مقالة منهجية

دمج حقن الكولاجيناز مع الحمل الميكانيكي الزائد الناتج عن التمرين: نموذج فأر يحاكي التهاب المفاصل العظمي للركبة بسبب إصابة الإجهاد والتحميل الزائد

DOI:

10.3791/70609

⸱

مايو 22, 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Yueyang Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 2College of Acupuncture and Massage, Anhui University of Traditional Chinese Medicine, 3School of Exercise and Health, Shanghai University of Sport, 4School of Rehabilitation Science, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 5Department of Rehabilitation Medicine, Shanghai Pudong Hospital

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول إنشاء نموذج فأر لالتهاب المفاصل العظمي في الركبة الناتج عن الضغط الزائد من خلال الجمع بين حقن الكولاجناز داخل المفصل مع الإجهاد المفرط الناتج عن التمارين، مما يوفر منصة طفيفة التوغل للتحقيق في المرض التنكسي.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التهاب المفاصل العظمي في الركبة (KOA) هو مرض تنكسي متعدد العوامل في المفاصل يناسب التفاعل المعقد بين تدهور الأنسجة البيولوجية والحمل الميكانيكي الزائد المستمر. غالبا ما تؤدي النماذج الجراحية التقليدية للحيوانات إلى تدمير المفاصل بعد الصدمة بسبب المحفز، مما يفشل في تكرار المرض التدريجي والتراكمي لمرض KOA التنكس البشري بدقة. لسد هذه الفجوة الانتقالية، تؤسس الدراسة الحالية نموذجا جديدا وقابلا للتكرار يحاكي KOA الناتج عن الإجهاد الناتج عن التحميل الزائد من خلال التآزر بين تدهور الغضروف الإنزيمي الخفيف والتحميل الميكانيكي المستمر. على وجه التحديد، تم دمج حقن الكولاجيناز من النوع الثاني داخل المفصل الموحدة مع الإجهاد الميكانيكي اليومي عبر جهاز تعب من نوع المدورة معاير بدقة على مدى أربعة أسابيع. تم التحقق من فعالية هذا التدخل المزدوج العامل باستخدام تحليلات سلوكية ونسيجية وجزيئية شاملة. كشف تحليل المشي الآلي عن عيوب حركية شديدة في المجموعة المجمعة. تميزت هذه النقاط بتقليل كبير في طول الخطوة، وعرض الخطوة، ومنطقة كف الوقفة القصوى. أكدت التقييمات النسيجية باستخدام صبغة السافرانين O-fast green هذه العيوب الوظيفية، وأظهرت تلفا تدريجيا في هيكل الغضاريف، وعيوب سطحية، ودرجات مرتفعة بشكل كبير في جمعية أبحاث التهاب المفاصل العظمي الدولية (OARSI) التي تعكس بأمانة السمات المرضية لمرض KOA البشري في المرحلة المبكرة والمتوسطة. علاوة على ذلك، أظهرت التقييمات الكيميائية المناعية تحسنا ملحوظا في تنظيم قناة المستقبل العابر المحتملة فانيلويد 4 (TRPV4) وتزامن انخفاض في بروتين المصفوفة الحاسم كولاجين النوع الثاني ألفا 1 (COL2A1) في الخلايا الغضروفية المفصلية. من خلال دمج عدم استقرار المفاصل الموضعي مع الإجهاد الميكانيكي المسيطر عليه، تتجنب هذه الاستراتيجية الحد الأدنى من التوغل الصدمات الحادة المرتبطة بالنماذج الجراحية. يؤسس هذا البروتوكول منصة تجريبية ذات صلة سريرية لتتبع الآليات الجزيئية الديناميكية، وتقييم الأنماط الظاهرية للألم المزمن، واختبار التدخلات العلاجية طويلة الأمد لالتهاب المفاصل العظمي في المراحل المبكرة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التهاب المفاصل العظمي (OA) هو حالة تنكسية متعددة العوامل تتميز بالألم، والتورم، والتصلب، وضعف الوظيفة، وتنشأ من عوامل مثل السمنة، والإجهاد الميكانيكي، والصدمات1. التهاب المفاصل العظمي في الركبة (KOA) منتشر بشكل كبير وشائع بشكل متزايد مع التقدم في العمر، إلا أن التجارب السريرية غالبا ما تكون محدودة النطاق بسبب تنوع المظاهر السريرية. لذلك، يتطلب تطوير علاجات فعالة نماذج حيوانية مناسبة2. نظرا للتباين الجوهري في OA، لا يوجد نموذج "معيار ذهبي" مقبول عالميا، مما يتطلب من الباحثين تحديد نماذج محددة تتماشى مع بحثهم العلمي.

