوب الشرق). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل الإضافي 1: الديناميكيات الزمنية للرطوبة النسبية ودرجة الحرارة المقاسة ضمن GNOVA (البنفسجي) وغرفة النمو (البرتقالي). تم تسجيل البيانات بفواصل زمنية كل خمس دقائق لمدة ثلاثة أيام. تم تسجيل البيانات داخل GNOVA مع نبات ذرة عمره سبعة أسابيع. المناطق المظللة بالأزرق الفاتح تتوافق مع فترات الليل. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الشكل التكميلي 2: النمو الميكروبي الناتج عن اختبار تعقيم GNOVA بدون أن تتلقى النباتات أي ري (Control) أو مع الري (المروي). (أ) عينات أسطوانة زجاجية فوق حلقة القطن. (ب) عينات أسطوانات زجاجية أسفل حلقة القطن. (ج) طلاء تسلسلي بتخفيفات صفيحة واحدة لعينات التربة. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الجدول التكميلي 1: مقارنة الميزات بين GNOVA وباقي الجينوتوبيوتيك النباتي الموجود (EcoFAB، صناديق وأكياس، FlowPot، وGnotoPot، وEcoFAB 3.0). تتم مقارنة الأنظمة عبر معايير رئيسية ذات صلة بتصميم التجارب، مثل سعة ارتفاع النبات، وسعة حجم الجذور، والتحكم في الري. تم جمع المعلومات من الأدبيات المنشورة ووصف النظام المتاح؛ عندما لم يتم الإبلاغ عن البيانات بشكل صريح، يتم الإشارة إلى التقديرات. † أفضل تقريب عندما لا يذكر في الأدبيات؛ ‡ لا يحتاج النظام إلى تفكيك أو نقله إلى غطاء تدفق طبقي لأداء المهمة؛ * ممكن مع تعديلات على النظام؛ فئات التكلفة المعرفة كالتالي: منخفضة (< 30 دولار أمريكي للوحدة)، متوسطة (30-100 دولار لكل وحدة)، أعلى (> 100 دولار للوحدة). يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الجدول التكميلي 2: قائمة المواد (BOM) والتكاليف المقدرة لتجميع وتشغيل وحدة GNOVA واحدة. تصنف المواد كمكونات قابلة لإعادة الاستخدام أو مكونات ذات استخدام واحد، مع تكلفة وحدة مقابلة للوحدة، والكميات المطلوبة لكل نظام، والتكلفة الإجمالية لكل نظام. تساهم المكونات القابلة لإعادة الاستخدام في تكلفة الإعداد الأولية، وتمثل المواد ذات الاستخدام الواحد تكلفة استهلاكية لكل تجربة. * محسوبة من أسعار الجملة المتفاوض عليها لأسعار فعالة من حيث التكلفة؛ ** الكمية المطلوبة تختلف حسب مدة التجربة، والتربة المستخدمة، وهدف البحث. قيمة لتجربة تستمر أربعة أسابيع مع جدول ري أسبوعي باستخدام خليط الطين والرمل؛ † التكلفة التقريبية لكمية المواد المطلوبة لكل نظام؛ ‡ لا يشمل سعر محلول المغذيات أو ركيزة التربة لأن ذلك يختلف حسب هدف التجربةيرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الجدول الإضافي 3: قيم p الناتجة لاختبار t ذو العينتين لنمو الذرة قامت بقياس المتغيرات المزروعة داخل GNOVA ونظام الأكياس. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

المناقشة

يوفر نظام الجنوتوبيوتيك النباتي المعروض هنا، GNOVA، أداة سهلة الوصول ومتعددة الاستخدامات لدراسة تفاعلات النباتات والميكروبات في محاصيل الحبوب. تشمل ميزاته الرئيسية زيادة قدرة النمو والري المدمج، مما يمدد نمو الحبوب إلى ما بعد مرحلة الشتلات في الظروف المعقمة. أداء هذا النظام مشابه لنظام EcoFAB 3.0 ويوفر نظاما بديلا للجنوتوبيوتيك النباتي المتاح. تم بناء النظام من مكونات متاحة تجاريا تم اختيارها من حيث التكلفة والبساطة والتوافق مع أجهزة المعقم متوسطة الحجم، مما يسهل اعتماده في المختبرات. التجميع والتشغيل بسيطان ولا يتطلبان معدات متخصصة، مما يقلل من الحواجز أمام التنفيذ. يمكن تكييف GNOVA لخدمة أهداف بحثية مختلفة بسبب توافقه مع مجموعة واسعة من ركائز التربة، وبروتوكولات تعقيم البذور، والملقحات الميكروبية (خالية من الجراثيم، SynCom، أو المجتمع الطبيعي)، والتحليلات المتنوعة في المناطق اللاحقة.

