مقالة منهجية

اختبار عزل الألياف المفردة لتقييم سلوك الألياف العضلية التأكسدية

515 مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/70637

⸱

مارس 31, 2026

 ,  ,  ,  , 
1Department of Health Promotion Sciences, Graduate School of Human Health Sciences, Tokyo Metropolitan University, 2Department of Immunology, Graduate School of Medicine, Juntendo University

في هذه المقالة

ملخص

يصف هذا البروتوكول عزل ألياف عضلية واحدة سليمة عن العضلة التأكسدية وإنشاء مزارع عضلية عالية النقاء مشتقة من هذه الألياف. ينتج الإجراء المحسن بشكل موثوق حوالي 300–500 ألياف عضلية سليمة لكل فأرة، مما يمكن من إجراء تحليلات جزيئية وخلوية لاحقة.

الملخص

تتكون العضلة العظمية من ألياف عضلية متعددة النوى تعتبر سلامتها ووظيفتها ضرورية للحركة والصحة العامة. في اضطرابات الأعصاب العضلية، يمكن أن تتأثر مجموعات العضلات بشكل مختلف عبر أنواع ومراحل الأمراض، مما يجعل من المهم عزل الألياف الفردية الحية من العضلات الممثلة للدراسات الميكانيكية. هدف هذا البروتوكول هو توفير طريقة موثوقة لعزل ألياف عضلية واحدة سليمة عالية من عضلة الفأر السليمة (SOL)، والتي يصعب فصلها بسبب طول الألياف وهشاشتها. من خلال تحسين تركيز الكولاجنازي ووقت الهضم، يقلل البروتوكول من فقدان الألياف ويحافظ على قابلية الاستمرار أثناء التفكك. يقلل سير العمل المحسن بشكل ملحوظ من التصاق الأنسجة المتبقية بالألياف المعزولة، مما يحد من انتقال الخلايا غير الليفية ويقلل من التلوث عبر الخلايا. هذه التقنية مناسبة لتحليلات الألياف المفردة وكذلك لعزل الخلايا الصناعية والتوسع اللاحق في ظروف تلوث طفيف. باستخدام هذا السير المحسن، نحصل بشكل روتيني على ~300–500 ألياف عضلية مفردة مستمدة من SOL سليمة يمكن تصنيفها بكفاءة عالية وتنتج أيضا مجموعة خلايا أقمار صناعية عالية الجودة مع تلوث بسيط للأرومات الليفية. باستخدام تحليلات مقارنة مع عضلة عضلة العضلات الطويلة (EDL)، نؤكد على قيمة نهج مخصص وخاص بالعضلات لتقييم العلاجات في أبحاث أمراض الأعصاب العضلية، مما يمكن من اختبار التدخلات الدوائية المرشحة ضمن نوافذ تجريبية صغيرة وقابلة للتعديل.

المقدمة

العضلة العظمية هي الأنسجة الأكثر وفرة في جسم الإنسان، حيث تمثل حوالي 40–50٪ من إجمالي كتلة الجسم1. تعمل العضلات الهيكلية كمخزن للطاقة على شكل جليكوجين. أثناء التعرض للبرد، يوفر الحرارة من خلال التكوين الحراري، والأهم من ذلك يوفر الحركة. تتكون العضلة العظمية من ألياف عضلية متعددة النوى بعد الانقسام. للحفاظ على نضج العضلات وإصلاحها، يتم توليد النظائر العضلية العضلية الجديدة بواسطة الخلايا الجذعية المقيمة في عضلتنا العظمية، وهي الخلية الفضائية (SC). توجد الخلايا العضلية العظمية على محيط ألياف العضلات الهيكلية بعد الولادة2،3،4. يتم تحديد ال SCs بواسطة عامل النسخ Pax7، الذي يعبر عنه في كل من الحالة السكونية والمنشطة 3,5. عند الإصابة أو التحفيز الضخم، تنشط الخلايا العضلية العضلية وترفع من التنظيم، تدخل البرنامج العضلي الميوجني، وتتكاثر، وفي النهاية تندمج مع ألياف عضلية موجودة أو جديدة لاستعادة وظيفة العضلات 6,7,8. الألياف العضلية متباينة في قدرتها على الجذع، والأصل الجنيني (الجسدي مقابل غير الجسمي)، ومرحلة النمو بعد الولادة (الشباب مقابل الكبير)، وتركيب العضلات (الألياف السريعة مقابل البطيئة)9,10,11.

اعتمادا على منطقة الجسم، يتم تخصيص العضلات الهيكلية لتلبية المتطلبات الطاقية والوظيفية لتلك المنطقة. هذا التغاير في ألياف العضلات ممكن بسبب انقباضها وقدرتها التأكسدية. في الواقع، تتكون ألياف العضلات من ألياف مؤكسدة بطيئة الارتعاش (تسمى النوع الأول وIIa) والألياف الجليكوليكية سريعة الانقباض (تسمى IIx، في القوارض IIb)12،13. هذه الفسيفساء الجميلة والوظيفية من أنواع الألياف تمكننا من التحرك بحرية في حياتنا اليومية. على سبيل المثال، العضلات الوضعية مثل العضلة العضلية (SOL) وعمود الفقرات المنتصب، تكون في حالة تنشيط مزمن منخفض المستوى، وبالتالي تحتوي على نسبة عالية من ألياف العضلات من النوع الأول والنوع IIa بطيئة التأكسد. على النقيض من ذلك، تتكون العضلات القصيرة ولكن سريعة المفعول مثل عضلة العضلات الطويلة (EDL) بشكل رئيسي من ألياف من النوع IIx وIIb الجليكوليتية. ومع ذلك، فإن تركيب الألياف ليس ثابتا؛ بل إن ألياف العضلات هي هياكل ديناميكية قادرة على الانتقال من سريع إلى بطيء والعكس حسب المتطلبات الوظيفية المفروضة عليها. الفرق في انقباض نوع الألياف ممكن بسبب محتوى بروتين الميوسين. هذا هو البروتين الرئيسي داخل العضلة العظمية، ويتكون من أشكال متشابكة من السلاسل الخفيفة والثقيلة في الميوسين12,14.

