يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

تسلسل متعدد المواقع لتصنيف السلالات في توكسوبلازما غوندي

262 مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/70645

⸱

مايو 26, 2026

 , 
1Department of Biosciences, Durham University, 2Department of Parasitology, Faculty of Veterinary Medicine, New Valley University

في هذه المقالة

ملخص

هنا، نقدم بروتوكولا لتحديد ونمط جيني سلالات توكسوبلازما غوندي باستخدام تسلسل النانو المسام المحمول لعلامات جينية مختارة، مما يتيح تحديد سلالات قابلة للتوسع والمستهدف في العزلات التي تديرها المختبرات مع إمكانية تطبيق مستقبلي في بيئات المراقبة.

الملخص

توكسوبلازما غوندي هو طفيلي أبيكومبلكان منتشر عالميا يتميز بتنوع جيني كبير، مما يتطلب طرقا جزيئية دقيقة لتمييز التناف. هدف هذا البروتوكول هو إنشاء سير عمل قابل للتكرار لتحديد الأنماط الجينية المستهدفة متعددة المواقع لعزلات T. gondii المزروعة. تتضمن العملية التكاثر الصناعي لسلالات النوع الأول (RH) والنوع الثاني (ME49)، واستخراج الحمض النووي الجيني، وتضخيم جيني SAG2 وSAG3 حسب المواقع الخاصة، وتحليلات قائمة على التسلسل للكشف عن تعدد أشكال النيوكليوتيدات الأحادية (SNPs) وأحداث الإدخال/الحذف (INDEL). تتم معالجة بيانات التسلسل لتوليد تسلسلات إجماع عالية الثقة ولإجراء محاذاة مقارنة لتحديد تعدد أشكال السلالة المحددة. أظهر تطبيق هذا السير على السلالات النموذجية كفاءة عالية في رسم الخرائط، وعمق قراءة ثابت عبر مواقع الهدف، واستعادة دقيقة لأحجام الأمبليكون المتوقعة، مما يؤكد الكشف الموثوق عن التنوع الجيني على مستوى الموقع. على الرغم من أن تعيين النمط الجيني الشامل يتطلب تضمين علامات موحدة إضافية، إلا أن هذا البروتوكول يوفر إطارا قابلا للتوسع وقابلا للتكرار للتوصيف الجيني المستهدف لعزلات T. gondii التي تدار في المختبر ويدعم تحليل تسلسل متعدد المواقع متسقا.

المقدمة

توكسوبلازما غوندي هو طفيلي أبيكومبلكان منتشر عالميا وتهديد كبير للحيوانات المنشأية المنقولة عبر الغذاء والماء، قادر على إصابة جميع الحيوانات ذات الدم الحار تقريبا، حيث تعد القطط البيضاء المضيفة النهائية1. تحدث العدوى في البشر والحيوانات عادة من خلال ابتلاع أكياس الأنسجة أو البويضات المتسخة، وقدرة الطفيلي على التناوب بين مرحلتي التاكيزويت والبراديزويت تتيح الاستمرارية طويلة الأمد في الأنسجة العصبية والعضلية، مما يساهم في انتقال العدوى عبر اللحوم والبيئة2،3.

على الرغم من أن ثلاثة سلالات مستنسخة (الأنواع الأولى، الثانية، والثالثة) تهيمن في أوروبا وأمريكا الشمالية، فقد تم توثيق تنوع جيني واسع، بما في ذلك السلالات غير النماذية والمؤتلفة، عالميا، خاصة في المناطق التي تحتوي على خزانات غنية بالحياة البرية4. لذلك، فإن التمييز الدقيق بين السلالات ضروري لتوضيح ديناميكيات الانتقال، والتحقيق في التفشيات، وفهم علم الأوبئة الإقليمي. لقد ساهمت طرق التصنيف الجيني التقليدية مثل PCR-RFLP، وتصنيف التسلسل متعدد المواقع المعتمد على سانجر (MLST)، وتحليل الأقمار الصناعية الدقيقة بشكل كبير في فهمنا لبنية تجمعات T. gondii لكنها محدودة في الدقة، والإنتاجية، وقدرتها على اكتشاف التنوع داخل النمط الجيني. غالبا ما تتطلب هذه الطرق عدة تفاعلات منفصلة وقد تفشل في اكتشاف الإدخالات أو الحذف أو الأنماط الجينية المعقدة داخل المواقع متعددة الأشكال1. لقد حسن تسلسل الجيل القادم قصير القراءة (NGS) الكشف عن المتحورات النادرة، لكنه لا يزال مقيدا في تحديد التغيرات الهيكلية المعقدة4.