يوصف KOA حاليا في الطب الحديث بأنه حالة تتضمن تفاعلا بين العوامل الميكانيكية والبيولوجية على الغضروف المفصلي والأنسجة حول الغضروف المحيط. نتيجة هذا التداخل المعقد هي بشكل أساسي التدهور التدريجي للغضروف المفصلي والمصفوفة المحيطة به3. يعمل الإجهاد الميكانيكي كإشارة تحويل حاسمة تحكم العمليات الفسيولوجية والمرضية المختلفة داخل خلايا وأنسجة المفاصل4. الحفاظ على الغضروف المفصلي في حالة صحية يتطلب حملا ميكانيكيا مناسبا ضمن النطاق الفسيولوجي. وعلى العكس، غالبا ما يؤدي التحميل الزائد إلى تدهور الغضروف وظهور KOA5 لاحقا. تعيق النماذج العفوية استثمارات زمنية واقتصادية كبيرة6، بينما تستخدم النماذج الجراحية نهجا مدمرا يمثل بشكل أساسي مرحلة KOA المتوسطة والمتأخرة، مع انحراف عن التقدم التنكسي الطبيعي 7,8. وعلى العكس، تستهدف النماذج الكيميائية مصفوفة الكولاجين لكنها تفشل في التقاط التغيرات الشاملة في الدهلية التنكسية البشرية عند استخدامها بدون إجهاد ميكانيكي9. الجمع بين التحلل الإنزيمي والجهد الميكانيكي الزائد يعالج هذه الفجوات من خلال إعادة تلخيص المرض التدريجي لإصابة الإجهاد الناتج عن التحميل الزائد بشكل أكثر دقة. هدف هذه الدراسة هو تأسيس والتحقق من نموذج فأر جديد ل KOA من خلال دمج حقن الكولاجيناز من النوع الثاني داخل المفصل مع الإجهاد الزائد باستخدام جهاز إرهاق العجلة الدوارة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أجريت جميع التجارب على الحيوانات وفقا للبروتوكولات التي وافقت عليها لجنة العناية والاستخدام للحيوانات في جامعة شنغهاي للطب الصيني التقليدي. أجريت التجارب بموجب ترخيص مشروع (رقم: PZSHUTCM201016022) من مركز الحيوانات التجريبية في جامعة شنغهاي لأخلاقيات الطب الصيني التقليدي، تماشيا مع لجنة المجلس الوطني للبحوث (الولايات المتحدة) لتحديث دليل العناية واستخدام الحيوانات المختبرية.

1. بروتوكول إنتاج نماذج الحيوانات

  1. قم بتوزيع 32 فأرا عمرها 10 أسابيع من نوع C57BL/6 عشوائيا إلى أربع مجموعات: ضابطة، كولاجناز، تمارين مفرطة، وكولاجناز + تمارين مفرطة.
    1. اعتاد جميع الفئران لمدة أسبوع واحد على الظروف القياسية للتغذية والسكن قبل بدء إجراءات النمذجة.
  2. تحفز نماذج الحيوانات على مدى فترة 4 أسابيع وفقا للمجموعات التجريبية المخصصة.
    1. أعط الكولاجيناز من النوع الثاني عن طريق الحقن داخل المفصل للفئران في مجموعة الكولاجيناز.
    2. خضع الفئران في مجموعة التمارين المفرطة لتدريب التمارين باستخدام جهاز عجلة دوارة.
    3. طبق كل من حقن الكولاجناز داخل المفصل وتدريب العجلة الدوارة على الفئران في مجموعة التمارين المفرطة + الكولاجناز المفرط.
    4. حافظ على نفس تكرار ومدة التدريب في جميع مجموعات التمارين ذات الصلة.