داخل الساركومير (أصغر وحدة وظيفية في العضلة تولد القوة)، يتفاعل رؤوس الميوسين والأكتين لتشكيل هيكل يعرف بالجسر المتقاطع. من خلال تحلل ATP، يتم إطلاق الطاقة من خلال دوران تفاعلات الميوسين والأكتين15,16. سلسلة الميوسين الثقيلة (MyHC) هي العلامة الأنسب لتحديد نوع الألياف12,13. اعتمادا على الشكل المماثل لل MyHC المعبر، يختلف معدل انقباض العضلات. كما ذكر، ألياف النوع الأول هي ألياف مؤكسدة بطيئة، على عكس ألياف النوع الثاني. تحتوي مجموعات العضلات السائدة من النوع الأول على وفرة أعلى من الإنزيمات التأكسدية، وهي أغنى بالميتوكوندريا، ولديها شبكة شعيرات شعرية كثيفة لتغذية العضلة17,18 (فكر في العدو الماراثوني). الألياف من النوع الأول مشفرة بواسطة جين MYH7 رقم 13,19. ألياف النوع الثاني سريعة التعب، وتحتوي على نسبة عالية من الإنزيمات الجليكوليتية، ولديها سرعة قصوى أكبر في التقصير، مما يجعلها مثالية للانفجارات القصيرة من القوة أو الحركة (فكر في رافع القوة). الألياف من النوع الثاني للأنواع IIa وIIx وIIb (في القوارض) مشفرة بواسطة جينات MYH2 وMYH1 وMYH4 على التوالي20,21. ليس من المستغرب أن أي إهانة فسيولوجية مرضية تؤثر على سلامة العضلات ستغير تركيب الألياف وتؤدي إلى تأثيرات سلبية على وظيفة العضلات، مما قد يقلل من جودة الحياة. في الواقع، العديد من الحثل العضلي يبدأ إما في الخلية الصناعية (أوباثيات الخلايا الفضائية) أو في ألياف العضلات (مشتقة من الخلايا العصبية الحركية أو نسيج العضلات)، ويمكن أن تسبب تحولا في تركيب نوع الألياف22،23،24،25. على سبيل المثال، تظهر إصابات الحبل الشوكي، ودراسات الراحة في الفراش، والسفر الفضائي (انعدام الجاذبية) أن قلة النشاط طويلة الأمد يمكن أن تحفز عضلات الوضعية للتحول من نمط بطيء إلى نمط ألياف سريع 26,27,28,29,30. وعلى العكس، في ضمور عضلي دوشين، سواء في نماذج الإنسان أو الفأر (mdx)، تتأثر الألياف السريعة بتحليل السكر بشكل أكبر وبشدة أكبر من نظيراتها الأبطأ 31,32,33,34. وبالمثل، في ضمور عضلي الوجه والعنق (FSHD)، يلاحظ انتقال ارتعاش سريع إلى بطيء مع نسبة أكبر من ألياف النوع الأول مع انخفاض إنتاج القوة في ألياف النوع الثاني24، 35، 36.

لا يزال من غير الواضح لماذا تتأثر بعض أنواع ألياف العضلات بشكل انتقائي أو تتجنب في أمراض مختلفة. حقيقة أن هذه الأنماط غير عشوائية تؤكد أهمية تحليل الآليات الأساسية، التي برز فيها عزل الألياف المفردة كتقنية قوية وشائعة الاستخدام. في الواقع، منذ أن تم تقديمه لأول مرة في منتصف الثمانينيات بواسطة بيشوف37، تم تحسين وتكييف هذه الأداة الضرورية باستمرار، مما أتاح تحقيقا أكثر دقة في بيولوجيا العضلات 38,39,40. ومن المهم أن عزل الألياف المفردة يحافظ على وجود الألياف القصيرة بالقرب قدر الإمكان من مكانها الفسيولوجي، مما يتيح تدقيقا كافيا لنشاطها الجزيئي. على الرغم من أن مجموعات العضلات مثل تلك الموجودة في عضلة الثني الأصابع (FDB) وEDL يمكن استخلاصها بسهولة نسبية 41,42,43، إلا أن عضلة SOL تظل واحدة من أصعب العضلات للحصول على مجموعة غنية من الألياف السليمة. ويرجع ذلك إلى صلابتها، وطول الألياف الطويل، وقابليتها للتلف. لمعالجة ذلك، تم تحسين تقنية في الدراسة الحالية تنتج بقوة مجموعة عالية الجودة وقابلة للحياة من الألياف من عضلة SOL المعروفة بصعوبة عزلها. عند دمجه مع عزل ألياف EDL، يمكن هذا النهج من زراعة الألياف والخلايا المشتقة (خلايا الأقمار الصناعية، الخلايا العضلية، وأنابيب العضلات) من مجموعات عضلية مختلفة. والأهم من ذلك، أن هذه المنصة تتيح تحقيقا منهجيا للعوامل الجزيئية التي قد تساهم بشكل مختلف في أمراض العضلات المتنوعة، وتوفر وسيلة قوية لاختبار التدخلات الدوائية بطريقة تكشف عن استجابات خاصة بنوع العضلات وتدعم في النهاية تطوير علاجات فعالة لأمراض العضلات الهيكلية.

البروتوكول

تم إيواء جميع الحيوانات في منشأة الحيوانات التابعة لجامعة طوكيو العاصمة (أرقام التصاريح: A4-4، A5-9، A6-7، A7-018). تم الحفاظ على جميع الحيوانات في ظروف خالية من مسببات الأمراض (SPF) محددة. التزمت الإجراءات التجريبية والتعامل مع الحيوانات المستخدمة في هذه الدراسة بدقة بإرشادات لجنة السلامة والأخلاقيات في جامعة طوكيو العاصمة.