توفر منصات التسلسل طويل القراءة، وخاصة تقنيات أكسفورد نانوبور، القدرة الآن على توليد قراءات مستمرة عالية الدقة مناسبة لحل المتغيرات الهيكلية والمواقع متعددة الأشكال5. قابليتها للنقل، وقدرتها على التحليل في الوقت الحقيقي، وتوافقها مع سير العمل المعتمد على المضخمات تجعلها أدوات واعدة للتطبيقات الميدانية والتحقيقات المتعلقة بالتفشي6. على الرغم من هذه المزايا، لا تزال سير العمل الموحدة متعددة المواقع للقراءة الطويلة لعملية التصنيف الجيني الروتيني ل T. gondii محدودة.

لسد هذه الفجوة، أنشأنا سير عمل لتسلسل المضخمات طويل القراءة قابل للتوسع يستهدف موقعين متعدد الأشكال (الشكل 1). وبالاقتران مع خط أنابيب تصفية واستدعاء متغيرات، يتيح هذا النهج الكشف الدقيق عن SNPs وINDELs، مما يدعم التمييز على مستوى الإجهاد. البروتوكول مناسب للمختبرات المجهزة لتضخيم PCR والتسلسل طويل القراءة، وقد تم التحقق منه باستخدام عزلات مزروعة. بينما قد يكون التكيف مع العينات السريرية أو البيئية الأولية ممكنا، إلا أن هذه التطبيقات تتطلب تحسينا إضافيا وتحققا. بشكل عام، يوفر هذا السير إطارا منظما لتوصيف جزيئات مستهدفة وقد يدعم التحقيقات الوبائية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

استخدمت هذه الدراسة سلالات طفيليات مخبرية معروفة وخطوط خلايا للأرومات الليفية البشرية التي تم الحصول عليها تجاريا. لم يكن هناك أي شخص أو حيوان مشارك بشكل مباشر.

ملاحظة: ما لم يذكر خلاف ذلك، يتم توفير المخازن المؤقتة والكواشف المستخدمة في هذا البروتوكول ضمن المجموعات التجارية المدرجة في جدول المواد.

1. اختيار العلامة الحيوية

  1. قم بتنزيل تسلسلات الجينوم ل SAG2 و SAG3 بصيغة FASTA من قاعدة بيانات الجينوم ToxoDB (https://toxodb.org/toxo/app).
  2. قم بمحاذاة التسلسل الزوجي باستخدام EMBOSS Water (https://www.ebi.ac.uk/jdispatcher/psa/emboss_water).
  3. اختر مناطق المضخمات ≤1,600 زوج قاعدة (bp) لتقليل وقت التسلسل وضمان تضخيم PCR بكفاءة.
  4. تأكد من أن كل منطقة تحتوي على SNPs معلوماتية أو تعدد أشكال INDEL لتمييز الإكشافات.

2. زراعة وحصاد توكسوبلازما غوندي تاكيزويتا

  1. صيانة زراعة الخلايا المضيفة
    1. احصل على الأرومات الليفية للقلفة البشرية (HFFs) من مصدر تجاري معتمد وزرعها في وسط نمو كامل مكون من وسط النسر المعدل من دولبيكو مع 10٪ مصل أبقار جنيني و1٪ بنسلين-ستريبتومايسين.
    2. حضن المزارع عند حرارة 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون في حاضنة رطبة.
  2. صيانة وتوسيع خطوط الطفيليات.
    1. إصابة طبقات الأحادية في الأرومات الليفية عند التقاء بنسبة 80–90٪ باستخدام التاكيزويتات عند تعدد العدوى من 1–3 طفيليات لكل خلية مضيفة. بالنسبة لقارورة T25 تحتوي على حوالي 1 × 106 من الأرومات الليفية، أضف 1–3 × 106 تاكيزويتات.
    2. افحص الزراعة يوميا باستخدام مجهر ضوئي مقلوب بتكبير 20× أو 40×. تحديد تحلل خلايا المضيف من خلال ملاحظة انتشار اضطراب الطبقة الأحادية.
      ملاحظة: لا تستخدم مزرعات الأرواح الليفية بعد الفقرة 20 لتجنب القطع الأثرية المرتبطة بالثقافة.
    3. حصاد التاكيزويتات.
      1. اجمع الزرعات عندما يكون ≥90٪ من تحلل الخلايا المضيفة مرئيا.
      2. الطرد المركزي عند 1300 × جرام لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
      3. أعد تعليق الحبيبة في محلول ملحي معقم بسعة 10 مل مخزف بالفوسفات عن طريق التوصيل اللطيف بالماصبات، ثم استخدم الطرد المركزي مرة أخرى عند 1,300 × جرام لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. كرر ذلك مرة أخرى.