2. بروتوكول حقن الكولاجيناز من النوع الثاني داخل المفصل

  1. التخدير
    1. تحفيز التخدير باستخدام الإيزوفلوران الذي يتم توصيله عبر جهاز تخدير غازي معاير. إجراء التحفيز السريع بتركيز 2٪–3٪ من الإيزوفلوران.
    2. حافظ على التخدير عند 1.5٪–2٪ من الإيزوفلوران. تأكد من التشغيل السليم لنظام التنظيف المخدر لمنع التعرض المهني.
    3. راقب معدل التنفس وردود فعل الفأر بشكل مستمر طوال فترة الإجراء.
  2. تحضير الجلد
    1. ضع كريم إزالة الشعر على المنطقة المحيطة بمفصل الركبة اليسرى. أزل الشعر تماما باستخدام مكشطة.
    2. نظف الجلد المكشوف جيدا. حافظ على ظروف معقمة طوال فترة التحضير.
  3. تحضير الكولاجناز من النوع الثاني
    1. قم بموازنة مسحوق الكولاجناز من النوع الثاني إلى درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة في خزانة أمان حيوية معقمة. استخدم محلول ملحي معقم بفوسفات (PBS، pH 7.2–7.4) كمذيب حصري ومخزن مؤقت لعملية الذوبان.
    2. قم بوزن الكتلة المطلوبة من مسحوق الكولاجيناز بدقة باستخدام ميزان تحليلي. أضف ببطء مادة PBS المعقمة إلى المسحوق للوصول إلى تركيز عمل نهائي يبلغ 0.04 U/μL.
    3. اخلط المحلول بلطف عن طريق وضع الخليط للأعلى والأسفل حتى يصبح صافيا وخاليا من الجزيئات المرئية. تجنب الدوامات العنيفة خلال هذه الخطوة لمنع فقدان النشاط الإنزيمي.
    4. قم بعمل الطرد المركزي بمحلول 0.04 وحدة وحدة لكل ميكرولتر عند سرعة 1,000 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. هذا يزيل الجسيمات الدقيقة غير المذابة ويمنع انسداد الإبر أثناء الحقن التالي.
    5. استنشق المادة الفائقة في أنابيب معقمة وتخزينها في حمام ثلج بدرجة حرارة 4 درجات مئوية للاستخدام الفوري. حضر المحلول حديثا لكل جلسة لضمان أقصى نشاط إنزيمي.
  4. الحقن داخل المفصل
    1. أمسك الجلد الظهري للفأر باستخدام الإبهام والسبابة في اليد غير المسيطرة على اليد. ثبت كلا الطرفين السفليين بالأصابع الخوامضية والصغيرة لتمديد مفاصل الركبة بشكل طبيعي وكشف منطقة الحقن بالكامل.
    2. احمل حقنة دقيقة بسعة 10 ميكرولتر مزودة بإبرة 30 جيجاب. أدخل الإبرة موازية لسطح الجلد في طبقة الجلد السطحية لمسافة تقارب 0.2 سم عند نقطة الدخول.
    3. قم بضبط اتجاه الإبرة ببطء إلى اتجاه عمودي بالنسبة للجلد عندما تقل مقاومة الأنسجة.
    4. استمر في تحريك الإبرة لمسافة تقارب 0.3–0.5 سم حتى يشير فقدان المقاومة إلى الدخول إلى تجويف المفصل. اسحب مكبس الحقنة ببطء لتأكيد عدم وجود ارتجاع الدم.
    5. حقن 5 ميكرولتر من محلول الكولاجيناز من النوع الثاني (تركيز: 0.04 U/μL) في تجويف المفصل بسرعةثابتة 10.
    6. حافظ على وضعية الإبرة مباشرة بعد الحقن. اضغط بلطف على الجلد المحيط بموقع الحقن لمدة 10–15 ثانية.
    7. اسحب الإبرة ببطء. اضغط على نقطة الدخول بخفة باستخدام شاش معقم لمدة 30 ثانية لمنع تسرب الدواء.
    8. ضع الفأر في قفص منزلي دافئ وجاف. اترك الحيوان يتعافى بشكل طبيعي من التخدير، والذي يستغرق عادة من 5 إلى 10 دقائق.
    9. استأنف شروط الإقامة والتغذية القياسية بعد أن يتعافى الفأر تماما.
    10. قم بإجراء هذه الحقن داخل المفصل مرتين في الأسبوع مع فترة 3–4 أيام بين الحقنتين، وذلك حصريا خلال فترة النمذجة التي تستمر 4 أسابيع (بعد التكيف الأولي لمدة أسبوع واحد).
    11. تخلص من جميع القطع الحادة فورا في حاويات بيولوجية معتمدة.
      ملاحظة: تأكد من قيام الأفراد المدربين بجميع الحقن لتقليل إصابات المفاصل والتغيرات التجريبية.