1. تحضير الكواشف

  1. ارتد قفازات طوال الوقت. في أنبوب طرد مركزي بسعة 25 مل، حضر 0.5٪ من محلول الكولاجناز النوع الأول في وسط النسر المعدل (DMEM) من دولبيكو عالي الجلوكوز + جلوتاماكس مع تعليق بنسلين-ستربتومايسين-أمفوتريسين B بنسبة 1٪. بعد أن يذوب الكولاجناز جيدا (انقر برفق على الأنبوب إذا لزم الأمر)، قم بتعقيم المحلول عن طريق الترشيح عبر فلتر منخفض الارتباط بالبروتين بحجم 0.22 ميكرومتر.
    ملاحظة: 2.5 مل من محلول الكولاجناز يكفي لسوليوسين (فأرة واحدة).
  2. حضر 10 مل من ألبومين مصل البقري بنسبة 5٪ (BSA) في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS). قم بتعطيل الحرارة عند 60 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، ثم قم بترشيح المحلول عبر مرشح منخفض الارتباط بالبروتين بحجم 0.22 ميكرومتر.
    ملاحظة: يمكن تخزين 5٪ BSA في محلول PBS عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 10 أيام.

2. تشريح عضلات السوليوس

  1. معدات التخطيط لتشريح العضلات (الشكل 1A).
  2. تخدير فئران C57BL/6 عن طريق الحقن داخل الصفاق لخليط مخدر ثلاثي (0.5 مل/جم وزن الجسم) يحتوي على 1 ملغ/ملليتر ميديتوميدين هيدروكلوريد، 5 ملغ/ملليتر ميدازولام، و5 ملغ/مل بوتورفانول تارتاترات، ثم قتل الفئران عن طريق خلع عنق الرحم.
  3. قم بعمل شقوق جلدية متتالية على الطرف الخلفي وقشر الجلد. أزل اللفافة السطحية.
  4. افصل وتر بلانتاريس (PLA) عن حزمتي وتر العضلة المعدية (GAS) والعضلة النعشية (SOL). قم بإزالة PLA بلطف عن طريق سحب وتره (الشكل 1B).
  5. اقطع حزم أوتار GAS وSOL واكشف العضلات. أدخل دبوسا في الفجوة بين الوتر القريب ل GAS وSOL (الشكل 1C).
  6. حرك الإبرة بحذر نحو الطرف البعيد لفصل عضلة SOL وعضلة GAS (الشكل 1D).
  7. اقطع حزم الأوتار من جانب GAS (الشكل 1E).
  8. ضع الوقت المخصص للغاز. قم بضبط موضع ال SOL بعناية لكشف الوتر القريب وقطعه بزوج من المقصات الدقيقة (الشكل 1F).
  9. ضع SOL على طاولة التشريح وأزل الوتر المتبقي (الشكل 1G).
    ملاحظة: هذه الخطوة اختيارية؛ الوتر المتبقي لا يؤثر على النتيجة.

3. هضم عضلات السوليوس

  1. انقل السوليوس السليم إلى أنبوب طرد مركزي بسعة 25 مل يحتوي على محلول كولاجناز 0.5٪ المحضر. حضن على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 130 دقيقة.
    ملاحظة: كل 15–20 دقيقة، يمكن تحريك العينة يدويا لتصبح ألياف منفصلة قليلا ودعم نشاط الكولاجناز.

4. عزل الألياف المفردة تحت المجهر المجسم

  1. اقطع ماصتين باستور لصنع واحدة ذات قطر واسع وأخرى ذات فتحة ضيقة (الشكل 2A). تحت اللهب، قم بتعقيم وتنعيم الثقوب لتجنب تلف العضلات أثناء التثبيت.
  2. لمنع التصاق الألياف أثناء العزل، قم بتغطية ماصات باستور وثلاث أطباق بتري بحجم 50 مم بنسبة 5٪ BSA/PBS.
    ملاحظة: تم استخدام المجهر المجسم (الشكل 2B) طوال خطوات العزل.
  3. بعد هضم العضلات، تخلص من محلول الكولاجنازي الزائد وانقل السوليوس إلى الطبق الأول الذي يحتوي على DMEM بنسبة 1٪ AB (الشكل 2C).
  4. باستخدام ماصة باستور واسعة السبطانة، اشطف بلطف صعودا وهبوطا لتفكيك الألياف (الشكل 2D).
  5. باستخدام ماصة باستور الضيقة، انقل الألياف المفردة السليمة على طول ألياف العضلة إلى الطبق الثاني. اغتنم الفرصة هنا لإزالة الحطام و/أو الألياف المنكمشة (الشكل 2E,F).
  6. نقل ألياف مفردة عالية الجودة (كاملة الطول أو سليمة) إلى طبق ثالث لضمان النقاء باستخدام ماصة باستور الضيقة (الشكل 2G,H).
  7. اجمع الألياف في أنبوب طرد مركزي مغطى ب BSAبسعة 25 مل. حرك التعليق بلطف، ثم اتركه لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة للسماح للألياف بالترسب إلى أسفل الأنبوب.
  8. باستخدام ماصة باستور الضيقة السبطانة، تخلص من السوبرناتانت بعناية، وأزل أي بقايا متبقية. اترك حوالي 500 ميكرولتر من DMEM مع محلول AB بنسبة 1٪. سيحتوي هذا الرواسب على مجموعة منقاء للغاية من ألياف عضلية منفردة (الشكل 2G,H).
    ملاحظة: يمكن لهذه التقنية أن تنتج > 300 ألياف فردية، والتي يمكن استخدامها بعد ذلك لاستخراج البروتين والرنا المغناطيسي والتحليل اللاحق.