3. استخراج الحمض النووي الجيني وتوليد الأمبليكونات

  1. استخلاص الحمض النووي الجينومي باستخدام مجموعة تنقية الحمض النووي الجينومية القائمة على عمود السيليكا7. الحمض النووي المخروط في مخزن تسيلية بسعة 50 ميكرولتر.
  2. قياس تركيز الحمض النووي باستخدام مطياف ميكروحجم.
  3. تخزين الحمض النووي عند 4 درجات مئوية قصيرة المدى أو −20 درجة مئوية للتخزين طويل الأمد.
  4. جهز تفاعلات PCR باستخدام خليط رئيسي من بوليميراز الحمض النووي عالي الدقة، وبادئات خاصة بالموقع (الجدول التكميلي 1)، وماء خال من النوكلياز.
  5. إجراء تضخيم PCR باستخدام جهاز تدوير حراري معاير تحت ظروف الدورة التالية: (أ) إزالة الطبيعة الأولية عند 98 °م لمدة 30 ثانية، (ب) 35 دورة بدرجة حرارة 98 °م لمدة 10 ثوان؛ التلدين حسب الموضع: 60 درجة مئوية ل SAG2، 68 درجة مئوية ل SAG3، 30 ثانية؛ 72 درجة مئوية لمدة 20 ثانية، (ج) التمديد النهائي: 72 درجة مئوية لمدة دقيقتين.
  6. تحقق من منتجات PCR عن طريق الرحلان الكهربائي على جل أغاروز بنسبة 1.5٪.
  7. منتجات Purify PCR باستخدام نظام PCR قائم على الأعمدة ونظام تنقية استخراج الجل وفقا لتعليمات الشركة المصنعة8. الحمض النووي المائل في 15–20 ميكرولتر من مخزن السائل.
    ملاحظة: قد تنخفض كفاءة وإنتاجية PCR بسبب انخفاض جودة قوالب الحمض النووي أو تركيزها أو ظروف التفاعل غير المثالية. إذا كان إنتاج الأمبليكونات منخفضا، تحقق من سلامة قالب الحمض النووي باستخدام الرحلان الكهربائي الهلام بالأجاروز وتركيزه ونقاء باستخدام مقياس طياف ضوئي. يجب أيضا تحسين درجات حرارة وتراكيز التلدين بتقنية PCR لأزواج البرايمر المستخدمة، وزيادة عدد دورات PCR حسب الحاجة.