يعد التلوث الأدنى ضروريا في تجارب الجنوتوبيوتيك النباتية لضمان أن التأثيرات التي لوحظت يمكن نسبتها إلى ميكروبات ذات اهتمام وليس إلى ملوثات. تعمل GNOVA البسيطة على تقليل خطر التلوث. الالتزام الصارم بتقنية المعقم والتوصيات الرئيسية التالية سيضمن الحفاظ على العقم. خلال إعداد التجربة، نوصي بتعقيم غطاء التدفق الطبقي بين اللقاحات الميكروبية لتقليل التلوث المتبادل للعلاجات. ترتيب تطبيق العلاجات يمكن أن يقلل أيضا من التلوث المتبادل. تطبيق العلاجات الخالية من الجراثيم قبل أي علاجات ميكروبية حية هو المثالي. قد تدخل ميكروبات أجنبية أيضا عبر البذور. لذلك يجب تحسين بروتوكولات تعقيم البذور السطحية لكل نوع نباتي أو مصدر بذور لتحقيق التوازن بين العقم والإنبات²⁶. يمكن تنفيذ بروتوكولات التعقيم للحبوب غير النموذجية، مثل الذرة الرفيعة²⁴، الشعير²⁹، عشب السويتش، والشوفان²³ بسهولة في GNOVA. إذا أثر التعقيم سلبا على الإنبات، يمكن استخدام بذور مبتعدة مسبقا بدلا من ذلك. يمثل الري مصدرا رئيسيا للتلوث في أنظمة الغنوتوبيوتيك. النقطة الأكثر أهمية خلال هذه العملية هي تثبيت المرشحات على خطوط الري. يجب أن تبقى نهايات أنابيب الري والمرشحات معقمة خلال هذه العملية. التعقيم باللهب يتطلب مهارة ويمكن أن يكون شاقيا للجهد، خاصة في التجارب الكبيرة (n >50). لذلك، يوصى باستخدام طريقة بديلة تعتمد على التبييض للتجارب الكبيرة أو عندما لا يكون التعقيم بالنار عمليا. ينصح أيضا بالحفاظ على مرشحات معقمة إضافية وتوفر المبيض أو الإيثانول أثناء الري في حالة التلوث أثناء التعامل مع مواد النظام. بالإضافة إلى ذلك، ينصح بشدة بإدراج وحدات مكافحة التلوث (أي عدم وجود نبات، عدم معالجة الميكروبات، وتلقي الري) لمراقبة التعقيم وتحديد الملوثات.

لتجاوز خطر تلوث الري، أغلقت أنظمة النباتات الغنوتوبولوجية الأولى بالكامل وافتقرت إلى القدرة على الري، مما حد من مدة التجارب. كانت الذرة تزرع بشكل غنوتوبيوتيكي في أكياس^{19 و30}، وأنابيب زجاجية، وأطباق بتري¹⁵ بين أسبوعين إلى أربعة أسابيع. ولتجديد المياه والمغذيات أثناء نمو النبات، أتاحت أنظمة بديلة مثل EcoFAB²³ وFlowPot وGnotoPot²¹ الري عن طريق التفكيك الجزئي داخل أغطية التدفق الطبقي. هذا حد من حجمها وتوافقها مع النباتات الأكبر. نظرا لأن خطوط الري سهلة الوصول خارج GNOVA، فلا حاجة للتفكيك، ولا يقتصر النظام على أحجام غطاء التدفق الطبقي. هذا لا يتيح فقط توفير مستمر للمغذيات والماء، بل يزيد أيضا من مساحة النمو المتاحة. يمكن أن يقلل مساحة البراعم من قدرة التمثيل الضوئي ويساهم في تقزم²⁴، كما أن تقييد حجم الجذور قد يؤدي إلى ارتباط الجذور ويقلل^من امتصاص الماء والمغذيات. يمكن أن يفسر الجمع بين مساحة النمو الصغيرة وقلة الري في نظام الأكياس انخفاض الكتلة الحيوية ونقص التطور الفينولوجي للذرة والقمح مقارنة بنظام GNOVA. سمح هذا النظام الجديد بنمو الذرة