5. إنشاء مزارع ميوبلاستات عالية النقاء من ألياف السوليوس

  1. قم بتخفيف ماتريجل ماتريجل إلى 0.1 ملغ/مل واستخدمه لتغطية طبق زراعة بحجم 100 مم. حضن الطبق عند 37 درجة مئوية لمدة 30–60 دقيقة حتى يبلمر الطلاء بشكل متساو.
  2. أضف كمية مماثلة من أكوتاز إلى تعليق ألياف العضلات واحتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. بعد ذلك، أضف 10 مل من وسط النمو (يتكون من DMEM خالي من الجلوكوز يحتوي على 30٪ مصل البقر الجنيني، 1٪ جلوتا ماكس، 1٪ مستخلص الدجاج-الجنين، CEE، 1٪ AB، و0.01 ميكروغرام/مل عامل نمو الأرومات الليفية الأساسية، bFGF)44.
    ملاحظة: كمية متساوية من الأكوتاز في هذه الحالة هي 500 ميكرولتر الموضح في القسم 4.8. يسهل الأكيوتاز الانفصال اللطيف لألياف العضلات ويساعد في تحرير الخلايا الفضائية، مما يدعم التوسع اللاحق لزراعة الخلايا العضلية.
  3. انقل 10 مل من تعليق ألياف العضلات المعالجة بالأكيوتاز إلى طبق مطلى بالماتريجيل. تضاف حوالي 4 ألياف مفردة/سم2 إلى طبق زراعة بحجم 100 مم. تأكد من توزيع الألياف بشكل متساو في جميع أنحاء طبق الزراعة.
  4. بعد 3 أيام في وسط الزراعة، يمكن ملاحظة مستعمرات الميوبلاست. استبدل وسط النمو يوميا حتى تصل العضلات إلى العدد المطلوب. عادة، بحلول اليوم السادس، تصبح ثقافات الميوبلاست متقاربة بما يكفي للمرحلة التجريبية (الشكل 3A).
  5. افصل الميوبلاست من طبق الزراعة الأصلي باستخدام التربسين وحضن العينة على حرارة 37 درجة مئوية لمدة دقيقتين. باستخدام جهاز قياس الدم الخلوي، عد الخلايا والبذور حسب حجم البئر والتقاء الخلايا اللازمة لتقدم العضلات.
    ملاحظة: لطبق 100 مم، أضف 1 مل من التربسين.

النتائج

تظهر تقنيتنا أن الألياف المعزولة من عضلات عضلة العضلة العضلية (SOL) والعضلات الطويلة (EDL) يمكن تصنيفها مناعيا بكفاءة ضد Pax7 (الشكل 3B). يمكن الاحتفاظ بهذه الألياف المعزولة في وسط زراعة عائم (مكون من DMEM + GlutaMAX مع 10٪ مصل حصان، 1٪ AB، 0.5٪ CEE) لمدة 3 أيام، يليه وضع التصنيف المناعي (الشكل 3B). لا ينصح بالاحتفاظ بالألياف الطافية لأكثر من 4 أيام. تحت ظروف الألياف العائمة المذكورة، تميل ألياف العضلة إلى التجمع بعد هذه الفترة، مما يؤثر على تحليل الوسم المناعي اللاحق.

يمكن استخدام التقنية المعروضة أيضا للحقن المناعي عبر البرنامج العضلي (الشكل 3C). في الواقع، تم طلاء العضلات المشتقة من SOL وEDL في صفائح بئر 24 عند التقاء حوالي 70٪. تم الحفاظ على الخلايا إما في وسط نمو لمدة يوم واحد (العضلات العضلية) أو تحفيزها للتمايز لمدة يومين أو أربعة أيام (أنابيب العضلة المبكرة والمتمايزة على التوالي). تم تحميل خمسة ميكروغرام من البروتين لتحليل الضربات المناعية.

تم التعبير عن MyHC I بشكل شبه محدد في ألياف العضلات المشتقة من SOL، مع تعبير ضئيل في أنابيب العضلة وضئيلا في الخلايا العضلية (الشكل 3C). تم التعبير عن MyHC II في ألياف عضلية SOL وEDL. يعكس هذا التعبير SOL، الذي يتكون أساسا من النوعين I وIIa، بينما يتكون EDL بشكل أساسي من ألياف IIx وIIb. لم تعبر الخلايا العضلية عن MyHC II، لكن تعبيرها ازداد تدريجيا أثناء التمايز. أظهرت البروتينات المرتبطة بالأكسدة PGC-1α وCOXIV تعبيرا أعلى متوقعا في الألياف المشتقة من SOL. أيضا، تم اكتشاف تعبير أعلى ل GLUT4 في ألياف SOL المعزولة مقارنة بألياف EDL. مشكلة قد يواجهها علماء أحياء العضلات الهيكلية هي أن البروتينات المستخدمة على نطاق واسع وأدوات التحكم في التحميل مثل α-التيوبولين، β-الأكتين، GAPDH والصبغات البروتينية الكلية بما في ذلك بونسو S، لا تبقى مستقرة عبر الخلايا العضلية، وأنابيب العضلات، وألياف العضلات المعزولة، حيث تظهر كل منها تنوعا واضحا. كانت شدة الإشارة في α-توبولين و β-أكتين الأعلى في أنابيب الميوتيوب، بينما كان تلوين بونسو S ضعيفا نسبيا في الميوبلاست. على النقيض من ذلك، أظهر GAPDH تعبيرا أقوى في ألياف عضلية EDL. ومع ذلك، وبحسب الغرض التجريبي، قد يظل أحد هذه البروتينات القابلة للتطبيق، ويمكن استكشاف عوامل تطبيع مثل بروتين صدمة الحرارة 70 (HSP70).