4. التحضير في المكتبة لترتيب القراءة الطويلة

  1. إصلاح الطرف وتتبع dA
    1. قم بإذابة جميع المواد المخلوقة وامزج جيدا بواسطة الدوامة. قم بتخفيف عينة التحكم في الحمض النووي ب 10.5 ميكرولتر من محلول التفريغ خلال الاستخدام الأول فقط واحتفظ بها على الثلج.
      ملاحظة: دائما استخدم خرز الدوامة المغناطيسية جيدا قبل كل استخدام.
      تحذير: لا تقم بتدوير خليط إنزيم التحضير النهائي؛ اخلط بلطف عن طريق استخدام الماصات.
    2. تم تعديل 200 fmol (~130 نانوغرام لجزء 1 كيلوبايت) من كل عينة DNA في أنابيب PCR بسعة 0.2 مل وضبط الحجم إلى 11.5 ميكرولتر باستخدام ماء خال من النوكليز.
    3. أضف 1 ميكرولتر من عينة التحكم المخففة في الحمض النووي لكل أنبوب وامزج بالماصة 10–20 مرة.
    4. جهز خليط رئيسي جاهز لكل عينة تحتوي على 1.75 ميكرولتر من محلول تفاعل و0.75 ميكرولتر من خليط الإنزيم (بما في ذلك 5٪ فائض).
    5. أضف 2.5 ميكرولتر من خليط الماستر إلى كل عينة، اخلط برفق ثم قم بتدوير الخليط لفترة وجيزة.
    6. حضانه في جهاز دورة حراري عند 20 درجة مئوية لمدة 5 دقائق تليها 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
  2. تنقية الحمض النووي المعد في النهاية
    1. انقل تفاعل 15 ميكرولتر إلى أنبوب طرد مركزي منخفض الربط بالحمض النووي بسعة 1.5 مل.
    2. أضف 15 ميكرولتر من الخرزات المغناطيسية المعلقة، وامزج بلطف وادور لفترة وجيزة.
    3. حضن العينات على خلاط دوار لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    4. حضر إيثانول طازج بنسبة 80٪ للغسيل.
    5. ضع الأنابيب على رف مغناطيسي حتى تتحول الخرزات إلى حبيبات وأزل الفائق بحذر.
    6. اغسل الخرزات مرتين ب 200 ميكرولتر من 80٪ إيثانول.
      ملاحظة: اترك الخرزات تكتمل الحبيبات، ثم أزل الإيثانول بحذر.
    7. خرزات جافة بالهواء لمدة ~30 ثانية؛ تجنب التجفيف الزائد لمنع التشقق.
    8. أعد تعليق الخرزات في ماء خال من النوكلياز بسعة 10 ميكرولتر وحضن لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة.
    9. ضع الأنابيب على رف مغناطيسي وانقل 10 ميكرولتر إلى أنبوب طرد مركزي دقيق نظيف منخفض الارتباط بالحمض النووي.
    10. قياس تركيز الحمض النووي باستخدام 1 ميكرولتر على مقياس طيفي.
  3. الترميز الشريطي الأصلي
    1. مزيج الليغاز الرئيسي ذوبان الثوبان/TA، EDTA، مخزن الشظايا القصيرة (SFB)، والباركود الأصلي (NB01–NB24).
    2. تعيين رموز باركود فردية للعينات من 1 إلى 24.
    3. قم بتجميع تفاعل الباركود باستخدام حمض نووي جاهز للنهاية بسعة 7.5 ميكرولتر، و2.5 ميكرولتر باركود أصلي، و10 ميكرولتر خليط رئيسي من ليغاز بلنت/TA
    4. اخلط جيدا عن طريق التوصيل بالماصة 10–20 مرة.
    5. حضن لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة وأنهى التفاعل ب 4 ميكرولتر EDTA، ثم اخلط جيدا عن طريق الأنابيب ثم ادور لفترة وجيزة.
    6. تجميع العينات المشفرة شريطيا في أنبوب طرد مركزي منخفض الربط بالحمض النووي بحجم 1.5 مل. أضف الخرزات المغناطيسية عند 0.4× وهو إجمالي حجم العينة المجمعة (مثلا، أضف 230 ميكرولتر من الخرزات إلى 575 ميكرولتر DNA مجمع). اخلط جيدا عن طريق استخدام الماصات، ثم حضن على خلاط دوار في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.
    7. اغسل الخرزات بمحلول 700 ميكرولتر من محلول القطع القصيرة (SFB). حرك الخرزات لإعادة تعليقها، ثم تدور للأسفل، ثم أعد العينة إلى الرف المغناطيسي ودع الخرزات تتسرب إلى الحبيبات. قم بإزالة المخزن باستخدام معصة، ثم تخلص منه.
    8. كرر الخطوة السابقة.
    9. لف الأنبوب للأسفل وضع الأنبوب مرة أخرى على الرف المغناطيسي. قم بإزالة أي مخزن مؤقت متبقي.
    10. قم بإزالة الأنبوب من الرف المغناطيسي وأعد تعليق الحبيبة في ماء خالي من النوكلياز بسعة 35 ميكرولتر عن طريق التحريك الخفيف اليدوي.
    11. حضانة المشروب على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق مع خلط متقطع، ثم نقل الإلوات إلى أنبوب ميكرو نظيف منخفض الارتباط بالحمض النووي.
  4. ربط المحول وتنظيف المكتبة
    1. تجميع تفاعل الربط باستخدام 30 ميكرولتر من الحمض النووي المشفر الشريطي المجمع، ومحول أصلي 5 ميكرولتر، و10 ميكرولتر لمخزن ربط (5×)، و5 ميكرولتر من ليغاز الحمض النووي T4.
    2. اخلط التفاعل جيدا عن طريق الرش بلطف والدوران لفترة وجيزة. حضن التفاعل لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    3. أضف 20 ميكرولتر من الخرزات المغناطيسية المعلقة إلى التفاعل وامزج عن طريق التوصيل بالمنابيت. حضن على خلاط دوار لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    4. قم بتدوير العينة والرصاصة على الرف المغناطيسي. أبق الأنبوب على المغناطيس واستخدم الماصة بعيدا عن السوبرناتان.
    5. اغسل الخرزات بإضافة 125 ميكرولتر من مخزن القطع القصير (SFB). حرك الخرزات لإعادة تعليقها، ثم الدوران للأسفل، ثم أعد الأنبوب إلى الرف المغناطيسي ودع الخرزات تتسرب بالرصاصة. أزل السوبرناتينت باستخدام ماصة، ثم تخلص منه.
    6. كرر الخطوة السابقة.
    7. لف الأنبوب مرة أخرى على المغناطيس. اقطع أي فائق متبق. قم بإزالة الأنبوب من الرف المغناطيسي وإعادة تعليق الحبيبة في مخزن تهويت بسعة 15 ميكرولتر (EB).
    8. قم بتدوير الحوض واحتضنه لمدة 10 دقائق عند درجة حرارة 37°C. حرك العينة كل دقيقتين عن طريق التحريك الخفيف لمدة 10 ثوان لتشجيع استكشاف الحمض النووي.
    9. ضع الحبيبات على مغناطيس حتى يصبح اللوات صافيا وعديم اللون، لمدة دقيقة واحدة على الأقل.
    10. إزالة واحتفاظ ب 15 ميكرولتر من الإلوات الذي يحتوي على مكتبة الحمض النووي في أنبوب طرد مركزي نظيف بسعة 1.5 مل منخفض ارتباط الحمض النووي.
    11. قم بقياس المكتبة النهائية باستخدام مقياس طيف الفوتو.