الجنوتوبيوتيك لفترة مماثلة لتلك الموجودة في السورغم في EcoFAB 3.0²⁴. علاوة على ذلك، يتجاوز النمو الجنوتوبيوتيك للقمح لمدة أربعة أسابيع في نظام الزراعة المائية (20) في نظام تربة أكثر تمثيلا. بالإضافة إلى القيود الفيزيائية، غالبا ما تعتمد أنظمة الجنوتوبيوتيك على تدفق هواء محدود للحفاظ على التعقيم. يمكن أن يؤدي تدفق الهواء المحدود إلى زيادة درجة الحرارة والرطوبة، بالإضافة إلى انخفاض معدلات تبادل الغاز، مما قد يؤثر على فسيولوجيا النبات³². تم الإبلاغ عن تحسن في النمو في الأنظمة التي تحتوي على تدفق هواء معزز، مثل صناديق الماجنتا المزودة بفلاتر HEPA^{رقم 33} التي تعمل بطريقة مشابهة لمرشح DW4 المستخدم في GNOVA. وبالمثل، أظهر EcoFAB 3.0 زيادة في درجة الحرارة والرطوبة النسبية لكنه لا يزال يعتبر منصة قوية لنمو الجنوتوبيوتيك للسورغم²⁴. يشير هذا إلى أنه رغم استمرار القيود الفيزيائية والبيئية داخل الأنظمة الجنوتوبية، فإن التقدم في تصميم النظام المعروض هنا لا يزال يوفر ظروفا محسنة تدعم النمو الجنوتوبيوتيك للحبوب بشكل أكثر فعالية.

سهولة التعديل هي ميزة رئيسية أخرى في GNOVA. تسمح وحدة تصميمه للمستخدمين بإجراء تغييرات على الأجزاء الفردية لتناسب احتياجاتهم البحثية وميزانيتهم بشكل أفضل. هذا النظام متوافق مع أي ركيزة تربة، بما في ذلك التربة الطبيعية. يجب أن تستند التعديلات على حجم الإعداد، وتركيز محلول المغذيات، وحجم وتكرار الري إلى الخصائص الفيزيائية-الكيميائية للتربة، لأنها تؤثر مباشرة على توفر^وتوزيع المغذيات والمياه. يمكن التسبب في الجفاف من خلال مراقبة وزن نظام GNOVA بأكمله وتحديد محتوى مياه التربة بالجاذبية³⁵. يمكن جمع إفرازات الجذور بشكل مدمر عن طريق حضانة النباتات المحصودة في ماء فائق النقاء³⁶ أو من خلال غسل النظام للحصول على مسرعات غير معقمة³⁷. إذا كانت هناك حاجة إلى إفرازات معقمة، يمكن تعديل وعاء GNOVA وقاعدة الدعم المطبوعة ثلاثية الأبعاد لدمج ميزة جمع إفراز مدمجة مشابهة لتلك الموجودة في تصميم EcoFAB 3.0²⁴. يمكن للعلماء المهتمين بفهم تأثيرات^{الأولوية 38} على تجمع المجتمعات الميكروبية تركيب خطوط ري إضافية حول الأصيص. وهذا يسمح بتطبيقات لاحقة لللقاحات الميكروبية مع الحفاظ على تعقيم خط الري الرئيسي. يمكن مراقبة الظروف البيئية بوضع حساسات معقمة لاسلكية لدرجة الحرارة والرطوبة النسبية داخل GNOVA. بدلا من ذلك، استبدال الأسطوانة الزجاجية بغرفة بولي كربونات وحفر منافذ أخذ عينات²⁴ سيمكن من قياس البيئة وأخذ عينات من الغازات. قد يسمح ذلك بقياس كمية الغازات والمركبات المتطايرة مثل ثاني أكسيد الكربون₂ و2 والإيثيلين مع إمكانية التأثير^{على أداء المصنع}. يمكن أيضا زيادة تدفق الهواء إلى النظام عن طريق إزالة الحلقة القطنية من الأسطوانة الزجاجية. ومع ذلك، فإن أي من هذه التعديلات قد تزيد من خطر التلوث ولم يتم التحقق منها أو تحسينها بعد ضمن GNOVA.