3. بروتوكول الجهد الزائد الناتج عن العجلة الدوارة

  1. تجهيز الأجهزة وفحص السلامة
    1. ضبط سرعة جهاز الإجهاد من نوع المدوران إلى 12 دورة في الدقيقة (ما يعادل تقريبا 0.063 م/ث) ومدة الدوران إلى ساعتين لكل جلسة.
    2. شغل وحدة التحفيز الكهربائي. تأكد من أن التيار الناتج ضمن النطاق الآمن المسبق بين 0.1–0.3 مللي أمبير. لا تزيد شدة التيار يدويا.
      تحذير: استخدم وحدة التحفيز الكهربائية فقط لتوجيه الفئران للعودة إلى العجلة، وليس كمنبه عقابي. افحص أسلاك الجهاز بحثا عن تلف وتأكد من تلامس الأقطاب الكهربائية بشكل جيد قبل التشغيل لمنع حدوث دوائر قصيرة وإصابات الصدمات الكهربائية.
  2. تدريب التكيف مع المناخ
    1. تأكد من أن غرف العجلات الدوارة في جهاز الإجهاد نظيفة وجافة وخالية من الحطام. قم بتعطيل أقطاب التحفيز الكهربائية عند مدخل العجلة للقضاء على أي إجهاد محتمل مرتبط بالتحفيز.
    2. تعامل مع كل فأر بلطف من قاعدة الذيل أو قم بإمساكه باستخدام نسيج طري معقم. ضع الفأر بشكل فردي في المنطقة المركزية من سطح تشغيل العجلة الدوارة.
    3. ضع الفأر في وضعية وقوف رباعية الأرجل طبيعية على سطح الجري الأفقي. وجه الجسم بشكل مواز لمحور الدوران المركزي للعجلة مع كفوف الأمامية للأمام والكفوف الخلفية للخلف قليلا.
    4. استخدم حاجز طري مؤقت غير مقيد لمنع الفأر من دخول منطقة القطب الضيقة خلال أول دقيقتين. أزل الحاجز بعد هذه الفترة للسماح للفأر باستكشاف الحجرة بالكامل بحرية.
    5. اترك الفئران في الجهاز الثابت لمدة 10 دقائق يوميا خلال أول 3 أيام. لا تبدأ دوران العجلة أو تبدأ أي تحفيز كهربائي خلال هذه الفترة.
    6. راقب الفأر بحثا عن علامات التوتر الشديد مثل التجمد المستمر أو الرفع المفرط. أعد وضع الفأر برفق إلى منطقة العجلة المركزية إذا أظهر سلوكا غير طبيعي لاستعادة وضعية طبيعية.
    7. شغل العجلة بسرعة 5 دورات في الدقيقة لمدة 30 دقيقة في اليوم الرابع. تقوم هذه الخطوة بتعود الفئران على إيقاع حركة الجهاز دون الحاجة لاستخدام الإشارات الكهربائية.
    8. وجه الفئران يدويا إلى مركز العجلة إذا سقطت أو توقفت أثناء مرحلة التكيف الإيقاعي. تأكد من بقاء التحفيز الكهربائي غير نشط طوال فترة التأقلم التي تستمر 4 أيام.
      تحذير: تجنب استخدام التحفيز الكهربائي خلال مرحلة التكيف لمنع استجابات التوتر الناتجة عن الخوف وضمان الالتزام بالتدريب المستقبلي.
  3. التنفيذ الرسمي للتمرين
    1. إجراء التدريب الرسمي في وقت محدد يوميا (مثلا من 9:00 صباحا حتى 11:00 صباحا). ارتد قفازات معزولة لوضع الفئران في جهاز التعب المدوار.
    2. أغلق باب الجهاز. ابدأ المعاملات المحددة مسبقا ب 12 دورة في الدقيقة (~0.063 م/ث) لمدة قصوى تبلغ 2 ساعة لكل جلسة (انظر الشكل 1).
      تحذير: راقب الفئران باستمرار أثناء التدريب. أوقف التدريب لمدة 5 دقائق إذا سقط الفأر بشكل مستمر (أكثر من 3 مرات خلال دقيقة واحدة) لمنع الإرهاق الشديد والإصابة الناتجة عن التوتر.
  4. تحديد وتحفيز نقطة نهاية التعب
    1. راقب الفئران باستمرار لتقييم حالة التعب لديهم. أنهي جلسة التدريب مبكرا، دون إجبار الساعتين كاملة، إذا استوفى الفأر على الأقل اثنين من معايير التعب الأربعة المحددة لتجنب الإجهاد الزائد.
    2. عرف المعيار 1 بأنه عدم القدرة على البقاء على عجلة القيادة لأكثر من 5 ثوان قبل السقوط. عرف المعيار 2 بأنه زيادة كبيرة في تكرار السقوط بمقدار 3 مرات أو أكثر خلال فترة دقيقة واحدة.
    3. عرف المعيار 3 بأنه غياب النية الإرادية للعودة إلى العجلة، حيث يبقى الفأر ثابتا أو يتحرك لفترة وجيزة فقط رغم التحفيز الكهربائي.
    4. عرف المعيار 4 كعرض لوضعيات الحركة غير الطبيعية. ابحث عن علامات واضحة مثل سحب الأطراف أو المشي المتمايل.
    5. اسمح للجهاز بتحفيز كهربائي خفيف تلقائيا عندما يسقط الفأر عند مدخل الدوارة. تأكد من توقف التحفيز الكهربائي فور عودة الفأرة إلى العجلة11.
      تحذير: أوقف التدريب فورا إذا أظهر الفأر حالات غير طبيعية مثل التشنجات أو ضيق التنفس. أزل الفأر من الجهاز وقدم علاجا للأعراض إذا لزم الأمر.
  5. معالجة ما بعد التدريب وتكرار المعالجة
    1. أوقف تشغيل الجهاز بعد انتهاء التدريب. ارتد قفازات معزولة لإخراج الفئران وإعادتها إلى أقفاصها المنزلية.
    2. وفر للفئران ماء شرب كاف. راقب الحيوانات بحثا عن أي نشاط غير طبيعي أو حالة عقلية أو مشاكل في الأطراف (مثل العرج أو ارتعاش العضلات).
    3. سجل أي شذوذات وقدم العلاج في الوقت المناسب.
    4. حافظ على تكرار التدريب مرة واحدة يوميا، ساعتين في كل جلسة، لمدة 4 أسابيع متتالية. حافظ على معايير التدريب ومراقبة السلامة متسقة طوال الفترة.
      ملاحظة: تحقق من أن جهاز التعب ووحدة التحفيز الكهربائية يعملان بشكل صحيح قبل كل جلسة تدريب يومية لضمان شدة تحفيز ثابتة.