5. تحضير خلايا التدفق وتسلسل المسام النانوية

  1. تحضير خلايا التدفق
    1. افحص خلية التدفق وتأكد من ≥80 مسام نشطة.
    2. جهز خليط البرايمر بدمج 117 ميكرولتر من محلول التدفق مع 3 ميكرولتر من محلول الحبل في أنبوب طرد مركزي دقيق ليصبح الحجم الإجمالي 120 ميكرولتر. اخلط بلطف عن طريق استخدام الماصات لتجنب إدخال فقاعات هواء. قم بتحميل خليط التمهيد الكامل بسعة 120 ميكرولتر ببطء في منفذ خلية التدفق، لضمان عدم ظهور فقاعات هواء أثناء التحميل.
  2. تحميل المكتبة وتسلسل الكتب
    1. تحضير خليط التسلسل بدمج 15 ميكرولتر من مخزن التسلسل (SB)، و10 ميكرولتر من خرز المكتبة (LIB)، و5 ميكرولتر من مكتبة الحمض النووي. اخلط بلطف عن طريق الرش بأنبوب 3–5 مرات لتجنب ظهور الفقاعات. خليط التسلسل الناتج بسعة 30 ميكرولتر جاهز للتحميل أو يمكن تعديله إلى 45 ميكرولتر إذا لزم الأمر.
    2. قم بتحميل 30–45 ميكرولتر من خليط التسلسل ببطء في منفذ عينة خلية التدفق عن طريق صرف المحلول باتجاه القطر.
      تحذير: تجنب إدخال فقاعات الهواء ولا تسمح لطرف الماصة بلمس الغشاء. أغلق منفذ التحميل بإحكام بعد التفريغ.
    3. ابدأ التسلسل مع تفعيل استدعاء القاعدة في الوقت الحقيقي وراقب نشاط المسام.
    4. استمر في التسلسل حتى يتم تحقيق تغطية ≥500× لكل مكبر صوت (موصى به ≥1000×)، لضمان عمق قراءة كاف لاستدعاء القاعدة الدقيقة، وتوليد تسلسل إجماعي موثوق، واكتشاف واثق للمتغيرات منخفضة التردد.
      ملاحظة: إذا كان التغطية المنخفضة للتسلسل واضحا، تأكد من وجود مدخل أمبلكون عالي الجودة عند التركيز المطلوب، وكمية كافية من مسام خلايا التدفق النشطة، ووسع التسلسل لتحقيق التغطية الموصى بها.