على الرغم من مزايا GNOVA وتنوعها، يجب النظر في بعض القيود. يجدر بالذكر أن هذا النظام مناسب بشكل أفضل للاستخدام داخل غرف النمو المسيطر عليها، حيث قد تؤثر الظروف غير المنضبطة في الدفيئة أو الحقل على أدائه. على الرغم من أن القمح استطاع النمو داخل النظام لمدة 17 أسبوعا، لوحظت علامات الإجهاد بعد حوالي 12 أسبوعا من النمو. لذلك، لا ينبغي زراعة القمح بعد عمر 12 أسبوعا. علاوة على ذلك، تم تأكيد الحفاظ على التعقيم فقط من خلال أربع فعاليات ري أسبوعية خلال فترة نمو مدتها أربعة أسابيع؛ التجارب الأطول تحمل مخاطر متزايدة للتلوث. على الرغم من أن GNOVA زادت من قدرة حجم الجذور، إلا أن تقييد الجذور لا يزال ممكنا، وقد يساعد التقييم الزمني لشكل الجذور في تحديد فترات النمو المثلى التي تقلل من ارتباط الجذور. بالإضافة إلى ذلك، بعض التعديلات على النظام، مثل استبدال الأسطوانة الزجاجية بأسطوانة بولي كربونات، يمكن أن تزيد تكلفة الإعداد إلى أكثر من 100 دولار أمريكي للوحدة. حاليا، يسمح GNOVA فقط بأخذ عينات مدمرة من نقطة النهاية، مما يزيد من متطلبات العمل والتكرار للدراسات الزمنية لديناميكيات الميكروبات، وأنماط الإفراز، أو مراقبة التعقايم. وأخيرا، الحفاظ على التعقيم أثناء الإعداد والري والحصاد يستغرق وقتا طويلا، وحتى الأنظمة المبسطة مثل GNOVA تتطلب جهدا مخصصا، مما يزيد من تكاليف التشغيل الإجمالية. يجب أخذ هذه القيود مجتمعة في الاعتبار عند اعتماد هذا النظام. علاوة على ذلك، يجب أخذ القيود البيئية الناتجة عن نمو الجنوتوبيوتيك في الاعتبار عند تخطيط التجارب وتفسير النتائج، لأنها قد تؤثر على فسيولوجيا النبات وبالتالي على الميكروبيوم المرتبط بها.

توفر GNOVA منصة جنوتوبيوتية متعددة الاستخدامات متوافقة مع محاصيل الحبوب. يتيح النظام استعادة أنظمة جذور شبه سليمة مناسبة لأدوات تحليل بنية الجذور مثل RhizoVision Explorer³⁹ وARIA⁴⁰، مما يسمح بتوصيف شكل الجذور استجابة لتنوع اللقاحات الميكروبية والظروف البيئية. عند دمجها مع SynComs وتحليلات متعددة الأوميكس، يسهل GNOVA تحديد الروابط الميكانيكية بين المؤثرات الميكروبية واستجابات النباتات. يمكن استخدام SynComs الأكبر (>100 عضو) مع تحليل ميتاجينومي ^41,42,43 لفحص أنماط التواجد المشترك وتحديد الميكروبات ذات الصلة البيئية تحت ظروف مختلفة ^5,44. على النقيض من ذلك، تتيح أجهزة SynComs الأصغر (<50 سلالة) مع الميتاترانسكريبتوميك^45,46، و19,47,48 الميتابروتيومية، والميتابولومكس ^49,50,51 توصيفا تفصيليا للاستجابة الوظيفية في كل من النباتات والميكروبات⁴⁴. معا، تضع هذه القدرات GNOVA أداة قيمة لتحديد الصفات الميكروبية الرئيسية التي يمكن أن تسرع تطوير اللقاحات الحيوية الجديدة التي تعزز استدامة الأنظمة الزراعية.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
Powerconnect cordless drill & 100-Piece Kit	Black+Decker	BDC120VA100	1/4" and 1/8" drill bits needed.
Vinyl tape, yellow, 1" wide x 36 yards	3M	471	Consumable material
Sterling Rubber bands size #32  (2 rubber bands per system)	Amazon	B001I1QO00	Consumable material.
Wheat seed			Cultivar used in this experiment: Catawba
Fiberglass pipe wrap insulation, 3 " widex 1/2 " thick  (2 pre-cut circles per system)	Lowe's	28930	Cut into 2 7/8 " (7.3 cm) diam circles. Consumable material. For high throughput production of circles roll out the wrap insulation and use the open edge of the pot to cut the circle by placing the pot on top of the insulation wrap and applying pressure and twisting.
DW4 Filter media, Pre-cut to 15" x 75 yards  (1 cut circle per system)	Class Biological Clean, Ltd	NA	Cut into 6.3 " (16.02 cm) diam circles. CBC has other pre-cut or standard roll sizes that can be purchased instead if desired.  Consumable material. cut a template of the circle in cardboard and use it to draw circles throughout the area of the DW4 media and cut with scissors.