الشكل 1
الشكل 1. تشريح عضلة السوليوس. (أ) المعدات المطلوبة للتشريح. 1: مقص دقيق، 2: ملقط دقيق، 3: مقص تشريح، و4: دبابيس تشريح. (ب) تم قطع وتر PLA من حزم أوتار GAS وSOL (سهم أصفر). تم رفع وتر PLA البعيد (السهم الأبيض) باستخدام الملقط. (ج) تم إدخال دبوس تشريح في الفراغ بين الوتر القريب للسهم الأحمر (SOL) وGAS (السهم الأخضر). (D) تم فصل SOL عن GAS باستخدام دبوس تشريح. (ه) تم قطع حزم أوتار GAS وSOL من جانب GAS. (F) تم قطع وتر SOL القريب بالمقص الدقيق. (G) تمت إزالة حزم الأوتار البعيدة الإضافية. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 2
الشكل 2. عزل ألياف السوليوس. (أ) المعدات المطلوبة للعزل. 1: ضيق القطر و2: ماصات باستور عريضة التجويف. (ب) المجهر المجسم المستخدم للعزل. (ج) تم نقل السوليوس المهضم بالكولاجناز إلى DMEM مع 1٪ AB. (د) انفصال ألياف سوليوس عن العضلة بعد أول 10 جلسات شطف. (ه) ألياف منفردة تنقل إلى الطبق الثاني. (و) صورة تظهر الألياف النظيفة التي أزيلت من الحطام والألياف المصغرة. (G) ألياف منفردة خالية من الحطام تنتقل إلى الطبق الثالث. (ح) ألياف منفردة سليمة مرئية بوضوح. شريط المقياس = 10 مم. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 3
الشكل 3. توسيع زراعة الخلايا وتحليل عينات EDL وSOL. (أ) بعد 6 أيام من العزل، تظهر عينات وسط التكاثر المزروعة زراعة مصب خلوية نقية تم الحصول عليها من ألياف سوليوس معزولة. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. (B) تظهر ألياف SOL وألياف مفردة مشتقة من EDL، مباشرة أو بعد 3 أيام من العزل، خلايا أقمار صناعية مميزة لجهاز Pax7 (الأخضر). غياب MyoD (الأحمر) يؤكد أن الخلايا الأقمارية لم تلتزم بعد بالتنشيط العضلي. تم تلوين الألياف بمادة DAPI (الأزرق). تمت ملاحظة الخلايا لاحقا عبر مجهر فلوري. شريط المقياس = 20 ميكرومتر. (C) تم استخدام 5 ميكروغرام من البروتين لإزالة العضلات المناعية للبلاستات العضلية، وأنابيب العضلات، والعينات المشتقة من ألياف العضلة. أظهرت لوحات الحقن المناعي تعبيرا عن MyHC I وMyHC II وPGC-1α وCOX IV وGLUT4 و α-tubulin و β-أكتين وGAPDH كأهداف للتنظيف المنزلي/التطبيع. تم استخدام صبغة بونسو S كوسيلة تحكم كاملة لتحميل البروتين. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

المناقشة

المفتاح الأول لعزل عدد كبير من ألياف العضلات عن العضلة العضلية (SOL) هو الحفاظ على السلامة الهيكلية للعضلة أثناء التشريح. إذا تمزق الإبيميسيوم في السول أو تم سحب العضلة بقوة، خاصة على محورها الطولي، أثناء التشريح، فإن عائد العزل يتأثر بشدة. عادة ما يكون من السهل تحديد هذه الأخطاء في التشريح بعد ذلك. في الواقع، بعد هضم الكولاجيناز، تصبح العضلة منكمشة بشكل موحد وتشكل كتلة بيضاء ومضغوطة. في مثل هذه الظروف، يمكن فقط تفكيك عدد قليل جدا من الألياف القابلة للحياة.

العامل الحاسم الثاني لعزل السوليوس الناجح هو كفاءة هضم الكولاجناز من النوع الأول. عندما يعمل الكولاجناز بشكل مثالي، يمكن الحصول على حوالي 100–200 ليف سوليوس خلال أول 10 جلسات شطف. على النقيض من ذلك، عندما يكون الهضم غير مثالي، حتى بعد أول 20 غسولة، قد يتم إفراز أقل من 50 ليفا. للحصول على إنتاج ألياف أعلى، يتطلب الأمر شطفا أكثر كثافة ودورات شطف إضافية. ومع ذلك، وبما أن ألياف SOL هشة للغاية، غالبا ما يؤدي ذلك إلى انكماش الألياف أثناء الشطف.

لإنشاء ثقافة ألاستية عضلية أولية مشتقة من SOL، يلعب هضم الكولاجيناز دورا حيويا مرة أخرى. عندما يكون الهضم فعالا، تبقى كمية أقل من الألياف متصلة بالأنسجة المتبقية، ونقل الألياف إلى وسط الزراعة يؤدي إلى تلوث بسيط في الأرواح الليفية. على النقيض من ذلك، عندما يكون الحمض النووي السريع غير مهضم جيدا، تبقى الألياف المفككة ملتصقة بالأنسجة المتبقية، مما يلوث مزرعة الخلايا العضلية بالخلايا الليفية. يجب على الباحثين البحث عن العلامات النموذجية لتلوث الخلايا الليفية في عينات الخلايا المزروعة؛ تشمل هذه الخلايا حجم خلية أكبر بكثير وبروزات هيكلية خلوية واسعة، مقارنة بالخلايا الأقمار الصناعية الأصغر بكثير على شكل المغزل في أطباق مطلية بالماتريجيل. إذا حدث تلوث، قد يخضع الباحثون للخلايا لخطوات ما قبل الطلاء كما هو موضح في مكان آخر45. لفترة وجيزة، يتم زراعة الطبقات القصيرة لمدة 3 أيام بعد العزل، ثم تتربسي وتغلف لفترة وجيزة على أطباق مغطاة بالكولاجين. خلال فترة الحضانة لمدة 15–30 دقيقة، تلتصق الأرومات الليفية بينما تبقى الخلايا الليفية معلقة وتنقل إلى صفائح مغطاة بالماتريجيل طازجة.