6. معالجة البيانات وتحليل المتغيرات

  1. استدعاء القاعدة وإزالة الإرسال
    1. أداء مكالمات قاعدة عالية الدقة باستخدام برامج استدعاء القاعدة المرتبطة بالمنصة مع إعدادات دقة عالية افتراضية لتوليد ملفات FASTQ لكل عينة لكل عينة. يقرأ DeMultiplex بواسطة الباركود ويحتفظ فقط بقراءة تمرير فلاتر مراقبة الجودة.
  2. قراءة التعيين ومعالجة BAM
    1. قم بتحميل تجميع الجينوم المرجعي لتوكسوبلازما غوندي GCF_000006565.2 (TGA4) من قاعدة بيانات الجينوم التابعة للمركز الوطني لمعلومات التكنولوجيا الحيوية (NCBI). استخلاص الكروموسوم VIII (NC_031476.1) لتحليل SAG2 والكروموسوم XII (NC_031480.1) لتحليل SAG3 . قم بفهرسة التسلسلات المرجعية باستخدام أدوات SAMtools وإنشاء مؤشر محاذاة باستخدام منشئ مؤشرات محاذاة طويلة القراءة.
    2. تقرأ خريطة إلى الجينوم المرجعي المفهرس باستخدام خوارزمية محاذاة طويلة القراءة محسنة لبيانات تسلسل النانوبور (مثل الإعداد المسبق للقراءة الطويلة؛ -ax map-ont).
    3. تحويل مخرجات المحاذاة إلى تنسيق BAM، وفرز، وفهرسة ملفات BAM باستخدام SAMtools. أضف معلومات مجموعة القراءة إلى كل ملف BAM باستخدام أدوات بيكارد. حساب متوسط التغطية لكل موقع باستخدام إحصائيات العمق وتوليد إحصائيات الرسم باستخدام مقاييس flagstat.
  3. توليد تسلسل الإجماع
    1. توليد تسلسلات توافق لكل مضخم باستخدام خوارزمية تلميع توافق تعتمد على الشبكات العصبية مع معلمات افتراضية. تصدير تسلسلات الإجماع بصيغة FASTA للتحليل اللاحق.
    2. إجراء تحليل محاذاة وتسلسل مقارن قائم على المراجع باستخدام قواعد بيانات جينومية متاحة للجمهور. تصور محاذاة القراءة والمواقع متعددة الأشكال باستخدام برنامج تصور الجينوم.
  4. النداء المتغير
    1. قم باكتشاف المتغيرات باستخدام خوارزمية استدعاء متغيرات تعتمد على الإجماع. فصل تعدد أشكال النيوكليوتيد الواحد (SNPs) وأحداث الإدخال/الحذف (INDELs) باستخدام أدوات اختيار المتغيرات (الملف التكميلي 1).
    2. تطبيق عتبات تصفية عالية الجودة. بالنسبة لأجهزة SNP، قم بتصفية نسخ مثل QD < 2.0، أو FS > 60.0، أو MQ < 40.0. بالنسبة لأجهزة INDEL، قم بتصفية نسخ مثل QD < 2.0 أو FS > 200.0.
    3. ضغط ومؤشر ملفات VCF المصفاة باستخدام أدوات معالجة VCF القياسية. توليد إحصائيات متغيرة باستخدام أدوات ملخص VCF.
  5. تعيين النمط الجيني
    1. استخلاص المتغيرات الخاصة بالمواقع من منطقتي SAG2 وSAG3 ومقارنة الملفات المتعددة الأشكال مع تسلسلات السلالات المرجعية لتعيين الأنماط الجينية ل T. gondii .

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

تم تضخيم الحمض النووي الجيني لتوكسوبلازما غوندي بنجاح بواسطة تفاعل بوليميراز المتسلسل (PCR) الذي استهدف علامتين جينيين: SAG2 وSAG3 (الشكل 2). بعد التنقية، أظهرت منتجات PCR نطاقات مميزة بالحجم المتوقع في الرحلان الكهربائي الهلام الأجاروزي، والتي تتوافق مع 639 بيس (SAG2) و1158 بيس (SAG3). أكد وضوح وثبات هذه النطاقات نجاحا في تضخيم وسلامة شظايا الجين المستهدف في تحليلات التسلسل اللاحقة.