Silicon tubing, Versilon SPX-50 High-strength, 1/8" ID x 1/4" OD x 1/16" wall thickness	Saint-Gobain	ABX00007	Cut into two long pieces ( 16" // 40.64 cm) and three short pieces (2.5" // 6.35 cm)
Sodium hypoclorite 5% available chlorine in aqueous solution	VWR	JT9416-1	Dilute to 2% v/v and use for maize sterilization protocol
Murashige & Skoog medium, micro and macro elements. 25 L	Research Products International	M10200-25.0	Diluted to 0.5x strength
Ethanol, 100%, Deacon Labs	Fisher scientific	04-355-451	Diluted to 95% v/v
Syringe 3 mL, luer lock unsterile  (2 per system)	Fisher scientific	14-817-117	Discard plunger and only keep the barrel, fill with glass wool and cap with foil.
Glass beakers, 250 mL	VWR	470191-150	Five are needed for wheat seed sterilization
Maize seed			Genotype used in this experiment: Mexico 21–22 B73XMo17
Aluminum baking tray 18" x 26"	Amazon	B01FIK54LQ	Make sure it fits the dimensions of your flow hood
Sodium Chloride	Fisher scientific	BP358-1	Prepare 0.145 M solution.
3D printed base, polylactic acid (PLA) filament used (1 per system)	Protolabs	NA	Printing and editable files can be found in supplemental materials. Files available at Dryad.org DOI https://doi.org/10.5061/dryad.f7m0cfzbc. DO NOT AUTOCLAVE if PLA was used as filament to produce the base. PLA will melt above 150 °C and can get deformed above 60 °C. It is recommended that the integrity of the PLA 3D printed base is tested if it is to be used at temperatures above 40 °C. For higher heat resistance materials such as PETG (Polyethylene Terephthalate Glycol) or PC (polycarbonate) can be used instead; this will increase the cost of the part and might still not be autoclaveable. 3D printing of the base prototypes were accomplished in a personal printer with build volumes of of 256 × 256 × 256 mm (length × width × height). For speed and cost efficiency we recommend printing in bulk at local commercial 3D-printing service providers.
Male luer to hose barb fitting 1/8 " ID, animal derivative-free polypropelene  (2 per system)	Cole-Parmer	EW-50114-69	Refered as fitting 1 in the protocol
Male slip luer to hose barb fitting 1/8 " ID, animal derivative-free polyproylene  (1 per system)	Cole-Parmer	EW-50114-63	Refered as fitting 2 in the protocol
201 Stainless steel worm gear hose clamps, 1 1/2" -3 1/2" clamping diameter (1 per system)	Grainger	5CZF2	Refered as hose clamps in protocol
Airstream Gen 3 Laminar flow cabinet with simple switch, dimensions 24 1/4" x 47 " x 28 1/4 "	ESCO Lifesciences	2120707	Refered as laminar flow hood in protocol. Any laminar flow hood with similar dimensions works. Modifications might be needed in smaller flow hoods.
Play sand, Quikrete Premium. 50 lb	The Home Depot	1001709466	Refered as sand in protocol
304 Stainless steel woven wire, 120 mesh (1 per system)	Amazon	B09KRS5F7T	Refered as stainless steel wire mesh in article. Cut into 4.7" (11.9 cm) diameter circles. For high troughput or circle production, cut a template of the circle in cardboard and use it to draw circles throughout the area woven mesh of the woven mesh and cut with scissors.
Clay (Montmorillonite), OIL-DRI Loose Sorbent, 50 lb Wt, not scented	Grainger	44Z111	Refered in protocol as clay. Consumable material.
Clear hurricane candle shade chimney tube without a bottom 4" OD x 30" length (1 per system)	WCG International	HST0430	Refered in protocol as glass cylinder
Clear plastic cap, 3" (7.6 cm) diam  (1 per system)	ClearTec Packaging	PCC3.000	Refered in protocol as plastic cap
Clear Polycarbonate tubing, 3" OD x 2 7/8" ID x 1/16' wall thickness x 12" length  (1 per system)	ePlastics	PCTUB3.000X2.875	Refered in protocol as pot. Can request company to cut to other desired lengths.
Cleanroom sterlization wrap, 6" x 6" (1 per system)	Fisher scientific	17-101-102	Refered in protocol as sterilization wrap. Consumable material.
Dissecting forceps, Medium serrated tip 4 1/2" length	VWR	82027-398	Refered in protocol as tweezers.
Tea strainers	Amazon	B0FRMRZWZY	Three are needed for wheat seed sterilization
Clorox bleach with 5.7% available chlorine	The Home Depot