4. تحليل المشي

  1. نظرة عامة على النظام
    1. قم بإجراء اكتساب وتحليل المشية باستخدام نظام تصوير تلقائي للمشي.
    2. قم بإجراء جميع إجراءات المشي على 32 فأرا عمرها 10 أسابيع من نوع C57BL/6 بعد فترة النمذجة التي تستمر 4 أسابيع.
    3. ضع الكاميرا عالية السرعة تحت حزام جهاز المشي الشفاف لالتقاط صور بطنية أثناء الحركة.
  2. التكيف والإعداد
    1. تعويد جميع الفئران على جهاز المشي قبل جمع البيانات الرسمية لتقليل الإجهاد.
    2. اضبط سرعة جهاز المشي على 20 سم/ثانية لتتناسب مع سرعة المشي الفسيولوجية للفئران.
    3. سجل ثلاث تجارب مستقلة صالحة لكل فأر مع فترة راحة قدرها دقيقتان بين التجارب.
  3. تسجيل التجربة واختيار الخطوات
    1. اسمح للفأر بالمشي باستمرار لمدة 60 ثانية خلال كل تجربة.
    2. قم بإجراء تجربة بديلة إذا كان التسجيل غير صالح بسبب "التجمد" أو القفز أو الدوران.
    3. ابدأ جمع البيانات فقط بعد أن يحقق الفأر حركة مستقرة ومتسقة لمدة لا تقل عن 10 ثوان.
    4. اختر ما لا يقل عن 4 خطوات كاملة متتالية من كل تجربة مدتها 60 ثانية للتحليل.
    5. تأكد من قيام مراقبين مستقلين أعمى باختيار الخطوات لإزالة التحيز الذاتي.
    6. تأكد من أن الفأر يحافظ على وضعية طبيعية رباعية الأرجل دون تخطي أو تقلبات مفاجئة في السرعة.
    7. تحقق من أن الخطوة تتضمن كل من طور الوقوف الحامل للوزن وطور التأرجح بالدفع الأمامي.
    8. تحقق من وجود صور واضحة لتلامس حزام الكف دون فقدان أو ضبابية أو تلوث.
  4. معالجة الصور واستخراج المعلمات
    1. استخدم خوارزميات النظام المدمجة لرقمنة الصور الملتقطة واكتشاف نقاط الاتصال بحزام الأقدام.
    2. احسب نسبة التأرجح إلى الوقفة كنسبة مدة طور التأرجح إلى مدة طور الوقفة.
    3. قس طول الخطوة (سم) كمسافة خطية تم قطعها خلال خطوة كاملة واحدة.
    4. قس عرض الخطوة (سم) كمسافة أفقية بين الحواف الوسطى للأقدام الخلفية المقابلة عند وضع الذروة.
    5. حدد منطقة الكف عند الوضع الأقصى (سم2) التي تمثل إجمالي مساحة التلامس عند أقصى وزن تحمل.
    6. احسب تباين مساحة الأقدام (سم2) كمعامل تباين مساحة التلامس عبر خطوات متتالية.
    7. احسب القيمة المتوسطة للتجارب الثلاث الصالحة لكل فأرة على حدة وصدر مجموعات البيانات النهائية.
      ملاحظة: استبعد التجارب التي تحتوي على سلوكيات توقف أو قفز أو دوران غير منتظمة من التحليل.