أد...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

تظهر هذه الدراسة فائدة تسلسل أكسفورد نانوبور طويل القراءة مع نهج متعدد المواقع المستهدف لتحديد الجينات السريع والموثوق لتوكسوبلازما غوندي. من خلال التركيز على موقعين مستضدين سطحيين موصوفين جيدا، SAG2 وSAG3، نؤسس إثبات مفهوم لتسلسل المواقع متعدد المواقع المعتمد على Oxford Nanopore من خلال تحليلات مقارنة لسلالات RH (النوع I) وME49 (النوع II)، مما يثبت قدرة المنصة على حل التنوع الجيني الخاص بالسلالة.

أدى تضخيم PCR لكلا الموقعين إلى إنتا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

المؤلفون لا يفرضون أي تضارب مصالح.

شكر وتقدير

تم تمويل هذا العمل من قبل وزارة التعليم العالي والبحث العلمي المصرية، الممثلة من قبل المكتب المصري للشؤون الثقافية والتعليمية في لندن، ومجلس أبحاث الأبحاث البريطانية (MR/X502947/1). تم إنشاء الشكل 1 باستخدام BioRender.com

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
Agarose powderThermo Fisher Scientific16500100لعملية الرحلان الكهربائي على الهلام
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)Thermo Fisher Scientific11995065وسيط زراعة الخلايا
epi2me-labs/wf-amplicon Nextflow workflow (v1.2.1)Oxford Nanopore Technologies, UKN/Aبرنامج Nextflow لمعالجة وتحليل بيانات تسلسل النوكليوتيدات النانوية؛ تم استخدام الإصدار 1.2.1 لتحليل بيانات MinION بشكل يمكن تكراره.
epi2me-labs/wf-alignment Nextflow workflow (v1.2.3)Oxford Nanopore Technologies, UKN/Aبرنامج Nextflow لمحاذاة قراءات تسلسل النوكليوتيدات النانوية للتسلسلات المرجعية والتصور المتكامل باستخدام IGV؛ تم استخدام الإصدار 1.2.3 لتحليل بيانات MinION بشكل يمكن تكراره.
Ethyl alcohol, pureMerck Life Science51976-500ML-Fلتنظيف الخرز
Fetal bovine serum (FBS)Sigma-AldrichMFCD00132239مكمل لزراعة الخلايا
Flow Cell Wash KitOxford Nanopore TechnologiesEXP-WSH004غسل خلية التدفق
GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder (10 kb)Thermo Fisher ScientificSM1331تأكيد الحجم
HFF-1 human foreskin fibroblast cell lineAmerican Type Culture Collection (ATCC)SCRC-1041الخلايا الليفية البشرية الجلدية المعزولة من جلد الوليد؛ تستخدم لتكاثر الطفيل
MinION Flow Cell (R10.4.1)Oxford Nanopore TechnologiesFLO-MIN114خلية تدفق للتسلسل
MinION Mk1B Sequencing DeviceOxford Nanopore Technologies, UKMIN-101Bمتسلسل النوكليوتيدات النانوية؛ تم إجراء التسلسل باستخدام برنامج MinKNOW (الإصدار 25.09.16) للتحكم في الجهاز واستدعاء القاعدة في الوقت الحقيقي.
MinKNOW SoftwareOxford Nanopore Technologies, UKN/Aالبرنامج المستخدم للتحكم في جهاز MinION Mk1B، والتسلسل في الوقت الحقيقي، واستدعاء القاعدة؛ الإصدار 25.09.16.
Native Barcoding Kit 24 V14Oxford Nanopore TechnologiesSQK-NBD114.24ترميز العينات المتعددة
NEB Blunt/TA Ligase Master MixNew England BiolabsM0367ربط الحمض النووي
NEBNext Quick Ligation ModuleNew England BiolabsE6056ربط المحول
NEBNext Quick Ligation Reaction Buffer (5×)New England BiolabsB6058يستخدم في ربط الحمض النووي
NEBNext Ultra II End Repair/dA-Tailing ModuleNew England BiolabsE7546تحضير المكتبة
Nuclease-free waterThermo Fisher ScientificR0581درجة بيولوجية جزيئية
NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit Macherey-Nagel740609.5تنقيه منتج PCR
Penicillin–Streptomycin (1%)Thermo Fisher Scientific (Gibco)15140-122مزيج مضاد حيوي
Phosphate-buffered saline (PBS)Thermo Fisher Scientific (Gibco)10010023محلول الغسل
Q5 High-Fidelity 2× Master MixNew England BiolabsM0492Sبوليميراز عالي الدقة
QIAamp DNA Blood Mini KitQiagen69504استخراج الحمض النووي
Quick T4 DNA LigaseNew England BiolabsM2200إنزيم ربط المحول
SYBR Safe DNA Gel StainThermo Fisher ScientificS33102صبغة تلطيخ الحمض النووي
TriTrack DNA Loading Dye (6×)Thermo Fisher ScientificR1161تحميل العينات في الهلام
Trypsin–EDTA (0.25%)Thermo Fisher Scientific (Gibco)25200056لنقل HFFs
1× TAE or 1× TBE buffer——محلول تشغيل
2× PCR premix——خليط جاهز لـ PCR