كما ذكر أعلاه ومتوافق مع تجربتنا، ألياف SOL أطول وأكثر هشاشة من ألياف عضلة العضلات الطويلة (EDL) ومثنية الديجيتوريوم بريفيس (FDB). وهذا يجعل نقل الألياف باستخدام ماصات باستور أمرا صعبا. من الضروري استنشاق الألياف على طول محورها الطولي بدلا من سحبها من المنتصف؛ وإلا، فإن الألياف تطوي وتنكمش تحت الإجهاد. بعيدا عن العوامل الحاسمة التي تحدد مباشرة نجاح عزل الألياف، هناك بعض الخطوات التقنية الإضافية ضرورية لتحسين إنتاجية ألياف السوليوس. واحدة من هذه الحلول هي تغطية جميع ماصات باستور وأطباقها وأنابيب الجمع ب 5٪ BSA. هذا يمنع ألياف العضلات المتفرقة حديثا من التصاق بالأسطح، مما يمنع طي الألياف والانكماش اللاحق. يوصى بتحضير ماصات باستور جديدة معقمة بالحرارة ومغطاة ب BSA في كل مرة يتم فيها عزل عينات العضلات. بدلا من ذلك، يمكن للباحثين إعداد مجموعة من ماصات باستور للاستخدام طويل الأمد. إذا كان الأمر كذلك، قم بتعقيم الحرارة في كل مرة وغطه ب BSA قبل الاستخدام.

كان البروتوكول التقليدي لعزل ألياف العضلات الفردية محسنا بشكل أساسي للعضلات المحللة مثل FDB وEDL37. ومع ذلك، فإن العضلات المؤكسدة، مثل SOL، تختلف من الناحية الهيكلية. أظهرت تحليلات النسخ أن التعبير الجيني المرتبط بمصفوفة خارج الخلية (ECM) يختلف بين SOL وEDL46، بما في ذلك جينات مثل الديستروفين، وهو بروتين رابط هيكلي خلوي للعضلة العظمية44. وبالتالي، فإن الحالة القياسية لهضم عضلات EDL مع كولاجناز 0.2٪ (2 ملغ/مل) لمدة 60–90 دقيقة ليست مثالية لعضلات SOL، مما يؤدي إلى حزم ألياف مضغوطة أو ألياف منكمشة بعد الهضم. في هذه الدراسة، قمنا بتحسين عدة خطوات رئيسية لتكييف البروتوكول لعضلات SOL التأكسدية. عن طريق تعديل تركيز الكولاجناز من النوع الأول إلى 0.5٪ (5 ملغ/مل)، وتمديد فترة الحضانة إلى 130 دقيقة، وتقليل الإجهاد الميكانيكي أثناء الشطف، يمكن الحصول على 300–500 ليف سليم من فأر واحد بشكل متسق. مقارنة ب EDL، يبقى عدد الألياف وإنتاجية عينات SOL أقل (يمكن أن تنتج EDL > 500 ليف); ومع ذلك، فإن عدد الألياف، والأهم من ذلك، جودة الألياف المشتقة من SOL لدينا قوية ومناسبة للتطبيقات اللاحقة مثل التصنيف المناعي والعزل المناعي. على الرغم من أن نتائج القطع المناعي لدينا كانت تتألف من عينات ألياف مفردة مجمعة، إلا أن التقنية المعروضة في هذا التقرير قادرة على استخراج الألياف الفردية سليمة بشكل موثوق، مما يجعلها مناسبة للتطبيقات اللاحقة مثل القطع المناعي، والبروتيوميك، وتسلسل الحمض النووي الريبي47 بدقة ليف واحد. يمكن للباحثين في المجال استخدام هذه التقنية لدراسة الفروق الأيضية والانقباضية بين ألياف العضلات التأكسدية والجليكولية.

بشكل عام، يوفر هذا البروتوكول طريقة قابلة للتكرار وسهلة الوصول لعزل الألياف التأكسدية السليمة عن عضلة العضلة النعشية، مما يوسع مجموعة الأدوات المتاحة لدراسة فسيولوجيا وآليات جزيئية خاصة بنوع ألياف العضلات.

الإفصاحات

المؤلفون لا يفرضون أي تضارب مصالح.