5. علم الأنسجة

  1. جمع الأنسجة وتثبيتها
    1. قم بقتل جميع الفئران بشكل إنساني عن طريق خلع عنق الرحم بعد فترة التحفيز التي تستمر 4 أسابيع. قم بتشريح مفصل الركبة اليسرى بعناية وإزالة الأنسجة الرخوة المحيطة الزائدة.
    2. اغمر العينة فورا في مثبت بارافورمالديهيد (PFA) مبرد مسبقا بنسبة 4٪ (بدون ثن). تأكد من أن حجم التثبيت يكون 10–15 ضعف حجم العينة لغمر النسيج بالكامل.
    3. ثبت النسيج في درجة حرارة الغرفة لمدة 48 ساعة. حرك حاوية التثبيت بلطف كل 8 ساعات لضمان اختراق كاف للثبيت.
  2. إزالة الكالسية من الأنسجة
    1. اشطف العينة المثبتة بماء جاري ببطء لمدة 10 دقائق. كرر عملية الشطف ثلاث مرات لإزالة بقايا PFA.
    2. انقل العينة إلى محلول إزالة الكالسية بقوة 0.5 مول/لتر حمض الإيثيلين ديامين رباعيا أسيتيك (EDTA) (الرقم الهيدروجيني 7.2–7.4). حافظ على حجم محلول إزالة الكالسية عند 20 ضعف حجم العينة وتخزينه عند 4 درجات مئوية.
    3. قم بإزالة الكالسيف من الأنسجة لمدة 14–21 يوما. استبدل السائل القديم بمحلول إزالة الكالسية EDTA الجديد كل 3 أيام.
    4. اختبر نقطة إزالة الكالسية بثقب برفق العظم تحت الغضروف بإبرة معقمة. اختتم عملية إزالة الكلب عندما تخترق الإبرة بسلاسة دون مقاومة.
    5. اغسل العينة التي تم إزالة الكالسية بالكامل تحت الماء الجاري لمدة ساعتين لإزالة بقايا EDTA. اغسل العينة لاحقا بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) ثلاث مرات لمدة 5 دقائق لكل مرة.
  3. التضمين والتقسيم
    1. جفف العينة الخالية من الكالسية بشكل متسلسل باستخدام سلسلة إيثانول متدرجة (70٪، 80٪، و90٪ لكل ساعة لكل منهما؛ 95٪ لساعة واحدة؛ الإيثانول المطلق مرتين لمدة ساعة لكل واحدة).
    2. نظف الأنسجة المجففة في الزيلين مرتين لمدة 10 دقائق لكل منهما. غرس الأنسجة التي تم إزالتها في البارافين.
    3. قطع النسيج المدمج بالبارافين إلى مقاطع سهمية مستمرة بسماكة 5 ميكرومتر باستخدام ميكروتوم. قم بتركيب الأقسام على شرائح زجاجية مغلفة بالبولي-إل-ليسين وخبزها في لوحة تسخين لتجفيف الشريحة عند درجة حرارة 60 درجة مئوية لمدة ساعتين.
  4. التقييم النسيجي
    1. صبغ الأقسام باللون الأخضر السريع O-سافرانين لتقييم نسيج الغضروف المفصلي.
    2. تقييم تدهور الغضروف باستخدام نظام تقييم جمعية أبحاث التهاب المفاصل العظمي الدولية (OARSI) تحت الحالات مزدوجة التعمية12.
  5. سير العمل الأساسي في الكيمياء المناعية (IHC)
    1. قم بإزالة القطع من الزينة مرتين لمدة 10 دقائق لكل منها. أعد ترطيب الأقسام بالتتابع عبر سلسلة إيثانول متدرجة إلى ماء منزوع الأيون.
    2. اغمر الأقسام في مخزن سترات بسعة 0.01 مول/لتر (pH 6.0) لاسترجاع الحواتم الحرارية الناتج عن الميكروويف. سخن المحلول حتى يغلي على طاقة عالية، ثم حافظ على هادئة على طاقة متوسطة لمدة 15 دقيقة.
    3. قم بتبريد الأقسام بشكل طبيعي إلى درجة حرارة الغرفة. اغسل الشرائح ب PBS ثلاث مرات لمدة 5 دقائق لكل منها
    4. حضن الأقسام في محلول ميثانول يحتوي على بيروكسيد الهيدروجين 3٪ (H2O2) لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لمنع نشاط البيروكسيداز الداخلي. اغسل الشرائح ب PBS ثلاث مرات لمدة 5 دقائق لكل مرة.
    5. ضع محلول مانع لمصل الماعز بنسبة 5٪ على الأقسام. حضن لمدة 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لسد مواقع الارتباط غير المحددة.
    6. تخلص من محلول الانسداد دون غسيل. استخدم محلول الجسم المضاد الأساسي المحدد (فانيلويد المستقبل العابر المحتملة 4 (TRPV4) عند 1:100، كاسباز-3 عند 1:200، أو كولاجين النوع الثاني ألفا 1 (COL2A1) عند تخفيف 1:150).
    7. حضن الأقسام التي تحتوي على الجسم المضاد الأساسي في غرفة رطبة عند 4 درجات مئوية طوال الليل لمدة 12–16 ساعة.
    8. قم بضبط الأقسام على درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة في اليوم التالي، ثم اغسله ب PBS ثلاث مرات لمدة 5 دقائق لكل منها. استخدم جسم مضاد ثانوي مضاد لبيروكسيداز الفجل الحار (HRP) مضاد للأرانب أو مضاد للفأر من نوع IgG المضاد الثانوي (تخفيف 1:500).
    9. حضن الأقسام التي تحتوي على الجسم المضاد الثانوي لمدة 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. اغسل الشرائح ب PBS ثلاث مرات لمدة 5 دقائق لكل مرة.
    10. ضع محلول كروموجين ديامينوبينزيدين (DAB) بقطر 3,3 قدم واحتضنه في الظلام لمدة 3–5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. أوقف التفاعل فورا باستخدام الماء منزوع الأيونات عندما تظهر إشارة بنية واضحة تحت المراقبة المجهرية.
    11. ضع صبغة مضادة على الأقسام بمحلول هيماتوكسيلين لمدة 5 دقائق. اشطف تحت الماء الجاري لمدة 10 دقائق لتسمح للبقعة بأن تتحول إلى اللون الأزرق.
    12. فرق بين الأقسام باستخدام محلول كحول حمضي بنسبة 1٪ لمدة 30 ثانية. اشطف الزلاجات تحت الماء الجاري لمدة 5 دقائق.
    13. جفف الأقسام بسرعة عبر سلسلة إيثانول متدرجة ونظف الأنسجة في الزيلين مرتين لمدة 10 دقائق لكل منها.
    14. قم بتركيب الشرائح باستخدام البلسم المحايد وغطها بأغطية راتنج بصرية. اترك الشرائح المثبتة تجف في درجة حرارة الغرفة.
  6. التحكم في IHC وتحليل الصور
    1. حدد تحكما سلبيا عن طريق استبدال الجسم المضاد الأساسي ب PBS أثناء عملية التلوين. تضمين قسم أنسجة غضرويف معروف وإيجابي كضابط إيجابي للتحقق من فعالية الأجسام المضادة.
    2. التقط صور القسم المصبوغ باستخدام ماسح شرائح كامل بتكبير 40× و100× تكبير.
      ملاحظة: قم بإجراء جميع التقييمات الأنسجة بشكل مستقل بواسطة مراقبين اثنين على الأقل من المراقبين المعينين لتقليل التحيز الذاتي.