المراجع

  1. Uzelac, A., Djurkovic-Djakovic, O. Isolation, genotyping and phenotyping Toxoplasma gondii in Europe - A critical perspective. Food Waterborne Parasitol. 40, e00279(2025).
  2. Yaman, Y., Bay, V., Kişi, Y. E. Discovery of host genetic factors through multi-locus GWAS against toxoplasmosis in sheep: addressing one health perspectives. BMC Veterinary Research. 21 (1), 263(2025).
  3. Khedr, A. A., et al. Exploring the role of chitosan and curcumin-loaded chitosan nanoparticles against chronic Toxoplasma infection in experimental mice. Scientific Reports. 15 (1), 41765(2025).
  4. Joeres, M., et al. Genotyping of European Toxoplasma gondii strains by a new high-resolution next-generation sequencing-based method. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 43 (2), 355-371 (2024).
  5. Gohar, Y., et al. Intra-strain genetic heterogeneity in Toxoplasma gondii ME49: Oxford Nanopore long-read sequencing reveals copy number variation in the ROP8-ROP2A locus. BMC Genomics. 26 (1), 1094(2025).
  6. Koutsogiannis, Z., Denny, P. W. Rapid genotyping of Toxoplasma gondii isolates via Nanopore-based multi-locus sequencing. AMB Express. 14 (1), 68(2024).
  7. DNeasy Blood & Tissue Kit Handbook. , QIAGEN. (2023).
  8. User manual PCR clean-up and Gel extraction. , MACHEREY-NAGEL. (2024).
  9. Karst, S. M., et al. High-accuracy long-read amplicon sequences using unique molecular identifiers with Nanopore or PacBio sequencing. Nature Methods. 18 (2), 165-169 (2021).
  10. Yu, P. -L., et al. Next-generation fungal identification using target enrichment and Nanopore sequencing. BMC Genomics. 24 (1), 581(2023).
  11. Vilares, A., et al. Towards a rapid sequencing-based molecular surveillance and mosaicism investigation of Toxoplasma gondii. Parasitology Research. 119 (2), 587-599 (2020).
  12. Fazaeli, A., Ebrahimzadeh, A. A new perspective on and re-assessment of SAG2 locus as the tool for genetic analysis of Toxoplasma gondii isolates. Parasitology Research. 101 (1), 99-104 (2007).
  13. Targa, L. S., et al. Toxoplasma gondii SAG2, SAG3 and GRA6 alleles and single nucleotide polymorphism in congenital infections with known parasite load and clinical outcome. Rev Inst Med Trop Sao Paulo. 65, e8(2023).
  14. Rico-Torres, C. P., et al. Can cloning and sequencing help to genotype positive Toxoplasma gondii clinical samples? Results and validation using SAG3 as a model. Infect Genet Evol. 101, 105283(2022).
  15. Sanchez, S. G., Besteiro, S. The pathogenicity and virulence of Toxoplasma gondii. Virulence. 12 (1), 3095-3114 (2021).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

سير عمل التنميط الجينياستخلاص الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين الجينوميالتضخيم النوعي للموقعجين SAG2جين SAG3تعدد أشكال النوكليوتيدات المفردةمحاذاة التسلسلات
تسلسل متعدد المواقع لتصنيف السلالات في توكسوبلازما غوندي
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.