شكر وتقدير

وقد دعمت هذه الدراسة إنشاء زمالات جامعية نحو خلق الابتكار العلمي والتكنولوجيا (JST، منحة رقم JPMJFS2139 إلى تي. إتش.) ومنح من الجمعية اليابانية لتعزيز العلوم (KAKENHI 23H00457 لمؤسسة N.L.F.، 20J12849 ل Y.Mi.، 24K222254 ل Y. Ma). وقد حظيت هذه الدراسة أيضا بدعم منحة الأبحاث المتقدمة من حكومة طوكيو الكبرى [R2-2] ل Y.Ma.، وصندوق البحث الاستراتيجي من TMU لمشروع بحثي مبتكر [R3] إلى مؤسسة طوكيو الوطنية. شكرا لياسورو فورويتشي على نصائحه وتعليقاته المفيدة.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
AccutaseInnovative Cell TechnologiesAT104
Basic fibroblast growth factorPeprotech450-33
Bovine serum albuminSigmaA9418
Butorphanol tartrateMeiji Yakuka Co., Ltd711-12الاسم التجاري: Vetorphale حقنة
Chicken Embryo ExtractUS BiologicalC3999
Collagenase type IWorthingtonM9B2717
DAPISigma-AldrichD9542
Fetal bovine serumGibco10437-028
Glucose-free DMEMGibcoA14430-01
GlutaMAXGibco10569
High-glucose DMEM+GlutaMAXGibco10569-010
Horse serumLife technology16050-130
Low-protein binding filterMilliporeSLGVR33RB
MatrigelCorning354230
Medetomidine hydrochlorideKyoritsu Seiyaku Co., Ltd8816الاسم التجاري: Dorbene حقنة
MidazolamMaruishi Pharmaceutical Co., Ltd4987211762100الاسم التجاري: Dormicum حقنة
Penicillin-streptomycin-amphotericin B suspensionWako161-23181
Ponceau S stain solutionSigma-Aldrich24-3875-5
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol redGibco25200056
Equipment
Centrifuge tubes (25 mL)IWAKI2362-025
Fluorescence microscopeKeyenceBZ-X810
Pasteur pipettesIWAKI5 3/4 IK-PAS-5P
StereomicroscopeLeicaM165C
Sterilin dishes (100-mm)Thermo Scientific3020-100يشار إليها على أنها طبق بيتري في المخطوطة
Anbitodies for immunolabelling
Goat anti-mouse (H+L), Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA-327231:400
Goat anti-rabbit (H+L), Alexa Fluor 594Thermo Fisher ScientificA-110121:400
Mouse Anti-Myosin Heavy ChainR&D SystemsMAB44701:400
Mouse Anti-Pax7DSHBAB-5284281:100
Rabbit Anti-MyoDSanta Cruz Biotechnologysc-7601:100
Anbitodies for immunoblotting
HRP-conjugated Anti-mouse IgGCytivaNA9311:1000/ peroxidase horseradish
HRP-conjugated Anti-Rabbit IgGCytivaNA9341:1000/ peroxidase horseradish
Mouse Anti-MyHC ISigmaM84211:1000/ Myosin Heavy Chain I
Mouse Anti-MyHC IISigmaM42761:1000/ Myosin Heavy Chain II
Mouse Anti-PGC-1αSanta Cruz Biotechnologysc-5173801:1000/ Pparg coactivator 1 alpha
Mouse Anti-α-tubulinCell Signaling Technology#38731:1000/ Alpha tubulin
Rabbit Anti-COXIVCell Signaling Technology#48501:1000/ Cytochrome c oxidase IV
Rabbit Anti-GAPDHCell Signaling Technology#22181:10000/ Glyceraldehyde-3-Phosphate Dehydrogenase
Rabbit Anti-GLUT4Cell Signaling Technology#22131:1000/ Glucose Transporter 4
Rabbit Anti-β-actinProteintech20536-1-AP1:2000/ Nonmuscle Beta-actin