6. التحليل الإحصائي

  1. التعامل مع البيانات والاختبار العام
    1. إجراء جميع جمع البيانات والتحليل تحت ظروف عمياء لتقليل التحيز التجريبي.
    2. تحليل المتغيرات المستمرة بين المجموعات التجريبية الأربع باستخدام تحليل التباين أحادي الاتجاه (ANOVA) لاختبار الفروق الكلية.
    3. تطبيق اختبار كروسكال-واليس H على أي متغيرات لا تستوفي الافتراضات البرامترية اللازمة.
  2. الاختبارات بعد الحدث وعتبات الأهمية
    1. قم بإجراء مقارنات زوجية لاحقة باستخدام اختبار توكي لتحديد فروق مجموعات محددة إذا كان التبرز الأولي يشير إلى دلالة إحصائية.
    2. اعتمد فقط على اختبار Tukey للتحكم في معدل الخطأ حسب العائلة. لا تدمج هذا مع أي طرق تصحيح مقارنات متعددة إضافية.
    3. عرف الدلالة الإحصائية بشكل موحد ك p < 0.05

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تحليل المشية
معلمات دورة المشي: تم تقييم نسبة التأرجح إلى الوقفة—المعرفة بأنها نسبة مدة طور التأرجح غير الحامل للوزن إلى طور الوقوف الحامل للوزن في خطوة واحدة—لتعكس توازن تحمل الوزن والدفع. مقارنة بمجموعة الضابطين (2.10 ± 0.06)، أظهرت الفئران التي تلقت حقنة كولاجناز داخل المفصل (1.45 ± 0.05) أو خضعت لتمارين مفرطة (1.68 ± 0.05) نسب تأرجح إلى وقفة أقل بشكل ملحوظ. ومن الجدير بالذكر أن هذا الانخفاض كان أكثر وضوحا في مجموعة الكولاجنازي + التمارين المفرطة (0.93 ± 0.05) مقار...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذه الدراسة، طورنا نموذجا جديدا للفأر ل KOA يحاكي تأثيرات الإجهاد الزائد على المفصل من خلال دمج حقن الكولاجناز داخل المفصل مع تدريب التمارين اليدوي المسبب للإرهاق على العجلات. تؤكد هذه النتائج مرة أخرى فكرة أن KOA ينشأ من تفاعل العوامل البيولوجية والميكانيكية. فهم وتحديد هذه العوامل يحمل وعدا لوضع خطط علاجية فردية واستراتيجيات وقائية لتخفيف الأعراض وتحسين جودة حياة الأفراد المصابين بالتهاب المفاصل العظمي في الركبة. علاوة على ذلك، يمكن أن يؤدي الكولاجناز أيضا إل...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المؤلفون لا يفرضون أي تضارب مصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يرغب المؤلفون في شكر المشاركين على وقتهم وجهدهم، وجميع الحيوانات المشاركة في الدراسة. وقد دعم هذا العمل طلب تمويل الحوافز لصندوق الحوافز لبناء تخصص التخصص الرئيسي في مستشفى هانغهاي يويانغ - قسم توينا [QY71.42.06] والإدارة الوطنية للطب الصيني التقليدي التخصص الرئيسي عالي المستوى - العلوم في توينا [zyyzdxk -2023061].

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
4٪ بارافورمالديهايد ثاقببيوتايمP0099
حمض الخليكسينوفارم631-61-8
نظام تصوير DigiGit للفئرانعلم الحياة للدفع الخلفيMSI-DIG-MS
حل EDTAبروسيلPB180320
شريط كاسيت التضمينلايكاIP C
الإيثانولسينوفارم64-17-5
صبغة خضراء سريعةليان1085995
كريم إزالة الشعرفيتG20161330
الهيماتوكسيلينأداماس61753A
الطرد المركزي المبرد عالي السرعةهيرملZ366K
الحاضنةتايتكM-210FN
جهاز التخدير الاستنشاقيرينجرRZ-Viking
إيزوفلورانويبيوW100
ميكروتومتيد بيلا10180-220
جهاز التعب من نوع دوار الفأربكين تشيشو دوباو للتكنولوجيا البيولوجيةYLS-10B
البلسم المحايدسينوفارم96949-21-2
سافرانين أو ستينالبيوسS0062
مركز دمج الأنسجة شبه الأوتوماتيكيثيرمو فيشرهيستوستار
لوحة تسخين بتجفيف الشرائحعلوم المجهر الإلكترونيXH-2002
حمام الماء بالطفو النسيجيالقاعدة الحيويةBT-I
الكولاجيناز من النوع الثانيسيغما-ألدرتشC4-22-1G
ماسح الشرائح بالكامللايكاأبيريو فيرسا
زيلينسينوفارم1330-20-7

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Friedman, B., et al. Adenosine A2A receptor signaling promotes FoxO associated autophagy in chondrocytes. Scientific Reports. 11, 968-968 (2021).
  2. O'Brien, P., et al. What are the patient factors that impact on decisions to progress to total knee replacement? BMJ Open. 9, e031310-e031310 (2019).
  3. Amirkhizi, F., et al. Higher dietary phytochemical index is associated with lower odds of knee osteoarthritis. Scientific Reports. 12, 9059-9059 (2022).
  4. Liu, Q., et al. Effects of mechanical stress on chondrocyte phenotype and chondrocyte extracellular matrix expression. Scientific Reports. 6, 37268-37268 (2016).
  5. Halonen, K. S., et al. Workflow assessing the effect of gait alterations on stresses in the medial tibial cartilage. Scientific Reports. 7, 17396-17396 (2017).
  6. Xu, L., Kazezian, Z., Pitsillides, A. A., Bull, A. M. J. A synoptic literature review of animal models for investigating the biomechanics of knee osteoarthritis. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 12, 1408015-1408015 (2024).
  7. Kim, J. E., et al. Development and characterization of various osteoarthritis models for tissue engineering. PLoS One. 13, e0194288-e0194288 (2018).
  8. Lampropoulou-Adamidou, K., et al. Useful animal models for the research of osteoarthritis. European Journal of Orthopaedic Surgery & Traumatology. 24, 263-271 (2014).
  9. Park, J., et al. A pathophysiological validation of collagenase II-induced biochemical osteoarthritis animal model in rabbit. Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 15, 437-444 (2018).
  10. van der Kraan, P. M., et al. Degenerative knee joint lesions in mice after a single intra-articular collagenase injection. Journal of Experimental Pathology. 71, 19-31 (1990).
  11. Li, J. A mouse model of osteoarthritis originating from lateral instability of the ankle joint. , Suzhou University. (2017).
  12. Glasson, S. S., et al. The OARSI histopathology initiative - recommendations for histological assessments of osteoarthritis in the mouse. Osteoarthritis and Cartilage. 18, Suppl 3. S17-S23 (2010).
  13. Perera, J. R., Gikas, P. D., Bentley, G. The present state of treatments for articular cartilage defects in the knee. Annals of the Royal College of Surgeons of England. 94, 381-387 (2012).
  14. Zhang, J., et al. Tetrahydrohyperforin prevents articular cartilage degeneration and affects autophagy in rats with osteoarthritis. Experimental and Therapeutic Medicine. 15, 5261-5268 (2018).
  15. Sun, Y., Wang, C., Gong, C. Repairing effects of glucosamine sulfate in combination with etoricoxib on articular cartilages of knee osteoarthritis. Journal of Orthopaedic Surgery and Research. 15, 150-150 (2020).
  16. Spender, J. K. On some hitherto undescribed symptoms in the early history of osteoarthritis: the so-called rheumatoid arthritis. British Medical Journal. 1, 781-783 (1888).
  17. Bannuru, R. R., et al. OARSI guidelines for the non-surgical management of knee, hip, and polyarticular osteoarthritis. Osteoarthritis and Cartilage. 27, 1578-1589 (2019).
  18. Felson, D. T. Osteoarthritis as a disease of mechanics. Osteoarthritis and Cartilage. 21, 10-15 (2013).
  19. van Tunen, J. A. C., et al. Association of malalignment, muscular dysfunction, and abnormal joint loading with tibiofemoral knee osteoarthritis. BMC Musculoskeletal Disorders. 19, 273-273 (2018).
  20. Zhang, L., et al. Knee joint biomechanics in physiological conditions and how pathologies can affect it: a systematic review. Applied Bionics and Biomechanics. 2020, 7451683-7451683 (2020).
  21. Amin, S., et al. Knee adduction moment and development of chronic knee pain in elders. Arthritis and Rheumatism. 51, 371-376 (2004).
  22. Foroughi, N., Smith, R., Vanwanseele, B. The association of external knee adduction moment with biomechanical variables in osteoarthritis. The Knee. 16, 303-309 (2009).
  23. Henak, C. R., Anderson, A. E., Weiss, J. A. Subject-specific analysis of joint contact mechanics: application to the study of osteoarthritis. Journal of Biomechanical Engineering. 135, 021003-021003 (2013).
  24. Menge, T. J., et al. Anterior horn meniscal repair using an outside-in suture technique. Arthroscopy Techniques. 5, e1111-e1116 (2016).
  25. Zhang, J., et al. Feasibility study of early prediction of postoperative MRI findings for knee stability after ACL reconstruction. BMC Musculoskeletal Disorders. 22, 649-649 (2021).
  26. Kawada, M., et al. Contribution of hip and knee muscles to lateral knee stability during gait. Journal of Physical Therapy Science. 32, 729-734 (2020).
  27. Shim, J. K., Choi, H. S., Shin, J. H. Effects of neuromuscular training on knee joint stability after anterior cruciate ligament reconstruction. Journal of Physical Therapy Science. 27, 3613-3617 (2015).
  28. Hirschmüller, A., et al. Rehabilitation before regenerative cartilage knee surgery: a new prehabilitation guideline. Archives of Orthopaedic and Trauma Surgery. 139, 217-230 (2019).
  29. Hartmann, H., Wirth, K., Klusemann, M. Analysis of the load on the knee joint and vertebral column with changes in squatting depth. Sports Medicine. 43, 993-1008 (2013).
  30. Fong, I. C. D., et al. Effect of foot progression angle adjustment on the knee adduction moment in runners with knee osteoarthritis. Gait & Posture. 61, 34-39 (2018).
  31. Du, J., et al. Effect of high fat diet and excessive compressive mechanical force on pathologic changes of temporomandibular joint. Scientific Reports. 10, 17457-17457 (2020).
  32. Hunt, M. A., et al. Varus thrust in medial knee osteoarthritis: quantification and effects of different gait-related interventions. Arthritis Care & Research. 63, 293-297 (2011).
  33. Christiansen, B. A., et al. Non-invasive mouse models of post-traumatic osteoarthritis. Osteoarthritis and Cartilage. 23, 1627-1638 (2015).
  34. Adães, S., et al. Intra-articular injection of collagenase in the knee of rats as an alternative model to study nociception. Arthritis Research & Therapy. 16, R10-R10 (2014).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

TRPV4 COL2A1

مقالات ذات صلة