المراجع

  1. Janssen, I., Heymsfield, S. B., Wang, Z. M., Ross, R. Skeletal muscle mass and distribution in 468 men and women aged 18–88 yr. J Appl Physiol. 89 (1), 81-88 (2000).
  2. Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibers. J Biophys Biochem Cytol. 9 (2), 493-495 (1961).
  3. Zammit, P. S., Partridge, T. A., Yablonka-Reuveni, Z. The skeletal muscle satellite cell: The stem cell that came in from the cold. J Histochem Cytochem. 54 (11), 1177-1191 (2006).
  4. Zammit, P. S., et al. Pax7 and myogenic progression in skeletal muscle satellite cells. J Cell Sci. 119 (9), 1824-1832 (2006).
  5. Seale, P., et al. Pax7 is required for the specification of myogenic satellite cells. Cell. 102 (6), 777-786 (2000).
  6. Günther, S., et al. Myf5-positive satellite cells contribute to Pax7-dependent long-term maintenance of adult muscle stem cells. Cell Stem Cell. 13 (5), 590-601 (2013).
  7. Gnocchi, V. F., White, R. B., Ono, Y., Ellis, J. A., Zammit, P. S. Further characterisation of the molecular signature of quiescent and activated mouse muscle satellite cells. PLoS One. 4 (4), e5205(2009).
  8. Halevy, O., et al. Pattern of Pax7 expression during myogenesis in the posthatch chicken establishes a model for satellite cell differentiation and renewal. Dev Dyn. 231 (3), 489-502 (2004).
  9. Biressi, S., Rando, T. A. Heterogeneity in the muscle satellite cell population. Semin Cell Dev Biol. 21 (8), 845-854 (2010).
  10. Zammit, P. S. All muscle satellite cells are equal, but are some more equal than others. J Cell Sci. 121 (18), 2975-2982 (2008).
  11. Ortuste Quiroga, H. P., Fujimaki, S., Ono, Y. Pax7 reporter mouse models: A pocket guide for satellite cell research. Eur J Transl Myol. 33 (4), (2023).
  12. Schiaffino, S., Reggiani, C. Fiber types in mammalian skeletal muscles. Physiol Rev. 91 (4), 1447-1531 (2011).
  13. Pette, D., Staron, R. S. Myosin isoforms, muscle fiber types, and transitions. Microsc Res Tech. 50 (6), 500-509 (2000).
  14. Ahmetov, I. I., Vinogradova, O. L., Williams, A. G. Gene polymorphisms and fiber-type composition of human skeletal muscle. Int J Sport Nutr Exerc Metab. 22 (4), 292-303 (2012).
  15. Guth, L., Samaha, F. J. Qualitative differences between actomyosin ATPase of slow and fast mammalian muscle. Exp Neurol. 25 (1), 138-152 (1969).
  16. Aguilera-Alcala, N., Morales-Reyes, Z., Martin-Lopez, B., Moleon, M., Sanchez-Zapata, J. A. Role of scavengers in providing non-material contributions to people. Ecol Indic. 117, 11(2020).
  17. Sullivan, S. M., Pittman, R. N. Relationship between mitochondrial volume density and capillarity in hamster muscles. Am J Physiol. 252 (1), H149-H155 (1987).
  18. Fujita, N., et al. Changes in lipid metabolism and capillary density of the skeletal muscle following low-intensity exercise training in a rat model of obesity with hyperinsulinemia. PLoS One. 13 (5), e0196895(2018).
  19. Narusawa, M., et al. Slow myosin in developing rat skeletal muscle. J Cell Biol. 104 (3), 447-459 (1987).
  20. Faerman, A., Shani, M. The expression of the regulatory myosin light chain 2 gene during mouse embryogenesis. Development. 118 (3), 919-929 (1993).
  21. Denardi, C., et al. Type 2x-myosin heavy chain is coded by a muscle fiber type-specific and developmentally regulated gene. J Cell Biol. 123 (4), 823-835 (1993).
  22. Ciciliot, S., Rossi, A. C., Dyar, K. A., Blaauw, B., Schiaffino, S. Muscle type and fiber type specificity in muscle wasting. Int J Biochem Cell Biol. 45 (10), 2191-2199 (2013).
  23. Talbot, J., Maves, L. Skeletal muscle fiber type: Using insights from muscle developmental biology to dissect targets for susceptibility and resistance to muscle disease. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 5 (4), 518-534 (2016).
  24. Celegato, B., et al. Parallel protein and transcript profiles of FSHD patient muscles correlate to the D4Z4 arrangement and reveal a common impairment of slow to fast fibre differentiation and a general deregulation of MyoD-dependent genes. Proteomics. 6 (19), 5303-5321 (2006).
  25. Ganassi, M., Muntoni, F., Zammit, P. S. Defining and identifying satellite cell-opathies within muscular dystrophies and myopathies. Exp Cell Res. 411 (1), 112906(2022).
  26. Gallagher, P., et al. Effects of 84-days of bedrest and resistance training on single muscle fibre myosin heavy chain distribution in human vastus lateralis and soleus muscles. Acta Physiol Scand. 185 (1), 61-69 (2005).
  27. Grimby, G., Broberg, C., Krotkiewska, I., Krotkiewski, M. Muscle fiber composition in patients with traumatic cord lesion. Scand J Rehabil Med. 8 (1), 37-42 (1976).
  28. Shenkman, B. S. From slow to fast: Hypogravity-induced remodeling of muscle fiber myosin phenotype. Acta Naturae. 8 (4), 47-59 (2016).
  29. Ohira, T., Kawano, F., Goto, K., Ohira, Y. Responses of skeletal muscles to gravitational unloading and/or reloading. J Physiol Sci. 65 (4), 293-310 (2015).
  30. Higashino, K., et al. Early changes in muscle atrophy and muscle fiber type conversion after spinal cord transection and peripheral nerve transection in rats. J Neuroeng Rehabil. 10, 46(2013).
  31. Webster, C., Silberstein, L., Hays, A. P., Blau, H. M. Fast muscle fibers are preferentially affected in Duchenne muscular dystrophy. Cell. 52 (4), 503-513 (1988).
  32. Pedemonte, M., Sandri, C., Schiaffino, S., Minetti, C. Early decrease of IIx myosin heavy chain transcripts in Duchenne muscular dystrophy. Biochem Biophys Res Commun. 255 (2), 466-469 (1999).
  33. Rafael, J. A., et al. Dystrophin and utrophin influence fiber type composition and post-synaptic membrane structure. Hum Mol Genet. 9 (9), 1357-1367 (2000).
  34. Kotelnikova, E., et al. Novel approach to meta-analysis of microarray datasets reveals muscle remodeling-related drug targets and biomarkers in Duchenne muscular dystrophy. PLoS Comput Biol. 8 (2), e1002365(2012).
  35. Banerji, C. R. S., Zammit, P. S. Pathomechanisms and biomarkers in facioscapulohumeral muscular dystrophy: Roles of DUX4 and Pax7. EMBO Mol Med. 13 (8), e13695(2021).
  36. Lassche, S., et al. Sarcomeric dysfunction contributes to muscle weakness in facioscapulohumeral muscular dystrophy. Neurology. 80 (8), 733-737 (2013).
  37. Bischoff, R. Proliferation of muscle satellite cells on intact myofibers in culture. Dev Biol. 115 (1), 129-139 (1986).
  38. Rosenblatt, J. D., Lunt, A. I., Parry, D. J., Partridge, T. A. Culturing satellite cells from living single muscle fiber explants. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 31 (10), 773-779 (1995).
  39. Collins, C. A., Zammit, P. S. Isolation and grafting of single muscle fibres. Methods Mol Biol. 482, 319-330 (2009).
  40. Ravenscroft, G., et al. Dissociated flexor digitorum brevis myofiber culture system—a more mature muscle culture system. Cell Motil Cytoskeleton. 64 (10), 727-738 (2007).
  41. Keire, P., Shearer, A., Shefer, G., Yablonka-Reuveni, Z. Isolation and culture of skeletal muscle myofibers as a means to analyze satellite cells. Methods Mol Biol. 946, 431-468 (2013).
  42. Smith, L. R., Meyer, G. A. Skeletal muscle explants: Ex-vivo models to study cellular behavior in a complex tissue environment. Connect Tissue Res. 61 (3-4), 248-261 (2020).
  43. Tarpey, M. D., et al. Characterization and utilization of the flexor digitorum brevis for assessing skeletal muscle function. Skeletal Muscle. 8 (1), 14(2018).
  44. Omairi, S., et al. Regulation of the dystrophin-associated glycoprotein complex composition by the metabolic properties of muscle fibres. Sci Rep. 9 (1), 2770(2019).
  45. Moyle, L. A., Zammit, P. S. Isolation, culture and immunostaining of skeletal muscle fibres to study myogenic progression in satellite cells. Methods Mol Biol. 1210, 63-78 (2014).
  46. Hettige, P., Tahir, U., Nishikawa, K. C., Gage, M. J. Comparative analysis of the transcriptomes of EDL, psoas, and soleus muscles from mice. BMC Genomics. 21 (1), 808(2020).
  47. Blackburn, D. M., Lazure, F., Soleimani, V. D. RNA sequencing of single myofibers from Mus musculus. Bio Protoc. 10 (4), e3525(2020).

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

اختبار عزل الألياف المفردة لتقييم سلوك الألياف العضلية التأكسدية
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.